Abstract
Compreender as interações heterotípicos precoces entre células cancerosas e torno estroma não-cancerosas é importante para elucidar os acontecimentos que levaram à activação do estroma e estabelecimento do microambiente do tumor (TME). Vários in vitro e em modelos in vivo de o TME foram desenvolvidos; No entanto, em geral, estes modelos não prontamente permitir o isolamento de populações de células individuais, sob condições não perturbando, para um estudo mais aprofundado. Para contornar esta dificuldade, temos utilizado um modelo TME in vitro utilizando um substrato de crescimento de células que consiste de uma inserção da membrana microporosa permeável que permite a geração simples de populações de células altamente enriquecido crescido intimamente, mas separadamente, em cada lado da membrana da pastilha para co prolongado vezes -Cultura. Através da utilização deste modelo, são capazes de gerar fibroblastos associados ao câncer grandemente enriquecido (CAF) populações de fibroblastos humanos diplóides normais seguinteco-cultura (120 h) com células de carcinoma da mama humano altamente metastáticas, sem o uso de marcação fluorescente e / ou separação de células. Além disso, através da modulação do tamanho de poro da pastilha, que podem controlar o modo de comunicação intercelular (por exemplo, comunicação GAP-junção, factores segregados) entre as duas populações de células heterotípicas, que permite a investigação dos mecanismos subjacentes ao desenvolvimento do TME, incluindo o papel da permeabilidade gap-junction. Este modelo serve como uma ferramenta valiosa para melhorar a nossa compreensão dos eventos iniciais que conduzem à iniciação do cancro de estroma, o começo da evolução da TME, e o efeito modulador do estroma das respostas de células de cancro a agentes terapêuticos.
Introduction
O microambiente do tumor (TME) é um sistema altamente complexa composta de células de carcinoma que co-existem e evoluem paralelamente estroma hospedeiro. Este componente do estroma consiste tipicamente em fibroblastos, células endoteliais, miofibroblastos, vários componentes do sistema imunológico, bem como uma matriz extracelular 1. Um componente significativo, muitas vezes a maioria do presente estroma, são fibroblastos activados, frequentemente referido como fibroblastos associados ao cancro ou fibroblastos associada a carcinoma (CAF) 2,3. Ao contrário de fibroblastos normais, não activado, FAC contribuir para a iniciação do tumor, progressão, angiogénese, invasão, metástase, e recorrência 4-11 em uma grande variedade de carcinomas, incluindo os da mama, da próstata, do pulmão, pâncreas, pele, cólon, do esófago, e ovário 5,6,12-17. No entanto, a natureza exata da contribuição da FAC em todo patogênese do câncer permanece mal definida. Além disso, a evidência clínica demonstrou valor prognóstico da FAC, Correlacionando sua presença para malignidades de alto grau, falha terapêutica e pobres 10,18,19 geral prognóstico.
Claramente, aumentando a nossa compreensão dos eventos que iniciam no desenvolvimento CAF, bem como as comunicações intercelulares mediadoras seu papel dentro da TME, pode fornecer excitantes novos alvos terapêuticos e estratégias avançadas que poderiam melhorar os resultados dos pacientes. Para atingir este objetivo, vários in vivo e in vitro modelos têm sido desenvolvidos. Embora as abordagens in vivo são mais um reflexo do TME dos pacientes, eles possuem limitações, incluindo a imensa complexidade e heterogeneidade, tanto dentro como entre tumores. Além disso, as amostras de tumores de seres humanos representam muitas vezes altamente desenvolvida TME e não permitir uma compreensão dos eventos iniciadores TME. estudos experimentais em animais oferecer algumas vantagens, no entanto generalização dos dados obtidos com animais para os seres humanos devem ser feitas com cautela devido a diferenças na physilogia entre os seres humanos e animais, tais como roedores (por exemplo, tiol química 20, a taxa metabólica 21, 22 da tolerância à pressão, etc). Além disso, ao contrário da população humana, que é geneticamente de natureza heterogénea, animais de laboratório são tipicamente produzidos até à homogeneidade. Além disso, é muitas vezes difícil de examinar as variações e alterações fisiológicas transientes fenótipo celular, bem como para controlar parâmetros experimentais específicos que utilizam animais, tais como roedores. Assim, in vitro 2 e 3 dimensões (2D e 3D) modelos de cultura de tecidos são frequentemente utilizados para fazer avançar a compreensão básica do desenvolvimento TME. Apesar de sua falta de um retrato fiel da complexidade dos sistemas in vivo, estes modelos oferecem vantagens que facilitam muito investigações mecanicistas. Modelos in vitro permitem uma análise mais simplificada, focado, e cost-effective da TME, em que estatisticamente significativa os dados podem ser gerados emcélulas livres de variações sistêmicas que surgem em animais.
Existem diversas variedades de sistemas in vitro. Os dois modelos in vitro TME mais vulgarmente utilizados consistem em monocamada mista ou culturas de células esferóides. Ambos os métodos de cultura são vantajosos para estudos básicos de interacções intercelulares (por exemplo, células normais com as células tumorais) e para a análise de várias alterações de fenótipo celular específico TME (por exemplo, aparecimento de fibroblastos associados ao cancro a partir de fibroblastos normais). Além disso, os esferóides são capazes de criar uma estrutura de tecido semelhante a mais reflexiva da TME, e pode ser representativa da heterogeneidade do tumor 23. No entanto esferóides muitas vezes produzem muito diferentes gradientes de tensão de oxigênio através de camadas, que podem complicar conclusões experimentais 24. Infelizmente, ambos os modelos são extremamente limitados na sua capacidade de isolar populações de células puras para posterior caracterização e estudo seguinte co-cultura. Para isso seria necessário pelo menos um tipo de célula a ser fluorescente-etiquetados ou rotulados com uma máquina de identificação e, em seguida, submeter o co-cultura mista à extensa processamento e separação de células para separar as populações de células. Enquanto um classificador de células é capaz de isolar uma população de células em vez puro, deve-se estar ciente do estresse celular e contaminação microbiana riscos potenciais 25.
Para facilitar a compreensão da comunicação intercelular, grandes esforços têm sido dedicados para o desenvolvimento e optimização de sistemas in vitro que imitam de perto o ambiente in vivo, permitindo ao mesmo tempo uma abordagem simplificada. Uma dessas ferramentas é a inserção microporosa permeável, um substrato de membrana que foi desenvolvido pela primeira vez em 1953 26 e posteriormente adaptado para diversas aplicações e estudos (por exemplo, polaridade celular 27, endocitose 28, o transporte da droga 29, modelagem de tecido 30, FERTilization 31, efeito espectador 32,33, etc). Este sistema permite o crescimento de células in vivo com anatómica -like e diferenciação funcional, bem como a expressão de muitos marcadores in vivo 34,35 que não são observados quando cultivadas em utensílios de plástico impermeável. Além disso, a membrana porosa extremamente fina (10 um de espessura) permite a rápida difusão de moléculas e tempos de equilíbrio, o qual simula o ambiente in vivo e permite funcionamento celular independente em ambos os domínios celulares basolaterais e apicais. Uma vantagem adicional da utilidade da pastilha como um sistema TME é a sua separação física das duas populações de células cultivadas heterotípicas em ambos os lados da membrana nas mesmas condições ambientais, mantendo ao mesmo tempo vários modos de comunicação intercelular através dos poros da membrana. Embora fisicamente separadas, as duas populações de células metabolicamente são acoplados através de elementos e segregadas, como odescrito aqui, também através de canais GAP-juncional. Além disso, mantendo as inserções em in vivo tensão parcial de oxigénio (pO 2), o modelo reduz as complicações de gradientes de oxigénio e químicos observados em outros sistemas. Pelo contrário, ela aumenta a compreensão dos mecanismos naturais que controlam o TME. Notavelmente, as duas populações de células pode ser facilmente isolado com elevado grau de pureza, sem a marcação fluorescente e / ou separação de células após períodos prolongados de co-cultura.
Aqui, descrevemos um protocolo TME in vitro que consiste de células de carcinoma da mama humano e fibroblastos humanos cultivados, respectivamente, em ambos os lados de uma inserção da membrana microporosa permeável, mas ainda em comunicação bidireccional contínua através dos poros da membrana. Mostra-se que, utilizando membranas com diferentes tamanhos de poros, a contribuição de um tipo específico de comunicação intercelular (por exemplo, factores segregados contra as junções de hiato) para o desenvolvimentodo TME pode ser investigada.
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Protocol
1. Preparação de Meios de Cultura e Células
- Preparar 500 ml de meio de Eagle mínimo essencial, suplementado com 12,5% (vol / vol) de soro fetal de bovino inactivado pelo calor (FBS), 2 mM de L-alanil-L-glutamina, e 100 unidades de penicilina e 100 ug de estreptomicina por ml.
NOTA: O meio de crescimento e suplemento (s) podem ser facilmente trocados para as necessidades de crescimento de outras estirpes de células ou linhas celulares. - Preparar 70 ul de meio de cultura de células para cada inserto (formato de 6 poços de inserção): meio essencial mínimo de Eagle suplementado com 50% (vol / vol) de 2 mM de L-alanil-L-glutamina FBS, desactivado por calor, e 100 unidades de penicilina e 100 ug de estreptomicina por ml.
NOTA: O meio é suplementado com 50% de FBS para facilitar a fixação de células para o lado de baixo (isto é, inferior) da peça inserta. O meio de crescimento e suplemento (s) podem ser facilmente trocados para as necessidades de crescimento de outras estirpes de células ou linhas celulares. - Prepara-se uma suspensão de células das células destinadas a ser revestida no lado inferior da peça inserta.
NOTA: Aqui, os resultados foram obtidos usando AG1522 fibroblastos humanos normais cultivados em frascos de 75 cm 2 de cultura de células e estas células será, portanto, o foco da descrição da preparação da suspensão de células. - Para recolher as células, remover o meio de crescimento e lavar 2x monocamada de células com 5 ml de 1x tampão fosfato salino (PBS).
- Remover o PBS e espalharam 1 ml de 0,25% (vol / vol) de tripsina com 2,21 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), pré-aquecida até à temperatura ambiente (TA) sobre as células durante 2 min à temperatura ambiente (temperatura ambiente).
- Extingue-se a actividade da tripsina com 9 ml de meio de crescimento completo (preparado no passo 1.1) e recolher as células por pipetagem suave da suspensão de células sobre a superfície do balão de 10x.
- Determinar a concentração de células usando um hemocitômetro ou contador eletrônico e pipeta do volume suspensão de células que irá provide 250.000 células por inserção em um tubo de centrífuga de 15 mL estéril.
- Agregar a suspensão de células por centrifugação (800 x g, 2 min). Suspende-se o sedimento de células com meio de crescimento (preparado no passo 1.2) para criar uma concentração de 250.000 células por 70 ul.
NOTA: A cultura de células em inserções permeáveis membrana microporosa é baseada em substratos 2D, a sementeira de células é realizada de modo semelhante, excepto que as células devem ser inicialmente suspensas em meio contendo 50% (vol / vol) de FBS para facilitar a ligação.
2. Preparação de inserções
NOTA: Para garantir condições estéreis, o trabalho em uma cabine de segurança biológica de fluxo laminar dedicada à cultura de células.
- Escolha as inserções com um tamanho dos poros da membrana de 0,4 um, 1 um, ou de 3 um (determinado pelo interesse experimental (s), como a dimensão dos poros pode ser usado para explorar o papel dos diferentes modos de comunicação intercelular).
NOTA: O 0.4 de poro é smalL suficiente para limitar a formação de junções de hiato funcionais entre células em ambos os lados da membrana de inserção e pode ser utilizado para estudar a comunicação intercelular por factores segregados. Considerando que, a 1 uM e 3 | iM poros são suficientemente grandes para permitir a formação de junções de hiato funcionais e podem ser usadas para estudar a comunicação intercelular por junções de hiato e ambos os factores segregados. - Remover inserções individuais da embalagem e colocar em um prato de multi-poços de tamanho igual.
NOTA: As pastilhas estão disponíveis com várias áreas de superfície de membrana para atender às necessidades específicas da aplicação (por exemplo, de 6 poços, inserções de 12 poços, e 24 poços.). Aqui, os resultados foram obtidos utilizando a inserção de 6 cavidades, e será, portanto, o foco da descrição do modelo. - Cobrir o prato, contendo as inserções com a tampa prato. Segurando o prato de multi-poços com ambas as mãos, inverter cuidadosamente o prato de modo a que as partes inferiores de inserção (isto é, lado de baixo) são agora voltado para cima.
- Remover the inferior do prato de multi-poços, expondo o lado inferior dos elementos de encaixe. Trabalhando com uma pastilha de cada vez, use um par de fórceps estéreis e suavemente segurar a inserção no lugar. Com a mão livre, utilizar uma pipeta com uma ponta de boca larga para desenhar 70 ul da suspensão de células (preparado em passos 1,3-1,8), contendo 250.000 células.
- Para as células placa, colocar suavemente a ponta da pipeta no centro da membrana da pastilha, e lentamente pipetar os 70 ul de suspensão de células, enquanto movendo-se lentamente a ponta da pipeta volta da superfície da membrana. Ser cuidadoso para não estender a ponta da pipeta e a suspensão de célula para o bordo da peça inserta.
NOTA: Se tocar a borda do inserto poderia resultar na perda de tensão capilar da suspensão de células que conduz às células de secagem para fora durante a fixação. - Repita o procedimento para inserções restantes, com o cuidado a ser exercido para não trabalhar diretamente sobre as inserções expostos para evitar contaminação microbiana potencial.
- Gentilmente devolver o multi-bemprato inferior para cobrir as inserções. Mantendo o prato com inserções invertido, incubar numa atmosfera de ar humidificada de CO 2 a 5% (vol / vol) a 37 ° C durante 30-45 min.
NOTA: Se a suspensão de células no inserto em contacto com o fundo do poço, levantar cuidadosamente o fundo da placa e colocá-la sobre a borda de topo do prato, de modo a formar um pequeno ângulo e cria uma maior separação entre a superfície do prato e o lado inferior das inserções (em que as células são semeadas). Isto irá evitar que as células de se ligarem à superfície dos poços, em vez da peça inserta. - Seguindo o tempo de incubação de 30-45 min, remover suavemente o prato contendo as inserções e colocá-lo na cabine de segurança biológica de fluxo laminar.
- Com as duas mãos e mantendo a tampa prato apertado, gentilmente re-inverter o prato de modo a que o lado inferior das inserções contendo as células ligadas agora voltada para baixo.
- Devagar e com cuidado adicionar 2 ml (1 ml de 3 de poro insere para evitar migratiem células de através dos poros da inserção) de meio completo pré-aquecido (ver passo 1.1) em cada poço, de modo que o fundo da inserção está imerso.
- Após a adição de meio de crescimento em todos os poços que contêm inserções, colocar o prato de volta na incubadora humidificada.
- Permitir que as inserções para permanecer intacta na incubadora durante 48 h. Após 48 horas, as células de alimentação por aspiração os 2 ml de meio a partir do fundo do poço, e adição de 2 ml de meio de crescimento fresco.
- Após a adição de meio fresco para o fundo do poço, semente de 1 ml da segunda suspensão população de células (~ 250000 células / ml) no lado de topo do inserto, que já possui a primeira população de células em crescimento no lado inferior (por estes experimentos, AG1522 (controlo) ou células cancerosas (experimentais) foram semeadas sobre o topo das inserções, que já têm células AG1522, destinado a tornar-se FAC, crescendo sobre o lado inferior das inserções). Coloque o prato de volta para a incubadora umidificada.
NOTA: Se o trabalhoção com as células que não aderem bem ao fundo da inserção, estas células podem ser cultivadas em alternativa, no lado de topo do inserto. - Alterar o meio a 24, 72, e 96 horas após a sementeira da segunda população de células sobre o lado de topo do inserto por aspiração do meio a partir da parte superior do inserto e da parte inferior do poço. Adicionar cuidadosamente 1 ml de meio fresco para o lado de topo do inserto e 2 ml para o fundo do poço. Permitir que as duas populações de células que permanecem na co-cultura de ambos os lados da membrana microporosa permeável ao inserto para 120 h.
3. Coleta de Células de Inserção por tripsinização
NOTA: Para além da facilidade de obtenção de populações de células enriquecidas, o modelo TME inserção também permite a tratamentos experimentais semelhantes (por exemplo, a incubação com substâncias químicas, a exposição a condições de oxigénio que estão acima ou abaixo da atmosfera ambiente, tratamento com radiação ionizante, etc.) como outros testes in vitro (por exemplo, em imuno-detecção in situ, transferência de Western) ou propagadas para experiências subsequentes 36.
- Para recolher as células, remover a inserção a partir do meio de crescimento e colocá-lo em uma placa de cultura de células de 35 mm contendo 1 ml de PBS. Lave o fundo e lados superiores das 1x inserção com 1 ml PBS.
- Remover o PBS e adicionar 200 mL de 0,25% (vol / vol) de tripsina com EDTA 2,21 mM, pré-aquecida até à TA.
- Se a recolha das células cultivadas no lado inferior da peça inserta, colocar a solução de tripsina no prato de 35 mm e coloque suavemente a parte inferior do inserto para dentro da solução de tripsina durante 2 min à temperatura ambiente.
- Se a célula de recolhas cultivadas no lado de topo do inserto, colocar o inserto em um prato de 35 mm e adicionar a solução de tripsina para a parte superior do inserto e incubar durante 2 minutos à temperatura ambiente.
- Extingue-se a actividade da tripsina por adição de 800 ul de meio de crescimento completo.
- Se recolher as células cultivadas na parte inferior da peça inserta, adicionar ao meio de crescimento para a milímetros prato de 35 e recolher as células por pipetagem suave ou 1 ml de suspensão de células sobre a superfície da pastilha de 10x, com a inserção ser realizada a uma ligeira ângulo, de tal modo que a suspensão de células recolhe dentro do prato.
- Se recolher as células a partir do lado de topo do inserto, adicionar ao meio de crescimento para o lado de cima e os gentilmente pipeta de 1 ml de suspensão de células sobre a superfície da pastilha de 10x.
4. Caracterização da Pureza celular por citometria de fluxo
NOTA: Para caracterizar a capacidade dos insertos de membrana microporosas permeáveis para manter a pureza do tele duas populações de células (isto é, superior e inferior) para um máximo de 120 horas, secções 1-3 foram realizados, com proteína fluorescente verde (GFP) tagged células MDA-MB-231 de serem plaqueadas no lado de topo do inserto, e AG1522 células não-marcadas com GFP de serem plaqueadas no lado inferior de 0,4 μm-, 1 μm-, ou 3 um inserções de poros.
- Uma vez que as células a partir do lado inferior do inserto foram recolhidos (procedimento descrito no ponto 3), sedimentar a suspensão de células por centrifugação (500 g, 30 seg).
- Remover o sobrenadante e suspender o grânulo celular em 400 ul de Hanks Solução Salina Equilibrada (HBSS) suplementada com 1% (vol / vol) de FBS.
- Realizar a análise por citometria de fluxo num citómetro equipado com um laser de 488 nm para excitar GFP e um filtro passa-banda de 530/30 GFP para detectar emissão de fotões 37.
- Para fins de identificação de célula, utilizar populações de células de controlo AG1522 para ajustar para a frente e tensões de dispersão lateral no citómetro de fluxo. Ajustara tensão de canal de GFP para definir o valor autofluorescência celular como o limite de detecção inferior para o sinal de GFP.
- Determinar gating limiar usando células de controlo. Avaliar a pureza de cada população de células com base na presença de células positivas para GFP em comparação com o controlo.
NOTA: uma população pura seria reflexo da ausência de células GPF-positivos detectados.
5. caracterização das células por imunofluorescência in situ
- Seguindo tripsinização de células a partir da inserção (ver secção 3), recolher as células, placa 5 x 10 4 células em 250 � de meio de crescimento (veja o passo 1.1) em lamelas de vidro esterilizados, e permitir que a aderir durante 1 hora numa atmosfera de ar umidificado de 5% (vol / vol) de CO2 a 37 ° C incubadora.
- No final da incubação, remover suavemente o prato que contém a lamela e colocá-lo na câmara de segurança biológica de fluxo laminar.
- Adiciona-se cuidadosamente 2 mL de meio completo pré-aquecido (ver etapa1.1) a cada prato, de modo que a lamela está imerso.
- Após a adição de meio de crescimento para todos os pratos contendo lamelas, devolver os pratos a uma atmosfera de ar humidificada de CO 2 a 5% (vol / vol) a 37 ° C numa incubadora durante 48 horas.
- Após a incubação de 48 h, lavar a amostra 3x com PBS e fixar com 4% (p / v) de formaldeído em PBS durante 10 min à TA.
- Lavar 5x com tampão salino Tris (TBS: Tris 50 mM-Cl, pH 7,5, NaCl 150 mM) e, em seguida, permeabilizar com 0,25% (vol / vol) Triton X-100, 0,1% (peso / vol) de saponina durante 5 min a RT.
- Bloquear os locais de ligação com 2% (vol / vol) de soro de cabra normal (NGS), 1% (peso / vol) de albumina de soro bovino (BSA), 0,1% (vol / vol) Triton X-100 em TBS não específica (bloqueando solução) durante 1 h à TA.
- Incubar com anticorpo primário (anti-Caveolina 1 (CAV1), 1: 1000) em solução a 4 ° C durante a noite bloqueando.
- Lavar anticorpos primários não ligados (3x, 5 min / lavagem) com 0,2% de NGS (vol / vol), 1% de BSA (p / v), 0,1% (VOl / vol) Triton X-100 em TBS (solução de lavagem).
- Incubar com anticorpo secundário à temperatura ambiente por 1 hora em solução de bloqueio (ver secção 5.4).
- Lavar anticorpo secundário não ligado (3x, 5 min / lavagem) com solução de lavagem (veja o passo 5.6).
- Mount lamelas em um slide com um meio de montagem anti-fade contendo 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), e selar com unha polonês.
- Observar células usando um objectivo ampliação óleo 63X em um microscópio invertido equipado com uma fonte de luz externa para a excitação de fluorescência, e capturar imagens usando uma câmera digital anexada para análise posterior.
6. caracterização de células por Western Blot
NOTA: O procedimento Western blot é descrito em outro lugar 38. Um breve resumo é descrito aqui:
- Seguindo descolamento das células a partir da inserção através de tripsinização (ver secção 3), sedimentar a suspensão de células por centrifugação (500 g, 30 seg).
- Remover o sobrenadante e suspender as 2x pellet celular com 100 mL PBS.
- Remover as células do sobrenadante e lise em 50 ul de ensaio de radioimunoprecipitação modificado (RIPA) de tampão (Tris pH 7,5 50 mM, NaCl 150 mM, NP40 a 1% (vol / vol), desoxicolato de sódio mono-hidratado (DOC) 0,5% (vol / vol), dodecilsulfato de sódio (SDS) a 0,1% (vol / vol)), que contém a protease e o inibidor de fosfatase coquetel.
- Incubar durante 20 min em gelo e centrifugar a 19000 g durante 15 min a 4 ° C.
- Determinar a concentração de proteínas no sobrenadante utilizando um ensaio de proteína de densidade óptica, compatível com os detergentes no tampão RIPA.
- proteínas separadas por electroforese em dodecil sulfato de sódio em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e electroblot sobre uma membrana de nitrocelulose de 0,2 um.
- Incubar as membranas em TBS contendo 0,1% (vol / vol) de Tween-20 (TBST) e 4% (peso / volume) de leite desnatado (solução de bloqueamento) durante 60 min e reagir com o anticorpo primário a 4 ° C durante a noite (anti-CAV1, 1: 1000).
- Lavar 3x membrana com TBST à temperatura ambiente (5 min / lavagem).
- Incubar as membranas durante 30 min em solução de bloqueio contendo um anticorpo secundário anti-ratinho conjugado com peroxidase de rábano (HRP) (1: 5000).
- Lavar 3x membrana com TBST à temperatura ambiente (5 min / lavagem).
- Visualizar os produtos de reacção por quimiluminescência utilizando um sistema de detecção de Western blot.
7. Caracterização de intercelular comunicação por citometria de fluxo
NOTA: Para caracterizar a capacidade de adaptação da membrana microporosa permeável insere a examinar diferentes modos de comunicação intercelular (por exemplo, fatores secretados, junções da diferença). Secções 1-2.12 foram realizados com células AG1522 não fluorescentes de serem plaqueadas no lado inferior de 0,4 μm-, 1 μm-, ou inserções 3 uM de poros.
- Cultura não marcado AG1522 células num prato de 35 mm a 90% de confluência utilizando meio descrito na secção 1.1.
- Rcélulas InSe 1x com 1 ml de HBSS.
- células de carga com calceína AM por incubação das células em HBSS contendo 30 mM de calceína AM.
- Incubar durante 15 min numa atmosfera de ar humidificada de CO 2 a 5% (vol / vol) a 37 ° C.
- Lavar as células 2x com 1 ml de HBSS.
- Tripsinizar as células por adição de uma solução de 200 mL de 0,25% (vol / vol) de tripsina com EDTA 2,21 mM, durante 2 min à temperatura ambiente.
- Extingue-se a actividade da tripsina por adição de 800 uL de meio completo contendo 12,5% (vol / vol) de FBS.
- Traga células em suspensão por pipetagem repetida.
- Determinar a concentração de células utilizando um hemocitómetro ou contador electrónico e placa 250.000 células carregadas com calceína AM para o lado de cima de inserções que já têm células AG1522 crescimento no lado inferior.
- Incubar as inserções em uma atmosfera de ar humidificada de 5% de CO2 a 37 ° C durante 6 h.
- Após 6 horas, recolher as células a partir do lado inferior das inserções, tal como descritona seção 3.
- Agregar a suspensão de células por centrifugação (500 g, 30 seg).
- Remover o sobrenadante e suspender o grânulo celular em 400 ul de HBSS suplementado com 1% (vol / vol) de FBS.
- Analisar as células num citómetro equipado com um laser e filtro capaz de excitar e detectar a emissão de calceína (496 nm e 516 nm, respectivamente), por protocolo do fabricante.
- Para fins de identificação de célula, utilizar uma população de células não coradas AG1522 controlo para ajustar para a frente e tensões de dispersão lateral no citómetro de fluxo. Ajustar a tensão de calceína canal para definir o valor autofluorescência celular como o limite de detecção inferior para o sinal de calceína.
- Determinar o valor-limite superior usando células controle Calce�a-carregados. Avaliar comunicação para cada inserção de células com base na presença de calceína células positivas versus controlo.
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Representative Results
Aqui nós adaptamos uma inserção de membrana microporosa permeável ao desenvolvimento de um sistema de co-cultura de células heterotípica in vitro que simula o microambiente do tumor in vivo (Figura 1). Este sistema permite a duas diferentes populações de células a serem cultivadas em ambos os lados da membrana porosa da inserção por longos períodos de tempo (até 120 horas, em nosso uso). É importante salientar o sistema é capaz de manter a pureza das populações de células, como determinado por plaqueamento MDA MB-231 células marcadas com GFP na parte superior de 0,4-, 1-, ou 3-m inserções de poros e permitindo-lhes crescer em co-cultura com células AG1522 crescente no lado inferior da peça inserta, durante 120 h. Após este tempo, as células foram recolhidas a partir do lado inferior do inserto e analisadas por citometria de fluxo para identificar a presença de quaisquer células positivas para GFP MDA-MB-231, que indicam uma perda de pureza população de células. A análise revelou 99,9% e 99,8% pure populações de 0,4 e 1 mm inserções de poros, respectivamente; No entanto, a inserção com 3 uM poros era incapaz de manter a separação das populações de células, como os poros eram suficientemente grandes para permitir que um número significativo de células MDA-MB-231 positivas para GFP para migrar através da membrana (Figura 2) .
Importante, através de imunofluorescência in situ e análise de Western blot, fomos capazes de demonstrar a capacidade deste sistema para gerar eficazmente fibroblastos associados ao cancro do normal diplóides humanas fibroblastos AG1522 a seguir à co-cultura com-231 MDA-MB de células de cancro da mama, como determinado pela expressão reduzida de Caveolina-1, um bem estabelecida CAF biomarcador 39-42 (Figura 3). CAV1 é uma proteína que forma o andaime caveolae no domínio jangada lipídica da membrana plasmática, o qual está envolvido em vários processos celulares 43. No Western blot, Foram observadas duas bandas distintas, o que corresponde às isoformas a e p de CAV1 44. Infelizmente, pouco se sabe sobre a diferença (s) entre as isoformas, especialmente seu papel como biomarcadores da CAF.
Também demonstraram a aptidão do sistema de co-cultura de inserção para modular a comunicação intercelular entre as duas populações de células heterotípicas (Figura 4). Não marcado, gap junction-AG1522 fibroblastos diplóides humanos competentes foram cultivadas até à confluência, no lado inferior da peça inserta. Um segundo conjunto de células AG1522 foram carregadas com calceína AM, um fluorescente GAP-permeável junção corante verde, e plaqueadas no lado de topo do inserto. As duas populações de células foram autorizados a comunicar, durante 6 h, e, em seguida, as células no lado inferior do inserto foram isolados e analisados por citometria de fluxo. células calceína-positiva a partir do lado inferior do inserto reflector seria de células que eslecido acoplamento gap-juncional através dos poros de inserção. O tamanho do poro de 0,4 uM inserir a formação de junções de hiato funcionais limitada entre as células em crescimento em ambos os lados do inserto, restringindo desse modo a comunicação de factores segregados (por exemplo, factores de crescimento, microvesículas, etc.). Alternativamente, o tamanho dos 1 uM e 3 | iM poros são aparentemente suficientemente grande para permitir o acoplamento funcional das células através de junções de hiato. Portanto, modulando o tamanho dos poros, pode-se começar a entender o papel diversificada (s) que os diferentes modos de comunicação intercelular pode ter no desenvolvimento TME e evolução.
Figura 1:. Permeável membrana microporosa Inserir Esquema Modelo (a) diplóides fibroblastos AG1522 humanos aparentemente normal (células de baixa passagem) destinado a se tornar FAC são semeados em invertidoinserções permeáveis microporosos constituídos por uma membrana de poliéster com uma espessura de 10 um, com 0,4 uM, 1 uM, 3 uM ou poros. Após fixação, as inserções são invertidos e colocados em poços de placas e cultivadas até à confluência. (B) As células cancerosas e fibroblastos de controlo são cultivadas separadamente em frascos antes de serem semeadas no lado de topo das inserções com fibroblastos em crescimento intimamente no lado inferior. (C) As células co-cultivadas são alimentadas a cada dois dias e mantidos durante o tempo desejado. (D) nos respectivos tempos após a co-cultura e / ou de tratamentos experimentais, os FAC (lado inferior das inserções) e / ou as células cancerosas (lado de cima da inserção) são cuidadosamente isolado por tripsinização, produzindo populações de células altamente puros, que pode ser usado para análise de pontos de extremidade ou propagadas para estudos posteriores. por favor clique aquipara ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:. Geração de populações de células altamente enriquecido fluxo representativas citometria resultados demonstram a capacidade do inserto para manter altamente enriquecido, populações de células heterotípicas ainda independentes a seguir à co-cultura de 120 horas. (A) células AG1522 colhidas a partir do lado inferior do inserto de poro 0,4 um mostram 99,9% da população de estar livre de células marcadas com GFP MDA-MB-231 crescendo no lado de topo do inserto (quadrante inferior esquerdo). (B) células AG1522 colhidas a partir do lado inferior do inserto de poro de 1 uM também mostram 99,8% população enriquecida (quadrante inferior esquerdo). (C) células AG1522 colhidas a partir do lado inferior do inserto de poro de 3 um revelam que apenas 68,5% da população é livre de células marcadas com GFP (quadrante inferior esquerdo), Indicando que um grande número de células MDA-MB-231 GFP positivas foram capazes de migrar através dos 3 mm poros. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3:. Generation of Cancer-associados fibroblastos expressão reduzida de CAV1 é um biomarcador consistente e confiável CAF. (A) As imagens microscópicas de imunofluorescência em situ (barra de escala = 20 mm), e (b) análise de Western blot de CAV1 em células AG1522 que estava em co-cultura com células AG1522 (controle) (à esquerda), ou com MDA células cancerosas da mama MB-231 (à direita) para 120 horas. A coloração com Ponceau S Red foi usado para controle de carga e para determinar a mudança vezes no Western blot. Os resultados são representativos detrês experiências separadas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4:. Modulação da Intercelular comunicação de Inserir tamanho de poro de fluxo análises de citometria de demonstrar a capacidade de adaptação do modelo microporosa permeável TME inserção membrana para seleccionar os diferentes modos de comunicação intercelular entre calceína AM carregados células AG1522 crescente na parte superior da peça inserta e de controlo AG1522 As células que crescem no seu lado inferior. (A) As células colhidas a partir do lado inferior da poro 0,4 um inserções mostram níveis muito baixos de células calceína-positiva (0,57%), que indica uma comunicação GAP-junção limitada através dos poros de inserção. (B) As células colhidas a partir do lado inferior de 1 uM inserções de poros mostram hníveis de grau superior de células calceína-positiva (9,98%), indicando a formação de junções de hiato funcionais. (C) As células colhidas a partir do lado inferior de 3 mm inserções de poros mostram altos níveis de células calceína-positivos (87,8%), indicando extensa comunicação gap-juncional. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo aqui descrito é um método simples, adaptável no procedimento in vitro (Figura 1) que utiliza uma inserção de membrana microporosa permeável para gerar populações de células individuais altamente enriquecidas a partir de uma co-cultura de células heterotípicas. Significativamente, o modelo é apropriado para a investigação de vários modos de comunicação intercelular. Os passos críticos incluem seleccionando a inserção de tamanho de poro apropriado para o interesse experimental específico (s), semeando a primeira população de células no lado inferior do inserto em meio suplementado com 50% de FBS, sementeira da segunda população de células no lado superior da inserir, e a co-cultura das duas populações distintas de células por um período adequado de tempo. Mostra-se que este sistema seja capaz de mimetizar várias características in vivo, proporcionando assim uma maior oportunidade para compreender o molecular, fenotípica, e as alterações que ocorrem durante a evolução latentes TME precoce, o que resolve uma grande disadvantage de diversos modelos in vitro estabelecidos TME (Figura 2).
O modelo pode ser facilmente modificado para permitir a investigação de vários aspectos das interacções célula-célula em desenvolvimento do cancro de estroma e evolução TME (Figura 4). Enquanto a poro 0,4 um inserto permite acoplamento íntimo entre as duas populações de células 45, que restringe significativamente a formação de junções de hiato funcionais entre células cultivadas em ambos os lados da membrana de inserção (Figura 4). Portanto, facilitando assim a investigação do papel de factores difusíveis (por exemplo, factores de crescimento) e / ou vesículas extracelulares (por exemplo, os exossomas), que medeiam o desenvolvimento CAF 46-48. Em alternativa, os 1 uM e 3 | iM poros são suficientemente grandes para permitir a formação de junções de hiato funcionais, permitindo, assim, o estudo de ambos metabólica acoplamento directo através de canais de junções e de comunicação indirecta atravésfactores segregados difusíveis. No entanto, como a inserção de poro de 3 um permite a migração de células através dos poros (ver Figura 2), que não mantém a pureza de duas populações de células separadas heterotípicas durante tempos prolongados de co-cultura (por ex., 120 h). Considerando que o presente modelo permite o estudo de vários aspectos da TME, que é limitada na sua capacidade para explicar muitas das interacções fisiológicas complexas que ocorrem dentro de uma TME in vivo (por exemplo, trocas de fluidos vasculares, etc).
Compreender os primeiros eventos de activação cancro de estroma e ao desenvolvimento do TME é importante na elucidação dos passos implicados na iniciação e progressão do tumor primário, bem como metástase. É agora amplamente aceito que o estroma câncer, especialmente FAC, possuem um papel fundamental no apoio a carcinogênese (revisto em 49). Isto levou ao desenvolvimento de muitos modelos in vitro 2D e 3D, objectivoed em estratégias de iluminação para direcionar os primeiros mecanismos que contribuem para estromal-ativação e progressão tumoral. Infelizmente, muitos destes modelos são limitados pela sua incapacidade para permitir o isolamento de populações de células individuais, sem demorado e estressante processamento, para um estudo mais aprofundado. Assim, este protocolo prevê uma adição significativa para o campo da pesquisa TME, uma vez que combina in vivo como propriedades, com a capacidade de obter de forma fácil e rápida populações de células altamente enriquecido ou puro para análise imediata ou propagação para estudos posteriores.
Uma vez que a técnica é dominada, o modelo TME pastilha pode ser utilizada para investigar diversas interacções bi-direccionais TME (por exemplo, cancro endotelial, cancro de células imunitárias, etc). Além disso, a complexidade do processo de co-cultura pode ser reforçada por colocação de uma população mista de células de um lado da peça inserta e uma única população no lado alternativo, assim, obtering um mais in vivo como TME complexidade população de células. No entanto, recomenda-se cautela na escolha de um insert com o poro de tamanho adequado, se utilizando células de diâmetro especialmente pequenas (por exemplo, linfócitos humanos com um diâmetro de ~ 7 mm 50), como eles podem ser capazes de migrar através dos poros menores ( por exemplo, 0,4 uM ou 1 uM). Antes da co-cultura, as experiências de migração (Figura 2) pode ser garantido para garantir a manutenção de populações de células puras todo experiências de co-cultura prolongados.
Este modelo também é favorável para investigar os efeitos de vários desafios terapêuticos (por exemplo, radiação ionizante, agentes quimioterapêuticos, hipertermia) e alterações fisiológicas (por exemplo, hipoxia, hiperoxia, inibidores biológicos) em populações de células mistas que são acoplados através da inserção da membrana microporosa permeável. O modelo demonstrou a sua capacidade para gerar sucesso FAC, identified por um biomarcador amplamente aceite CAF (ou seja, a regulação negativa de CAV1) 39-42 (Figura 3), o qual foi ainda reduzida em 55% quando o sistema de inserção foi mantida em in vivo como PO 2 (7 mm Hg; 0,5% o 2) 51, destacando a adaptabilidade do modelo para vários desenhos e das condições experimentais (dados não apresentados). Em suma, este modelo fornece uma abordagem simplificada e uma oportunidade para modular fatores temporais e externos, a fim de obter uma percepção mais profunda ativação câncer estroma, a evolução inicial do TME e respostas celulares a agentes terapêuticos ou ambientais.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses conflitantes ou conflitantes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Cell Culture | |||
| AG01522 (i.e., AG1522) human diploid fibroblast | Coriell | 107661 | Passage 8-13 |
| MDA-MB-231-luc-D3H1 breast adenocarcinoma cell line | PerkinElmer | 119261 | Parental line: ATCC (#HTB-26) |
| MDA-MB-231/GFP breast adenocarcinoma cell line | Cell Biolabs | AKR-201 | |
| Eagle's minimal essential medium (MEM) | Corning Cellgro | 15-010-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified | Sigma | F6178-500mL | |
| Corning Glutagro Supplement (200 mM L-alanyl-L-glutamine) | Corning Cellgro | 25-015-Cl | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100x | Corning Cellgro | 30-002-Cl | |
| Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (0.4 μm pore) | Costar | 3450 | |
| Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (1 μm pore) | Greiner bio-one | 657610 | |
| Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (3 μm pore) | Costar | 3452 | |
| 6-well Culture Plate | Greiner Bio-One Cellstar | 657160-01 | |
| 75 cm2 cell culture flask | CellStar | 658 170 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning Cellgro | 21-040-CV | without calcium & magnesium |
| 0.25% (vol/vol) Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x | Corning Cellgro | 25-053-Cl | |
| 15 ml Centrifuge Tube | CellTreat | 229411 | |
| 35 mm x 10 mm Cell Culture Dish | Greiner bio-one | 627 160 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Immunofluorescent Microscopy | |||
| Mouse anti-Caveolin 1 | BD Transduction Laboratories | 610406 | In situ Immunofluorescence - 1:5,000 |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-11029 | In situ Immunofluorescence - 1:2,000 |
| Bovine Serum Albumin - Fraction V | Rockland | BSA-50 | Immunoglobulin and protease free |
| 16% (wt/vol) Formaldehyde Solution | ThermoFisher Scientific | 28908 | Dilute to 4% with 1x PBS |
| Premium Cover Glass (22 mm x 22 mm No.1) | Fisher | 12548B | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-50ML | |
| SlowFade Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | S36938 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Flow Cytometric Analysis | |||
| Calcein, AM | Molecular Probes | C3100MP | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-076 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Western Blot Analysis | |||
| Mouse anti-Caveolin 1 | BD Transduction Laboratories | 610406 | Western Blot - 1:1,000 |
| Tween-20 | BioRad | 170-6531 | |
| Nitrocellulose Membrane (0.2 μm) | BioRad | 162-0112 | |
| Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| BioRad DC Protein Assay | BioRad | 500-0116 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | BioRad | 161-0302 | |
| Sodium deoxycholate monohydrate (DOC) | Sigma | D5670 | |
| IGEPAL CA-630 (NP40) | Sigma | I8896 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | BioRad | 161-0158 |
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