Summary
En este artículo se describe un protocolo simple y reproducible para manipular las condiciones de oxígeno disuelto en un entorno de laboratorio para estudios de comportamiento animal. Este protocolo se puede utilizar tanto en entornos de enseñanza y la investigación de laboratorio para evaluar la respuesta del organismo de macroinvertebrados, peces, anfibios o de cambios en la concentración de oxígeno disuelto.
Abstract
La capacidad de manipular el oxígeno disuelto (DO) en un entorno de laboratorio tiene una aplicación importante para investigar una serie de cuestiones ecológicas y de comportamiento del organismo. El protocolo descrito aquí proporciona un método simple, reproducible, y controlado para manipular DO para estudiar la respuesta de comportamiento en los organismos acuáticos resultantes de la hipoxia y condiciones anóxicas. Durante la realización de la desgasificación del agua con nitrógeno se utiliza comúnmente en entornos de laboratorio, ningún método explícito para su aplicación ecológica (acuático) existe en la literatura, y este protocolo es el primero en describir un protocolo para desgasificar el agua para observar la respuesta del organismo. Esta técnica y el protocolo fueron desarrollados para la aplicación directa de los macroinvertebrados acuáticos; Sin embargo, pequeños peces, anfibios y otros vertebrados acuáticos podrían ser fácilmente sustituidos. Se permite la fácil manipulación de los niveles de OD que van desde 2 mg / L a 11 mg / L con la estabilidad para un máximo de un período de observación de los animales-5 min.Más allá de un periodo de observación de 5 minutos la temperatura del agua comenzó a subir, ya los 10 minutos se convirtieron en los niveles de OD demasiado inestable para mantener. El protocolo es escalable para el organismo estudio, reproducible y fiable, lo que permite una rápida implementación en laboratorios de enseñanza de introducción y aplicaciones de investigación de alto nivel. Los resultados esperados de esta técnica deberán establecer una relación disuelto cambios de oxígeno a las respuestas de comportamiento de los organismos.
Introduction
El oxígeno disuelto (DO) es un parámetro fisicoquímico clave importante en la mediación de un número de procesos biológicos y ecológicos dentro de los ecosistemas acuáticos. Las exposiciones a la hipoxia aguda y crónica subletal reducir las tasas de crecimiento en ciertos insectos acuáticos y reducen la supervivencia de los insectos expuestos 1. Este protocolo fue desarrollado para proporcionar un método controlado para manipular los niveles de OD en el agua corriente para observar los efectos sobre el comportamiento animal. Dado que la supervivencia de todos los organismos acuáticos aeróbicos 'depende de la concentración de oxígeno para vivir y reproducirse, los cambios en la concentración de DO a menudo se reflejan en los cambios de comportamiento de los organismos. Se han observado más invertebrados acuáticos y peces móviles para responder a bajas concentraciones de oxígeno (hipoxia) mediante la búsqueda de los lugares con mayor DO 2,3. Para los organismos acuáticos menos móviles, adaptaciones de comportamiento para aumentar la ingesta de DO puede ser la única opción viable. El orden de macroinvertebrados acuáticos de PlecOptera (stonefly) se ha observado para realizar movimientos "push-up" para aumentar el flujo de agua, y la absorción de oxígeno, a través de sus branquias externas 4 - 6. Estos comportamientos adaptativos se han observado en los entornos naturales y en experimentos de laboratorio.
manipulación en el laboratorio de OD en el agua abre importantes oportunidades para estudios de comportamiento animal, pero existen importantes lagunas en la implementación metodológica. Por ejemplo, un estudio utilizó grandes acuarios para evaluar el tiempo fisiológico respuesta de perca americana (Micropterus salmoides) a entornos hipóxicos siguiente gasificación con nitrógeno, pero escasa detalle se da para la metodología 7. Otro estudio realizado en peces cebra (Danio rerio) describe el uso de gas nitrógeno y una piedra porosa para entregar gas al agua y reducir la DO del agua 8. Para las aplicaciones basadas en la química, métodos para la desgasificación de solventes utilizan especializadaaparato 9-11 para eliminar el oxígeno a partir de disolventes, pero no sería adecuado para estudios de comportamiento animal. Si bien estos estudios emplean métodos para eliminar el oxígeno del agua, ningún método descriptivo se pudo identificar que permitiría la evaluación de la conducta animal en respuesta a cambios DO.
Este método se describe a continuación es un intento para describir completamente un protocolo para la manipulación de la DO de agua mediante el uso de gas nitrógeno. Además, este método fue desarrollado hacia la observación de relaciones entre el comportamiento stonefly (flexiones) y DO que se empleó en un laboratorio de biología de nivel de primer año. Una de las principales ventajas de este método es que se puede realizar fácilmente en un laboratorio con material de vidrio y materiales accesibles a la mayoría de los centros de enseñanza secundaria y superior común. El protocolo también es fácilmente adaptable, lo que permite a las personas a escala del procedimiento para cumplir con los objetivos establecidos para aplicaciones de investigación o de enseñanza.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Nota: Este experimento no hizo uso de los vertebrados y por lo tanto no requieren la aprobación por el Instituto de Juniata College para el Cuidado de Animales y el empleo. Sin embargo, para las personas adaptación de este método para su uso con vertebrados, la aprobación del IACUC debe ser buscada.
Recogida de muestras 1. Campo
- Determinar y evaluar los posibles sitios de campo para la capacidad de recopilar, almacenar y stoneflies de transporte rápido para minimizar el tiempo en tránsito con un tiempo máximo recomendado en el tránsito de 1 hr.
- Tomar muestras de lanzamiento neta en el lugar de campo seleccionado siguiendo los procedimientos estándar kick-net suficientes veces para recoger al menos 35 stoneflies 12.
- Recoger 50 L de agua corriente y las rocas con un diámetro máximo de 2 cm a partir de corrientes.
- Coloque acuarios en un frigorífico ajustado a la temperatura de la corriente de sitio. Distribuir rocas recogidas en el lugar de la corriente en acuarios y rellenar con 4 L de agua corriente por acuario. Coloca 20-30 Stoneflies recogidos por el acuario y colocar una piedra burbujeo unido a un burbujeador de acuario en cada tanque y se convierten en peleles que añade continuamente aire de la habitación al agua.
- Permitir que las moscas de piedra para adaptarse al nuevo ambiente en los acuarios para un período de 48 horas.
Figura 1. Configuración para la manipulación de oxígeno disuelto. (A) 1) Colocación de un tubo de cobre de lengüeta de la manguera macho 2) Ubicación del tapón de sellado para examinar para asegurar así frasco sellado. (B) 1) 2 L matraz de brazo lateral llena con 1,9 l de agua 2) Tubo de Gas y burbujeador de aire (azul) para su uso en burbujeo de nitrógeno y burbujeo de aire de la habitación, respectivamente 3 tanque de nitrógeno) y los valores calibrados 4) 2 L matraz llena con 0,4 l de agua con tubo de vacío sumergida 5) medidor de oxígeno disuelto. Por favor, haga clic aquí paraver una versión más grande de esta figura.
2. Conjunto Experimental hasta
- En una parte superior del banco, conectar un tubo de vacío de pared estándar al brazo lateral de un 2 L matraz de brazo lateral como se muestra (1 en la Figura 1B).
- Llenar el matraz con 1,9 l de agua corriente de envases de plástico de 3 L que contengan agua corriente recogida en el refrigerador ajustado a 12 ° C.
- Colocar el matraz y el tubo en una bandeja suficientemente grande para contener un baño de hielo alrededor del matraz de brazo lateral y sin entorpecer la visión del interior matraz y llenar la bandeja con hielo.
- Perforar dos agujeros 3 mm de diámetro en un tapón de goma para permitir el paso de 1) un tubo de cobre para entregar el gas al recipiente y 2) la sonda de un metro de oxígeno en el matraz de 2 l de brazo lateral (1 en la Figura 1B) .
- Haga una incisión lateral desde el borde del tapón a uno de los orificios para permitir el asentamiento del cable de la sonda de DO en el tapón.
- Conectar un acoplador con una manguera macho de 3 mmpúa a un trozo de tubo de cobre de 2 mm de diámetro (1 en la Figura 1A). Asegúrese de que este tubo es lo suficientemente largo para llegar a un radio de 10 cm de la parte inferior del matraz mientras que llegar a través del tapón.
- Colocar el tubo con el acoplador de que el segundo agujero en el tapón hasta que la longitud de la parte inferior del tapón es suficiente para alcanzar al menos de 10 cm de la parte inferior del matraz.
- Conectar un tubo de gas de polietileno de pared fina 0,75 m de longitud con un diámetro de 3 mm para el acoplador en el tubo.
- Deslizar tanto el sensor de oxígeno y el tubo de cobre en el matraz y sellar el frasco con el tapón.
- Verificación de un sello seguro entre el tapón y el frasco, así como un ajuste perfecto entre el tubo y el cable de la sonda dentro del tapón.
- Llenar un matraz de 1 l con 0,4 l de agua del grifo y coloque adyacente a la bandeja con el baño de hielo y el frasco vacío.
- Sumergir el tubo de polietileno procedentes de la gran matraz de vacío en el agua del matraz 1 L. asegurar latubo con cinta de tal manera que permanecerá sumergida a través del experimento.
- Conectar la línea de gas de diámetro 3 mm del frasco de vacío a una sala de burbujeo de aire acuario. Comience a burbujear el agua en el matraz de 2 L enchufando el burbujeador de acuario, que introduce aire de la habitación y oxígeno al agua.
- Monitorear la concentración de oxígeno y la temperatura del agua con el medidor de OD durante 5 minutos o hasta que se establece el equilibrio de la DO dentro de la cámara de tal manera que se produce un pequeño cambio en la DO.
3. Prueba de la estabilidad del montaje experimental
- Pruebe cada instalación para la estabilidad DO antes de la adición de la mosca de las piedras.
- Añadir tres o cuatro rocas en el matraz de 2 L de modo que tienen stoneflies sustrato propicio para flexiones de brazos.
- Comience una manipulación de prueba de la DO desconectando el tubo de gas del pelele y lo conecta a la línea de gas nitrógeno.
- Empezar burbujear nitrógeno a 20 pies cúbicos por hora (CFH) por aproximadamente 40seg a 1 min.
- Una vez que la DO ha bajado hasta 0.5 mg / L de la concentración objetivo, reducir el flujo a 15 CFH y permitir que la concentración disminuya hasta el objetivo.
- Alto el flujo de nitrógeno inmediatamente una vez que se alcanza la concentración objetivo.
- Utilice el burbujeador sala de aire de acuario para regresar la concentración a la concentración objetivo si la DO disminuye por debajo del objetivo.
- Si la DO es inestable durante el ensayo de una puesta a punto a continuación, comprobar el volumen de agua todavía está en el 1,9 L y no hay agua ha burbujeado a cabo, la temperatura del agua es estable y no cambia, y los sellos en todos los accesorios parecen ser apretadas y selladas.
- Una vez que los tres ensayos se han realizado y el experimentador tiene confianza en la capacidad de controlar la DO, conecte la tubería de gas de burbujeo y la burbuja al equilibrio de nuevo.
- Burbuja para el equilibrio uniendo la línea de gas de 3 mm de diámetro para el burbujeador de acuario y comenzar la adición de aire de la habitación al agua hasta que la concentración deoxígeno en el agua no aumenta o cambia por 3 min.
- Una vez en equilibrio, deje de burbujear y quitar el sello del frasco.
4. Stonefly Experimento push-up
- Se divide el número total de moscas de piedra por el número de observadores para determinar el número de ensayos a realizar.
- Determinar diferentes niveles de OD entre 2 y 10 mg / L para evaluar la respuesta de comportamiento de stoneflies (número de flexiones).
- Configurar un frasco por ensayo y añadir un número igual de stoneflies ya que no son observadores en el matraz (4 stoneflies dentro de este diseño), colocar la sonda y el tubo de nuevo en el frasco, a continuación, volver a sellar el frasco con el tapón de goma.
Nota: Una inicial DO concentración de 10 mg / L fue elegido como el primer punto de observación, ya que era la concentración de oxígeno de la corriente desde donde se tomaron muestras de las moscas de piedra. - Una vez que el agua está a 10 mg / L por burbujeo siguientes pasos 02/10 a 02/11, registrar la temperatura del agua de arranque y permitir elstoneflies para insertarse en el sustrato de roca en el matraz.
- Asignar sólo un observador para ver una sola stonefly para garantizar un recuento preciso del comportamiento de flexión de brazos, que es el movimiento del cuerpo hacia arriba y abajo exhibido por el stonefly.
- Contar y registrar el número de flexiones observados a lo largo de un período de observación de 3 min.
- Manipular hacer para el siguiente nivel de OD experimental y repetir período de observación de 3 minutos para los niveles experimentales adicionales.
Nota: Dentro de este diseño experimental, se evaluaron tres diferentes niveles de OD.
5. Análisis estadístico
- Para llevar a cabo el análisis de utilización promedio estadístico de flexiones en los cuatro moscas de piedra a través de un grupo para un ensayo DO dado.
- Utilice el software de cálculo estadístico R libre 12 para llevar a cabo un análisis de la varianza (ANOVA) en el número de flexiones y las concentraciones a cabo con el fin de cada ensayo experimental (DO nivel) y la temperatura como covariates. Analizado DO como los niveles discretos de un solo factor.
- Utilice una prueba de normalidad de Anderson-Darling residuales para comprobar la normalidad 13.
- Realizar una regresión lineal de los datos mediante el trazado de la media del número de flexiones de brazos contra las concentraciones de OD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Seis ensayos de la configuración descrita fueron realizadas por 24 estudiantes de primer año de licenciatura en un entorno de laboratorio de enseñanza para cuantificar el número de flexiones stoneflies realizan en respuesta a diferentes concentraciones de oxígeno en el agua. El número medio de flexiones realizado dentro de un nivel de OD y dentro de cada ensayo se agruparon para trazar flexiones contra el nivel de OD en la Figura 2. Se realizó un ANOVA inicialmente utilizando la concentración de OD, el orden secuencial de los ensayos, la temperatura, así como las interacciones entre todas las variables. Los resultados sugieren que sólo Concentración de oxígeno influyó significativamente el número de flexiones realizadas por stoneflies (R 2 adj. = 0,322, p = 0,004) y ninguna otra interacción variable o fue un predictor significativo de flexiones. Todos los datos utilizados en este análisis se confirmó la normalidad mediante una prueba de Anderson-Darling.
contenido "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figura 2. Número medio de flexiones realizadas por stoneflies agrupados por ensayo frente a la concentración de oxígeno disuelto. Esto muestra una relación negativa significativa (R 2 adj. = 0,322, p = 0,004) entre las flexiones y concentración de oxígeno disuelto (pendiente de -6,063). Los números rojos indican la temperatura del agua (en ° C) durante un ensayo. Las temperaturas son muy estables por períodos de 3 minutos del ensayo, pero variado a través del experimento. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Código Suplementario Archivo:. Código R para el análisis estadístico Por favor, haga clic aquí para descargararchivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Los pasos críticos
Este procedimiento proporciona una manera sencilla y eficaz para manipular DO en un entorno de laboratorio para llevar a cabo estudios de comportamiento en los organismos acuáticos. Encontramos que hayan varios pasos / los elementos vitales para tener en cuenta al realizar este experimento que relaciona directamente con los resultados. Dentro de un ensayo, es crítico para mantener la presión de la cámara para evitar cambios en la presión parcial de los gases por encima del agua, y posterior DO fluctuaciones. Siguiendo los pasos descritos en la "prueba de la estabilidad de la configuración experimental" subsección del protocolo es crítico. La inspección de la junta del tapón con el matraz, asegurando la inmersión completa de la tubería de vacío en el matraz de 1 L de agua (para evitar el reflujo de aire de la habitación), y de estar la línea de gas y DO sello del alambre con el tapón puede ayudar a mantener un establo ambiente de la cámara. Además, maximizar el volumen de agua en la cámara es necesaria para mejorar la estabilidad de DO dentro deun juicio ya que hemos encontrado que muy pocos resultados en volumen errática e inestable y manipulaciones.
El mantenimiento de la temperatura del agua en la cámara es imprescindible para un buen control de los niveles internos de OD. Si bien hemos sido capaces de mantener la temperatura de agua fría dentro de los experimentos individuales del grupo, alguna variación mínima en la temperatura a través de diferentes ensayos fue evidente (Figura 2). Desde nuestra gama global de temperaturas fue baja (11.8-13.5˚C) y dentro del rango típico para moscas de piedra, que no resultó ser un predictor significativo en nuestro modelo de flexiones stonefly. Sin embargo, la temperatura del agua es conocido para efectuar el potencial saturación de oxígeno del agua de 14,15, y no mantener la temperatura del agua cámara tendría un impacto directo sobre los niveles de OD. Con un buen sellado, el volumen adecuado de agua, y la temperatura estable del agua, presión de la cámara interna y Do es fácil de mantener durante todo el experimento y el control de DO entre los ensayos es smesa y reproducible.
Limitaciones y modificaciones
Dos posibles limitaciones de este experimento son el tamaño de la cámara y la duración del período de observación. El volumen de agua (~ 2 L) y pequeña abertura en el cuello de la cámara limita el tamaño de organismo capaz de ser utilizado. En esta escala, el protocolo permite fácil sustitución de stoneflies para otros macroinvertebrados, anfibios y peces más pequeños, pero no sería aplicable para los organismos de mayor tamaño (es decir, los peces depredadores, pulpos). Sin embargo, sería posible escalar este experimento mediante el uso de grandes vasos, y adaptando el protocolo general para cumplir diversos objetivos de aprendizaje / investigación con organismos más grandes. Además, cualquier sustrato requerida en la cámara para organismos más grandes debe tenerse en cuenta al elegir material de vidrio debido al pequeño tamaño de cuello en el matraz de 2 L. En nuestro experimento se recogieron pequeñas piedras de río-con mosca de las piedras y brindaron una amplia cámara de s ubstrate para las moscas de piedra para realizar flexiones.
Condiciones de la cámara internos sobre los períodos de observación corto tiempo se mantuvieron con fluctuaciones mínimas, sin embargo, se mantiene la incertidumbre acerca de los períodos de observación más largos. Que utilizan el período de observación de 3 min se indica en el protocolo, la temperatura del agua de la cámara y los niveles de OD se mantuvieron en valores constantes. Hemos sido capaces de mantener la DO y la temperatura del agua hasta un periodo de observación de 5 minutos, pero a un largo período de observación de 10 minutos, la temperatura del agua en la cámara comenzó a subir. En el protocolo actual, no es posible extender el periodo de observación más allá de 5 min. Sin embargo, adaptaciones al protocolo actual (como el uso de una sala de clima controlado) podría permitir una mayor estabilidad a largo plazo de la temperatura del agua. Además, un análisis más robusto y detallado del tiempo de observación frente a las condiciones ambientales (temperatura del agua, DO, presión parcial) ayudaría a determinar los factores limitantes.
contenido "> Este protocolo tiene la capacidad de ser modificado (como se mencionó anteriormente) para satisfacer un número de diferentes necesidades y objetivos. Una modificación adicional al protocolo existente sería una modificación del sistema de burbujeo. Mientras que utilizó únicamente un pequeño tubo de cobre a burbujear el agua, nos dimos cuenta que la adición de las grandes burbujas de gas nitrógeno a menudo desalojado las moscas de piedra de su control sobre las piedras de río y los envió flotando alrededor de la cámara. hemos tratado de usar una piedra burbujeo durante más aún la dispersión de gas nitrógeno , pero encontraron que el agua de la cámara no se agita lo suficiente para dispersar uniformemente el gas nitrógeno, lo que resulta en una columna de condiciones de hipoxia dentro de la cámara. el perfeccionamiento del sistema de suministro de gas de nitrógeno puede dar una idea útil, y quitar el factor de confusión potencial de desalojar stoneflies a partir de sustrato entre los ensayos DO. Importancia y aplicaciones futuras
Este experimento fue el primero de su clase en elincluir un protocolo detallado de desarrollo para manipular los niveles de OD para la observación del comportamiento animal en un entorno de laboratorio. Mientras que otros trabajos publicados sugirió el uso de gas nitrógeno para manipular los niveles de OD 7,8,16, no se presta suficiente detalle metodológico para permitir la replicación. El interés en este desarrollo del protocolo surgió del deseo de manipular los niveles de OD y observar el comportamiento de los animales para su uso en un laboratorio de la ecología de introducción a nivel universitario en Juniata College. Dentro de la clase de 24 estudiantes, este protocolo demostró ser reproducible a través de ensayos con diferentes niveles de OD y en todos los grupos de estudiantes. Por otra parte, este protocolo proporciona una forma muy accesible y rentable para manipular los niveles de OD para la experimentación en laboratorio.
Si bien este protocolo fue desarrollado específicamente para su uso con mosca de las piedras en un laboratorio de enseñanza, que podría ser fácilmente adaptado para otros objetivos. Más específicamente, este protocolo podría ser utilizado fácilmente con otros pequeños acuáticamacroinvertebrados, peces, y anfibios incluso dependiendo de la especie de interés. Por ejemplo, los miembros de la orden Amphipodia que aumentan su actividad locomotora en respuesta a la hipoxia 17 podría ser utilizado, o pez rojo (Carassius auratus) que exhiben una "tragando" comportamiento en la superficie del agua durante las condiciones de hipoxia 16. Además, diversas etapas de la vida de los organismos acuáticos también podrían utilizarse con este protocolo para ayudar a mejorar nuestra comprensión de las demandas de oxígeno organísmicos lo largo del desarrollo. Este protocolo también podría utilizarse para estudiar las respuestas bioquímicas a la hipoxia mediante la experimentación con anfibios como mudpuppies (Necturus maculosus) 18. Además, este protocolo se puede escalar hacia arriba o hacia abajo en tamaño para satisfacer las necesidades de los organismos más o menos grandes y aplicaciones de enseñanza o de investigación. Si bien consideramos que el protocolo y la propia aplicación específica es de interés ecológico amplio, la mayor fortaleza de este protocol es que proporciona un gran desarrollo de las fundaciones a través de grupos taxonómicos y objetivos experimentales.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Filter flask 2 L | Pyrex | 5340 | |
| Rubber Stopper size 6 | Sigma-Aldrich | Z164534 | |
| Nalgene 180 Clear Plastic Tubing | Thermo Scienfitic | 8001-1216 | |
| Whisper 60 air pump | Tetra | ||
| Standard flexible Air line tubing | Penn Plax | ST25 | |
| 0.25 inch Copper tubing | Lowes Home Improvement | 23050 | |
| Male hose barb | Grainger | 5LWH1 | |
| Female Connector | Grainger | 20YZ22 | |
| Heavy Duty Dissolved Oxygen Meter | Extech | 407510 | |
| Nitrogen gas | Matheson TRIGAS | ||
| Radnor AF150-580 Regulator | Airgas | RAD64003036 |
References
- Hoback, W., Stanley, D. Insects in hypoxia. J. Insect Physiol. 47 (6), 533-542 (2001).
- Craig, J., Crowder, L. Hypoxia-induced habitat shifts and energetic consequences in Atlantic croaker and brown shrimp on the Gulf of Mexico shelf. Mar Ecol-Prog Ser. 294, 79-94 (2005).
- Gaulke, G., Wolfe, J., Bradley, D., Moskus, P., Wahl, D., Suski, C. Behavioral and Physiological Responses of Largemouth Bass to Rain-Induced Reductions in Dissolved Oxygen in an Urban System. T Am Fish Soc. 144 (5), 927-941 (2015).
- Genkai-Kato, M., Nozaki, K., Mitsuhashi, H., Kohmatsu, Y., Miyasaka, H., Nakanishi, M. Push-up response of stonefly larvae in low-oxygen conditions. Ecol Res. 15 (2), 175-179 (2000).
- McCafferty, W. Aquatic Entomology: The Fishermen's and Ecologists' Illustrated Guide to Insects and Their Relatives. , Jones and Bartlett. (1983).
- Chapman, L., Schneider, K., Apodaca, C., Chapman, C. Respiratory ecology of macroinvertebrates in a swamp-river system of east Africa. Biotropica. 36 (4), 572-585 (2004).
- Suski, C., Killen, S., Kieffer, J., Tufts, B. The influence of environmental temperature and oxygen concentration on the recovery of largemouth bass from exercise implications for live - release angling tournaments. J Fish Biol. 68, 120-136 (2006).
- Abdallah, S., Thomas, B., Jonz, M. Aquatic surface respiration and swimming behaviour in adult and developing zebrafish exposed to hypoxia. J Exp Biol. 218 (11), 1777-1786 (2015).
- Ciba Geigy Ag. Method and apparatus for degassing viscous liquids and removing gas bubbles suspended therein. US patent. Gassmann, H., Chen, C., Vermot, M. , 3,853,500 (1974).
- Hewlett-Packard Company. Apparatus for degassing liquids. US patent. Berndt, M., Schomburg, W., Rummler, Z., Peters, R., Hempel, M. , 6,258,154 (2001).
- Sims, C., Gerner, Y., Hamberg, K. Systec inc.,. Vacuum degassing. US patent. , 6494938 (2002).
- Barbour, M., Gerritsen, J., Snyder, B., Stribling, J. Report number EPA 841-B-99-002. Rapid bioassessment protocols for use in streams and wadeable rivers. , USEPA. Washington. (1999).
- Anderson, T., Darling, D. A Test of Goodness of Fit. J Am Stat Assoc. 49 (268), 765-769 (1954).
- Rounds, S., Wilde, F., Ritz, G. Chapter A6 Field Measurements. Section 6.2 DISSOLVED OXYGEN. National Field Manual for the Collection of Water-Quality Data. , U.S. Geological Survery. Virginia, U.S. (2013).
- Hem, J. Study and Interpretation of the Chemical Characteristics of Natural. , U.S. Geological Survery. (1985).
- Burggren, W. 34;Air Gulping" Improves Blood Oxygen Transport during Aquatic Hypoxia in the Goldfish Carassius auratus. Physiol Zool. 55 (4), 327-334 (2015).
- Frederic, H., Mathieu, J., Garlin, D., Freminet, A. Behavioral, Ventilatory, and Metabolic Responses to Severe Hypoxia and Subsequent Recovery of the Hypogean Niphargus rhenorhodanensis and the Epigean Gammarus fossarum (Crustacea: Amphipoda). Physiol Zool. 68 (2), 223-244 (2015).
- Ultsch, G., Duke, J. Gas Exchange and Habitat Selection in the Aquatic Salamanders Necturus maculosus and Cryptobranchus alleganiensis. Oecologia. 83 (2), 250-258 (1990).
