Summary
نموذج المنشأة transurethral قسطرة للفئران يسمح دراسة أمراض المثانة، بما في ذلك عدوى المسالك البولية، ولكن يمكن أن يتم فقط في الإناث. نموذج جديد لتقطير transurethral الذكور، المعروضة هنا، سيمكن البحث في منطقة تتسم بالاختلافات السريرية والوبائية قوية بين الجنسين.
Abstract
التهابات المسالك البولية (UTI) شائعة للغاية في جميع أنحاء العالم، تحمل مراضه كبيرة والنفقات المرتبطة بالرعاية الصحية. نماذج الحيوانات الصغيرة، والتي تعكس بدقة وضع المرض والتقدم، تسمح بتشريح للتفاعلات المضيف الممرض وجيل من الحصانة للإصابة. في الفئران، اكتسبت UTI تقطير إينترافيسيكال من أوروباثوجينيك كولايالمسبّب في أكثر من 85 في المائة مجتمع، يلخص العديد من مراحل الإصابة في البشر. حتى وقت قريب، غير أن UTI يمكن فقط أن تكون على غرار في أنثى الحيوانات. وقد أعاق هذا القيد دراسة الاختلافات المتعلقة بالجنس في UTI، فضلا عن غيرها من أمراض المثانة، مثل سرطان. هنا، نحن تصف طريقة لغرس الفئران الذكور التي تتيح إجراء مقارنة مباشرة بين الحيوانات الذكور والإناث وتوفير بروتوكول مفصلة لتقييم أنسجة المثانة عن طريق التدفق الخلوي كوسيلة لتحسين فهم استجابات المضيف للإصابة. معا، سوف تساعد هذه النهج في تحديد العوامل المضيفة التي تسهم في التحيزات القائمة على الجنس ولاحظ UTI وغيرها من الأمراض المرتبطة بالمثانة.
Introduction
التهابات المسالك البولية (UTI) واحدة من الأمراض الأكثر شيوعاً في البلدان المتقدمة النمو1. تتشابه معدلات الإصابة بين الإناث والذكور بين حديثي الولادة و كبار السن2. ومع ذلك، قد قبل انقطاع الطمث النساء البالغات، حدوث زيادة كبيرة ل UTI المكتسبة في المجتمع مقارنة بالرجال2،3. ونظرا لأن هذا المرض يؤثر بالدرجة الأولى المرأة، البحوث الأساسية والسريرية أغلبية ساحقة ركزت على UTI في الإناث. ومع ذلك، UTI في الرجال هو تحدي الكبير والمداريين الرعاية الصحية4. والواقع أن سبب UTI في الرجل ترتبط بارتفاع الإصابة بالأمراض، هذه الالتهابات بشكل روتيني تعرف بأنها معقدة4،5.
تطور فهمنا للدور المركزي للتحيز القائم على الجنس في علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض، أساليب جديدة مطلوبة لاستكشاف هذا الجانب سابقا المهملة من المرض. الاختلافات بين الجنسين دوراً أساسيا في الإصابة؛ والحصانة الإناث بنسبة أعلى من أمراض المناعة الذاتية، في حين أن الذكور أكثر عرضه لبعض الأمراض، مثل السل، والملاريا، وفيروس نقص المناعة البشرية6،7. سرطان المثانة، أمراض أورولوجيك آخر، إلى حد كبير أكثر انتشارا في الرجال أكثر من النساء، وقد أظهرت دراسات عدة دور الاندروجين في تطوير خبيثة8،،من910،11 ،12. خصوصا، ومع ذلك، يتم تحقيق علاجات إينترافيسيكال لسرطان المثانة حصرا في الحيوانات الإناث، بسبب عدم القدرة على كاثيتيريزي مرارا وتكرارا الفئران الذكور13.
دراسة إمراضية UTI تعتمد اعتماداً كبيرا على نماذج القوارض من العدوى (مثلالفئران والجرذان). قد تستخدم نماذج مورين من UTI أوروباثوجينس أصلاً المعزولة من الإصابات البشرية، مثل أوروباثوجينيك كولاي (أبيك)، الكلبسيله، البرازية، المكوّرات العنقودية، أو بروتيوس14. عادة، يتم إدخال البكتيريا في المثانة قسطرة عبر مجرى البول. يمكن إزالة أثر العدوى والخزانات والكليتين لتقييم معايير محددة للإصابة، مثل الاستعمار الجرثومي أو تلف الأنسجة المضيف الاستجابة المناعية15،16. عالمياً، ومع ذلك، تستخدم فقط أنثى الحيوانات للبحوث UTI. وفي الواقع، لاحظنا العديد من الدراسات، لأسباب التشريحية، قسطرة للفئران الذكور ليس ممكناً13،17،،من1819. في الآونة الأخيرة، قد وصف نهج العمليات جراحية لتقطير الذكور الذي يتم فتح البطن، المثانة هو المشردين خارجياً عن طريق تطبيق ضغط لطيف على فتح في البطن، ويتم حقن البكتيريا في المثانة20. ويتيح هذا النهج العدوى الذكور، على حساب التدخل الجراحي. وهكذا، يتضمن تحذيراً رئيسية لهذا النهج تأثير الالتهاب، على نتائج الإصابة مثل القدرة على حمل استجابة التئام الالتهابات إلى شق21. كما تشمل مصالحنا فهم التحيز القائم على الجنس في التصدي للمرض، قمنا بتطوير طريقة لتقطير إينترافيسيكال البكتيرية في الفئران الذكور أكثر تطابقاً مع النهج transurethral غير الجراحية الراسخة المستخدمة في القوارض الإناث22 .
نموذجنا تستند منهجية المتبعة، ويوفر القدرة على مقارنة مباشرة الاستجابة المناعية المضيف إلى UTI في الحيوانات الذكور والإناث. هذا الأسلوب سوف تسمح بتشريح للفوارق القائمة على الجنس في الإصابة، ويحتمل أن توفر القرائن الجزيئية والخلوية للفروق وضوحاً في حساسية واستجابة للإصابة بين الجنسين. بالإضافة إلى ذلك، يحتوي هذا النموذج قيمة أبعد من الدراسات UTI، يسمح بإنشاء نماذج للتحقيق في الأمراض الأخرى المرتبطة بالمثانة، مثل سرطان المثانة والبروستاتا ومتلازمة المثانة تحت أو عبر active والتهاب المثانة الخلالي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت التجارب الماوس وفقا للموافقة على البروتوكول رقم 2012 0024 بمد اللجنة 'الأخلاق en expérimentation أنيمالي"مركز باريس" et سود (لجنة الأخلاقيات للتجارب الحيوانية)، في تطبيق الأوروبية 2010 التوجيه/63 الاتحاد الأوروبي.
1-إعداد القسطرة
- إعداد قنية الحصول في الوريد-طب الأطفال واحد لكل مجموعة من الفئران للإصابة. استخدام إليه الربيع يحمل في ثناياه عوامل، تجريد كل قنية إبرة، حسب تعليمات الشركة المصنعة. تجاهل الإبر، والحفاظ على قنية الحقن البلاستيكية فقط.
- تعقيم القسطرة في غطاء الاندفاق الصفحي لدورة واحدة الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية)، وعادة 25-30 دقيقة.
ملاحظة: يمكن استخدام القسطرة للماوس واحد أو أكثر، ولكن ينبغي أن تستخدم قسطرة جديدة بين المجموعات التجريبية، والجنسين، أو السلالات البكتيرية.
2-إعداد أوروباثوجينيك كولاي للإصابة
- قبل يومين على الأقل من قبل الإصابة، باستخدام حلقة تطعيم عقيمة، الانتصارات أوبيك من مخزون بكتيرية مجمدة على طبق أجار مرق لوريا (رطل)، التي تحتوي على المضادات الحيوية إذا كان ذلك مناسباً. احتضان عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. ويمكن تخزين لوحات عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
- في قارورة Erlenmeyer عقيمة 100 مل، تطعيم مل 10 رطل، التي تحتوي على المضادات الحيوية إذا كان ذلك مناسباً، مع مستعمرة واحدة من لوحة رطل واحتضان الدائمة في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها (حوالي 16-18 ساعة).
ملاحظة: الثقافات الدائمة تسمح بالتعبير عن نوع بيلي 1، التي ضرورية للعدوى23. ثقافات نمت تهز سيكون أقل كفاءة بيلي التعبير، ومن ثم تتعارض معدلات الإصابة. - قياس الكثافة البصرية (OD)600 الثقافة بين عشية وضحاها، وحساب العدد من البكتيريا كل مل باستخدام منحنى نمو محددة مسبقاً. كمثال، لابيك سلالة UTI89، التطوير التنظيمي600 = 0.35 يساوي 2 × 108 زيمبابوي كل مل، وبالتالي، ثقافة بين عشية وضحاها مع OD600 = 2.4 سيكون ما يعادل 13.7 × 108 زيمبابوي كل مل تجريبيا تحديد العلاقة بين OD600 والبكتيريا قادرة على البقاء مع كل سلالة جديدة من العاملين للعدوى.
-
تحديد كمية البكتيريا اللازمة بالنظر في العدد من الحيوانات للإصابة وأن يتلقى كل الماوس حوالي 107 مستعمرة تشكيل وحدات (زيمبابوي) في 50 ميكروليتر PBS. تدرج في الحساب حجم ميليلتر ~ 130 قتيلا لب القسطرة والمحاقن و 100 ميليلتر اللازمة لتحديد العدوى.
- وتدور تعليق البكتيرية في ميكروسينتريفوجي منضدية في 17,000 س ز لمدة 1 دقيقة ريسوسبيند بيليه البكتيرية الناتجة في 2 × 108 زيمبابوي كل مل في برنامج تلفزيوني. تمييع متسلسل قاسمة هذا التعليق ولوحة على أجار رطل، مع المضادات الحيوية إذا كان ذلك ملائماً، لتحديد العدوى الدقيق لكل عدوى.
- رسم العدوى البكتيرية في محقن 1 مل وإرفاق القسطرة إلى نهاية المحاقن. الاستفادة من حقنه إزالة أي الهواء وكساد المكبس لملء المساحة الجوية الميت في القسطرة قبل البدء تقطير.
3-إعداد الفئران
- تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل من xylazine الكيتامين و 5 ملغ/كغ 100 مغ/كغ. ويمكن توفير الحرارة تكميلية.
- التأكد من أن كل الماوس هو مخدراً كاملا بالضغط قاطع مع الضغط المتوسط. الفئران هي مخدراً تماما عندما لا تتفاعل وتتطلب 3-5 دقائق للوصول إلى هذه الدولة.
- ضع الفئران ضعيف وتطبيق متوسط الضغط على أسفل البطن لتفريغ مثانة البول. قربه كاملة يشعر وكأنه بازلاء تحت الجلد بين القمم إيليك.
ملاحظة: قد استخدمت isoflurane المستنشقة كاثيتيريزي الفئران الإناث15،22، بيد أنه لم يتم اختبار ما إذا كان يتم تخديره الفئران الذكور بما فيه الكفاية باستنشاق إيسوفلوراني لهذا الإجراء.
4-ترانسوريثرال تقطير الفئران الإناث
- باستخدام اليد غير المهيمنة، وضع الإبهام على الذيل واصبع لنفس اليد على بطن الماوس وتطبيق ضغط لطيف في معارضة الاتجاهات عقد الماوس بقوة في مكانها.
-
ضع طرف القسطرة عمودي على الماوس في فتحه الاحليل. مع ضغط لطيف، الشريحة القسطرة في مجرى البول، حتى يفي المحور الفوهة الاحليل، بينما في الوقت نفسه خفض المحاقن حيث أنها موازية لسطح العمل. وتتطلب القسطرة لا تزييت. عدم دفع أو إجبار القسطرة في مجرى البول. وينبغي أن الشريحة القسطرة بسلاسة وسهولة في مجرى البول، مع قليل من أي مقاومة.
- قبل غرس العدوى (الخطوة 4، 3)، مرة واحدة من القسطرة في المكان، جداً بلطف سحب الجلد البطن نحو رأس الماوس مع الإصبع غير المهيمنة اليد التي موجود بالفعل في بطن الماوس (الخطوة 4، 1). إذا كانت القسطرة في مجرى البول، الأنسجة يؤلف الفوهة الاحليل لن يتحرك، بينما إذا تم بشكل غير صحيح وضع القسطرة في المهبل، سيتم نقل الأنسجة أعلى وبعيدا عن القسطرة. وينبغي إجراء هذا الاختبار السريع على كل الماوس.
- عندما يلتقي محورا للقسطرة الفوهة الاحليل، ببطء الاستغناء عن 50 ميليلتر من العدوى البكتيرية. ويقلل نسبة تقطير بطيء ارتداد مثاني في الكلي. ببطء بإزالة القسطرة لمنع التسرب، وعبر عدد 5. وضع الفئران في اقفاصها في موقف ضعيف.
5-ترانسوريثرال تقطير من الفئران الذكور
- ضع اثنين الإبهام الملقط cranially وكودالي للأعضاء التناسلية الخارجية للماوس. سحب القلفة الكشف الكامل عن حشفة القضيب. حالما يتم وضع القضيب خارجياً، الإفراج عن ملقط الإبهام.
- تغيير موضع الملقط على استقرار القضيب بارزة عمودي على الحيوان، وعقد الجهاز بلطف ولكن تاوتلي. تصور ماتيوس الاحليل وإدخال القسطرة بعناية في فتحه صغيرة في طرف الجهاز. دليل القسطرة بلطف إلى القضيب، تجاه جسم الماوس، والحفاظ على التوتر لطيف مع الملقط. وتتطلب القسطرة لا تزييت. لا تستخدم القوة القسطرة في القضيب؛ وينبغي أن الشريحة القسطرة بسلاسة في مجرى البول، مما يشير إلى الموضع الصحيح.
- عندما يلتقي محورا للقسطرة غيض القضيب، ببطء شديد الاستغناء عن 50 ميليلتر من العدوى، مع الحفاظ على موقف القضيب. يمكن الإشارة إلى نوعية تقطير في هذا الوقت وفقا لدرجة جودة تقطير محددة سلفا، مثل التي تظهر في الشكل 2.
- سحب القسطرة ببطء، على عد 5، لمنع التسرب من العدوى. وضع الفئران في اقفاصها في موقف ضعيف. ينبغي أن تبدأ الحيوانات استرداد 30-45 دقيقة بعد إدارة المخدر.
6-البت في زيمبابوي في الأجهزة المصابة
- في نقاط زمنية محددة سلفا، وافق التضحية الفئران باستخدام إجراءات التشغيل الموحدة (مثلاً، والتفكك عنق الرحم أو جرعة زائدة من ثاني أكسيد الكربون). ترطيب البطن جيدا مع الإيثانول 70% تقليل التلوث بالفراء.
- جعل شق عبر الثلث السفلي من البطن الماوس على الأقل 2 سم باستخدام المقص وإزالة المثانة وأي الأجهزة المطلوبة، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر، الكلي، الخصية، الحويصلات، أو الغدد بريبوتيال، أسيبتيكالي إلى 5 مل أنابيب كاب البوليبروبيلين المفاجئة التي تحتوي على 1 مل PBS العقيمة. تبقى جميع العينات على الجليد.
- مجانسة الأجهزة مع الخالطون يده حتى تبقى تقريبا لا الأنسجة الصلبة، حوالي 15-60 ثانية اعتماداً على الجهاز. الدهون عدم تجانسه جيدا، ويمكن التعرف عليه بسهولة لماع أبيض بيج الأنسجة. تجاهل التذويب الدهون قبل أو بعد. تغسل في الخالطون في الإيثانول متبوعاً ببرنامج تلفزيوني بين كل التجريبية أو المجموعة الجهاز.
ملاحظة: بشكل عام، استخدام أجهزة المجانسة المحمولة أو أجهزة المجانسة طاحونة حبة. في حين أن جميع هذه الأنظمة قد أسفرت عن نتائج مماثلة، حسبما تقرره المقارنة المباشرة لزيمبابوى البكتيرية في 24 ساعة بعد الإصابة، ينبغي تحديد الظروف المثلى مجانسة الأنسجة المضيف مع الحفاظ على استمرارية البكتيرية تجريبيا قبل تنفيذ هذا البروتوكول بشكل روتيني. - إجراء تخفيف المسلسل من تعليق الجهاز المتجانس. لوحة تخفيف على ألواح أجار رطل، التي تحتوي على المضادات الحيوية عندما يكون ذلك مناسباً، واحتضان بين عشية وضحاها (~ 15 ساعة) عند 37 درجة مئوية. سلالات أبيك مرات مضاعفة سريعة جداً وعلى هذا النحو، ينبغي الحرص على عدم احتضان لوحات أجار طويل جداً لأن هذا سوف يعوق القدرة على عد مستعمرات فردية.
7-تدفق سيتوميتريك تحليل أنسجة المثانة
- إعداد المخزن المؤقت الهضم المحتوية على كولاجيناز في 34 وحدة/مل والدناز في 100 ميكروغرام/مل، في برنامج تلفزيوني. الحفاظ على الجليد. إعداد أنبوب مخروطي 15 مل واحد كل الحيوانات يتم تحليلها والكوة 1 مل الهضم المخزن المؤقت كل أنبوب.
- وفي تيميبوينتس محددة سلفا، وافقت التضحية الفئران باستخدام إجراءات التشغيل القياسية (مثل سرطان عنق الرحم التفكك أو جرعة زائدة من ثاني أكسيد الكربون). ترطيب البطن جيدا مع الإيثانول 70% تقليل التلوث بالفراء.
-
جعل شق عبر الثلث السفلي من البطن الماوس على الأقل 2 سم باستخدام المقص وإزالة المثانة كاملة. فرم جيدا مع مقص، قطع المثانة إلى 2-3 مم2 الحجم قطعة، عادة حوالي 8 قطع.
- إضافة المثانة مفروم واحد كل أنبوب يحتوي على المخزن المؤقت الهضم. اهتز لغسل المثانة مفروم الأنسجة في المخزن المؤقت الهضم. الحفاظ على الجليد حتى يتم تشريح جميع الخزانات ومفروم.
- احتضان قربه المفروم لمدة 60-75 دقيقة عند 37 درجة مئوية، مع قوية المصافحة باليد ل 5 ق كل 15 دقيقة. عندما الأنسجة بمظهر زجاجي شفاف، تشبه الرطب المناديل الورقية، اكتمال الهضم. سيتم إزالة البروتينات السطحية من الخلايا اللازمة لتحديد هوية الهضم فترات طويلة وينبغي تجنبها.
- إلغاء تنشيط إنزيمات الهضم بإضافة 2-3 مل من المثلج التدفق الخلوي المخزن المؤقت (برنامج تلفزيوني يحتوي على 2% مصل بقرى الجنين (FBS) و 0.2 مم يدتا) وتخلط برفق. وضع أنابيب على الجليد.
- لضمان تعليق خلية مفردة، ولإزالة أي النسيج الضام، تمرير محتويات الأنبوب من خلال عامل تصفية 100 ميكرومتر توضع في أنبوب مخروطي 15 مل. اضغط برفق أي الأنسجة المتبقية من خلال عامل التصفية مع نهاية المكبس المحاقن. يجب غسل الفلتر مع مخزن مؤقت لقياس تدفق إضافية 2 مل. الاحتفاظ بعينات على الجليد.
- تغسل العينات باستخدام الطرد المركزي لمدة دقيقة 7 في 200 س ز، 4 درجة مئوية. ريسوسبيند الكريات في 100 ميليلتر التدفق الخلوي المخزن المؤقت تحتوي على نادي كتلة، تضعف إلى 5 ميكروغرام/مل ونقل إلى 96-فضلا عن جولة أسفل لوحة. بعد 10-15 دقيقة، إضافة 100 ميليلتر المطلوب جسم كوكتيل لكل عينة. احتضان عينات ل 30-45 دقيقة، على الجليد، على محمية من الضوء.
ملاحظة: كتلة Fc كاشف تستخدم لمنع ربط الجزء Fc من الأجسام المضادة للخلايا التعبير عن مستقبلات Fc. الغرض منه تقليل ملزمة جسم غير محدد. تحديد الأجسام المضادة لاستخدام سوف تعتمد على فرضية يجري اختباره في التجربة، ويجب أن يكون محدداً مع مدخلات من الأدب. في الشكل 3، استخدمت لقياس تسلل الخلايا المناعية عموما، جسم CD45 المضادة، وهو بروتين خلايا المناعية عموم. - تغسل العينات باستخدام الطرد المركزي لمدة دقيقة 7 في 200 س ز، 4 درجة مئوية. ريسوسبيند الكريات الخلية في 200 ميليلتر التدفق الخلوي العازلة وتمرير عينات من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر في أنبوب البوليستيرين 5 مل فقط قبل الحصول على سيتوميتير تدفق.
- جمع العينة كاملة على سيتوميتير التدفق. هضم جيد سوف تسفر عن الخلايا 200,000-400,000، مع 8,000-10,000 CD45+ الخلايا الخلايا المناعية من السذاجة الماوس قربه، بينما الأجهزة المصابة سوف تحتوي على أكثر من16 (الشكل 3).
ملاحظة: لا يمكن استخدام عينات على استعداد لتحليل تدفق سيتوميتريك لتقييم زيمبابوي. لا ينصح بتقسيم المثانة إلى قسمين كما توجد لا أدلة تثبت أن الاستعمار أبيك أو تسلل الخلايا المناعية موحدة في جميع أنحاء الأنسجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في وضع هذا البروتوكول، أفواج من إناث وذكور الفئران C57Bl/6 الذين تتراوح أعمارهم بين 6 إلى 8 أسابيع كانت عبء عميق، والبكتيرية تقييمها في أكياس في النقاط الزمنية تتراوح بين 1 ساعة لمدة 30 يوما. وترد النتائج التي تسفر عنها هذه الدراسات في مكان آخر (شرف زيتشلينسكي et al.، معلق). وهنا، يقدم بيانات تمثيلية من الإصابات على مدار 24 ساعة. جدير بالذكر أن عبء البكتيرية كان يعادل بين الفئران الذكور والإناث على مدار 24 ساعة بعد الإصابة (الشكل 1). وقد لوحظ اختلاف بسيط في عبء البكتيرية داخل كل مجموعة على مدار 24 ساعة بعد الإصابة، مماثلة لما تم الإبلاغ عنه في الفئران الإناث15،16.
إذا كان هو الحرص على قربه فارغة بما فيه الكفاية للبول قبل الإصابة، نادراً ما يلاحظ تسرب كبير للعدوى في الفئران الإناث. ومع ذلك، أدى تقطير في الفئران الذكور كميات كبيرة من العدوى البكتيرية المتسرب من الاحليل، لا سيما خلال مرحلة التطوير لهذا البروتوكول. لتحديد ما إذا كانت الخسارة للعدوى في وقت الإصابة أثرت الاستعمار أو إنشاء للإصابة، استخدمنا نظام تصنيف لكل تقطير. كل تقطير سجلت على مقياس من 1-5، مع 1 يجري استعمار المثلى، والبكتيرية كانت مصممة على مدار 24 ساعة بعد الإصابة (الشكل 2، مربع). بينما كان هذا النظام يعتمد المحقق، ولذلك، يحتمل أن تكون ذاتية، صاحب البلاغ الأولية لهذه الدراسة تحديد جميع الدرجات فور تقطير، قبل تقييم عبء البكتيرية في أكياس المصابة. توجد لا فروق يعتد بها إحصائيا بين زيمبابوي التي تم الحصول عليها من الحيوانات مع عشرات تقطير مختلفة، حسب تقييم اختبار كروسكال-واليس nonparametric مقارنة مرتبة يعني كل عمود مع رتبة يعني كل عمود آخر (p = 0.17) وتصحيح لمقارنات متعددة باستخدام اختبار دن. من هذا التحليل، يمكن أن يستنتج أن الأمثل إينستيليشنز (نقاط > 3)، أدى إلى تسرب كبير للعدوى البكتيرية أثناء الإصابة، ولا يؤثر بشكل ملحوظ الاستعمار الجرثومي في 24 ساعة (الشكل 2، الرسم البياني). جدير بالذكر أن ذوي الخبرة، تواتر تسرب في الفئران الذكور تقلص إلى حد كبير.
وأخيراً، كان الهدف في وضع هذا النموذج لمقارنة مباشرة الاستجابة المناعية لابيك في الحيوانات الذكور والإناث. لاختبار ما إذا كان يتم تبديل تسلل الخلوية بين الجنسين في الاستجابة إلى UTI، عدد CD45+ قيمت الخلايا المناعية في السذاجة وافواج المصابة من الفئران الذكور والإناث بالتدفق الخلوي. بينما لم يكن العدد الخلايا المناعية الموجودة في الحيوانات السذاجة مختلفة بين الفئران الذكور والإناث (p = 0.95)، كانت هناك زيادة ذات دلالة إحصائية في التسلل إلى قربه من الفئران الإناث المصابة (p = 0.0015) (الشكل 3 أ-ب).
رقم 1: أبيك كولونيزيس قرب الذكور والإناث بكفاءة متساوية. 6 إلى 8 أسبوع من العمر إناث وذكور الفئران C57Bl/6 تم ترسيخها مع 107 "زيمبابوي لابيك". 24 ساعة بعد الإصابة، قربه من أسيبتيكالي إزالة تعداد عبء البكتيرية. ويصور الأرض زيمبابوي/المثانة. كل نقطة من واحد الماوس، تجربة تمثيلية من 5 سيظهر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: "نوعية تقطير" ترتبط "عبء البكتيرية" في 24 ساعة بعد الإصابة. 6 إلى 8 أسبوع من العمر إناث وذكور الفئران C57Bl/6 تم ترسيخها مع 107 "زيمبابوي لابيك". فورا بعد كل تقطير، تعيين باحث واحد نقاط جودة لتقطير، حسب تعريف معايير محددة (مربع النص). 24 ساعة بعد الإصابة، قربه من أسيبتيكالي إزالة تعداد عبء البكتيرية. ارسم يصور جودة المعينة نقاط مقابل زيمبابوي/المثانة. كل نقطة واحدة من الماوس، تظهر التجارب المجمعة 5. p = 0.17، اختبار كروسكال-واليس مقارنة مرتبة يعني كل عمود مع رتبة يعني كل عمود أخرى مع الاختبار المخصص بعد دن لمقارنات متعددة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: هو زيادة "تسلل الخلايا المناعية" في "الفئران الإناث" ردا على UTI. 6 إلى 8 الأسبوع كانت تغرس القديمة إناث وذكور الفئران C57Bl/6 أو لا مع 107 "زيمبابوي لابيك". قطع دوت تمثيلية تصور المثانة مجموع الخلايا مع CD45+ الخلايا المناعية عن طريق بوابة باللون الوردي من السذاجة أو إصابة الفئران. يظهر الرسم البياني العدد المطلق ل CD45+ الخلايا المناعية في أكياس من السذاجة أو الفئران المصابة على مدار 24 ساعة. كل نقطة واحدة من الماوس، تظهر التجارب المجمعة 2. فقيم يحددها اختبار مان-ويتني. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يوفر العديد من الفرص الجديدة للبحث في تأثير الجنس على أمراض المثانة المخاطية تقطير transurethral من الفئران الذكور، ولكن أيضا تحديات عدة. قبل كل شيء، قيد واحد أن تقطير يمكن في البداية أن تكون صعبة من الناحية التقنية، أدى إلى التهاب المفرط أثناء الإدراج القسطرة. يمكن تحقيق تحسن في أسلوب بتقطير فئران ميتة بحل ملونة، مثل صبغ إيفانز الأزرق. ينبغي للتأكد من نجاح تقطير، فتش الخزانات بصريا ويمكن تقييم حجم السائل عميق باستخراج مع حقنه السلين. ولا يمكن المبالغة في أهمية تحركات بطيئة، ولطيف: ينبغي أن يكون هناك أي مقاومة وليس القوة المستخدمة لإدخال القسطرة، كما سوف يؤدي هذا إلى التهاب الزائدة وتلف الأنسجة. عند القيام بشكل صحيح، سوف الشريحة القسطرة دون عناء في مجرى البول. إذا كان هناك شعور المقاومة أو إعاقة، فمن الأفضل إزالة القسطرة وريتيمبت الإدراج.
طريق مضاهاة جودة تقطير لعبء البكتيرية على مدار 24 ساعة بعد الإصابة، أثبتنا أن أسلوب الكمال، الذي يضيع مقدار صغير من العدوى البكتيرية في وقت الإصابة، لا تزال النتائج في استعمار قوي المثانة. في الاستفادة من هذا البروتوكول، ينبغي أن تهدف محقق لتحقيق إينستيليشنز خالية من تسرب. ومع ذلك، يضمن متانة الإجراء أن إينستيليشنز ناقصة لا تزال توفر بيانات مفيدة ونتائج التفسير.
ميزة كبيرة لدينا تقنية على الأسلوب البديل المنشورة فقط من التهاب المثانة الذكور هو نهجها غير الغازية، وغير الجراحية. نهجنا باستخدام تقطير transurethral يتبع المسار الفيزيولوجية من خلال مجرى البول إلى المثانة، ودون الإخلال بالسلامة الهيكلية للبطن. يتضمن الأسلوب الغازية، الموصوفة ب أولسون والزملاء20، العوامل الملازمة للعمليات الجراحية، بما في ذلك التهاب، وتأخر الشفاء، وما نتج عن ذلك ندبا. ذات الصلة لا سيما فيما يتعلق بالدراسات المتعلقة بالاستجابة المناعية للعدوى استجابة للكائن للصدمات الجراحية. وهذا يشمل تشكيل بيئة برو تحريضية وتحبيب الأنسجة المحتملة، فضلا عن برنامج شفاء جرح للالتهابات كجزء من عملية الشفاء. وتمثل هذه العوامل تأثيرات غير مرغوب فيها ضمن الإعداد التجريبية.
أخيرا، كان الهدف من هذه الدراسة لتطوير طريقة تتيح المقارنة المباشرة للذكور والإناث من الاستجابات المناعية أثناء UTI، التي يمكن تطبيقها على الدراسات المستقبلية التي تتناول تأثير الجنس على أمراض المثانة المخاطية، مثل الإصابة وسرطان علم الأحياء. كميزة ثانية، الأسلوب الموصوفة هنا المرايا التي تستخدم في الفئران الإناث لعقود19. وهكذا، تجارب أجريت في الفئران الذكور مع هذا الأسلوب قابلة للمقارنة لمجموعة واسعة من البحوث القائمة. لدينا تجارب قد كشفت عن وجود اختلافات في الاستجابة، وأن هذه الاختلافات يمكن أن يوفر أدلة لفهم التفاوت القائم على أساس الجنس استجابة لالتهابات الأغشية المخاطية، فضلا عن الأمراض الأخرى من المثانة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن نشكر الدكتور ماتيو روسو لقراءة نقدية المخطوطة و "مختبر إيمونوبيولوجي الجذعية" لأفكارهم المفيدة أثناء وضع هذا البروتوكول والمشروع. هذا العمل كان مدعومة جزئيا بتمويل من "الاتحاد الأوروبي السابعة إطار برنامج ماري كوري العمل" (PCIG11-GA-2012-3221170، وعلم الأورام المناعية لابيكس (ماي).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Insyte Autoguard Shielded IV Catheters 24 G, 0.7 mm external diameter, 14 mM long | BD Medical | 381811 or 381411* | * catalog number is country-dependent |
| inoculating loop | Greiner Bio-One | 731171 | |
| LB Miller broth | Difco | 244620 | |
| LB Miller agar | Difco | 244520 | |
| Cuvettes | Bio-rad | 223-9955 | |
| syringes | B Braun | 9166017V | |
| Thumb (Adson) forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| 5 ml tubes, polypropylene | Falcon | 352063 | |
| Tissue Ruptor disposable probes | Qiagen | 990890 | |
| 15 ml flip cap tubes | Thermo Scientific | 362694 | |
| DNAse | Invitrogen | 18047019 | |
| Liberase TM | Sigma-Aldrich | 5401119001 | should be aliquotted and stored at -20 °C to avoid repeated freeze-thaw |
| 100 µM MACS SmartStrainers | Miltenyi | 130-098-463 | compatible with 15 ml tubes, preferred |
| 100 µm cell strainers | Falcon | 352360 | compatible with 50 ml tubes, if MACS Smart Strainers are not available |
| 96 well plate | Falcon | 353077 | |
| Fc block | BD Pharmingen | 553142 | anti-CD16/CD32 |
| anti-mouse CD45 antibody | BD Biosciences | 561487 | many different fluorescent conjugation options are available |
| 5 ml tubes polystyrene with filter cap | Falcon | 352235 | |
| insulin syringe | Terumo | BS05M2913 | |
| hand held homogenizer | Qiagen | 9001272 | TissueRuptor |
| flow cytometer | BD Biosciences | N/A | Fortessa SORP |
| Flow cytometry software | BD Biosciences | N/A | Diva |
References
- Hooton, T. M., Stamm, W. E. Diagnosis and treatment of uncomplicated urinary tract infection. Infect Dis Clin North Am. 11 (3), 551-581 (1997).
- Harper, M., Fowlis, G. Management of urinary tract infections in men. Trends in Urology, Gynaecology & Sexual Health. 12 (1), 30-35 (2007).
- Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nat Rev Urol. 7 (12), 653-660 (2010).
- Lipsky, B. A. Urinary tract infections in men. Epidemiology, pathophysiology, diagnosis, and treatment. Ann Intern Med. 110 (2), 138-150 (1989).
- Conway, L. J., Carter, E. J., Larson, E. L. Risk Factors for Nosocomial Bacteremia Secondary to Urinary Catheter-Associated Bacteriuria: A Systematic Review. Urol Nurs. 35 (4), 191-203 (2015).
- Markle, J. G., Fish, E. N. SeXX matters in immunity. Trends Immunol. 35 (3), 97-104 (2014).
- Yu, C. Y., Whitacre, C. C. Sex, MHC and complement C4 in autoimmune diseases. Trends Immunol. 25 (12), 694-699 (2004).
- Castelao, J. E., et al. Gender- and smoking-related bladder cancer risk. J Natl Cancer Inst. 93 (7), 538-545 (2001).
- Donsky, H., Coyle, S., Scosyrev, E., Messing, E. M. Sex differences in incidence and mortality of bladder and kidney cancers: national estimates from 49 countries. Urol Oncol. 32 (1), 40-e31 (2014).
- Garg, T., et al. Gender Disparities in Hematuria Evaluation and Bladder Cancer Diagnosis: A Population-Based Analysis. J Urol. , (2014).
- Dobruch, J., et al. Gender and Bladder Cancer: A Collaborative Review of Etiology, Biology, and Outcomes. Eur Urol. , (2015).
- Hsu, J. W., et al. Decreased tumorigenesis and mortality from bladder cancer in mice lacking urothelial androgen receptor. Am J Pathol. 182 (5), 1811-1820 (2013).
- El Behi, M., et al. An essential role for decorin in bladder cancer invasiveness. EMBO Mol Med. 5 (12), 1835-1851 (2013).
- Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs. Am J Med. 113, Suppl 1A. 05S-13S (2002).
- Ingersoll, M. A., Kline, K. A., Nielsen, H. V., Hultgren, S. J. G-CSF induction early in uropathogenic Escherichia coli infection of the urinary tract modulates host immunity. Cell Microbiol. 10 (12), 2568-2578 (2008).
- Mora-Bau, G., et al. Macrophages Subvert Adaptive Immunity to Urinary Tract Infection. PLoS Pathog. 11 (7), e1005044 (2015).
- Oliveira, P. A., et al. Technical Report: Technique of Bladder Catheterization in Female Mice and Rats for Intravesical Instillation in Models of Bladder Cancer. (Conference Title)39th Scand-LAS and ICLAS Joint Meeting. 36, 5-9 (2009).
- Seager, C. M., et al. Intravesical delivery of rapamycin suppresses tumorigenesis in a mouse model of progressive bladder cancer. Cancer Prev Res (Phila). 2 (12), 1008-1014 (2009).
- Hagberg, L., et al. Ascending, unobstructed urinary tract infection in mice caused by pyelonephritogenic Escherichia coli of human origin). Infect Immun. 40 (1), 273-283 (1983).
- Olson, P. D., Hruska, K. A., Hunstad, D. A. Androgens Enhance Male Urinary Tract Infection Severity in a New Model. J Am Soc Nephrol. , (2015).
- Knipper, J. A., et al. Interleukin-4 Receptor alpha Signaling in Myeloid Cells Controls Collagen Fibril Assembly in Skin Repair. Immunity. 43 (4), 803-816 (2015).
- Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nat Protoc. 4 (8), 1230-1243 (2009).
- Wright, K. J., Seed, P. C., Hultgren, S. J. Development of intracellular bacterial communities of uropathogenic Escherichia coli depends on type 1 pili. Cell Microbiol. 9 (9), 2230-2241 (2007).
