Abstract
פיתוח שרירי דג זברה הוא שמור ביותר עם מערכות יונקות הפיכתם מודל מצוין ללמוד את תפקוד שרירים ומחלות. myopathies רב המשפיע תפקוד שרירי שלד ניתן במהירות להעריך בקלות דג זברה במהלך הימים הראשונים של עובר. ב -24 שעות לאחר ההפריה (hpf), דג הזברה wildtype ספונטני השרירים מתכווצים הזנב שלהם ועל ידי 48 hpf, התנהגויות שחייה מבוקר התערוכה דג הזברה. צמצום תדירות, או שינויים אחרים, תנועות אלה עשויים להצביע על תפקוד לקוי שרירי שלד. כדי לנתח את התנהגות שחייה וכדי להעריך את ביצועי שריר בפיתוח דג זברה מוקדם, אנו מנצלים, הוא בתגובת בריחה עוררת מגע מבחני תנועה.
מגע עורר מבחנים בתגובת בריחה יכולים לשמש כדי להעריך את ביצועי שריר במהלך פרקים קצרים פרץ וכתוצאה מהתכווצות של סיבי שריר מהיר עווית. בתגובה לגירוי חיצוני, אשר במקרה זה היא טפיחה עלראש, דג הזברה wildtype ב 2 ימים לאחר ההפריה (DPF) בדרך כלל מפגינים לשחות פרץ חזק, מלווה פניות חדות. השיטה שלנו מכמתת את תפקוד שרירי שלד על ידי מדידת האצה מקסימלית במהלך תנועה שחי פרץ, ההאצה להיות ביחס ישר את הכח הנוצר על ידי התכווצות שרירים.
בניגוד לכך, מבחני תנועה במהלך התפתחות זחל דג זברה מוקדם משמשים כדי להעריך את ביצועי שריר בתקופות מתמשכות של פעילות שרירה. באמצעות מערכת מעקב כדי לפקח על התנהגות שחייה, נקבל חישוב אוטומטי של תדירות הפעילות ומרחק דג זברה ישנה ל- 6 ימים, רעיוני של תפקוד שרירי השלד שלהם. מדידות של ביצועי שחייה הן בעלי ערך עבור הערכה פנוטיפי של מודלי מחלות הקרנת תפוקה גבוהה של מוטציות או טיפולים כימיים המשפיעות תפקוד שרירי שלד.
Introduction
במהלך דג הזברה בעשור האחרון שמש יותר ויותר ללמוד ביולוגיה של תא שריר ומחלות. הפיתוח החיצוני המהיר של עובר דג הזברה, בשילוב עם הבהירות האופטית שלה, מאפשר הדמיה הישירה של בניית שריר, צמיחה, ותפקוד. תהליך פיתוח שריר שמור ביותר דג זברה וזה אפשר דוגמנות המוצלחת של מגוון רחב של מחלות שרירים כוללים בניוון שרירים ו myopathies המולד 1-8. בחינה מדוקדקת של מודלי דג זברה לא ספקה רק תובנה רומן לתוך pathobiology תנאים אלה, אלא גם מספקת מצע שיאפשר הבדיקה של טיפולים מתאימים 6,9-13.
ניתוח מודלי דג זברה של מחלות שריר מסתמך על מבחנים אמינים לשחזור למדוד ביצועי שריר. מחקרים קודמים מדדו את יכולת יצירת כוח בהצלחה של שריר תא המטען דג הזברה בדגים בין 3 ל 7 DPF ידיבגירוי חשמלי התכווצות של דג משותק מחוברת מערכת התמרת כוח 14. זה יכול לספק מדידה מפורטת של כוח אבל הם לא אידיאלי ניסויי תפוקה גבוהים יותר ויש יתרונות למדידת ביצועים שרירים במהלך שחייה. בשעה 2 DPF שריר דג הזברה היא מתפקדת במלואה הדג יכול לעורר תנועות שחייה פרץ בתגובה לגירויים. את assay בתגובה בריחה מגע לעורר משמש למדידת תאוצה במהלך תנועה שחייה פרץ, אשר ניתן להשתמש בהם כאמצעי בכוח התכווצות.
אחד המדדים המנוצלים ביותר של תפקוד שרירים בחולי מיופתיה הוא מבחן 6 דקות הליכה, אשר מתעד את המרחק הכולל הלך על משטח שטוח קשה 15,16. יש לנו ליישם מבחן השוואה כדי למדוד את תפקוד שריר 6 DPF זחלי דג זברה, לפיה אנו עוקבים אחר המרחק הכולל ושחה, ואת המספר הכולל של תנועות שנעשו על ידי כל זחל על פני תקופה של 10 דקות. זו מבוצעתבאמצעות מערכת מעקב אוטומטית, אשר מספקת מדידות אמינות תפוקה גבוהה של ביצועי שריר. שתי הבדיקות שרירים הם מאוד לשחזור שימשו לכמת הבדלים בביצועי השריר במודלים מיופתיה דג הזברה 8.
Protocol
1. Assay תגובת מגע עורר
- הכנת 2 DPF עוברים Assay תגובה מגע עורר
- ודא את השעה ביום שבה הבדיקה נעשית עולה בקנה אחד בין הניסויים כי הפעילות יכולה להשתנות באופן דרמטי במהלך היום 17,18.
הערה: הניסוי צריכה להתבצע עיוור ואת סדר הבדיקות באקראי למזער חפצים הניסיונות. - הקצה את הדגים זנים מספר, אשר אינו ידוע הפרט בביצוע הניסוי. בעקבות זאת, באמצעות כלים מקוונים זמינים באופן חופשי ליצור רשימה אקראית המכתיבה את סדר הבדיקה.
- לפחות שעה אחת לפני הבדיקה, עוברים dechorionate ידי קורעת חור סיסית ואת משיכתו בעדינות סיסית בנפרד באמצעות פינצטה בסדר. הסר את כל פסולת מצלחת פטרי לפני החזרה אל האינקובטור C 28 °.
- ודא את השעה ביום שבה הבדיקה נעשית עולה בקנה אחד בין הניסויים כי הפעילות יכולה להשתנות באופן דרמטי במהלך היום 17,18.
- ביצוע Assay תגובת מגע עורר
- STA חוםGE ל -28 מעלות צלזיוס לפחות 15 דקות לפני תחילת הבדיקה.
הערה: שלב זה נשלט על טמפרטורה יישאר 28 ° C למשך של בדיקות. טמפרטורה תשפיע פעילות ועל כן חשוב לשמור על טמפרטורה קבועה. אם במה מחוממת אינה זמינה אז הטמפרטורה של המים צריכה להיות במעקב כל הניסויים צריכים להתנהל באותה הטמפרטורה. - מניחים צלחת פטרי מלאות בינוני העובר (5 mM NaCl, KCl 0.17mM, 0.33 מ"מ 2 CaCl, 0.33 מ"מ MgSO 4 במים) על גבי הבמה המוארת ולעגן את המצלמה במהירות גבוהה מעל צלחת פטרי.
- הפעל את תוכנת צריבה מצלמת וידאו (כגון זרם Pix 5, המתוארת כאן) ו תחת לשונית "סביבת העבודה" ובחר 1,000 מסגרת לכל שניות (1,000 fps) כמהירות הלכידה מנת להבטיח כי פעולת שחייה מהירה של הדג נרשם.
- עבודה עם עובר אחד בכל פעם, למקם את העובר middle של צלחת פטרי עם דג הזברה נראית בבירור את שדה הראיה.
הערה: אם עובר שוחה משם לפני תחילת הניסוי ולהחליף אותה באחרת, כמו לתפוס מחדש ומיצוב של העובר עלול לגרום לכך שרשת desensitized לגירוי ותגובות פרץ חזר עשוי לקדם חולשת שרירים בחלק מדגמי מחלה. - בגין הקלטה על ידי לחיצה על כפתור "הקלט" ו, לספק גירוי mechanosensory לעובר על ידי נגיעה בו בעדינות עם מחט קהה על החלק העליון של הראש.
- עצור את ההקלטה לאחר שהעובר שחתה מחוץ לשדה הראייה או חזר לנוח.
הערה: פסגות האצה בתוך 0.2 השניות הראשונות של תגובת בריחת הפרץ בעקבות הגירוי המכאני. לכן, להבטיח כי לפחות במהלך 0.2 השניות הראשונות של תגובת בריחת הקלטת הדג נמצא בשדה הראייה. השימוש בתוכנה כמתואר בשלב 1.2.3, הנתונים באופן אוטומטי יישמרוכקובץ וידאו .avi. תוכנה ללכידת וידאו אלטרנטיבית כגון חינם לכידת וידאו או Softonic, אשר שניהם זמינים באופן חופשי להורדה, יכול לשמש גם. - מחזיר את העובר בצלחת פטרי חדש ובחר עובר אחר לבדיקה. תבצע את הבדיקות על מינימום של 15 דגים.
- STA חוםGE ל -28 מעלות צלזיוס לפחות 15 דקות לפני תחילת הבדיקה.
- כימות התנהגות שחייה
- כדי לכמת את התנהגות שהחייה, להפעיל את התוכנה ובחר את "תנועת הזחלים היחידה ללא רקע חיסור" מודול כדי לפתוח את קובץ וידאו נשמר .אבי.
- באמצעות הכלי "ביד חופשית" או "פוליגון" מאזורי בחר שורת התפריטים של הסרט כדי לשמש לניתוח. ודא כי האזור המקיף הוא את המיקום המקורי של הדגים באזור שהדגים ישחו לתוך. ודא כי הבדיקה נשללת מהאזור להיות מנותח. התוכנה אוטומטית יהיה לעקוב אחר מסלולו של דגים בתוך האזור הרצוי.
- כדי לבצע tהוא ניתוח, לחץ על "ניסוי" משורת התפריטים ובחר "הוצאה להורג". כאשר יתבקש לשמור את קובץ ניתוח נתונים הגולמי (.phr פורמט) במיקום הרצוי. לאחר השמירה, לחץ על "התחל" כדי להתחיל את הניתוח. בסופו של הניתוח על ידי לחיצה על "עצור" תחת "הניסוי" לתפריט נשלף. חלון המכיל את התוצאות יוצג.
- גלול ימינה כדי לקבל את הערך "האצה מקסימלית". אם תרצו, לייצא נתונים אלו על ידי סגירת חלון התוצאות והלחיצה על הכפתור "תוצאות היצוא מיידיות" תחת "התוצאות" לתפריט נשלף. בחר בקובץ ניתוח נתונים הגולמי המתאים ולחץ על פתוח. קובץ טקסט שניתן לפתוח בתוכנית גיליון אלקטרוני יישמרו בתיקיית היעד.
- חזור על תהליך זה עבור כל דג פרט ממוצע להשיג האצה מקסימלית הממוצעת עבור כל זן (ראה איור 1).
הערה: כחלופה using התוכנה המתוארת כאן, חבילות דומות כגון תוכנת ImageJ הזמינה באופן חופשי וניתן להשתמש בו כדי לחלץ את הנתונים הרלוונטיים תנועה. תוסף Tracker חלקיקי 3D ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר מסלולי שחייה.
2. Assay תנועה - 10 דק 'מבחן שחו
- הכנת 6 DPF עוברים לניתוח שחייה
- במידת צורך, מעין עובר הגנוטיפ הנדרש, למשל על ידי בחינת ביטוי של חלבון פלואורסצנטי או על ידי הפנוטיפ, והמקום לתוך צלחת פטרי נפרדת (25-30 עובר לכל צלחת). לחלופין, הגנוטיפ יכול להיקבע לאחר השלמת assay תנועה.
- בשעת 3 DPF, בחינה מחדש בצלחות פטרי ולהסיר כל עוברים שלא נולדו ופסולת. חזור בצלחות פטרי עד 28 ° C חממה עד 6 DPF.
- תבצע את הבדיקות של כל זני 09:00-12:00, וזה הזמן שבו זחלי דג זברה הם פעילים ביותר. קבע סדר אקראי בדיקות ומצבה של pמאוחר של wildtype דגימות מוטציה כדי למזער את ההשפעות של בדלי יממה והטיית ניסיוניים אחרים.
הערה: חשוב כי זמן בדיקה עקבית בין הניסויים כי הפעילות יכולה להשתנות באופן דרמטי במהלך היום. - לפחות 30 דקות לפני בדיקה, זחלי מקום לתוך צלחת 48-היטב עם זחל אחד לכל טוב. לאחר ההעברה, למלא את בארות כך פני המים הוא ממש מתחת העליון של הבאר, הבטחת אין בועות. חזור צלחות עד 28 ° C חממה.
- קח צלחות מתוך האינקובטור להתאקלם לאור במשך חמש דקות לפני הבדיקה.
- ביצוע Assay תנועה
- מניחים את צלחת 48-היטב לתוך תא ההקלטה, אשר מצויד במצלמה דיגיטלית אינפרא אדום, לכידת עד 60 מסגרות / שנייה, כך הזחלים כי ניתן לאתר בחושך. בדוק שכל הבארות ממוקמות בתוך הרשת המעגלית על תוכנות נידות ושכל הזחלים הם CLEקארלי לזיהוי.
- הפעל את התוכנה ובחר את מודול "מעקב". תחת "קובץ" לחץ על "ליצור פרוטוקול חדש" ולערוך את מספר בארות המשמשים לניסוי. גדר היא את משך הניסוי ותקופת האינטגרציה עד 10 דקות על ידי לחיצה על "הפרמטרים" לתפריט נשלף ובחירה "פרמטרי הפרוטוקול", ובהמשך על הכרטיסייה "הזמן". באותו "פרמטרי פרוטוקול" תיבה דו שיח לחץ על הלשונית "אפשרויות" וודא כי תיבת הסימון "Numeriscope" לוחצת שבעקבותיה, התיבה "פרמטרי פרוטוקול" הדיאלוג יכולה להיות סגורה.
- כדי להגדיר את אזורי ההקלטה להדגיש את הרשת כולה ולחץ לחיצה כפולה על אחת הבארות. לחץ על הכפתור "לצייר אזורים" ולצייר סביב בפינה השמאלית העליונה, בפינה הימנית עליונה, ובארות שמאליות תחתונות ולחץ על "לבנות", אשר מאפשרת לתוכנה לקבוע את המיקום באופן אוטומטי של כל טוב. כמו כן לצייר בקנה מידההבר ולחץ על "חלים לקבוצה". בסיום, לחץ על הכפתור "לצייר אזורים".
- מבחינה ויזואלית לקבוע את סף זיהוי על ידי ההחלקה "סף זיהוי" בר לרמה שבה רק תנועות הדגים מודגשות ללא אותות רקע.
ההערה: סף זיהוי ינוע בין זנים ובכך הספים צריכים להיקבע בכל פעם נבחן זן חדש. בנתוני הנציג הציגו סף זיהוי של 25 מ"מ / sec היה בשימוש. - לפני תחילת בדיקות להיכנס ספי תנועה לגילוי של חוסר פעילות, ותנועות קטנות וגדולות.
הערה: הנתונים נציג הציגה סף חוסר פעילות של 6 מ"מ / sec ו סף פעילות פרץ של 30 מ"מ / sec היה בשימוש. הספים לקבוע את התנועה המינימלית כדי להיחשב פעיל ושל רמת הביטחון הנדרשת כדי להיחשב פעילות פרץ ולאפשר סיווג הפעילות לתוך קטן (פעיל אך מתחת פעילויותיו פרץספי ty) וגדולים (גבוה מסף פעילות פרץ) תנועות. הספים ניתן לשנות בהתאם לפעילות של זני דגים בפרט מנותחים.
הערה: למרות assay ניתן לבצע אחד משני מצבים בהירים או כהים, זחלי דג זברה הוכחו להיות יותר פעילים ב -18 כהה. - הגדר את עוצמת האור בתוך החדר להיות ב 0% על ידי לחיצה על "הגדרות נהיגה אור" כפתור תחת "פרמטרים" לתפריט הנשלף. בתיבת הדו-שיח שתופיע, להוסיף את ההגדרות האור הנדרשת.
הערה: עוצמת האור בתוך החדר יכולה להיות מופעלת כדי להפעיל ולכבות בזמן הבדיקות כדי לעורר פעילות זחל - סגור את הדלת של חדר ההקלטה להתחיל הקלטת וידאו.
- כימות התנהגות שחייה
- לאחר הניסוי הושלם, לחץ על "עצור" תחת "הניסוי" לתפריט נשלף. Bo דיאלוגx עם כל התוצאות יוצג.
- על מנת לגשת לתוצאות אלה ב- Excel לחץ על "לפתוח המכיל תיקייה" ולפתוח את קובץ Excel שמופיע בתיקייה שהתקבלה. הפרמטרים החשובים הם "smlct" (ספירת תנועה קטנה), "larct" (ספירת תנועה גדולה), "smldist" (מרחק הכולל מכוסה על ידי הדגים בתנועות קטנות) ואת "lardist" (מרחק הכולל מכוסה על ידי הדגים בתנועות גדולות ).
הערה: בעקבות ההקלטה, התוכנה גם מחזירה שני קבצי פלט נוספים בצורת קובץ avi (שמכילה סרטון וידאו של קלטת 10 דקות) קובץ תמונת .png (המכיל ייצוג חזותי של התנועה במהלך 10- ניסוי דק, ראה איור 2). - לאחר ערכי התנועה מחושבים, חזור על קבצי AVI ו- png לסקור אם ערכי התנועה מחושבים מתארים במדויק את תנועות השחייה של הדג (ראה איור3).
הערה: כחלופה באמצעות התוכנה המתוארת כאן, חבילות כגון תוכנת ImageJ זמין באופן חופשי וניתן להשתמש בו כדי לעקוב אחר התנהגות locomotory.
Representative Results
מגע עורר assay בתגובה ניתן להשתמש כדי לקבוע את המהירות והתאוצה של תנועות השחייה שהינו מדד יחסי של כוח השריר. בתגובה לגירוי מכאני, כגון ברז קטן על הראש 2 DPF תערוכת דג זברה פראית סוג פעולה שחיה מהר. וידאו נתפס ונותח עבור שני מודלי מיופתיה דג זברה שונים: Tg (ACTA1 D286G -eGFP), מודל של מיופתיה nemaline כי הוכח יש חולשת שרירים משמעותית, ודגם של ניוון שרירים דושנו שבו פגמי שרירים חמורים תוארו בשעה 5 DPF 19,20. תמונות מתוך וידאו של מגע טיפוסי עורר assay מיוצגים באיור 1 א. האצה של דג הזברה נבדק ונמצא שיא בתוך שניות 0.2 הראשון של התגובה בריחה שחייה פרץ (איור 1B). האצה מקסימלית שיא זו מספקת מדד כי הוא יחסי גרם כוחenerating קיבולת של שרירי השלד. הערכים האצים מקסימלית היו בממוצע על מנת להשיג ערך אצה מקסימלית ממוצע (± סטיית התקן של הממוצע) עבור כל זן: Tg (ACTA1 D286G -eGFP): ממוצע = 276.0 ± 28.8 m / sec 2, n = 3 ניסויים לשכפל עצמאיים הכולל 15 דגים בודדים; שליטת wildtype: ממוצע = 500.8 ± 50.28 m / sec 2, n = 3 ניסויים לשכפל עצמאיים הכוללים 15 דגים בודדים; DMD PC2 - / - מוטציה: ממוצע = 249.9 ± 19.1 m / sec 2, n = 3 ניסויים לשכפל עצמאיים הכוללים 12-19 דגים בודדים; DMD PC2 +/- heterozygotes: ממוצע = 235.9 ± 8.7 מ '/ שני 2, n = 3 ניסויים לשכפל עצמאיים הכוללים 16-27 דגים בודדים; DMD PC2 + / + הומוזיגוטים wildtype: ממוצע = 230.9 ± 8.7 מ '/ שני 2, n = 3 ניסויים לשכפל עצמאיים הכוללים 8-27 דגים בודדים (איור 1 ג). כצפוי, Tg (D286 ACTA1G -eGFP) דגים נמצאו כבעלי ירידה משמעותית אצת מקסימלית המציין את תפקוד שרירים מופחת, אשר עולה בקנה אחד עם מודלי עכבר ונתוני חולה 8,21,22. PC2 DMD - / - דגים מוטנטים עם זאת, לא הראו הבדל האצה מקסימלית, ב- 2 DPF, עולה בקנה אחד עם לגילוי פגמים שריר מ 3 DPF 20 (1D איור).
מבחני תנועה בוצעו 6 DPF לקבוע את ושח הפעילות ומרחק ידי זני דג זברה כאינדיקצית ביצועי שריר. בעקבות בדיקה, ייצוג בתרשים של תנועות שחייה על פני תקופת בדיקות העשר דקות נוצר, עם קווים אדומים וירוקים המייצגים תקופות של תנועה איטית ומהירה בהתאמה וקווים שחורים מייצגי תקופות של חוסר פעילות (איור 2). הצג גבוה פעילות דג הזברה wildtype הפרט ללא תקופות יחסית של חוסר פעילות כמו opposed כדי Tg (ACTA1 D286G -eGFP) דגים, שהם פחות פעילים תקופת הבדיקה (איור 2 ב).
התנהגות שהחייה הייתה לכמת על ידי חישוב ממוצע ערכי הפרט של מספר התנועות ואת ושח המרחק ידי כל דגים (איור 3). שניהם, Tg (ACTA1 D286G -eGFP) דגים (איור 3 א ו 3 ב) ו DMD PC2 - / - דגים מוטנטים (איור 3 ג ו 3D) נמצאו כבעלי ירידה משמעותית במספר הממוצע של תנועות ומרחק שחה לעומת שלהם שולט: Tg (ACTA1 D286G -eGFP) דגים: מתכוונים מספר התנועות = 94.3 ± 13.6, אומר ושח מרחק = 112.9 ± 18.4 מ"מ, n = 3 ניסויים לשכפל עצמאיים הכוללים 45 דגים; שולט סוג בר: מתכוון מספר התנועות = 177.4 ± 14.0, אומר ושח מרחק = 300.2 ± 22.8 מ"מ, n = 3 חד עצמאיניסויים eplicate המהווים 45 דגים; DMD PC2 - / - מוטציה: מתכוון מספר התנועות = 163.3 ± 30.0, אומר ושח מרחק: 298.4 ± 60.37 מ"מ, n = 3 ניסויים לשכפל עצמאיים הכוללים דגים 12-20; DMD PC2 +/- heterozygotes: ממוצע מספר התנועות = 362.3 ± 38.8, אומר ושח מרחק: 660.3 ± 86.1mm n = 3 ניסויים לשכפל עצמאיים הכוללים דגים 17-27; DMD PC2 + / + הומוזיגוטים wildtype: מתכוונים מספר התנועות = 341.9 ± 91.6, אומרים ושח מרחק = 574.3 ± 170.9mm n = 3 ניסויים לשכפל עצמאיים הכוללים דג 8-25.
איור 1:. כימות מגע לעורר assay בתגובה ל -2 DPF עוברי דג הזברה (א) תמונות Snapshot של דג הזברה שליטה במהלך מגע לעורר מבחני ב 2 DPF. (ב) פרופיל האצה עבור sec 0.2 הראשון שלTg (ACTA1 D286G -eGFP) היחיד (אדום) ו שליטה יחידה (כחול) דג זברה לאחר יישום של גירוי המגע. התאוצה המרבית מיוצג על ידי קווים מקווקווים. (C, D) כימות של האצה מקסימלית (m / sec 2) רשמה מבחני בתגובה עורר מגע של (C) Tg (ACTA1 D286G -eGFP) דג הזברה (ד) PC2 DMD - / - דגים מוטנטים לעומת שליטה דג הזברה 2 DPF. ברי שגיאה לייצג ± SEM עבור 3 ניסויים לשכפל, * p <0.05. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2:. ייצוג מבחני תנועה עבור עוברי דג הזברה (א) עוברי דג הזברה ממוקמים צלחות 48-היטב תנועה נרשם מלמעלה באמצעות מצלמה דיגיטלית אינפרא אדום. (ב) סכמטי של תנועת דג זברה במהלך תקופת הבדיקה עם קווים אדומים המתארים תנועות מהירות, קווים ירוקים המתארות תנועות איטיות וקווים שחורים המתארים חוסר פעילות (כפי שנקבע על ידי ספי זיהוי נכנסו בתוכנה). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3:. כימות מבחני תנועה במשך 6 DPF הזחלים דג הזברה כימות (א) מספר התנועות (B) המרחק שעובר Tg (ACTA1 D286G -eGFP) דג הזברה לעומת שליטה דג הזברה ב 6 DPF.כימות של (C) מספר התנועות (ד) המרחק שעובר PC2 DMD - / - דגים מוטנטים לעומת שליטה דג הזברה ב 6 DPF. ברי שגיאה לייצג ± SEM עבור 3 ניסויים לשכפל, * p <0.05, ** p <0.01. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
רבי מודלים שונים של בעלי חיים כוללים עכברים, כלבים, דג זברה, זבובים ותולעים תרמו לכיוון הבנתנו את הבסיס הגנטי המולקולרי של מחלות שרירים, וסייעו בפיתוח גישות טיפוליות כדי להילחם בם. דג הזברה מתגאה מספר יתרונות לחקר מחלת שריר. דג הזברה מספקת מערכת manipulable גנטית להעריך דפוסים שרירים מורכבים בסביבה פיזיולוגית מתאימה, הדבר שאינו אפשרי במערכות בתרבות חוץ גופייה. בניגוד למודלים בעלי חיים בעלי חוליות אחרים, המספר הגדול של דגים מיוצרים, יחד עם הבהירות האופטית שלה, הופך לפשוט יותר מהירה, תפוקה גבוהה ב כימי vivo ו סריקות גנטיות.
כאן אנו מתארים את הפיתוח של מבחני תנועת דג זברה לספק תפוקה גבוהה שיטה אוטומטית כדי להעריך את ביצועי שריר במהלך embryogenesis דג הזברה. המבחנים הם יש להודות כי מקצבי יממהגירויים סביבתיים חיצוניים ישפיעו התנהגות שחי דג זברה באופן משמעותי 17,18. בדיקות חוזרות ונשנות של אותו דג הזברה גם תובלנה הרגלה וגרמו לצמצום בתגובת מישוש גירוי 23. לכן, על מנת להשיג תוצאות לשחזור בין ניסויים כל עובר דג זברה צריך להיבדק פעם אחת בלבד, בזמן תנאי היום ותאורה צריך להיות אחיד, וטמפרטורת מים צריך להיות מוסדרת בחוזקה.
באמצעות המגע עורר ניתוח ב -2 DPF אנו יכולים למדוד את התאוצה המרבית ישירות תובענה שחי פרץ, אשר עומדת ביחס לכוח שריר. טכניקות קודמות דג זברה בחנו כוח שריר על ידי קשירת שני הקצוות של העוברים באי ציוד ניסיוני אשר התכווצות שרירים מגורה באמצעות שדה חשמלי ואת יכולת כוח המניבה של השריר 14 נמדד. בעוד שיטה זו מודדת את כוח קיבולת ייצור של tהוא שריר הזחל, זה לא למדוד את הכח בפועל שנוצר על ידי שריר הזחל במהלך שחייה. לפיכך, אנו פתחנו שיטה בעקיפין להעריך את הכח שנוצר במהלך תנועת שחי זחל הנורמלית לספק מדד כולל של בריאות שרירים. מערכת הווידאו במהירות גבוהה, מסוגלת להקליט תנועות דג זברה בודדות בשיעור מסגרת של 1,000 מסגרות / שנייה יכולה לשמש כדי לזהות הבדלים קטנים אך משמעותיים בתפקוד שריר, אשר אינם שונים באופן ישיר על ידי עין. זה יהיה עניין לראות איך שדווח בעבר שינויים בכוח-דור גירוי חשמלי לתאם עם שינויים בביצועים שחייה.
בנוסף למגע עורר מבחני תגובה יכולים לשמש גם כדי להעריך קינמטיקה שחי, כמו צורה ומהירות גל הגוף במהלך התנועה שחי 24, לתת מדידת כמותית של התנהגות locomotory.
בשל התנועה הספונטנית של zebrafהזחלים ish לאחר 3 DPF, לא הצלחנו לבצע את מבחני-לעורר מגע למדוד את תפקוד השרירים. לעומת זאת, מדדנו ביצועים שרירים על פני תקופה ארוכה על ידי קביעה ושח המרחק ידי זחלי דג זברה ב 6 DPF. בדיקה זו, אם כי אמצעי עקיף של תפקוד השרירים, שניתן להשתמש בהם כדי לזהות דגים מוצגות ביצועים שריר לקוי 8 או ניוון מוחיים 25,26. בדיקה זו לא רק מספקת מדידה מקבילה במבחן 6 דקות ההליכה אבל מתאים גם תפוקה גבוהה אוטומטית מסכי סמים או mutagenesis vivo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 21 G x 1' Blunt Needle | Terumo/Admiral Medical Supplies | TE2125 | |
| 48-well plates | Sigma | M8937 | |
| 90 mm Petri Dishes | Pacific Laboratory Products PT | S90001 | |
| High Speed Camera | Baumer | HXC20 | |
| http://www.randomization.com | N/A | Steps 1.1.2, 2.1.3 | |
| Incubator | Thermoline Scientific | TEI-43L | |
| Plastic Pipette | VWR | 16001-188 | |
| StreamPix5 | NorPix | Step 1.2.3 | |
| Temperature Control Unit | Viewpoint | ||
| Tweezers, style 8 | ProSciTech | T04-821 | |
| Zebrabox System | Viewpoint | ||
| Zebralab | Viewpoint | Steps 1.3.1, 2.2.1 |
References
- Bassett, D. I., Bryson-Richardson, R. J., Daggett, D. F., Gautier, P., Keenan, D. G., Currie, P. D. Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo. Development. 130 (23), 5851-5860 (2003).
- Gupta, V. A., Kawahara, G., et al. A splice site mutation in laminin-α2 results in a severe muscular dystrophy and growth abnormalities in zebrafish. PLoS ONE. 7 (8), e43794 (2012).
- Gupta, V., Kawahara, G., et al. The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies. Hum Mol Genet. 20 (9), 1712-1725 (2011).
- Kawahara, G., Karpf, J. A., Myers, J. A., Alexander, M. S., Guyon, J. R., Kunkel, L. M. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci. 108 (13), 5331-5336 (2011).
- Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation. Dis Model & Mech. 5 (3), 389-396 (2012).
- Ruparelia, A. A., Oorschot, V., Vaz, R., Ramm, G., Bryson-Richardson, R. J. Zebrafish models of BAG3 myofibrillar myopathy suggest a toxic gain of function leading to BAG3 insufficiency. Acta Neuropathol. 128 (6), 821-833 (2014).
- Sztal, T. E., Sonntag, C., Hall, T. E., Currie, P. D. Epistatic dissection of laminin-receptor interactions in dystrophic zebrafish muscle. Hum Mol Genet. 21 (21), 4718-4731 (2012).
- Sztal, T. E., Zhao, M., et al. Zebrafish models for nemaline myopathy reveal a spectrum of nemaline bodies contributing to reduced muscle function. Acta Neuropathol. 130 (3), 389-406 (2015).
- Pichler, F. B., Laurenson, S., Williams, L. C., Dodd, A., Copp, B. R., Love, D. R. Chemical discovery and global gene expression analysis in zebrafish. Nat Biotechnol. 21 (8), 879-883 (2003).
- Peterson, R. T., Shaw, S. Y., et al. Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation. Nat Biotechnol. 22 (5), 595-599 (2004).
- Kawahara, G., Serafini, P. R., Myers, J. A., Alexander, M. S., Kunkel, L. M. Characterization of zebrafish dysferlin by morpholino knockdown. Biochem Bioph Res Co. 413 (2), 358-363 (2011).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nat Rev Drug Discov. , (2005).
- Smith, L. L., Beggs, A. H., Gupta, V. A. Analysis of skeletal muscle defects in larval zebrafish by birefringence and touch-evoke escape response assays. J Vis Exp. (82), e50925 (2013).
- Sloboda, D. D., Claflin, D. R., Dowling, J. J., Brooks, S. V. Force measurement during contraction to assess muscle function in zebrafish larvae. J Vis Exp. (77), (2013).
- McDonald, C. M., Henricson, E. K., et al. The 6-minute walk test as a new outcome measure in Duchenne muscular dystrophy. Muscle Nerve. 41 (4), 500-510 (2010).
- McDonald, C. M., Henricson, E. K., et al. The 6-minute walk test and other clinical endpoints in duchenne muscular dystrophy: reliability, concurrent validity, and minimal clinically important differences from a multicenter study. Muscle Nerve. 48 (3), 357-368 (2013).
- Hurd, M. W., Debruyne, J., Straume, M., Cahill, G. M. Circadian rhythms of locomotor activity in zebrafish. Physiol Behav. 65 (3), 465-472 (1998).
- MacPhail, R. C., Brooks, J., Hunter, D. L., Padnos, B., Irons, T. D., Padilla, S. Locomotion in larval zebrafish: Influence of time of day, lighting and ethanol. Neurotoxicology. 30 (1), 52-58 (2009).
- Berger, J., Berger, S., Jacoby, A. S., Wilton, S. D., Currie, P. D. Evaluation of exon-skipping strategies for Duchenne muscular dystrophy utilizing dystrophin-deficient zebrafish. J Cell Mol Med. 15 (12), 2643-2651 (2011).
- Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish. Biochem Bioph Res Co. 423 (4), 785-788 (2012).
- Ravenscroft, G., Jackaman, C., et al. Mouse models of dominant ACTA1 disease recapitulate human disease and provide insight into therapies. Brain. 134 (4), 1101-1115 (2011).
- Ravenscroft, G., Wilmshurst, J. M., et al. A novel ACTA1 mutation resulting in a severe congenital myopathy with nemaline bodies, intranuclear rods and type I fibre predominance. Neuromuscular Disord. 21 (1), 31-36 (2011).
- Wolman, M. A., Jain, R. A., Liss, L., Granato, M. Chemical modulation of memory formation in larval zebrafish. Proc Natl Acad Sci. 108 (37), 15468-15473 (2011).
- Müller, U. K., van Leeuwen, J. L. Swimming of larval zebrafish: ontogeny of body waves and implications for locomotory development. J Exp Biol. 207 (Pt 5), 853-868 (2004).
- Cheng, W., Tian, J., Burgunder, J. M., Hunziker, W., Eng, H. L. Myotonia congenita-associated mutations in chloride channel-1 affect zebrafish body wave swimming kinematics. PLoS ONE. 9 (8), e103445 (2014).
- Moggio, M., Colombo, I., et al. Mitochondrial disease heterogeneity: a prognostic challenge. Acta Myol. 33 (2), 86-93 (2014).
