Abstract
La comprensión de las interacciones tempranas heterotípicos entre las células cancerosas y el estroma no canceroso que rodea es importante en el esclarecimiento de los acontecimientos que conducen a la activación del estroma y el establecimiento del microambiente tumoral (TME). Varios in vitro y en modelos in vivo de la TME se han desarrollado; Sin embargo, en general, estos modelos no permiten fácilmente el aislamiento de poblaciones de células individuales, en condiciones no perturbar, para su posterior estudio. Para evitar esta dificultad, se ha empleado un modelo TME in vitro usando un sustrato de crecimiento de las células que consta de un inserto de membrana microporosa permeable que permite la generación sencilla de poblaciones de células altamente enriquecido crecido íntimamente, sin embargo, por separado, a cada lado de la membrana de la pieza de inserción para co extendida -Cultura veces. Mediante el uso de este modelo, que somos capaces de generar fibroblastos enormemente enriquecido asociada al cáncer (CAF) las poblaciones de fibroblastos humanos diploides normales siguienteco-cultivo (120 horas) con células de carcinoma de mama humano altamente metastásicas, sin el uso de marcado fluorescente y / o la clasificación de células. Además, mediante la modulación del tamaño de poro de la inserción, se puede controlar para el modo de comunicación intercelular (por ejemplo, comunicación brecha cruce, factores secretados) entre las dos poblaciones de células heterotípicos, que permite la investigación de los mecanismos subyacentes al desarrollo de la TME, incluyendo el papel de la permeabilidad brecha de la salida. Este modelo sirve como una herramienta valiosa en la mejora de la comprensión de los eventos iniciales que conducen a la iniciación del cáncer de estroma, la evolución temprana de la TME, y el efecto de modulación del estroma en las respuestas de las células cancerosas a los agentes terapéuticos.
Introduction
El microambiente tumoral (TME) es un sistema altamente complejo compuesto de células de carcinoma que coexisten y evolucionar junto estroma huésped. Este componente estromal típicamente consiste en fibroblastos, miofibroblastos, células endoteliales, varios componentes inmunológicos, así como una matriz extracelular 1. Un constituyente importante, a menudo la mayoría de este estroma, son fibroblastos activados, refiere con frecuencia como fibroblastos asociados al cáncer o fibroblastos de carcinoma asociada (CAF) 2,3. A diferencia de los fibroblastos normales, no activado, CAF contribuyen a la iniciación del tumor, la progresión, la angiogénesis, invasión, metástasis y la recurrencia 4-11 en una amplia variedad de carcinomas, incluyendo cáncer de mama, próstata, pulmón, páncreas, piel, colon, esófago, y ovario 5,6,12-17. Sin embargo, la naturaleza exacta de la contribución de CAF en toda la patogénesis del cáncer sigue siendo mal definidos. Por otra parte, la evidencia clínica ha demostrado un valor pronóstico de la CAF, Correlacionando su presencia a los tumores malignos de alto grado, los fracasos terapéuticos, y pobres en general 10,18,19 pronóstico.
Claramente, la mejora de nuestra comprensión de los sucesos iniciadores en el desarrollo de la CAF, así como las comunicaciones intercelulares que median su papel dentro de la TME, puede proporcionar emocionantes nuevas dianas terapéuticas y estrategias mejoradas que podrían mejorar los resultados del paciente. Hacia este objetivo, varios en vivo y en modelos in vitro han sido desarrollados. Si bien los métodos in vivo son más un reflejo de TME de los pacientes, poseen limitaciones, incluyendo la inmensa complejidad y heterogeneidad tanto dentro como entre los tumores. Por otra parte, las muestras tumorales procedentes de sujetos humanos a menudo representan muy desarrollados TME y no permiten una comprensión de los sucesos iniciadores TME. los estudios en animales experimentales ofrecen algunas ventajas, sin embargo, la generalización de los datos en animales a los seres humanos debe hacerse con precaución debido a las diferencias en physiology entre humanos y animales tales como roedores (por ejemplo, la química de tiol 20, la tasa metabólica 21, tolerancia al estrés 22, etc.). Además, a diferencia de la población humana, que es genéticamente heterogénea en la naturaleza, los animales de laboratorio son típicamente criados para la homogeneidad. Además, a menudo es difícil de examinar variaciones fisiológicas transitorios y los cambios del fenotipo de células, así como para el control de los parámetros experimentales específicos utilizando animales tales como roedores. Por lo tanto, 2- in vitro y modelos de cultivo de tejidos de 3 dimensiones (2D y 3D) son frecuentemente utilizados para avanzar en el conocimiento básico del desarrollo de TME. A pesar de su falta de una representación exacta de la complejidad de los sistemas in vivo, estos modelos ofrecen ventajas que facilitan en gran medida las investigaciones mecanicistas. Modelos in vitro permiten un análisis más simplificado, enfocado, y rentable de la TME, por lo que estadísticamente significativa los datos pueden ser generados encélulas libres de variaciones sistémicas que surgen en los animales.
Hay varias variedades de sistemas in vitro. Los dos modelos TME in vitro utilizados más comúnmente consisten en monocapa mixta o cultivos celulares esferoides. Ambos métodos de cultivo son ventajosas para estudios básicos de interacciones intercelulares (por ejemplo, células normales con células tumorales) y para el análisis de varios cambios de fenotipo celular específicos TME (por ejemplo, la aparición de los fibroblastos asociados con el cáncer de fibroblastos normales). Además, los esferoides son capaces de crear una estructura similar a un tejido más reflexiva del TME, y pueden ser representativos de la heterogeneidad del tumor 23. Sin embargo esferoides menudo producen muy diversos gradientes de tensión de oxígeno a través de capas, que pueden complicar conclusiones experimentales 24. Desafortunadamente, ambos modelos son extremadamente limitados en su capacidad para aislar poblaciones de células puras para su posterior caracterización y estudio siguiente co-cultura. Para ello, sería necesario al menos un tipo de célula que ser marcado con fluorescencia-o etiquetados con un fabricante de identificación, y luego someter el co-cultivo mixto a la extensa procesamiento y clasificación de células para separar las poblaciones de células. Mientras que un clasificador de células es capaz de aislar una población de células en lugar puro, uno debe ser consciente de estrés celular y la contaminación microbiana riesgos potenciales 25.
Para facilitar la comprensión de la comunicación intercelular, grandes esfuerzos se han dedicado a desarrollar y optimizar en sistemas in vitro que imitan estrechamente el entorno in vivo, al tiempo que permite un enfoque simplificado. Una de estas herramientas es la inserción microporosa permeable, un sustrato de membrana que fue desarrollado por primera vez en 1953 26 y posteriormente adaptado para diversas aplicaciones y estudios (por ejemplo, la polaridad celular 27, 28 endocitosis, transporte de drogas 29, el modelado de tejido 30, FERTilization 31, efecto espectador 32,33, etc.). Este sistema permite el crecimiento de las células con anatómica in vivo -como y la diferenciación funcional, así como la expresión de muchos en vivo marcadores 34,35 que no se observó cuando se cultivan en recipientes de plástico impermeable. Además, la membrana porosa extremadamente delgada (10 micras de espesor) permite la rápida difusión de las moléculas y los tiempos de equilibrio, que simula el entorno in vivo y permite el funcionamiento celular independiente en los dominios de células apical y basolateral. Una ventaja adicional de la utilidad de la inserción como un sistema de TME es su separación física de dos poblaciones de células cultivadas heterotípicos a cada lado de la membrana en las mismas condiciones ambientales, mientras que el mantenimiento de los diversos modos de comunicación intercelular a través de los poros de la membrana. Aunque físicamente separados, las dos poblaciones de células se acoplan metabólicamente a través de elementos secretadas y, como dedescribe aquí, también a través de los canales de gap-unión. Además, mediante el mantenimiento de las piezas de inserción en la tensión de oxígeno in vivo parcial (PO 2), el modelo reduce las complicaciones de oxígeno y químicas gradientes observados en otros sistemas. Más bien, se aumenta la comprensión de los mecanismos naturales que controlan el TME. En particular, las dos poblaciones de células pueden ser fácilmente aislados con alta pureza, sin el etiquetado fluorescente y / o la clasificación de células después de períodos prolongados de co-cultivo.
Aquí se describe un protocolo TME in vitro que consiste en células de carcinoma de mama humano y fibroblastos humanos cultivados, respectivamente, a ambos lados de un inserto de membrana microporosa permeable, pero todavía en continua comunicación bidireccional a través de los poros de la membrana. Se demuestra que mediante el uso de membranas con diferentes tamaños de poro, la contribución de un tipo específico de la comunicación intercelular (por ejemplo, factores secretados frente a uniones gap) para el desarrollode la TME pueden ser investigados.
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Protocol
1. Preparación de medios de cultivo y las células
- Preparar 500 ml de medio de Eagle esencial mínimo suplementado con 12,5% (vol / vol) de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS), 2 mM L-alanil-L-glutamina, y 100 unidades de penicilina y 100 mg de estreptomicina por ml.
NOTA: El medio de crecimiento y suplemento (s) se puede cambiar fácilmente para los requisitos de crecimiento de otras cepas de células o líneas celulares. - Preparar 70 l de medio de cultivo celular para cada pieza de inserción (6 pocillos formato de inserto): medio esencial mínimo de Eagle suplementado con 50% (vol / vol) 2 mM L-alanil-L-glutamina FBS, inactivado por calor, y 100 unidades de la penicilina y 100 mg de estreptomicina por ml.
NOTA: El medio se suplementó con 50% de FBS para facilitar la unión de células a la parte inferior (es decir, inferior) de la inserción. El medio de crecimiento y suplemento (s) se pueden intercambiar fácilmente para los requisitos de crecimiento de otras cepas de células o líneas celulares. - Preparar una suspensión celular de las células destinadas a ser plateado en el lado inferior de la pieza de inserción.
NOTA: En este caso, los resultados se obtuvieron usando AG1522 fibroblastos humanos normales cultivadas en 75 cm 2 frascos de cultivo de células, y por lo tanto estas células serán el foco de la descripción de la preparación de la suspensión celular. - Para recoger las células, eliminar el medio de crecimiento y se lavan las células 2x monocapa con 5 ml de 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Retire el PBS y se extendió 1 ml de 0,25% (vol / vol) con tripsina 2,21 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), pre-calentó a temperatura ambiente (RT) sobre las células durante 2 min a TA (temperatura ambiente).
- Se detiene la actividad de la tripsina con 9 ml de medio de crecimiento completo (preparado en el paso 1.1) y recoger las células pipeteando suavemente la suspensión celular sobre la superficie del matraz de 10x.
- Determinar la concentración de células utilizando un hemocitómetro o un contador electrónico y pipetear el volumen de suspensión celular que provide 250.000 células por inserto en un tubo de centrífuga de 15 ml estéril.
- Se precipitan la suspensión de células por centrifugación (800 xg, 2 min). Suspender el sedimento de células con medio de crecimiento (preparado en el paso 1.2) para crear una concentración de 250.000 células por 70 microlitros.
NOTA: Como el cultivo de células en insertos de membrana microporosa permeable se basa en sustratos 2D, la siembra de células se lleva a cabo de manera similar, excepto que las células deben suspenderse inicialmente en medio que contiene 50% (vol / vol) de FBS para facilitar la unión.
2. Preparación de insertos
NOTA: Para garantizar condiciones estériles, el trabajo en una cabina de seguridad biológica de flujo laminar dedicada al cultivo celular.
- Seleccione insertos con un tamaño de poro de membrana de 0,4 micras, 1 micras, o 3 micras (determinado por el interés (s) experimental, ya que el tamaño de poro se pueden utilizar para explorar el papel de los diferentes modos de comunicación intercelular).
NOTA: El poro de 0,4 micras es Small suficiente para limitar la formación de uniones gap funcionales entre células a cada lado de la membrana de inserción y se puede utilizar para estudiar la comunicación intercelular por factores secretados. Considerando que, los 1 micras y 3 micras poros son lo suficientemente grandes para permitir la formación de uniones gap funcionales y se puede utilizar para estudiar la comunicación intercelular por ambas uniones gap y factores secretados. - Retirar los cartuchos individuales del embalaje y colocar en una fuente de múltiples pocillos de igual tamaño.
NOTA: Las inserciones están disponibles con diferentes áreas de superficie de membrana para adaptarse a las necesidades específicas de la aplicación (por ejemplo, de 6 pocillos, inserciones de 12 pocillos y 24 pocillos.). A continuación, los resultados se obtuvieron usando el inserto de 6 pocillos, y por lo tanto será el tema central de la descripción del modelo. - Cubra el plato, que contiene los insertos con la tapa de la placa. Sosteniendo el plato de múltiples pocillos con las dos manos, invierta suavemente el plato de tal manera que las partes inferiores de inserción (es decir, inferior) están orientados hacia arriba.
- Retire THe fondo de la placa de múltiples pocillos, dejando al descubierto el lado inferior de los insertos. Trabajar con un inserto a la vez, utilizar un par de fórceps estéril y coloque un lado del inserto en su lugar. Con la mano libre, utilizar una pipeta con una punta de boca ancha para dibujar 70 l de la suspensión celular (preparado en los pasos 1.3-1.8), que contiene 250.000 células.
- Para la placa de las células, coloque la punta de la pipeta suavemente en el centro de la membrana de la inserción, y poco a poco los pipeta 70 l de suspensión celular mientras se mueve lentamente la punta de pipeta alrededor de la superficie de la membrana. Tenga cuidado de no extender la punta de la pipeta y la suspensión celular hasta el borde de la pieza de inserción.
NOTA: Al tocar el borde de la pieza de inserción podría resultar en la pérdida de tensión capilar de la suspensión celular que conduce a las células que se secan a cabo durante la unión. - Repita para las inserciones restantes, con el cuidado que se ejerce no trabajar directamente sobre los insertos expuestos para evitar una posible contaminación microbiana.
- volver suavemente la de múltiples pocillosfondo del plato para cubrir las inserciones. Mantener el plato con inserciones invertida, se incuban en una atmósfera de aire humidificado de 5% (vol / vol) de CO2 a 37 ° C durante 30-45 minutos.
NOTA: Si la suspensión de células en los contactos inserte la parte inferior del pozo, levante con cuidado la parte inferior del plato y el descanso en el borde de la parte superior del plato, de manera que forme un ángulo leve y crea una mayor separación entre la superficie del plato y el lado inferior de las piezas de inserción (donde se siembran las células). Esto evitará que las células se adhieran a la superficie de los pocillos en lugar de la inserción. - Tras el tiempo de incubación de 30-45 minutos, retire suavemente el plato que contiene las inserciones y colocarlo en la cabina de seguridad biológica de flujo laminar.
- Con dos manos y mantener la tapa de la placa apretado, suavemente volver a invertir el plato de manera que el lado inferior de los insertos que contienen las células unidas se enfrenta ahora hacia abajo.
- Poco a poco y con cuidado añadir 2 ml (1 ml de 3 micras de poro inserta para evitar migratien las células a través de los poros de inserción) de medio completo precalentado (véase el paso 1.1) a cada pocillo, de modo que se sumerge la parte inferior del inserto.
- Después de la adición de medio de crecimiento en todos los pocillos que contienen inserciones, colocar el plato de nuevo en el incubador humidificado.
- Permitir que los insertos reposar sin perturbaciones en la incubadora durante 48 horas. Después de 48 h, alimentar a las células mediante la aspiración de los 2 ml de medio de la parte inferior del pozo y la adición de 2 ml de medio de crecimiento fresco.
- Después de añadir medio fresco a la parte inferior del pozo, semillas de 1 ml de la segunda suspensión población de células (~ 250.000 células / ml) en el lado superior de la pieza, que ya tiene la primera población de células que crecen en el lado inferior (para estos experimentos, las células AG1522 (control) o células cancerosas (experimentales) se colocan en la parte superior de los insertos, que ya tienen células AG1522, destinados a convertirse en los CAF, que crece en el lado inferior de las piezas de inserción). Coloque el plato de nuevo en el incubador humidificado.
NOTA: Si el trabajoing con las células que no se adhieren bien a la parte inferior de la pieza de inserción, estas células pueden ser cultivadas alternativamente en el lado superior del inserto. - Cambiar el medio a las 24, 72, y 96 horas después de la siembra de la segunda población de células en el lado superior del inserto por aspiración el medio de la parte superior de la pieza de inserción y la parte inferior del pozo. agregar suavemente 1 ml de medio fresco a la parte superior de la inserción y 2 ml a la parte inferior del pozo. Permitir que las dos poblaciones de células que permanecen en el co-cultivo a cada lado de la membrana de inserción microporosa permeable para 120 hr.
3. Insertar la recolección de células a partir de tripsinización
NOTA: Además de la facilidad de obtener poblaciones de células enriquecidas, el modelo TME inserto también permite tratamientos experimentales similares (por ejemplo, la incubación con productos químicos, exposición a condiciones de oxígeno que están por encima o por debajo de la atmósfera ambiente, tratamiento con radiación ionizante, etc.) como otra in vitro (por ejemplo, in situ inmuno-detección, transferencia de Western) o propagan para experimentos posteriores 36.
- Para recoger las células, extraiga la tapa del medio de crecimiento y colocarlo en una placa de cultivo celular de 35 mm que contiene 1 ml de PBS. Lavar la parte inferior y los lados superiores de los 1x de inserción con 1 ml de PBS.
- Retire el PBS y añadir 200 l de 0,25% (vol / vol) con tripsina con EDTA 2,21 mM, previamente calentada a RT.
- Si la recogida de las células cultivadas en el lado inferior del inserto, colocar la solución de tripsina en el plato 35 mm y colocar suavemente la parte inferior de la pieza de inserción en la solución de tripsina durante 2 min a TA.
- Si la recogida de la células crecido en el lado superior del inserto, colocar el inserto en un plato de 35 mm y añadir la solución de tripsina a la parte superior de la pieza de inserción y se incuba durante 2 min a TA.
- Se detiene la actividad de la tripsina mediante la adición de 800 l de medio de crecimiento completo.
- Si la recogida de las células cultivadas en la parte inferior de la pieza de inserción, añadir el medio de crecimiento a la placa de 35 mm y recoger las células pipeteando suavemente las 1 ml de suspensión celular sobre la superficie de la pieza de inserción 10 veces, con el inserto se mantiene a una ligera ángulo, de manera que la suspensión de células se recoge en el plato.
- Si la recogida de las células desde el lado superior de la pieza de inserción, añadir el medio de crecimiento en el lado superior y la pipeta suavemente las 1 ml de suspensión celular sobre la superficie de la pieza de inserción 10 veces.
4. Caracterización de la Pureza celular por citometría de flujo
NOTA: para caracterizar la capacidad de los insertos de membrana microporosa permeable para mantener la pureza de tél dos poblaciones de células (es decir, superior e inferior) para un máximo de 120 horas, se realizaron secciones de 1-3, con la proteína verde fluorescente (GFP)-etiquetados células MDA-MB-231 se sembraron en el lado superior de la pieza, y células AG1522 no GFP-etiquetados se sembraron en el lado inferior de 0,4 μm-, 1 μm-, o 3 micras insertos de poros.
- Una vez que las células se recogieron de la parte inferior de la pieza de inserción (procedimiento descrito en la Sección 3), sedimentar la suspensión de células por centrifugación (500 g, 30 sec).
- Eliminar el sobrenadante y suspender el sedimento celular en 400 l de solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) suplementado con 1% (vol / vol) de FBS.
- Realizar análisis de citometría en un citómetro de flujo equipado con un láser de 488 nm para excitar GFP y un filtro de paso de banda de 530/30 para detectar GFP por emisión de fotón 37.
- Para fines de identificación celular, utilice el control de las poblaciones de células AG1522 para ajustar hacia delante y tensiones de dispersión lateral en el citómetro de flujo. Ajustarel voltaje canal de GFP para ajustar el valor de autofluorescencia celular como el umbral de detección más bajo para la señal de GFP.
- Determinar gating umbral utilizando células de control. Evaluar la pureza de cada población de células basándose en la presencia de células GFP-positivas frente a control.
NOTA: Una población pura podría ser el reflejo de ninguna célula GPF-positivos detectados.
5. Caracterización de las células por inmunofluorescencia in situ
- Después de tripsinización de células de la inserción (véase la sección 3), recoger las células, la placa de 5 x 10 4 células en 250 l de medio de crecimiento (véase el paso 1.1) en cubreobjetos de vidrio estériles, y permitir que se unieran durante 1 hora en una atmósfera de aire humidificado de 5% (vol / vol) de CO 2 a 37 ° C incubadora.
- Al final de la incubación, se elimina suavemente el plato que contiene el cubreobjetos y colocarlo en la cabina de seguridad biológica de flujo laminar.
- Añadir cuidadosamente 2 ml de medio completo pre-calentado (véase el paso1.1) a cada placa, de manera que se sumerge el cubreobjetos.
- Después de la adición de medio de crecimiento para todos los platos que contienen cubreobjetos, devolver los platos a una atmósfera de aire humidificado de 5% (vol / vol) de CO 2 a 37 ° C en una incubadora durante 48 hr.
- Después de la incubación de 48 horas, lavar las muestras con 3x PBS y fijar con 4% (peso / vol) de formaldehído en PBS durante 10 min a TA.
- Enjuague 5x con Tris Buffered Saline (TBS: 50 mM Tris-Cl, pH 7,5, NaCl 150 mM) y después se permeabilizan con 0,25% (vol / vol) X-100, 0,1% (peso / vol) de saponina Triton durante 5 min a RT.
- Bloquear los sitios de unión con 2% (vol / vol) de suero de cabra normal (NGS), 1% (peso / volumen) de albúmina de suero bovino (BSA), 0,1% (vol / vol) Triton X-100 en TBS no específica (bloqueo solución) durante 1 hora a RT.
- Incubar con el anticuerpo primario (anti-caveolina 1 (CAV1), 1: 1000) en solución de bloqueo a 4 ° C durante la noche.
- Lavar anticuerpos primarios sin unir (3x, 5 min / lavado) con 0,2% NGS (vol / vol), 1% (peso / volumen) de BSA, 0,1% (vol / vol) Triton X-100 en TBS (solución de lavado).
- Incubar con el anticuerpo secundario a temperatura ambiente durante 1 hr en solución de bloqueo (véase la sección 5.4).
- Lávese anticuerpo secundario no unido (3x, 5 min / lavado) con solución de lavado (véase el paso 5.6).
- Monte cubreobjetos sobre un portaobjetos con un medio de montaje anti-fade que contiene 4 ', 6-diamino-2-fenilindol (DAPI), y sellar con esmalte de uñas.
- Observar las células utilizando un objetivo 63X de aumento del petróleo en un microscopio invertido equipado con una fuente de luz externa para la excitación de fluorescencia, y capturar imágenes con una cámara digital conectada para su posterior análisis.
6. Caracterización de las células por Western Blot
NOTA: El procedimiento de Western blot se describe en otro 38. Un breve resumen se describe aquí:
- Después de separación de las células del inserto por tripsinización (véase la sección 3), sedimentar la suspensión de células por centrifugación (500 g, 30 sec).
- Aspirar el sobrenadante y suspender las 2x sedimento celular con 100 l de PBS.
- Retire las células sobrenadante y lisan en 50 l de ensayo de radioinmunoprecipitación modificado (RIPA) de tampón (Tris pH 7,5 50 mM, NaCl 150 mM, NP40 1% (vol / vol), desoxicolato de sodio monohidrato (DOC) 0,5% (vol / vol), dodecil sulfato de sodio (SDS) al 0,1% (vol / vol)), que contiene la proteasa y fosfatasa cóctel inhibidor.
- Incubar durante 20 min en hielo y centrifugar a 19.000 g durante 15 min a 4 ° C.
- Determinar la concentración de proteínas en el sobrenadante utilizando un ensayo de densidad óptica de proteína, compatible con los detergentes en el tampón RIPA.
- proteínas separadas por electroforesis en dodecilsulfato de sodio en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) y electrotransferencia sobre una membrana de 0,2 micras de nitrocelulosa.
- Incubar las membranas en TBS que contenía 0,1% (vol / vol) de Tween-20 (TBST) y 4% (peso / volumen) de leche desnatada (solución de bloqueo) durante 60 min y reaccionar con el anticuerpo primario a 4 ° C durante la noche (anti-CAV1, 1: 1000).
- Lavar 3x membrana con TBST a temperatura ambiente (5 min / lavado).
- Incubar las membranas durante 30 min en solución de bloqueo que contiene un anticuerpo secundario anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (1: 5000).
- Lavar 3x membrana con TBST a temperatura ambiente (5 min / lavado).
- Visualizar productos de reacción por quimioluminiscencia utilizando un sistema de detección de transferencia Western.
7. Caracterización de comunicación intercelular por Citometría de Flujo
NOTA: Para caracterizar la capacidad de adaptación de la membrana microporosa permeable inserta para examinar los diferentes modos de comunicación intercelular (por ejemplo, los factores secretados, uniones gap). Secciones 1-2.12 se realizaron con células AG1522 no fluorescentes se sembraron en el lado inferior de 0,4 μm-, 1 μm-, o 3 insertos micras de poro.
- Cultura no etiquetados células AG1522 en un plato de 35 mm hasta la confluencia del 90% usando medio descrito en la sección 1.1.
- Rcélulas INSE 1x con 1 ml de HBSS.
- células de carga con calceína AM por incubación de las células en HBSS que contiene 30 mM de calceína AM.
- Incubar durante 15 minutos en una atmósfera de aire humidificado de 5% (vol / vol) de CO2 a 37 ° C.
- Lavar las células 2 veces con 1 ml de HBSS.
- Trypsinize células mediante la adición de solución de 200 l de 0,25% (vol / vol) con tripsina con EDTA 2,21 mM durante 2 min a TA.
- Se detiene la actividad de la tripsina mediante la adición de 800 l de medio completo que contenía 12,5% (vol / vol) de FBS.
- Llevar células en suspensión mediante pipeteo repetido.
- Determinar la concentración de células mediante el uso de un hemocitómetro o un contador electrónico y la placa 250.000 células cargadas con calceína AM a la parte superior de los insertos que ya tienen células AG1522 crecen en el lado inferior.
- Incubar los insertos en una atmósfera de aire humidificado de 5% de CO2 a 37 ° C durante 6 horas.
- Después de 6 horas, recoger las células desde el lado inferior de las piezas de inserción, como se describeen la sección 3.
- Se precipitan la suspensión de células por centrifugación (500 g, 30 sec).
- Eliminar el sobrenadante y suspender el sedimento celular en 400 l de HBSS suplementado con 1% (vol / vol) de FBS.
- Analizar las células en un citómetro equipado con un láser y el filtro capaz de excitar y detectar la emisión de calceína (496 nm y 516 nm, respectivamente), según el protocolo del fabricante.
- Para fines de identificación celular, utilizar una población de células control sin teñir AG1522 para ajustar hacia delante y tensiones de dispersión lateral en el citómetro de flujo. Ajuste el voltaje de canal de calceína para establecer el valor de autofluorescencia celular como el umbral de detección más bajo para la señal de calceína.
- Determinar el límite umbral superior utilizando células de control cargadas con calceína. Evaluar la comunicación para cada inserto de células basándose en la presencia de células de calceína-positivas frente a control.
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Representative Results
Aquí hemos adaptado un inserto de membrana microporosa permeable para desarrollar un sistema de células de co-cultivo heterotípicos in vitro que imita el microambiente tumoral in vivo (Figura 1). Este sistema permite que dos poblaciones diferentes de células que se cultivan en cada lado de la membrana porosa de la pieza de inserción para largos períodos de tiempo (hasta 120 horas, en el uso). Es importante destacar que el sistema es capaz de mantener la pureza de las poblaciones de células, tal como se determina mediante siembra de células GFP-etiquetados MDA-MB-231 en el lado superior de 0.4-, 1-, o 3 insertos m de poro y que les permite crecer en co-cultivo con células AG1522 creciente en el lado inferior de la pieza de inserción, por 120 hr. Después de este tiempo, las células se recogieron desde el lado inferior de la pieza de inserción y se analizaron por citometría de flujo para identificar la presencia de cualquier célula MDA-MB-231 GFP-positivas, lo que indicaría una pérdida de la pureza de la población celular. El análisis reveló un 99,9% y el 99,8% de la PUre poblaciones de 0,4 y 1 micras insertos de poros, respectivamente; sin embargo, la pieza de inserción con 3 micras poros fue incapaz de mantener la separación de las poblaciones de células, ya que los poros eran lo suficientemente grandes para permitir que un número significativo de las células MDA-MB-231 GFP-positivas a migrar a través de la membrana (Figura 2) .
Es importante destacar que, a través de inmunofluorescencia in situ y análisis de transferencia Western hemos sido capaces de demostrar la capacidad de este sistema para generar eficazmente fibroblastos asociados con el cáncer de la normal diploides humanas fibroblastos AG1522 siguientes co-cultivo con-231 MDA-MB de células de cáncer de mama, como se determina por reducción de la expresión de caveolina-1, una bien establecida CAF biomarcador 39-42 (Figura 3). CAV1 es una proteína de andamiaje que forma la caveolae en el dominio de balsa lipídica de la membrana plasmática, que está implicada en múltiples procesos celulares 43. En la transferencia de Western, Se observaron dos bandas distintas, correspondientes a las isoformas alfa y beta de CAV1 44. Por desgracia, poco se sabe acerca de la diferencia (s) entre las isoformas, especialmente su papel como biomarcadores de la CAF.
También hemos demostrado el nivel de competencia del sistema de co-cultivo de inserción para modular la comunicación intercelular entre las dos poblaciones de células heterotípicos (Figura 4). La no marcado, brecha de la salida fibroblastos AG1522 diploides humanas competentes se cultivaron hasta la confluencia en el lado inferior de la pieza de inserción. Un segundo conjunto de células AG1522 fueron cargadas con calceína AM, un fluorescente brecha de la salida de tinte verde permeable, y se sembró en el lado superior de la pieza. Las dos poblaciones de células se les permite comunicarse durante 6 h, y luego se aislaron y se analizaron por citometría de flujo de las células en el lado inferior de la pieza de inserción. células calceína positivo desde el lado inferior de la pieza de inserción serían reflectante de células que EStablecido acoplamiento brecha-unión a través de los poros de inserción. El tamaño del poro 0,4 micras insertar la formación de brecha de la salida funcional limitada entre las células que crecen en cada lado de la pieza de inserción, limitando así la comunicación de factores secretados (por ejemplo, factores de crecimiento, microvesículas, etc.). Alternativamente, el tamaño de los poros 1 micras y 3 micras son aparentemente lo suficientemente grande como para permitir el acoplamiento funcional de las células a través de uniones. Por lo tanto, mediante la modulación del tamaño de los poros, se puede comenzar a entender el papel (s) diversa que los diferentes modos de comunicación intercelular pueden tener en el desarrollo y evolución de TME.
Figura 1:. Permeable membrana microporosa Insertar Modelo de sistema (a) AG1522 fibroblastos diploides humanas (células de apariencia normal, el paso bajo) destinados a convertirse en los CAF se siembran en forma invertidainserciones microporosas permeables que consisten en una membrana de poliéster de 10 micras con 0,4 m, 1 m, ó 3 micras poros. Después de la unión, las piezas de inserción se invierte y se coloca en los pocillos de placas y se cultivaron hasta la confluencia. (B) Las células de cáncer y fibroblastos de control se cultivan por separado en frascos antes de ser sembradas en el lado superior de los insertos con fibroblastos en crecimiento íntimamente en el lado inferior. (C) Las células co-cultivadas se alimentan cada dos días y se mantuvieron durante el tiempo deseado. (D) En los tiempos respectivos siguiente co-cultivo y / o tratamientos experimentales, los CAF (lado inferior de las piezas de inserción) y / o células cancerosas (lado superior de la pieza de inserción) son cuidadosamente aislado por tripsinización, produciendo poblaciones de células altamente puras, que puede ser utilizado para el análisis de los criterios de valoración o propagó para estudios posteriores. por favor, haga clic aquípara ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:. Generación de poblaciones celulares altamente enriquecido flujo Representante citometría resultados demuestran la capacidad de la inserción de mantener, sin embargo, las poblaciones de células heterotípicos independientes siguientes 120 horas de co-cultivo altamente enriquecido. (A) células AG1522 cosechadas desde el lado inferior de la inserción de 0,4 micras de poro muestran el 99,9% de la población a estar libre de células MDA-MB-231 GFP-etiquetados crecen en el lado superior de la pieza (cuadrante inferior izquierdo). (B) células AG1522 cosechadas desde el lado inferior del inserto de poro 1 micras también muestran 99,8% población enriquecida (cuadrante inferior izquierdo). (C) células AG1522 cosechadas desde el lado inferior del inserto de poro 3 micras revelan que sólo el 68,5% de la población está libre de células GFP-etiquetados (cuadrante inferior izquierdo), Lo que indica que un gran número de células MDA-MB-231 GFP-positivas fueron capaces de migrar a través de los poros de 3 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3:. Generación de los fibroblastos asociados al cáncer reducción de expresión de un biomarcador CAV1 es consistente y fiable de la CAF. (A) Las imágenes microscópicas de inmunofluorescencia en situ (barra de escala = 20 micras), y (b) análisis de transferencia de Western de CAV1 en las células AG1522 que había estado en co-cultivo con células AG1522 (control) (izquierda), o con MDA- las células de cáncer de mama MB-231 (derecha) durante 120 horas. La tinción con Ponceau S Rojo fue utilizado para el control de la carga y para determinar el cambio veces en transferencias de Western. Los resultados son representativos detres experimentos separados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4:. La modulación de Comunicación Intercelular por Insert de tamaño de poro de flujo análisis de citometría de demostrar la capacidad de adaptación del modelo TME inserto de membrana microporosa permeable para seleccionar diferentes modos de comunicación intercelular entre calceína AM cargado células AG1522 creciente en la parte superior de la pieza de inserción y el control AG1522 las células que crecen en su lado inferior. (A) Las células cosechadas a partir de la parte inferior de 0,4 micras de poro insertos muestran niveles muy bajos de células calceína positivo (0,57%), lo que indica la comunicación brecha cruce limitada a través de los poros de inserción. (B) Las células cosechadas a partir de la parte inferior de 1 m insertos de poros muestran higher niveles de células calceína-positivo (9,98%), lo que indica la formación de uniones gap funcionales. (C) las células recolectadas desde el lado inferior de 3 micras de poro insertos muestran altos niveles de células calceína-positivo (87,8%), lo que indica una amplia comunicación brecha-unión. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El protocolo descrito aquí es un simple, adaptable en procedimiento in vitro (Figura 1) que utiliza un inserto de membrana microporosa permeable para generar poblaciones de células individuales altamente enriquecido de un co-cultivo de células heterotípicos. De manera significativa, el modelo es adecuado para la investigación de diversos medios de comunicación intercelular. Los pasos críticos incluyen la selección de la pieza de inserción de tamaño de poro apropiado para el interés experimental específico (s), la siembra de la primera población de células en la parte inferior de la inserción en el medio suplementado con 50% de FBS, la siembra de la segunda población de células en el lado superior de la insertar, y co-cultivo de las dos poblaciones de células distintas por una duración de tiempo apropiado. Se demuestra que este sistema es capaz de imitar diversas características in vivo, proporcionando así una mayor oportunidad de comprender los mecanismos moleculares, fenotípica, y cambios latentes que ocurren durante la evolución temprana de TME, que resuelve un problema importante disadvantage de muchos modelos establecidos TME in vitro (Figura 2).
El modelo puede ser fácilmente modificado para permitir la investigación de diversos aspectos de las interacciones célula-célula en el desarrollo del cáncer de estroma y la evolución TME (Figura 4). Mientras que el poro inserto de 0,4 micras permite el acoplamiento íntimo entre las dos poblaciones de células 45, restringe significativamente la formación de uniones gap funcionales entre las células cultivadas en cada lado de la membrana de inserción (Figura 4). Por lo tanto, facilitando así la investigación del papel de los factores difusibles (por ejemplo, factores de crecimiento) y / o vesículas extracelulares (por ejemplo, exosomas), que median el desarrollo CAF 46-48. Alternativamente, los 1 micras y 3 micras poros son lo suficientemente grandes para permitir la formación de uniones gap funcionales, lo que permite el estudio tanto de acoplamiento metabólico directo a través de canales de unión y de comunicación indirecta a través defactores secretados difusibles. Sin embargo, como el poro inserto 3 micras permite la migración de células a través de los poros (véase la Figura 2), no mantiene la pureza de dos poblaciones de células heterotípicos separados durante los tiempos de co-cultivo prolongados (por ejemplo., 120 hr). Considerando que el presente modelo permite el estudio de diversos aspectos de la TME, que está limitado en su capacidad para tener en cuenta muchas de las complejas interacciones fisiológicas que se producen dentro de un in vivo TME (por ejemplo, intercambio de fluidos vasculares, etc.).
La comprensión de los acontecimientos tempranos de la activación del cáncer de estroma y el desarrollo de la TME es importante en la aclaración de los pasos implicados en la iniciación y la progresión del tumor primario, así como la metástasis. Ahora es ampliamente aceptado que el estroma del cáncer, especialmente los CAF, poseen un papel fundamental en el apoyo a la carcinogénesis (revisado en 49). Esto ha llevado al desarrollo de muchos modelos in vitro 2D y 3D, el objetivoed en las estrategias que iluminan para apuntar los primeros mecanismos que contribuyen a la activación del estroma y la progresión tumoral. Desafortunadamente, muchos de estos modelos están limitados por su incapacidad para permitir el aislamiento de poblaciones de células individuales, sin que consume tiempo y el procesamiento estresante, para el estudio adicional. Así, este protocolo proporciona una adición significativa al campo de la investigación de TME, ya que combina las propiedades in vivo como con la capacidad de obtener fácil y rápidamente las poblaciones de células altamente enriquecido o puro para su análisis inmediato o propagación para estudios posteriores.
Una vez que se domina la técnica, el modelo TME inserto puede ser utilizado para la investigación de diversas interacciones TME bi-direccionales (por ejemplo, cáncer endotelial, cáncer de las células inmunitarias, etc.). Además, la complejidad de la co-cultivo se puede mejorar mediante la colocación de una población de células mixtas en un lado de la pieza de inserción y una sola población en el lado alternativo, así obtenering una mayor in vivo como TME complejidad población celular. Sin embargo, se debe tener cuidado en la selección de un inserto con el tamaño de poro adecuado si se utilizan células de especial de pequeño diámetro (por ejemplo, linfocitos humanos con un diámetro de ~ 7 m 50), ya que pueden ser capaces de migrar a través de los poros más pequeños ( por ejemplo, 0,4 m o 1 m). Antes de co-cultivo, los experimentos de migración (Figura 2) pueden estar justificadas para garantizar el mantenimiento de las poblaciones de células puras a través de experimentos de co-cultivo extendidos.
Este modelo también es susceptible de investigar los efectos de diversos retos terapéuticos (por ejemplo, radiación ionizante, agentes quimioterapéuticos, hipertermia) y alteraciones fisiológicas (por ejemplo, hipoxia, hiperoxia, inhibidores biológicos) en poblaciones de células mixtas que están acopladas a través del inserto membrana microporosa permeable. El modelo ha demostrado su capacidad para generar con éxito los CAF, identified por un biomarcador ampliamente aceptado CAF (es decir, la baja regulación de CAV1) 39-42 (Figura 3), que se redujo aún más por 55% cuando el sistema de inserción se mantuvo a in vivo como PO 2 (7 mm Hg; 0,5% O 2) 51, poniendo de relieve la capacidad de adaptación del modelo para varios diseños y las condiciones experimentales (datos no mostrados). En suma, este modelo proporciona un enfoque simplificado y una oportunidad para modular los factores temporales y externos con el fin de obtener una visión más profunda en la activación del cáncer de estroma, la evolución temprana de la TME, y las respuestas celulares a los agentes terapéuticos o ambientales.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses en competencia o en conflicto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Cell Culture | |||
| AG01522 (i.e., AG1522) human diploid fibroblast | Coriell | 107661 | Passage 8-13 |
| MDA-MB-231-luc-D3H1 breast adenocarcinoma cell line | PerkinElmer | 119261 | Parental line: ATCC (#HTB-26) |
| MDA-MB-231/GFP breast adenocarcinoma cell line | Cell Biolabs | AKR-201 | |
| Eagle's minimal essential medium (MEM) | Corning Cellgro | 15-010-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified | Sigma | F6178-500mL | |
| Corning Glutagro Supplement (200 mM L-alanyl-L-glutamine) | Corning Cellgro | 25-015-Cl | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100x | Corning Cellgro | 30-002-Cl | |
| Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (0.4 μm pore) | Costar | 3450 | |
| Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (1 μm pore) | Greiner bio-one | 657610 | |
| Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (3 μm pore) | Costar | 3452 | |
| 6-well Culture Plate | Greiner Bio-One Cellstar | 657160-01 | |
| 75 cm2 cell culture flask | CellStar | 658 170 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning Cellgro | 21-040-CV | without calcium & magnesium |
| 0.25% (vol/vol) Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x | Corning Cellgro | 25-053-Cl | |
| 15 ml Centrifuge Tube | CellTreat | 229411 | |
| 35 mm x 10 mm Cell Culture Dish | Greiner bio-one | 627 160 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Immunofluorescent Microscopy | |||
| Mouse anti-Caveolin 1 | BD Transduction Laboratories | 610406 | In situ Immunofluorescence - 1:5,000 |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-11029 | In situ Immunofluorescence - 1:2,000 |
| Bovine Serum Albumin - Fraction V | Rockland | BSA-50 | Immunoglobulin and protease free |
| 16% (wt/vol) Formaldehyde Solution | ThermoFisher Scientific | 28908 | Dilute to 4% with 1x PBS |
| Premium Cover Glass (22 mm x 22 mm No.1) | Fisher | 12548B | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-50ML | |
| SlowFade Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | S36938 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Flow Cytometric Analysis | |||
| Calcein, AM | Molecular Probes | C3100MP | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-076 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Western Blot Analysis | |||
| Mouse anti-Caveolin 1 | BD Transduction Laboratories | 610406 | Western Blot - 1:1,000 |
| Tween-20 | BioRad | 170-6531 | |
| Nitrocellulose Membrane (0.2 μm) | BioRad | 162-0112 | |
| Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| BioRad DC Protein Assay | BioRad | 500-0116 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | BioRad | 161-0302 | |
| Sodium deoxycholate monohydrate (DOC) | Sigma | D5670 | |
| IGEPAL CA-630 (NP40) | Sigma | I8896 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | BioRad | 161-0158 |
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