Summary
Den här artikeln beskriver en enkel och reproducerbar protokoll för att manipulera löst syreförhållandena i laboratoriemiljö för djurbeteendestudier. Detta protokoll kan användas i både undervisning och forskning laboratoriemiljö för att utvärdera organismsvar macroinvertebrates, fiskar eller amfibier till förändringar i koncentrationen av löst syre.
Abstract
Förmågan att manipulera löst syre (DO) i laboratoriemiljö har betydande tillämpning för att undersöka ett antal ekologiska och organismbeteendefrågor. Protokollet som beskrivs här ger en enkel, reproducerbar och kontrollerad metod för att manipulera DO att studera beteendesvar i vattenlevande organismer till följd av hypoxisk och anoxiska förhållanden. När de utför avgasning av vatten med kväve används ofta i laboratoriemiljö, finns ingen explicit metod för ekologisk (akvatisk) ansökan i litteraturen, och detta protokoll är den första att beskriva ett protokoll till degasify vatten för att observera organismsvar. Denna teknik och protokoll utvecklades för direkt tillämpning för vatten macroinvertebrates; kunde dock små fiskar, amfibier, och andra vattenlevande ryggradsdjur enkelt sätt kan ersättas. Det möjliggör enkel hantering av DO nivåer som sträcker sig från 2 mg / l till 11 mg / L med stabilitet under upp till en 5 min djur-observationsperioden.Bortom en 5 min observationsperiod vattentemperaturer började stiga, och vid 10 min DO nivåer blev alltför instabil för att underhålla. Protokollet är skalbar till studien organismen, reproducerbar och pålitlig, vilket möjliggör ett snabbt genomförande i inledande undervisningslabb och på hög nivå forskningsansökningar. De förväntade resultaten av denna teknik bör gälla löst syre ändras till beteendemässiga reaktioner av organismer.
Introduction
Löst syre (DO) är en viktig fysikalisk parameter viktig i att förmedla ett antal biologiska och ekologiska processer inom vattenekosystem. Exponeringar mot akut och kronisk subletal hypoxi minska tillväxttakten i vissa vattenlevande insekter och minska överlevnaden av insekter utsätts en. Detta protokoll har utvecklats för att ge en kontrollerad metod för att manipulera DO nivåer i strömmande vatten för att observera effekterna på djurens beteende. Eftersom alla aeroba vattenlevande organismer överlevnad beror på syrekoncentrationen för att leva och föröka sig, är förändringar i koncentrationen av DO ofta uttryck i beteendeförändringar av organismer. Fler mobila ryggradslösa vattendjur och fiskar har observerats att svara på låga syrehalter (hypoxiska) genom att söka lokaler med högre DO 2,3. För mindre rörliga vattenlevande organismer, beteende anpassningar öka intaget av DO kan vara det enda möjliga alternativet. Den akvatiska makroinvertebrater ordning Plecoptera (stonefly) har noterats att utföra "push-up" rörelser för att öka flödet av vatten, och upptag av syre, över deras yttre gälar 4 - 6. Dessa adaptiva beteende har observerats i naturliga miljöer och i laboratorieexperiment.
Laboratorium manipulation av DO i vatten öppnar upp stora möjligheter för djurbeteendestudier, men betydande brister i metod driftsättning finns. Till exempel använde en studie stora akvarier att utvärdera den fysiologiska svarstid Largemouth basen (Micropterus salmoides) till hypoxiska miljöer efter gasning med kväve, men föga detalj ges för metoden 7. En annan studie utförd på zebrafisk (Danio rerio) beskrivs användning av kvävgas och en porös sten för att leverera gas till vatten och minska DO i vattnet åtta. För kemi-baserade applikationer, metoder för avgasning av lösningsmedel utnyttjar specialiseradeapparat 9-11 för att ta bort syre från lösningsmedel, men skulle inte vara lämpligt för foderbeteendestudier. Även om dessa studier använder metoder för att avlägsna syre från vatten, kan någon beskrivande metod identifieras som skulle göra det möjligt för utvärdering av djurens beteende som svar på DO förändringar.
Denna metod beskrivs i det följande är ett försök att fullständigt beskriva ett protokoll för manipulering av DO av vatten genom användning av kvävgas. Vidare har denna metod utvecklats mot att observera relationer mellan stonefly beteende (armhävningar) och göra det användes i en förstaårselev-nivå biologi laboratorium. En av de största fördelarna med denna metod är att det lätt kan utföras inom ett laboratorium med gemensam glas och material tillgängliga för de flesta sekundära och högre utbildningsinstitutioner. Protokollet är också lätt att anpassa, vilket för individer att skala förfarande för att uppfylla de mål som anges i forsknings- eller undervisningsprogram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: Detta experiment använde inte ryggradsdjur och därför inte kräver godkännande av Juniata College Institute for Animal Care och användning kommittén. Men för personer som anpassar den här metoden för användning med ryggradsdjur, bör IACUC godkännande sökas.
1. Fält Provtagning
- Bestämma och utvärdera potentiella fält platser för förmågan att samla in, lagra och transportbäcksländor snabbt för att minimera tiden i transit med en maximal rekommenderad tid i transit av en timme.
- Utför kick-net provtagning på valda fält webbplats enligt standard kick-net förfaranden tillräckligt många gånger för att samla in minst 35 bäcksländor 12.
- Samla 50 liter ström vatten och stenar med en maximal diameter på 2 cm från vattendrag.
- Placera akvarier i kylskåp inställt på temperaturen hos strömmen stället. Fördela stenar som samlats på strömmen plats i akvarier och fyll med 4 liter ström vatten per akvarium. placera 20-30 Insamlade bäcksländor per akvarium och placera en bubblande sten fäst vid ett akvarium bubbel i varje tank och slå på bubblers att kontinuerligt lägga rumsluften till vattnet.
- Låt bäcksländor att anpassa sig till den nya miljön i akvarier för en 48 timmars period.
Figur 1. Ställ upp för löst syre manipulation. (A) 1) Montering för kopparrör manliga slang 2) Placering av propp tätning att undersöka för att säkerställa bra tätningskolv. (B) 1) 2 L sidoarmskolv fylld med 1,9 liter vatten 2) Gas röret och luftbubblare (blå) för användning i kvävebubbling och rumsluft bubblande, respektive 3) Kväve tanken och mätas värden 4) 2 L kolv fylld med 0,4 liter vatten med vakuumrör nedsänkt 5) upplöst syremätare. klicka här för atten större version av denna siffra.
2. Försöks Ställ in
- På en bänk, ansluta en vanlig väggar vakuumrör åt sidan armen av en 2 L sidoarm kolv som visas (en i figur 1B).
- Fyll kolven med 1,9 L av strömmande vatten från 3 L plastbehållare som håller samlas ström vatten i kylskåp inställt på 12 ° C.
- Placera kolven och slang på en bricka stor nog att rymma ett isbad runt sidoarmskolv utan att skymma vyn i kolven inre och fylla magasinet med is.
- Borra hål två 3 mm diameter i en gummipropp för att tillåta passage av en) ett kopparrör för att leverera gas till kärlet och 2) sonden i en DO mätaren in i två L sidoarmskolv (1 i figur 1 B) .
- Göra ett lateralt snitt från kanten av proppen till ett av hålen för att medge placering av tråden i DO sonden i proppen.
- Anslut en kopplare med en 3 mm manliga slangBarb till en bit av 2 mm diameter koppar rör (1 i Figur 1A). Säkerställa att detta rör är tillräckligt lång för att nå till inom 10 cm från botten av kolven samtidigt nå genom proppen.
- Placera röret med kopplaren även det andra hålet i proppen tills längden från botten av proppen är tillräckligt för att nå till inom 10 cm från botten av kolven.
- Anslut en 0,75 m längd, tunnväggigt polyeten gas rör med en diameter av 3 mm till kopplaren på röret.
- Skjut både DO sonden och kopparrör i kolven och kolven med proppen.
- Kontrollera för en säker tätning mellan proppen och kolven, såväl som en tät passning mellan röret och sonden tråden inuti proppen.
- Fyll en 1 L flaska med 0,4 liter kranvatten och placera i anslutning till facket med isbadet och termos.
- Dränka polyetenröret som kommer från den stora vakuumkolven in i vattnet i en L kolv. säkrarör med tejp så att det kommer att förbli nedsänkt genom experimentet.
- Anslut 3 mm diameter gasledning från vakuumkolven till ett akvarium rum luftbubbel. Börjar att bubbla vattnet i 2 L kolv genom att koppla in akvariet bubbelenheten, som introducerar rumsluft och syre till vattnet.
- Övervaka DO koncentrationen och temperaturen på vattnet med DO mätare för 5 min eller till dess att jämvikt av DO upprättas inom kammaren så att liten förändring i DO sker.
3. Testa stabilitet Experimental Ställande
- Testa varje inställning för DO stabilitet före tillsatsen av bäcksländor.
- Tillsätt tre eller fyra stenar till 2 L kolv så att bäcksländor har substrat gynnsamt för armhävningar.
- Börja en rättegång manipulation av DO genom att koppla gasröret från bubbel och kopplar den till kväve gasledningen.
- Börja bubblande kväve vid 20 kubikfot per timme (CFH) för cirka 40sek till 1 min.
- När DO har sjunkit till inom 0,5 mg / L för målkoncentrationen, minska flödet till 15 CFH och låta koncentrationen sjunka till målet.
- Upphör flöde av kväve omedelbart när målkoncentrationen nåtts.
- Använda akvariet rummet-luftbubblare för att återföra koncentrationen till målkoncentrationen om DO minskar under målet.
- Om DO är instabil under testning av en set-up sedan kontrollera vattenvolymen är fortfarande på 1,9 L och inget vatten har bubblade ut, vattentemperaturen är stabil och inte förändras, och tätningar på alla kopplingar verkar vara tät och förseglas.
- När tre försök har gjorts och försöksledaren har förtroende för förmågan att kontrollera DO, bifoga gasledningen till bubbel och bubblan till jämvikt igen.
- Bubbla till jämvikt genom att fästa 3 mm diameter gasledningen till akvariet bubblare och start av tillsats av rumsluft till vattnet tills koncentrationen avsyre i vattnet inte ökar eller förändras till tre minuter.
- En gång vid jämvikt, sluta bubblande och bryta förseglingen kolven.
4. Stonefly Push-up Experiment
- Dela upp det totala antalet bäcksländan med antalet observatörer för att bestämma antalet försök att utföra.
- Fastställer andra DO nivåer mellan 2 och 10 mg / L för att utvärdera beteendegensvar av bäcksländan (antal pushups).
- Ställ upp en flaska per prov och tillsätt en lika många bäcksländor som det finns observatörer till kolven (4 bäcksländor inom denna design), placera sonden och röret tillbaka in i kolven, sedan återförsluta kolven med gummipropp.
Notera: En initial DO koncentration av 10 mg / L valdes som den första observationspunkten eftersom det var DO koncentrationen av strömmen från där bäcksländan samplades. - När vattnet är på 10 mg / L genom att bubbla följande stegen 2,10-2,11, spela in utgångs vattentemperatur och tillåtabäcksländan att fästa på berg substratet i kolven.
- Tilldela bara en observatör för att titta på en enda stonefly att säkerställa korrekt räkning av push-up beteende, som är upp och ner kroppsrörelse som uppvisas av stonefly.
- Räkna och registrera antalet armhävningar observerats under loppet av en 3 min observationsperiod.
- Manipulera DO till nästa experimentella DO nivå och upprepa 3 min observationsperiod för ytterligare experimentella nivåer.
Obs: Inom detta experimentell design har tre olika DO nivåer utvärderas.
5. Statistisk analys
- För att utföra statistisk analys använder genomsnittligt antal armhävningar över de fyra bäcksländor över en grupp för en given DO rättegång.
- Använd den fria R statistiska beräkningar programvara 12 för att utföra en variansanalys (ANOVA) på antalet armhävningar och DO-koncentrationer med hjälp av storleksordningen varje experimentell studie (DO nivå) och temperatur som covariates. Analyseras DO som diskreta nivåer av en enskild faktor.
- Använd en Anderson-Darling normalitet test på restprodukter för att kontrollera normalitet 13.
- Utför en linjär regression på data genom att rita det genomsnittliga antalet armhävningar mot DO koncentrationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sex studier av den beskrivna installationen utfördes av 24 freshmen studenter i undervisningslaboratoriemiljö för att kvantifiera antalet armhävningar bäcksländor utföra som svar på olika DO koncentration i vatten. Det genomsnittliga antalet armhävningar utförs inom en DO-nivå och inom varje försök slogs samman för att rita armhävningar mot DO nivån i Figur 2. En ANOVA utfördes initialt utnyttja DO koncentration, ordningsföljd av försök, temperatur, samt interaktioner mellan alla variabler. Resultaten tyder på att endast DO koncentrationen påverkas signifikant antalet armhävningar utförs av bäcksländor (R 2 adj. = 0,322, p = 0,004) och ingen annan variabel eller interaktion var en signifikant prediktor för armhävningar. Alla data som används i denna analys bekräftades för normalitet med hjälp av en Anderson-Darling-test.
innehåll "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figur 2. Medelvärde antal armhävningar utförs av bäcksländor grupperade efter prövning avsatt mot koncentrationen löst syre. Detta visar en betydande negativ relation (R 2 adj. = 0,322, p = 0,004) mellan armhävningar och upplöst syrekoncentration (lutning -6,063). Röda siffror anger vattentemperatur (i ° C) för en rättegång. Temperaturerna var stabila över 3 min provanställningar, men varierade över experimentet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande kodfil. R-koden för statistiska analyser Klicka här för att ladda nerfil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
kritiska stegen
Detta förfarande ger ett enkelt och effektivt sätt att manipulera DO i laboratoriemiljö för att utföra beteendestudier på vattenlevande organismer. Vi fann att det finns flera viktiga steg / objekt att vara medveten om när du utför detta experiment som direkt relaterade till resultaten. Inom en studie, är det kritiskt att upprätthålla kammartrycket för att undvika förändringar i partialtrycket av gaser över vattnet, och efterföljande DO svängningar. Efter stegen i "testa stabiliteten i experimentuppställning" under protokollet är kritisk. Inspektera tätningen av proppen med kolven, vilket säkerställer fullständig nedsänkning av vakuumslangen in i en L kolv med vatten (för att förhindra backflöde av rumsluft), och sittplatser gasledningen och DO tråd tätning med proppen kan bidra till att upprätthålla en stabil kammarmiljön. Dessutom, maximera mängden vatten i kammaren är nödvändigt att förbättra stabiliteten hos DO inomen studie som vi har funnit att alltför liten volym resulterar i oregelbunden och instabil DO manipulationer.
Bibehålla vattentemperaturen i kammaren är absolut nödvändigt för god kontroll av interna DO nivåer. Medan vi kunde upprätthålla temperaturer kallvatten inom enskilda gruppsexperiment, var några minimala variationer i temperatur mellan olika försök uppenbar (figur 2). Eftersom vår totala temperaturintervall var låg (11.8-13.5˚C) och inom det typiska området för bäcksländor, gjorde det inte visa sig vara en betydande prediktor i vår modell för stonefly armhävningar. Emellertid är vattentemperaturen känt att åstadkomma syremättnad potential vatten 14,15, och misslyckas med att upprätthålla kammar vattentemperaturen skulle ha direkta effekter på DO nivåer. Med en bra tätning, tillräcklig volym vatten och stabil vattentemperatur, inre kammartryck och DO är lättskött hela experimentet och kontroll av DO mellan försöken är sbord och reproducerbar.
Begränsningar och modifikationer
Två potentiella begränsningar av detta experiment är storleken av kammaren och längden av observationsperioden. Den volym vatten (~ 2 L) och liten öppning i halsen av kammaren begränsar storleken på organismen kunna användas. I denna skala, skulle protokollet möjliggör enkel substitution av bäcksländan på andra macroinvertebrates, amfibier och mindre fiskar, men skulle inte vara tillämplig för större organismer (dvs., rovfiskar, octopi). Men skulle det vara möjligt att skala detta experiment upp med hjälp av större glas, och anpassa den totala protokollet för att möta olika lärande / forskningsmål med större organismer. Dessutom bör vilket som helst substrat som krävs i kammaren för större organismer beaktas när man väljer glasvaror på grund av liten halsstorleken på 2 L kolv. I vårt experiment små flodstenar samlades med bäcksländor och gav gott kammare s ubstrate för bäcksländan att utföra armhävningar.
Interna kammarförhållanden över korta tidsobservationsperioder hölls med minimala svängningar, men osäkerhet kvarstår om längre observationsperioder. Utnyttjar 3 min observationsperioden som beskrivs i protokollet, kammar vattentemperatur och DO nivåer upprätthölls vid konstanta värden. Vi kunde upprätthålla DO och vattentemperatur upp till en 5 min observationsperiod, men vid en 10 min lång observationsperiod, vattentemperaturer i kammaren började stiga. I det nuvarande protokollet, är det inte möjligt att förlänga observationsperioden efter fem minuter. Dock kunde anpassningar till det nuvarande protokollet (som att använda ett klimat kontrollerade rum) möjliggöra ökad långsiktig stabilitet av vattentemperaturer. Vidare skulle en mer robust och detaljerad analys av observationstiden kontra omgivningsbetingelser vatten (temperatur, DO, partialtryck) bidra till att avgöra begränsande faktorer.
innehåll "> Detta protokoll har förmågan att ändras (som nämnts ovan) att uppfylla ett antal olika behov och mål. En ytterligare modifiering av det nuvarande protokollet skulle vara en modifiering av bubblande systemet. Medan vi utnyttjas endast en liten kopparrör bubbla vattnet, gjorde vi märker att tillsatsen av de stora kväve gasbubblor ofta rubbas de bäcksländor från sitt grepp om floden stenar och skickade dem flyter runt kammaren. vi försökte använda en bubblande sten för jämnare spridning av kvävgas , men fann att kammaren vattnet inte omrördes tillräckligt för att jämnt dispergera den kvävgas, vilket resulterar i en kolonn av hypoxiska förhållanden inne i kammaren. Ytterligare förfining av kvävgas tillförselsystem kan ge användbar insikt, och ta bort den potentiella FÖRBRYLLA av dislodging bäcksländan från substratet mellan DO prövningar. Betydelse och framtida tillämpningar
Detta experiment var det första i sitt slag iclude ett detaljerat protokoll utveckling att manipulera DO nivåer för djurens beteende observation i laboratoriemiljö. Medan andra publicerade arbeten föreslog användning av kvävgas för att manipulera DO nivåer 7,8,16, är otillräcklig metod detalj ges för att möjliggöra för replikering. Intresset för detta protokoll utveckling berodde på vår önskan att manipulera DO nivåer och observera djurens beteende för användning i en college-nivå inledande ekologi laboratorium vid Juniata College. Inom klassen av 24 studenter, detta protokoll visade sig reproducerbar i studierna med olika DO nivåer och mellan grupper av studenter. Dessutom ger detta protokoll en mycket lättillgänglig och kostnadseffektivt sätt att manipulera DO nivåer för laboratorieexperiment.
Även om detta protokoll utvecklades speciellt för användning med bäcksländan i en undervisning labb, kan det enkelt anpassas för andra mål. Mer specifikt, kan detta protokoll enkelt användas med andra små vattenlevandemacroinvertebrates, fisk, och även amfibier beroende på art av intresse. Till exempel medlemmar av ordningen Amphipodia som ökar deras lokomotiv aktivitet som svar på hypoxi 17 skulle kunna användas, eller guldfisk (Carassius auratus) som uppvisar en "gulping" beteende på vattenytan under hypoxiska betingelser 16. Dessutom kan olika livsstadier vattenlevande organismer även användas med detta protokoll för att öka vår förståelse för organismsyrebehov under utveckling. Detta protokoll kan också användas för att studera biokemiska svar på hypoxi genom att experimentera med amfibier såsom mudpuppies (necturus maculosus) 18. Vidare kan detta protokoll skalas upp eller ner i storlek för att möta behoven hos större eller mindre organismer och undervisnings- eller forskningsansökningar. Även om vi anser att protokollet och den specifika själva ansökan är bred ekologiskt intresse, den största styrkan i denna protocol är att det ger en bra grund utveckling över taxonomiska grupper och experimentella mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Filter flask 2 L | Pyrex | 5340 | |
| Rubber Stopper size 6 | Sigma-Aldrich | Z164534 | |
| Nalgene 180 Clear Plastic Tubing | Thermo Scienfitic | 8001-1216 | |
| Whisper 60 air pump | Tetra | ||
| Standard flexible Air line tubing | Penn Plax | ST25 | |
| 0.25 inch Copper tubing | Lowes Home Improvement | 23050 | |
| Male hose barb | Grainger | 5LWH1 | |
| Female Connector | Grainger | 20YZ22 | |
| Heavy Duty Dissolved Oxygen Meter | Extech | 407510 | |
| Nitrogen gas | Matheson TRIGAS | ||
| Radnor AF150-580 Regulator | Airgas | RAD64003036 |
References
- Hoback, W., Stanley, D. Insects in hypoxia. J. Insect Physiol. 47 (6), 533-542 (2001).
- Craig, J., Crowder, L. Hypoxia-induced habitat shifts and energetic consequences in Atlantic croaker and brown shrimp on the Gulf of Mexico shelf. Mar Ecol-Prog Ser. 294, 79-94 (2005).
- Gaulke, G., Wolfe, J., Bradley, D., Moskus, P., Wahl, D., Suski, C. Behavioral and Physiological Responses of Largemouth Bass to Rain-Induced Reductions in Dissolved Oxygen in an Urban System. T Am Fish Soc. 144 (5), 927-941 (2015).
- Genkai-Kato, M., Nozaki, K., Mitsuhashi, H., Kohmatsu, Y., Miyasaka, H., Nakanishi, M. Push-up response of stonefly larvae in low-oxygen conditions. Ecol Res. 15 (2), 175-179 (2000).
- McCafferty, W. Aquatic Entomology: The Fishermen's and Ecologists' Illustrated Guide to Insects and Their Relatives. , Jones and Bartlett. (1983).
- Chapman, L., Schneider, K., Apodaca, C., Chapman, C. Respiratory ecology of macroinvertebrates in a swamp-river system of east Africa. Biotropica. 36 (4), 572-585 (2004).
- Suski, C., Killen, S., Kieffer, J., Tufts, B. The influence of environmental temperature and oxygen concentration on the recovery of largemouth bass from exercise implications for live - release angling tournaments. J Fish Biol. 68, 120-136 (2006).
- Abdallah, S., Thomas, B., Jonz, M. Aquatic surface respiration and swimming behaviour in adult and developing zebrafish exposed to hypoxia. J Exp Biol. 218 (11), 1777-1786 (2015).
- Ciba Geigy Ag. Method and apparatus for degassing viscous liquids and removing gas bubbles suspended therein. US patent. Gassmann, H., Chen, C., Vermot, M. , 3,853,500 (1974).
- Hewlett-Packard Company. Apparatus for degassing liquids. US patent. Berndt, M., Schomburg, W., Rummler, Z., Peters, R., Hempel, M. , 6,258,154 (2001).
- Sims, C., Gerner, Y., Hamberg, K. Systec inc.,. Vacuum degassing. US patent. , 6494938 (2002).
- Barbour, M., Gerritsen, J., Snyder, B., Stribling, J. Report number EPA 841-B-99-002. Rapid bioassessment protocols for use in streams and wadeable rivers. , USEPA. Washington. (1999).
- Anderson, T., Darling, D. A Test of Goodness of Fit. J Am Stat Assoc. 49 (268), 765-769 (1954).
- Rounds, S., Wilde, F., Ritz, G. Chapter A6 Field Measurements. Section 6.2 DISSOLVED OXYGEN. National Field Manual for the Collection of Water-Quality Data. , U.S. Geological Survery. Virginia, U.S. (2013).
- Hem, J. Study and Interpretation of the Chemical Characteristics of Natural. , U.S. Geological Survery. (1985).
- Burggren, W. 34;Air Gulping" Improves Blood Oxygen Transport during Aquatic Hypoxia in the Goldfish Carassius auratus. Physiol Zool. 55 (4), 327-334 (2015).
- Frederic, H., Mathieu, J., Garlin, D., Freminet, A. Behavioral, Ventilatory, and Metabolic Responses to Severe Hypoxia and Subsequent Recovery of the Hypogean Niphargus rhenorhodanensis and the Epigean Gammarus fossarum (Crustacea: Amphipoda). Physiol Zool. 68 (2), 223-244 (2015).
- Ultsch, G., Duke, J. Gas Exchange and Habitat Selection in the Aquatic Salamanders Necturus maculosus and Cryptobranchus alleganiensis. Oecologia. 83 (2), 250-258 (1990).
