Summary
Denne artikkelen beskriver en enkel og reproduserbar protokoll for å manipulere oppløst oksygenbetingelser i et laboratorieoppsett for dyrestudier oppførsel. Denne protokollen kan bli anvendt i både arbeids- og forskning laboratoriet for å evaluere organisme reaksjon av makroinvertebrater, fisk eller amfibier til forandringer i konsentrasjon av oppløst oxygen.
Abstract
Evnen til å manipulere oppløst oksygen (DO) i et laboratorieoppsett har betydelig anvendelse for å undersøke en rekke miljømessige og atferds organisme spørsmål. Protokollen er beskrevet her gir en enkel, reproduserbar, og kontrollert metode for å manipulere GJØRE for å studere atferdsrespons hos akvatiske organismer som følge av hypoksisk og anoksiske forhold. Mens du utfører avgassing av vann med nitrogen er vanligvis brukes i laboratoriet, finnes det ingen eksplisitt metode for økologisk (akvatiske) søknad i litteraturen, og denne protokollen er den første til å beskrive en protokoll for å degasify vann for å observere organismal respons. Denne teknikken og protokollen ble utviklet for direkte anvendelse for vann makroinvertebrater; men kan lite fisk, amfibier og andre vannlevende virveldyr være lett erstattes. Det gir mulighet for lett manipulering av DO-nivåer i området fra 2 mg / l til 11 mg / l med stabilitet for opptil et 5 min dyreobservasjonsperioden.Utover en 5 min observasjonsperioden vanntemperaturer begynte å stige, og 10 min DO nivåer ble for ustabil til å vedlikeholde. Protokollen er skalerbar til studiet organisme, reproduserbar og pålitelig, slik at for rask implementering i innledende undervisningslaboratorier og høyt nivå forskning. De forventede resultatene av denne teknikken bør forholde oppløst oksygen endringer i atferdsmessige responser av organismer.
Introduction
Oppløst oksygen (DO) er en nøkkelfysio parameter viktig i formidling en rekke biologiske og økologiske prosesser i akvatiske økosystemer. Eksponeringer for akutt og kronisk under dødelig hypoksi redusere vekstrater i enkelte vannlevende insekter og redusere overlevelsen av insekter utsatt en. Denne protokollen ble utviklet for å tilveiebringe en kontrollert fremgangsmåte for å manipulere DO-nivåer i strømmen vann for å observere virkningen på dyrs oppførsel. Ettersom alle aerobe vannlevende organismer overlevelse avhenger av oksygenkonsentrasjon for å leve og reprodusere, endringer i konsentrasjonen av DO ofte gjenspeiles i atferdsendringer hos organismer. Flere mobile vannlevende virvelløse dyr og fisk har blitt observert å svare på lavt oksygenkonsentrasjon (hypoksiske) ved å søke steder med høyere DO 2,3. For mindre mobile vannlevende organismer, til atferdstilpasninger øke inntaket av DO kan være den eneste levedyktige alternativet. Vann macroinvertebrate orden Plecoptera (Stonefly) er kjent for å utføre "push-up" bevegelser for å øke strømmen av vann, og opptak av oksygen, på tvers av sine eksterne gjellene 4 - 6. Disse adaptiv atferd er observert i naturmiljøer og i laboratorieforsøk.
Laboratory manipulering av DO i vann åpner opp store muligheter for dyreadferd studier, men store hull i metodisk distribusjon eksisterer. For eksempel, en studie brukt store akvarier for å evaluere den fysiologiske responstiden til Largemouth bass (Micropterus salmoides) til hypoksiske miljøer følgende gassing med nitrogen, men snaut detaljer er gitt for metodikken 7. En annen studie utført på Zebra fisk (Danio rerio) er beskrevet ved hjelp av nitrogengass og en porøs stein for å levere gass til vann og redusere DO av vannet åtte. For kjemisk-baserte applikasjoner, metoder for avgassing av løsemidler bruke spesialiserteApparat 9 - 11 for å fjerne oksygen fra oppløsningsmidler, men ville ikke være egnet for dyr oppførsel studier. Selv om disse studiene benytte metoder for å fjerne oksygen fra vannet, kunne ingen beskrivende metode bli identifisert som ville tillate for evaluering av dyrs oppførsel som reaksjon på endringer i DO.
Denne fremgangsmåten beskrevet i det følgende er et forsøk på å fullt ut beskrive en protokoll for manipulering av DO fra vann ved anvendelse av nitrogengass. Videre ble denne metoden utviklet seg mot å observere sammenhenger mellom Stonefly atferd (pushups) og gjøre som var ansatt i en freshman-nivå biologi laboratorium. En av de viktigste fordelene med denne metoden er at det lett kan utføres innenfor et laboratorium med felles glass og materialer tilgjengelig for de fleste videregående og høyere utdanningsinstitusjoner. Protokollen er også lett tilpasses, slik at for enkeltpersoner å skalere prosedyren for å oppfylle målene som er fastsatt for forsknings- eller undervisningsprogrammer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Dette forsøket brukte ikke virveldyr og derfor ikke krever godkjenning av Juniata College Institute for Animal Care og bruk komité. Men for personer tilpasse denne metoden for bruk med virveldyr, bør IACUC godkjenning søkes.
1. Feltet Prøvetaking
- Bestem og vurdere potensielle feltsider for evnen til å samle inn, lagre og transportsteinfluer raskt for å minimere tid i transitt med en maksimal anbefalt tid i transitt av en time.
- Utfør kick-net prøvetaking på det valgte feltet nettstedet følgende standard spark-net prosedyrer nok ganger til å samle inn minst 35 steinfluer 12.
- Samle 50 L av bekkevann og stein med en maksimal diameter på 2 cm fra strømmer.
- Plasser akvarier i et kjøleskap innstilt på temperaturen av strømmen området. Fordel steiner samlet på strømmen området i akvarier og fyll med 4 liter strøm vann per akvarium. Plasser 20-30 Innsamlede steinfluer per akvariet og plassere en boblende stein festet til et akvarium bobler inn i hver tank og slå på bubblers å kontinuerlig legge romluft til vannet.
- La de steinfluer til å tilpasse seg det nye miljøet i akvariet for en 48 timers periode.
Figur 1. Sett opp for oppløst oksygen manipulasjon. (A) 1) Montering for kobberrør å male slange 2) Plassering av propp segl å undersøke for å sikre godt tetting kolbe. (B) 1) 2 L side-arm kolbe fylt med 1,9 l vann 2) Gass rør og luftboble (blå) for bruk i nitrogen boblende og romluft bobling, henholdsvis 3) Nitrogen tank og gauged verdier 4) 2 L kolbe fylt med 0,4 liter vann med vakuumrør nedsenket 5) Oppløst oksygen meter. klikk her for åse en større versjon av denne figuren.
2. Eksperimentell Set opp
- På en benk topp, kobler du en standard vegger vakuumrør til siden armen av en 2 L sidearm kolbe som er vist (1 i figur 1B).
- Fylle kolben med 1,9 l av bekkevann fra 3 L plast-beholdere som inneholder samlet strøm vann i kjøleskap innstilt på 12 ° C.
- Plasser kolbe og rør på et brett stort nok til å holde et isbad rundt side-arm kolbe uten å skjule utsikten over kolben interiør og fylle skuffen med is.
- Bore to hull med 3 mm diameter i en gummipropp for å tillate passasje av 1) et kobber-rør for å levere gassen til karet og 2) sonden av et DO apparatet til 2 L sidearm kolbe (1 i figur 1 B) .
- Foreta en sideveis snitt fra kanten av stopperen til ett av hullene for å tillate plassering av ledningen til DO-sonden inn i stopperen.
- Koble en kopling med en 3 mm mannlig slangebrodd til et stykke på 2 mm diameter kobberrøret (1 i figur 1A). Sørge for at dette rør er lang nok til å nå til i løpet av 10 cm fra bunnen av kolben mens nå gjennom proppen.
- Plasser røret med kopleren skjønt det andre hullet i proppen til tidsvarigheten fra bunnen av proppen er nok til å nå til i løpet av 10 cm fra bunnen av kolben.
- Koble en 0,75 m lengde, tynnvegget polyetylen gass rør med en diameter på 3 mm til kobleren på røret.
- Skyv begge DO-sonden og kobberrøret inn i kolben og forsegle kolbe med propp.
- Sjekk for en sikker tetning mellom proppen og kolben, samt en tett tilpasning mellom røret og sonden ledning innenfor stopperen.
- Fyll en 1 L flaske med 0,4 liter vann fra springen og legg ved siden av skuffen med isbad og termos.
- Senk polyetylenrør som kommer fra den store termosflaske i vannet av en L kolbe. Festrør med tape slik at det vil være neddykket gjennom eksperimentet.
- Koble 3 mm diameter Gassledning fra vakuumkolben til et akvarium rom-luft bobleren. Begynner å boble i vannet i 2-liters kolben ved å plugge i akvariet bobleren, som introduserer romluft og oksygen til vannet.
- Overvåke DO-konsentrasjonen og temperaturen til vannet med den DO måleren i 5 minutter eller inntil likevekt av DO etableres inne i kammeret slik at små endringer i DO er oppstått.
3. Teste Stabilitet av Experimental Set Up
- Test hver oppsett for DO stabilitet før tilsetning av steinfluer.
- Legg tre eller fire steiner til 2 liter kolbe slik at steinfluer har underlaget bidrar for pushups.
- Begynn en prøve manipulering av DO ved å koble fra gasslangen fra boble og knytter den til nitrogengass linje.
- Begynn boblende nitrogen ved 20 kubikkmeter per time (CFH) for ca 40sek til 1 min.
- Når DO har sunket til innen 0,5 mg / L til målet konsentrasjon, redusere flyten til 15 CFH og tillater konsentrasjonen for å redusere til målet.
- Slutt strøm av nitrogen umiddelbart så snart ønsket konsentrasjon er nådd.
- Bruk akvariet rom-luft bobler for å gå tilbake konsentrasjonen til målet konsentrasjonen hvis DO synker under målet.
- Hvis DO er ustabil under testing av en set-up så sjekk vannvolumet er fortsatt på 1,9 L og ikke vann har boblet ut, vanntemperaturen er stabil og ikke forandrer seg, og pakninger på alle beslag synes å være tett og forseglet.
- Når tre forsøk har blitt utført og eksperimentator har tillit til evnen til å kontrollere DO, feste gassledningen til boble og boble til likevekt igjen.
- Boble til likevekt ved å feste den 3 mm diameter gassledningen til akvariet bobleren og start av tilsetning av romluft til vannet inntil konsentrasjonen avoksygen i vannet øker ikke eller endres i 3 min.
- Når på likevekt, stoppe bobler og bryte seglet kolben.
4. Stonefly Push-up Experiment
- Del det totale antall steinfluer med antall observatører å bestemme antall forsøk for å utføre.
- Bestemme forskjellige DO-nivåer mellom 2 og 10 mg / l for å evaluere de atferdsmessige respons av steinfluer (antall pushups).
- Sett opp en kolbe per prøving og legge til et likt antall steinfluer som det er observatører til kolben (4 steinfluer i denne design), plasserer sonden og rør inn i kolben, deretter forsegle flasken med gummiproppen.
Merk: En innledende oksygenkonsentrasjon på 10 mg / l ble valgt som den første observasjonspunktet, siden det var DO-konsentrasjonen i strømmen fra hvor steinfluer ble prøvetatt. - Når vannet er på 10 mg / L ved å boble følgende trinn 02.10 til 02.11, ta start vanntemperatur og lasteinfluer å feste til rock underlaget i kolben.
- Gi bare en observatør for å se en eneste Stonefly å sikre nøyaktig telling av push-up oppførsel, som er opp og ned kroppsbevegelse utstilt av Stonefly.
- Telle og registrere antall push-ups observert i løpet av en 3 min observasjonsperioden.
- Manipulere DO til neste eksperimentelle DO nivå og gjenta 3 min observasjonsperiode for de ekstra eksperimentelle nivåer.
Merk: Innenfor denne eksperimentell design, ble tre ulike DO nivåer evaluert.
5. Statistisk analyse
- For å utføre statistisk analyse bruk gjennomsnittlig antall push-ups på tvers av de fire steinfluer over en gruppe for en gitt DO rettssak.
- Bruk gratis R statistisk databehandling programvare 12 for å utføre en variansanalyse (ANOVA) på antall push-ups og DO-konsentrasjoner ved hjelp av rekkefølgen på hver eksperimentell studie (DO-nivå) og temperatur som COVariates. Analysert DO som diskrete nivåer av en enkelt faktor.
- Bruk en Anderson-Darling normalitet test på residualer for å se etter normalitet 13.
- Utfør en lineær regresjon på dataene ved å plotte gjennomsnittlig antall push-ups mot DO konsentrasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Seks studier av den beskrevne oppsettet ble utført ved 24 freshmen studentene i en laboratorieundervisning innstilling å kvantifisere antall push-ups steinfluer utføre som svar på ulike DO konsentrasjon i vann. Gjennomsnittlig antall push-ups utføres innenfor et DO-nivå og innenfor hvert forsøk ble slått sammen for å plotte push-ups mot DO nivået i figur 2. En ANOVA ble utført i utgangspunktet benytte DO konsentrasjon, kronologisk rekkefølge av prøvelser, temperatur, samt samspillet mellom alle variabler. Resultatene tyder på at bare oksygenkonsentrasjon betydelig påvirket antall push-ups utføres av steinfluer (R 2 adj. = 0,322, p = 0,004) og ingen andre variable eller samspillet var en signifikant prediktor for pushups. Alle data som brukes i denne analysen ble bekreftet for normalitet ved hjelp av en Anderson-Darling test.
innhold "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figur 2. Gjennomsnittlig antall push-ups utføres av steinfluer gruppert etter rettssaken plottet mot konsentrasjon av oppløst oksygen. Dette viser en signifikant negativ sammenheng (R 2 adj. = 0,322, p = 0,004) mellom push-ups og oppløst oksygen (helling av -6,063). Røde tall indikerer vanntemperaturen (i ° C) i en rettssak. Temperaturene har vært stabil over 3 min prøveperioder, men variert over eksperimentet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplemental arkivkode.: R-kode for de statistiske analysene Klikk her for å laste ned dennefil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
kritiske trinn
Denne fremgangsmåten tilveiebringer en enkel og effektiv måte å manipulere DO i et laboratorieoppsett for å utføre Adferdsstudier på vannorganismer. Vi fant det å være flere kritiske trinn / elementer for å være klar over når du utfører dette eksperimentet som er direkte knyttet til resultatene. Innenfor en prøve, er det viktig å opprettholde kammertrykket for å unngå forandringer i partialtrykket til gasser over vannet, og påfølgende DO svingninger. Etter fremgangsmåten i "testing stabiliteten av den eksperimentelle oppsett" ledd protokollen er kritisk. Inspeksjon av forseglingen av stopperen med kolben, noe som sikrer fullstendig neddykking av vakuumrøret inn i 1 liter kolbe med vann (for å hindre tilbakestrøm av romluft), og sittegassledningen og DO ledning tetning med proppen kan bidra til å opprettholde en stabil kammer miljø. I tillegg maksimere vannvolum i kammeret er nødvendig for å forbedre stabiliteten av DO innenforen prøveordning som vi har funnet ut at for lite volum resulterer i ujevn og ustabil DO manipulasjoner.
Opprettholde temperaturen på vannet i kammeret er avgjørende for god kontroll av interne DO nivåer. Mens vi var i stand til å opprettholde kaldtvannstemperaturer innenfor enkelte konsern eksperimenter, noen minimal variasjon i temperatur på tvers av ulike studiene var tydelig (figur 2). Siden vår generelle temperatur var lav (11.8-13.5˚C) og innenfor typiske området for steinfluer, gjorde det ikke viser seg å være en signifikant prediktor i vår modell for Stonefly pushups. Imidlertid er vanntemperaturen kjent for å påvirke oksygenmetningen potensialet i vann 14,15, og ikke å opprettholde kammervanntemperaturen vil ha direkte innvirkning på DO nivåer. Med en god tetning, tilstrekkelig volum av vann og stabil vanntemperatur, intern kammertrykk og gjør er enkelt vedlikeholdes gjennom hele eksperimentet og kontroll av DO mellom studiene er sbord og reproduserbar.
Begrensninger og Modifikasjoner
To potensielle begrensninger av dette forsøk er størrelsen av kammeret og lengden av hele observasjonsperioden. Volumet av vann (~ 2 L) og liten åpning i halsen av kammeret begrenser størrelsen på organismen i stand til å bli brukt. På denne skalaen, vil protokollen gir enkel substitusjon av steinfluer for andre makroinvertebrater, amfibier, og mindre fisk, men ville ikke være aktuelt for større organismer (dvs. rovfisk, blekksprut). Imidlertid ville det være mulig å skalere dette eksperimentet opp ved hjelp av større glass, og å tilpasse den generelle protokollen for å møte ulike læring / forskning mål med større organismer. I tillegg bør en hvilken som helst substrat som kreves i kammeret for større organismer tas hensyn til ved valg av glass på grunn av liten hals størrelse på 2 liter kolbe. I vårt eksperiment små elve steiner ble samlet inn med steinfluer og ga rikelig kammer s ubstrate for steinfluer å utføre pushups.
Innvendige kammerforhold over korte tidsobservasjonsperiodene ble opprettholdt med minimale svingninger, men usikkerheten er fortsatt om lengre observasjonsperioder. Utnytte 3 min observasjonsperioden beskrevet i protokollen, kammeret vanntemperatur og DO-nivåer ble opprettholdt ved konstante verdier. Vi var i stand til å opprettholde DO og vanntemperaturen opp til en 5 minutters observasjonsperioden, men ved en 10 min lang observasjonsperiode, vanntemperaturer i kammeret begynte å stige. I den aktuelle protokoll, er det ikke mulig å forlenge observasjonsperioden ut over 5 min. Men tilpasninger til dagens protokoll (for eksempel ved hjelp av et klimakontrollert rom) kan tillate økt langsiktig stabilitet i vanntemperaturer. Videre vil en mer robust og detaljert analyse av observasjonstiden versus omgivelsesvannforhold (temperatur, DO, delvis trykk) å fastslå begrensende faktorer.
innhold "> Denne protokollen har evnen til å bli modifisert (som nevnt ovenfor) for å møte en rekke forskjellige behov og formål. Ytterligere en modifikasjon av eksisterende protokoll vil være en modifikasjon av den boblende systemet. Selv om vi benyttet utelukkende en liten kobberrør å boble vannet, vi la merke til at tillegg av de store nitrogengassbobler ofte løsner de steinfluer fra deres holder på elve steiner og sendte dem flyter rundt i kammeret. Vi forsøkte å bruke en boblende stein for jevnere spredning av nitrogengass , men fant at kammeret vannet ikke ble agitert nok til å jevnt dispergere nitrogengass, noe som resulterer i en kolonne av hypoksiske betingelser i kammeret. Ytterligere forbedring av den nitrogengassleveringssystemet kan gi nyttig innsikt, og fjerne den potensielle forvirre for omplassering av steinfluer fra underlaget mellom DO prøvelser. Betydning og fremtidige applikasjoner
Dette eksperimentet var den første i sitt slag til iavleiringer en detaljert protokoll utvikling for å manipulere DO-nivåer for dyrs atferd observasjon i et laboratorium. Mens andre publiserte arbeider foreslått bruk av nitrogengass for å manipulere DO-nivåer 7,8,16, er utilstrekkelig metodiske detaljer som er gitt for å muliggjøre replikasjon. Interessen for denne protokollen utvikling stammet fra vårt ønske om å manipulere DO nivåer og observere dyrs atferd for bruk i en college-nivå innledende økologi laboratorium ved Juniata College. Innenfor klassen av 24 elever, denne protokollen viste reproduserbare over studier med ulike DO nivåer og på tvers av grupper av studenter. Dessuten gir denne protokollen en svært tilgjengelig og kostnadseffektiv måte å manipulere DO nivåer for laboratorium eksperimentering.
Mens denne protokollen ble utviklet spesielt for bruk med steinfluer i en undervisnings lab, kan det lett tilpasses for andre formål. Mer spesifikt, denne protokollen kan lett brukes med andre små vannmakroinvertebrater, fisk, og til og med amfibier avhengig av arten av interesse. For eksempel medlemmer av ordenen Amphipodia som øker deres lokomotiv aktivitetsnivået til hypoksi 17 kan brukes, eller gullfisk (Carassius auratus) som viser en "gulping" oppførsel ved vannoverflaten under hypoksiske forhold 16. I tillegg ulike livsstadier vannlevende organismer kan også brukes med denne protokollen for å bidra ytterligere vår forståelse av organisme oksygen krav gjennom utvikling. Denne protokollen kan også benyttes til å studere biokjemiske reaksjoner på hypoksi ved å eksperimentere med amfibier som mudpuppies (Necturus maculosus) 18. Videre kan denne protokollen skaleres opp eller ned i størrelse for å møte behovene til større eller mindre organismer og undervisning eller forskning. Mens vi føler at protokollen og den spesifikke programmet i seg selv er av bred økologisk interesse, den største styrken til denne protokollen,l er at det gir en flott fundament utvikling på tvers av taksonomiske grupper og eksperimentelle mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Filter flask 2 L | Pyrex | 5340 | |
| Rubber Stopper size 6 | Sigma-Aldrich | Z164534 | |
| Nalgene 180 Clear Plastic Tubing | Thermo Scienfitic | 8001-1216 | |
| Whisper 60 air pump | Tetra | ||
| Standard flexible Air line tubing | Penn Plax | ST25 | |
| 0.25 inch Copper tubing | Lowes Home Improvement | 23050 | |
| Male hose barb | Grainger | 5LWH1 | |
| Female Connector | Grainger | 20YZ22 | |
| Heavy Duty Dissolved Oxygen Meter | Extech | 407510 | |
| Nitrogen gas | Matheson TRIGAS | ||
| Radnor AF150-580 Regulator | Airgas | RAD64003036 |
References
- Hoback, W., Stanley, D. Insects in hypoxia. J. Insect Physiol. 47 (6), 533-542 (2001).
- Craig, J., Crowder, L. Hypoxia-induced habitat shifts and energetic consequences in Atlantic croaker and brown shrimp on the Gulf of Mexico shelf. Mar Ecol-Prog Ser. 294, 79-94 (2005).
- Gaulke, G., Wolfe, J., Bradley, D., Moskus, P., Wahl, D., Suski, C. Behavioral and Physiological Responses of Largemouth Bass to Rain-Induced Reductions in Dissolved Oxygen in an Urban System. T Am Fish Soc. 144 (5), 927-941 (2015).
- Genkai-Kato, M., Nozaki, K., Mitsuhashi, H., Kohmatsu, Y., Miyasaka, H., Nakanishi, M. Push-up response of stonefly larvae in low-oxygen conditions. Ecol Res. 15 (2), 175-179 (2000).
- McCafferty, W. Aquatic Entomology: The Fishermen's and Ecologists' Illustrated Guide to Insects and Their Relatives. , Jones and Bartlett. (1983).
- Chapman, L., Schneider, K., Apodaca, C., Chapman, C. Respiratory ecology of macroinvertebrates in a swamp-river system of east Africa. Biotropica. 36 (4), 572-585 (2004).
- Suski, C., Killen, S., Kieffer, J., Tufts, B. The influence of environmental temperature and oxygen concentration on the recovery of largemouth bass from exercise implications for live - release angling tournaments. J Fish Biol. 68, 120-136 (2006).
- Abdallah, S., Thomas, B., Jonz, M. Aquatic surface respiration and swimming behaviour in adult and developing zebrafish exposed to hypoxia. J Exp Biol. 218 (11), 1777-1786 (2015).
- Ciba Geigy Ag. Method and apparatus for degassing viscous liquids and removing gas bubbles suspended therein. US patent. Gassmann, H., Chen, C., Vermot, M. , 3,853,500 (1974).
- Hewlett-Packard Company. Apparatus for degassing liquids. US patent. Berndt, M., Schomburg, W., Rummler, Z., Peters, R., Hempel, M. , 6,258,154 (2001).
- Sims, C., Gerner, Y., Hamberg, K. Systec inc.,. Vacuum degassing. US patent. , 6494938 (2002).
- Barbour, M., Gerritsen, J., Snyder, B., Stribling, J. Report number EPA 841-B-99-002. Rapid bioassessment protocols for use in streams and wadeable rivers. , USEPA. Washington. (1999).
- Anderson, T., Darling, D. A Test of Goodness of Fit. J Am Stat Assoc. 49 (268), 765-769 (1954).
- Rounds, S., Wilde, F., Ritz, G. Chapter A6 Field Measurements. Section 6.2 DISSOLVED OXYGEN. National Field Manual for the Collection of Water-Quality Data. , U.S. Geological Survery. Virginia, U.S. (2013).
- Hem, J. Study and Interpretation of the Chemical Characteristics of Natural. , U.S. Geological Survery. (1985).
- Burggren, W. 34;Air Gulping" Improves Blood Oxygen Transport during Aquatic Hypoxia in the Goldfish Carassius auratus. Physiol Zool. 55 (4), 327-334 (2015).
- Frederic, H., Mathieu, J., Garlin, D., Freminet, A. Behavioral, Ventilatory, and Metabolic Responses to Severe Hypoxia and Subsequent Recovery of the Hypogean Niphargus rhenorhodanensis and the Epigean Gammarus fossarum (Crustacea: Amphipoda). Physiol Zool. 68 (2), 223-244 (2015).
- Ultsch, G., Duke, J. Gas Exchange and Habitat Selection in the Aquatic Salamanders Necturus maculosus and Cryptobranchus alleganiensis. Oecologia. 83 (2), 250-258 (1990).
