Summary
Dit artikel beschrijft een eenvoudige en reproduceerbare protocol om opgeloste zuurstof omstandigheden in een laboratorium omgeving voor gedrag dierstudies manipuleren. Dit protocol kan worden gebruikt in zowel het onderwijs en onderzoek laboratorium instellingen organismal reactie van macrofauna, vissen, amfibieën of op veranderingen in de concentratie van opgeloste zuurstof te evalueren.
Abstract
Het vermogen om opgeloste zuurstof (DO) in een laboratoriumomgeving manipuleren significante toepassing op een aantal ecologische en organismaal gedrag vragen onderzoeken. De hier beschreven protocol voorziet in een eenvoudige, reproduceerbare en gecontroleerde manier te manipuleren doen om behavioral reactie in het water levende organismen als gevolg van hypoxie en zuurstofloze omstandigheden te bestuderen. Tijdens het uitvoeren ontgassen water met stikstof gewoonlijk wordt gebruikt in het laboratorium instellingen, geen expliciete methode ecologische (levende) toepassing bestaat in de literatuur, en dit protocol als eerste een protocol om water te ontgassen organismal respons waar te beschrijven. Deze techniek en protocol werden ontwikkeld voor rechtstreekse aanvraag voor aquatische macrofauna; kon echter kleine vissen, amfibieën en andere ongewervelde gewervelde dieren gemakkelijk worden vervangen. Het maakt gemakkelijke manipulatie van DO variërend van 2 mg / l tot 11 mg / l met stabiliteit tot 5 min dierlijke observatieperiode.Beyond a 5 min observatieperiode watertemperaturen begon te stijgen, en op 10 min DOEN levels werd te instabiel te onderhouden. Het protocol is schaalbaar tot de studie organisme, reproduceerbaar en betrouwbaar, waardoor een snelle implementatie in inleidende onderwijs laboratoria en onderzoek op hoog niveau toepassingen. De verwachte resultaten van deze techniek dienen betrekking opgeloste zuurstof wijzigingen gedragsreacties organismen.
Introduction
Opgeloste zuurstof (DO) is een belangrijke parameter fysiochemische belang bij het mediëren diverse biologische en ecologische processen in aquatische ecosystemen. Blootstelling aan acute en chronische sub-dodelijke hypoxie verminderen groeicijfers in bepaalde levende insecten en het voortbestaan van insecten blootgesteld 1 te verminderen. Dit protocol is ontwikkeld om een gecontroleerde manier te verstrekken aan DO niveaus manipuleren stroom water naar de effecten op het gedrag van dieren te observeren. Omdat overleven alle aërobe water levende organismen 'afhankelijk van de zuurstofconcentratie in om te leven en te reproduceren, worden veranderingen in de concentratie van DO vaak tot uiting in gedragsveranderingen door organismen. Meer mobiele ongewervelde dieren en vissen zijn waargenomen om te reageren op lage zuurstofconcentraties (hypoxie) door te trachten locales met hogere DO 2,3. Voor minder mobiele het water levende organismen, gedragsaanpassingen om de inname van DO te verhogen kan de enige realistische optie. De aquatische macro-invertebraat levensgemeenschappen orde van PlecOptera (stonefly) is aangegeven op "push-up" bewegingen uitvoeren om de waterstroom en zuurstofopname te verhogen, tegenover de uitwendige kieuwen 4-6. Deze adaptieve gedrag waargenomen in de natuur en in laboratoriumexperimenten.
Laboratorium manipulatie van DO in water opent aanzienlijke mogelijkheden voor het gedrag van dierproeven, maar belangrijke lacunes in methodologische implementatie bestaan. Bijvoorbeeld, een studie gebruikte grote aquaria om de fysiologische responstijd van Largemouth bass (Micropterus salmoides) naar hypoxische omgevingen na begassing met stikstof te evalueren, maar weinig detail wordt gegeven voor de methodiek 7. Een andere studie uitgevoerd op Zebra vis (Danio rerio) beschreven met behulp van stikstofgas en een poreuze steen om gas te leveren aan water en de DO van het water 8 verminderen. Voor de chemie-gebaseerde toepassingen, methoden voor het ontgassen van oplosmiddelen te gebruiken gespecialiseerdeInrichting 9-11 om zuurstof uit oplosmiddelen te verwijderen, maar niet geschikt voor het gedrag dierstudies. Hoewel deze studies met methoden om zuurstof uit water te verwijderen, kon geen beschrijvende methode gekozen die het mogelijk maken voor de evaluatie van het gedrag van dieren in reactie op veranderingen DO.
Deze werkwijze hierna beschreven is een poging om een protocol voor manipulatie van DO van water volledig te beschrijven met stikstofgas. Verder werd deze methode ontwikkeld in de richting van het observeren van de relaties tussen stonefly gedrag (push-ups) en DO die werd gebruikt in een eerstejaars-niveau biologie laboratorium. Een van de belangrijkste voordelen van deze methode is dat het gemakkelijk kan worden uitgevoerd in een laboratorium met gemeenschappelijke glaswerk en materialen toegankelijk voor de meeste middelbaar en hoger onderwijs instellingen. Het protocol is ook eenvoudig aan te passen, waardoor individuen om de procedure om de uiteengezet voor onderzoek of onderwijs toepassingen doelstellingen te schalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Let op: Dit experiment niet gewervelde dieren te gebruiken en daarom geen goedkeuring door Juniata College Institute for Animal Care en gebruik Comite niet nodig. Maar voor individuen aanpassing van deze werkwijze voor gebruik bij vertebraten, moet IACUC goedkeuring aangevraagd.
1. Gebied Monsternemingsprocedure
- Vast te stellen en te evalueren mogelijke veld plaatsen voor de mogelijkheid om te verzamelen, opslaan en transporteren steenvliegen snel tot tijd in transit te minimaliseren met een maximale aanbevolen tijd in doorvoer van 1 uur.
- Voer kick-net bemonstering op het geselecteerde veld ter plaatse volgende standaard kick-net procedures vaak genoeg om ten minste 35 steenvliegen 12 te verzamelen.
- Verzamel 50 L van stroom water en rotsen met een maximale diameter van 2 cm van streams.
- Plaats aquaria in de koelkast ingesteld op de temperatuur van de stroom plaats. Verdeel rotsen verzameld op de stroom plaats in aquaria en vul met 4 L van stroom water per aquarium. Plaats 20-30 Verzameld steenvliegen per aquarium en plaats een borrelende steen bevestigd aan een aquarium bubbler in elke tank en zet Bubblers om voortdurend toe te voegen ruimte lucht naar het water.
- Laat de steenvliegen aan te passen aan de nieuwe omgeving in de aquaria voor een 48 uur periode.
Figuur 1. Stel voor opgeloste zuurstof manipulatie. (A) 1) Montage voor koperen pijp aan mannelijke slang weerhaak 2) Locatie van stopper afdichting te onderzoeken om te zorgen voor goed afdichten kolf. (B) 1) 2 L zijarm kolf gevuld met 1,9 L water 2) Gas buis en lucht bubbler (blauw) voor gebruik in stikstof borrelen en lucht in de ruimte bubbling, respectievelijk 3) Stikstof tank en gemeten waarden 4) 2 L kolf gevuld met 0,4 liter water met vacuümbuis ondergedompeld 5) Opgeloste zuurstof meter. klik hier ombekijk een grotere versie van dit cijfer.
2. Experimentele Set up
- Op een bankje top, sluit u een standaard ommuurde vacuümbuis aan de zijarm van een 2 L zijarm kolf zo wordt weergegeven (1 in Figuur 1B).
- Vul de kolf met 1,9 L van stroom water uit 3 L plastic verpakkingen inhoudende opgevangen stroom water in de koelkast ingesteld op 12 ° C.
- Plaats de kolf en slangen op een dienblad groot genoeg is om een ijsbad rond de zijarm kolf te houden zonder het zicht op de kolf interieur en vul de bak met ijs.
- Boor twee gaten diameter 3 mm in een rubberen stop aan de passage van 1) een koperen buis laat het gas te leveren aan het vat en 2) de sonde van DO meter de 2 L zijarm kolf (1 in figuur 1B) .
- Voeg een laterale insnijding van de rand van de dop van een van de gaten zitten van de draad van de sonde DO zodat in de stop.
- Sluit een koppelstuk met een 3 mm mannelijke slangweerhaak om een stuk van 2 mm diameter koperen buis (1 in figuur 1A). Zorgen dat deze pijp is lang genoeg is om binnen 10 cm van de bodem van de kolf, terwijl het bereiken door de stop.
- Plaats de buis met koppelstuk hoewel het tweede gat in de stop tot de lengte vanaf de bodem van de stop voldoende bereikt binnen 10 cm van de bodem van de kolf.
- Sluit een 0,75 m lang dunwandig polyethyleen gasbuis met een diameter van 3 mm aan de koppeling op de buis.
- Schuif zowel de DO-sonde en koperen buizen in de kolf en sluit de kolf met de stopper.
- Controleer op een veilige afdichting tussen de stop en de kolf, en een nauwsluitende passing tussen de buis en de probe draad in de stop.
- Vul een 1 liter fles met 0,4 liter kraanwater en plaats grenzend aan de lade met het ijsbad en vacuüm kolf.
- Dompel de polyethyleen buis afkomstig van de grote thermoskan in het water van de kolf van 1 liter. Zet debuis met tape zodat het zal ondergedompeld werden tot het experiment.
- Sluit de 3 mm diameter gasleiding uit de thermoskan een aquarium kamer is voorzien van bubbler. Beginnen te borrelen het water in de 2 L kolf door de stekker in het aquarium bubbler, die kamerlucht en zuurstof voorstelt aan het water.
- Controleer de DO concentratie en temperatuur van het water met de DO meter gedurende 5 minuten of totdat evenwicht van DO wordt ingesteld in de kamer zodat weinig verandering in DO plaatsvindt.
3. Het testen van de stabiliteit van de Experimental Set Up
- Test elke setup voor DO stabiliteit voorafgaand aan de toevoeging van steenvliegen.
- Voeg drie of vier rotsen naar de 2 L kolf, zodat steenvliegen hebben substraat bevorderlijk voor push-ups.
- Begin een proef manipulatie van DO door het loskoppelen van de gasleiding uit waskolf en bevestigen aan het stikstofgas lijn.
- Begin borrelende stikstof bij 20 kubieke voet per uur (CFH) ongeveer 40sec tot 1 min.
- Zodra de DO onder 0,5 mg / L van de doelconcentratie is gedaald tot, vermindering van de stroom naar 15 CFH en laat de concentratie afnemen tot het doel.
- Staakt stroom van stikstof wanneer de beoogde concentratie wordt bereikt.
- Gebruik het aquarium kamer is voorzien van bubbler om de concentratie terug te keren naar de beoogde concentratie als de DO daalt onder het doel.
- Als de DO is instabiel tijdens het testen van een set-up controleer dan het volume water is nog steeds op 1,9 L en geen water is geborreld out, temperatuur van het water is stabiel en niet veranderen, en zeehonden op alle armaturen verschijnen strak en verzegeld zijn.
- Nadat drie proeven zijn uitgevoerd en de experimentator heeft vertrouwen in het vermogen om te doen controleren, bevestigen de gasleiding naar de bubbler en bubble weer evenwicht.
- Bubble evenwicht door het aanbrengen van het 3 mm diameter gasleiding naar het aquarium bubbler en starten van de toevoeging van kamerlucht naar het water tot de concentratie vanzuurstof in het water niet toeneemt of veranderen 3 min.
- Eenmaal bij evenwicht, stop borrelen en ontsluiten de kolf.
4. Stonefly Push-up Experiment
- Verdeel het totale aantal steenvliegen door het aantal waarnemers het aantal proeven uit te voeren bepalen.
- Bepaal DO verschillende niveaus tussen 2 en 10 mg / L om de gedragsreactie van steenvliegen (aantal pushups) evalueren.
- Opzetten van een fles per proef en voeg een gelijk aantal steenvliegen want er zijn waarnemers aan de kolf (4 steenvliegen binnen dit ontwerp), plaatst u de sonde en leiding terug in de fles, dan verzegelt de kolf met de rubberen stop.
Opmerking: Een eerste DO concentratie van 10 mg / l werd gekozen als het eerste observatiepunt omdat het de DO concentratie van de stroom waaruit de steenvliegen bemonsterd. - Zodra het water is op 10 mg / l door borrelen volgende stappen 2,10-2,11, registreren de start temperatuur van het water en laat desteenvliegen te hechten aan de rots substraat in de kolf.
- Wijs slechts één waarnemer aan een enkele stonefly kijken om nauwkeurige telling van push-up gedrag, dat is de op- en neergaande beweging van het lichaam vertoond door de stonefly waarborgen.
- Tellen en het aantal push-ups waargenomen in de loop van een 3 min observatieperiode opnemen.
- Manipuleren doen om de volgende experimentele DO level en herhaal 3 min observatieperiode voor de bijkomende experimentele niveaus.
Opmerking: Binnen deze experimentele opzet, werden drie verschillende DO niveaus geëvalueerd.
5. Statistische analyse
- Statistische analyse gebruik gemiddeld aantal push-ups over de vier steenvliegen te voeren over een groep voor een bepaalde DO trial.
- Gebruik de gratis R statistische berekeningen software 12 tot en met een variantieanalyse (ANOVA) uit te voeren op het aantal push-ups en de DO concentraties met behulp van de orde van elke experimentele studie (DO-niveau) en de temperatuur als covariates. Geanalyseerd DO als discrete niveaus van een enkele factor.
- Gebruik een Anderson-Darling normaliteit testen op residuen om te controleren op normaliteit 13.
- Voer een lineaire regressie op de gegevens door het uitzetten van de gemiddelde aantal opdrukken tegen DO concentraties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Zes proeven met de beschreven opstelling werd uitgevoerd door 24 freshmen studenten tijdens een leer- laboratoriumopstelling het aantal push-ups steenvliegen voeren als reactie op verschillende DO concentratie in water kwantificeren. Het gemiddelde aantal push-ups uitgevoerd binnen een DO-niveau en binnen elke proef werd samengevoegd met push-ups tegen de DO niveau plot in figuur 2. Een ANOVA werd in eerste instantie uitgevoerd met behulp van DO concentratie, volgorde van de proeven, temperatuur, evenals de interactie tussen alle variabelen. De resultaten suggereren dat alleen de concentratie significant beïnvloed het aantal push-ups uitgevoerd door steenvliegen (R2 adj. = 0,322, p = 0,004) en geen andere variabele of interactie was een belangrijke voorspeller van push-ups. Alle gegevens die in deze analyse werd bevestigd voor normaliteit met behulp van een Anderson-Darling-test.
content "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figuur 2. Gemiddeld aantal push-ups uitgevoerd door steenvliegen gegroepeerd op proef uitgezet tegen de concentratie van opgeloste zuurstof. Dit blijkt uit een significante negatieve relatie (R2 adj. = 0,322, p = 0,004) tussen push-ups en opgeloste zuurstof concentratie (helling van -6,063). Rode getallen geven watertemperatuur (in ° C) gedurende een proef. De temperaturen waren stabiel over 3 periodes min proef, maar gevarieerd over het experiment. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende Code Bestand:. R-code voor de statistische analyses Klik hier om deze te downloadenfile.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
kritische stappen
Deze procedure zorgt voor een eenvoudige en efficiënte manier te doen te manipuleren in een laboratorium setting om behavioral studies uit te voeren op het water levende organismen. We vonden er zijn een aantal cruciale stappen / zaken bewust te zijn van bij het uitvoeren van dit experiment die direct verband houden met de uitkomsten. In een proef, is het essentieel om de kamerdruk op veranderingen in de partiële druk van gassen boven het water te vermijden behouden en daaropvolgende DO schommelingen. Naar aanleiding van de stappen in de "het testen van de stabiliteit van de experimentele opstelling" onderafdeling van het protocol is van cruciaal belang. Inspectie van de zegel van de stop met de kolf, zorgen voor volledige onderdompeling van het vacuüm slang in de kolf van 1 liter water (tot terugstromen van lucht in de ruimte te voorkomen), en het plaatsen van de gasleiding en de DO draad afdichting met de stop kan bijdragen tot het behoud van een stabiele kamer milieu. Bovendien, het maximaliseren van de hoeveelheid water in de kamer is noodzakelijk om de stabiliteit van DO binnen verbetereneen proces, zoals we hebben geconstateerd dat er te weinig volume resulteert in een onregelmatig en instabiel DO manipulaties.
Het handhaven van temperatuur van het water in de kamer is absoluut noodzakelijk voor een goede beheersing van de interne DO niveaus. Terwijl we konden koud water temperaturen in de afzonderlijke experimenten groep heeft, enkele minimale temperatuurverschillen tussen verschillende onderzoeken bleek (figuur 2). Sinds onze totale bereik van temperaturen laag (11.8-13.5˚C) en binnen het normale bereik voor steenvliegen was, heeft zij niet blijken te zijn een belangrijke voorspeller in ons model voor Stonefly push-ups zijn. Echter, is de watertemperatuur bekend bij de zuurstofverzadiging potentieel van water 14,15 bewerkstelligen, en niet in slagen om de kamer temperatuur van het water te handhaven zou directe gevolgen voor DO niveaus. Met een goede afdichting, adequate hoeveelheid water, en een stabiele temperatuur van het water, inwendige kamer druk en doen is gemakkelijk te onderhouden gedurende het experiment en de controle van DO tussen trials is stafel en reproduceerbaar.
Beperkingen en Modificaties
Twee mogelijke beperkingen van dit experiment zijn de grootte van de kamer en de duur van de observatieperiode. De hoeveelheid water (~ 2 L) en kleine opening in de hals van de kamer beperkt de grootte van het organisme kunnen worden gebruikt. Op deze schaal, zou het protocol zorgen voor een gemakkelijke vervanging van steenvliegen voor andere macrofauna, amfibieën en kleine vissen, maar zou niet van toepassing voor grotere organismen (dat wil zeggen, roofvissen, octopussen) zijn. Het zou echter mogelijk zijn om dit experiment te schalen door grotere glaswerk, en aanpassing van de algemene protocol verschillende leren / onderzoeksdoelen ontmoeten grotere organismen. Daarnaast moet elk substraat vereist in de kamer voor grotere organismen rekening worden gehouden bij het kiezen glaswerk vanwege kleine nek grootte op de 2 L kolf. In ons experiment werden kleine rivier-stenen verzameld met steenvliegen en op voorwaarde dat voldoende ruimte s ubstrate voor de steenvliegen om push-ups uit te voeren.
Binnenkamer omstandigheden gedurende korte tijd observatieperioden werden gehandhaafd met minimale fluctuaties echter onzekerheid bestaan over langere periodes observatie. Gebruik makend van de 3 min observatieperiode beschreven in het protocol, kamer temperatuur van het water en DO niveaus werden bij constante waarden behouden. We waren in staat om te doen en het water temperatuur te handhaven tot 5 minuten observatieperiode, maar op een 10 minuten lange observatieperiode, watertemperaturen in de kamer begon te stijgen. In het huidige protocol is het niet haalbaar om de observatieperiode na 5 min verlengen. Echter, aanpassingen aan het huidige protocol (zoals het gebruik van een klimaat gecontroleerde ruimte) kan leiden tot een verhoogde stabiliteit op lange termijn van de watertemperatuur. Verder zou een meer robuuste en gedetailleerde analyse van de observatietijd versus ambient water condities (temperatuur, DO, partiële) helpen bij het bepalen beperkende factoren.
content "> Dit protocol heeft de mogelijkheid te wijzigen (zoals hierboven vermeld) met een aantal verschillende behoeften en doelstellingen. Een extra wijziging van het bestaande protocol zou een wijziging van het borrelende systeem. Hoewel we gebruik uitsluitend een koperen pijp te borrelen het water, we hebben gemerkt dat de toevoeging van de grote stikstof gasbellen vaak verdreven de steenvliegen uit hun greep op de rivier stenen en stuurde ze zweven rond de kamer. we hebben geprobeerd om een bruisende stenen gebruiken voor meer gelijkmatige verspreiding van stikstofgas , maar vonden dat de kamer water niet voldoende om de spreiding stikstofgas, waardoor een kolom van hypoxische omstandigheden in de kamer werd geroerd. Verdere verfijning van het stikstofgas afgiftesysteem kan nuttig inzicht, en verwijder het potentieel verwarren van verdrijven steenvliegen van substraat tussen DO proeven. Betekenis en toekomstige toepassingen
Dit experiment was de eerste in zijn soort include een gedetailleerde ontwikkeling protocol te doen niveaus voor het gedrag van dieren observatie te manipuleren in een laboratorium omgeving. Terwijl andere gepubliceerde werk stelde voor het gebruik van stikstofgas te doen niveaus 7,8,16 te manipuleren, is onvoldoende methodologische detail gegeven om voor replicatie. De belangstelling voor dit protocol ontwikkeling kwam voort uit onze wens om DO niveau te manipuleren en te observeren het gedrag van dieren voor gebruik in een college-niveau inleidende ecologie laboratorium Juniata College. In de klas van 24 studenten, dit protocol bleek reproduceerbaar in de onderzoeken met verschillende DO niveaus en in groepen studenten. Bovendien is dit protocol zorgt voor een zeer toegankelijke en kosteneffectieve manier om DO niveaus voor laboratorium experimenten te manipuleren.
Hoewel dit protocol voor gebruik met steenvliegen tijdens een leer- lab is ontwikkeld, kan het gemakkelijk worden aangepast voor andere doeleinden. Concreet kan dit protocol gemakkelijk worden gebruikt met andere kleine waterdierenmacroinvertebraten, vissen, amfibieën en zelfs afhankelijk van de soort van belang. Bijvoorbeeld leden van de orde Amphipodia dat hun locomotief activiteit in reactie op hypoxie 17 te verhogen zou kunnen worden gebruikt, of goudvis (Carassius auratus), die vertonen een "slurpend" gedrag op het wateroppervlak tijdens hypoxische omstandigheden 16. Bovendien, verschillende levensstadia van aquatische organismen kan ook worden gebruikt met dit protocol om verder helpen ons begrip van organismal zuurstof eisen tijdens de ontwikkeling. Dit protocol kan ook worden gebruikt om biochemische reacties op hypoxie te bestuderen door te experimenteren met amfibieën zoals mudpuppies (necturus maculosus) 18. Verder kan dit protocol worden vergroot of verkleind in grootte aan de behoeften van grotere of kleinere organismen en onderwijs en onderzoek toepassingen. Terwijl we het gevoel dat het protocol en de specifieke applicatie zelf is van een brede ecologisch belang, de grootste kracht van deze protocol is dat het een geweldige basis ontwikkeling in taxonomische groepen en experimentele doelstellingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Filter flask 2 L | Pyrex | 5340 | |
| Rubber Stopper size 6 | Sigma-Aldrich | Z164534 | |
| Nalgene 180 Clear Plastic Tubing | Thermo Scienfitic | 8001-1216 | |
| Whisper 60 air pump | Tetra | ||
| Standard flexible Air line tubing | Penn Plax | ST25 | |
| 0.25 inch Copper tubing | Lowes Home Improvement | 23050 | |
| Male hose barb | Grainger | 5LWH1 | |
| Female Connector | Grainger | 20YZ22 | |
| Heavy Duty Dissolved Oxygen Meter | Extech | 407510 | |
| Nitrogen gas | Matheson TRIGAS | ||
| Radnor AF150-580 Regulator | Airgas | RAD64003036 |
References
- Hoback, W., Stanley, D. Insects in hypoxia. J. Insect Physiol. 47 (6), 533-542 (2001).
- Craig, J., Crowder, L. Hypoxia-induced habitat shifts and energetic consequences in Atlantic croaker and brown shrimp on the Gulf of Mexico shelf. Mar Ecol-Prog Ser. 294, 79-94 (2005).
- Gaulke, G., Wolfe, J., Bradley, D., Moskus, P., Wahl, D., Suski, C. Behavioral and Physiological Responses of Largemouth Bass to Rain-Induced Reductions in Dissolved Oxygen in an Urban System. T Am Fish Soc. 144 (5), 927-941 (2015).
- Genkai-Kato, M., Nozaki, K., Mitsuhashi, H., Kohmatsu, Y., Miyasaka, H., Nakanishi, M. Push-up response of stonefly larvae in low-oxygen conditions. Ecol Res. 15 (2), 175-179 (2000).
- McCafferty, W. Aquatic Entomology: The Fishermen's and Ecologists' Illustrated Guide to Insects and Their Relatives. , Jones and Bartlett. (1983).
- Chapman, L., Schneider, K., Apodaca, C., Chapman, C. Respiratory ecology of macroinvertebrates in a swamp-river system of east Africa. Biotropica. 36 (4), 572-585 (2004).
- Suski, C., Killen, S., Kieffer, J., Tufts, B. The influence of environmental temperature and oxygen concentration on the recovery of largemouth bass from exercise implications for live - release angling tournaments. J Fish Biol. 68, 120-136 (2006).
- Abdallah, S., Thomas, B., Jonz, M. Aquatic surface respiration and swimming behaviour in adult and developing zebrafish exposed to hypoxia. J Exp Biol. 218 (11), 1777-1786 (2015).
- Ciba Geigy Ag. Method and apparatus for degassing viscous liquids and removing gas bubbles suspended therein. US patent. Gassmann, H., Chen, C., Vermot, M. , 3,853,500 (1974).
- Hewlett-Packard Company. Apparatus for degassing liquids. US patent. Berndt, M., Schomburg, W., Rummler, Z., Peters, R., Hempel, M. , 6,258,154 (2001).
- Sims, C., Gerner, Y., Hamberg, K. Systec inc.,. Vacuum degassing. US patent. , 6494938 (2002).
- Barbour, M., Gerritsen, J., Snyder, B., Stribling, J. Report number EPA 841-B-99-002. Rapid bioassessment protocols for use in streams and wadeable rivers. , USEPA. Washington. (1999).
- Anderson, T., Darling, D. A Test of Goodness of Fit. J Am Stat Assoc. 49 (268), 765-769 (1954).
- Rounds, S., Wilde, F., Ritz, G. Chapter A6 Field Measurements. Section 6.2 DISSOLVED OXYGEN. National Field Manual for the Collection of Water-Quality Data. , U.S. Geological Survery. Virginia, U.S. (2013).
- Hem, J. Study and Interpretation of the Chemical Characteristics of Natural. , U.S. Geological Survery. (1985).
- Burggren, W. 34;Air Gulping" Improves Blood Oxygen Transport during Aquatic Hypoxia in the Goldfish Carassius auratus. Physiol Zool. 55 (4), 327-334 (2015).
- Frederic, H., Mathieu, J., Garlin, D., Freminet, A. Behavioral, Ventilatory, and Metabolic Responses to Severe Hypoxia and Subsequent Recovery of the Hypogean Niphargus rhenorhodanensis and the Epigean Gammarus fossarum (Crustacea: Amphipoda). Physiol Zool. 68 (2), 223-244 (2015).
- Ultsch, G., Duke, J. Gas Exchange and Habitat Selection in the Aquatic Salamanders Necturus maculosus and Cryptobranchus alleganiensis. Oecologia. 83 (2), 250-258 (1990).
