Abstract
Obstakels van DNA, met inbegrip strak gebonden eiwitten en verscheidene laesies, kan ernstig de progressie van de cel replicatieapparatuur remmen. De blokkering van een replisome kan leiden tot de dissociatie van het chromosoom, hetzij gedeeltelijk of volledig, wat leidt tot de ineenstorting van de replicatie vork. Het herstel van deze val is een noodzaak voor de cel nauwkeurig volledige chromosomale duplicatie en vervolgens verdelen. Daarom, wanneer de instorting optreedt, de cel geëvolueerd diverse mechanismen die plek om de DNA vork te herstellen en laat replicatie neem aan te vullen met high fidelity. Eerder zijn deze replicatie herstel pathways in bacteriën bestudeerd met behulp van UV-schade, die het nadeel van het niet gelokaliseerd op een bekende plaats heeft. Dit manuscript beschrijft een systeem met behulp van een fluorescentie-repressor Operator System (FROS) om een site-specifiek eiwit blok dat de stalling en de ineenstorting van de replicatie fo kan induceren creërenrks in Escherichia coli. Protocollen detail hoe de status van replicatie kan worden gevisualiseerd in enkelvoudige levende cellen middels fluorescentiemicroscopie en DNA replicatie tussenproducten kunnen worden geanalyseerd door 2-dimensionale agarose gelelektroforese. Temperatuurgevoelige mutanten van replisome componenten (bijv DnaBts) kunnen in het systeem worden opgenomen om een synchrone ineenstorting van de replicatievorken induceren. Bovendien kan de rol van de recombinatie eiwitten en helicases die betrokken zijn bij deze processen worden onderzocht met behulp van genetische knockouts in dit systeem.
Introduction
Tijdens DNA-replicatie, de replisome geconfronteerd obstakels op het DNA die de progressie beïnvloeden. DNA-schade met inbegrip van letsels en hiaten evenals afwijkende structuren kunnen voorkomen dat de replisome voortzetting 1. Recentelijk is gevonden dat eiwitten gebonden aan het DNA zijn de meest voorkomende bron van belemmering vork progressie 2 replicatie. De kennis van de gebeurtenissen na de ontmoeting van de replisome met een nucleoproteïne blok eerder beperkt door het onvermogen om zo'n blok in het chromosoom van een levende cel te induceren op een bekende locatie. In vitro onderzoek heeft ons begrip van de kinetisch gedrag verbeterd een actieve replisome wanneer aan een nucleoproteïne blokkade 3, alsmede de mechanische details van de replisome zelf 4,5. Huidige kennis van de reparatie van replicatie wordt gewoonlijk uitgevoerd met UV als beschadigende middel en onderzocht met behulp van nucleïnezuren in vivo 6-8 in vivo kerneiwitten blok algemeen verstaan van deze onderzoeken of er verschillen in de moleculaire gebeurtenissen binnen de herstelmechanismen vanwege de duidelijke oorzaak van de replicatie blok blijft nog nader te bepalen.
We beschrijven hier een systeem waarmee een nucleoproteïne blok op een specifieke locatie van het chromosoom met behulp van een TL-repressor operatorsysteem (FROS) worden vastgesteld. Wij gebruiken een stam van E. coli die een reeks van 240 tetO-plaatsen opgenomen in het chromosoom 9 heeft. TetO elke plaats in de array een 10 bp willekeurige sequentie flankerende om de stabiliteit van de matrix te verhogen door het voorkomen RecA-gemedieerde recombinatie in de array. Deze array, en variaties daarvan, werden oorspronkelijk gebruikt om E. begrijpen coli chromosoom dynamiek 10,11, maar werden vervolgens aangepast aan prevent in vivo replicatie 12. De matrix is gevonden stabiel worden gehandhaafd en naar blok dicht bij 100% van replicatievorken wanneer gebonden TetR 10,12. Het gebruik van de vergelijkbare lacO array in vitro is gevonden zo weinig als 22 plaatsen voldoende om 90% van replicatie geblokkeerd waren, hoewel kortere matrix minder effectief in vivo 13 was. De matrix aan te passen aan een nucleoproteïne verstopping maken dient de repressor eiwit zeer op overproductie onder geoptimaliseerde omstandigheden waar het dan bindt aan de array een wegversperring maken. De vorming van de blokkering en de daaropvolgende afgifte, kan worden gemonitord met behulp van fluorescentiemicroscopie of een fluorescent gelabeld variant van het Tet-repressor wordt gebruikt. De status van replicatie in elke cel wordt aangeduid door het aantal foci gezien, waarbij een enkel brandpunt betekent maar een kopie van de matrix aanwezig in de cel en meerdere foci zijn indicatief voor actieve replicatie. Deze actieve replicatie wordt ingeschakeld wanneer het nucleoproteïne blokkade wordt omgekeerd door de toevoeging van de inducer onnodig dat de bindingsaffiniteit van het TetR operatorplaats afneemt voldoende voor replisome te gaan door de matrix. De repressor proteïne nog kan binden aan het DNA met hoog genoeg affiniteit die de nu meerdere kopieën van de matrix kan worden gevisualiseerd.
Meer ingewikkelde details van de gebeurtenissen bij de nucleoproteïne blokkade kan worden ontdekt met behulp van neutrale-neutrale tweedimensionale agarosegelelektroforese en Southern hybridisatie 14-16. Deze technieken laten de analyse van DNA tussen de diverse populatie. De replicatie tussenproducten die gevormd worden tijdens het evenement, en mogelijk nog niet herstelde, kan worden gevisualiseerd. Door het variëren van de restrictie-enzym en probe gebruikt, kunnen de tussenproducten worden gevisualiseerd niet alleen in de matrix gebied maar ook stroomopwaarts van de matrix bij de replicatievork regresses 17,18. Deregressie heeft plaatsgevonden na de replisome dissociatie; de leidende en ontluikende strengen te scheiden van de template strengen en hybridiseren met elkaar als de matrijs strengen tegelijkertijd opnieuw gloeien resulteert in een vierweg DNA-structuur (a Holliday kruising).
Met dit systeem is aangetoond dat de replicatie vork niet stabiel wanneer dit blok 18 stuit. Daarnaast kunnen derivaten van temperatuurgevoelige replisome componenten worden gebruikt om te voorkomen dat het herladen van de replicatievork eenmaal is ingestort. Zodra een blok wordt ingesteld, kan de spanning worden verschoven naar een niet-permissieve temperatuur voor een synchrone deactivering van de replisome en een gecontroleerd preventie herladen waarborgen. Deze temperatuur veroorzaakte deactivering zorgt alle vorken binnen de populatie ingestort op een bepaalde tijd en maakt de beoordeling van wat gebeurt wanneer de replisome instort, hoe het DNA wordt verwerkt, wat nodig is om restart het proces van DNA-replicatie.
Een voordeel van het beschreven systeem is dat het nucleoproteïne blok is volledig omkeerbaar; Daarom werd het vermogen van de cellen om te herstellen van het nucleoproteïne blok kan volgen. De toevoeging van anhydrotetracycline aan de cellen zal verlichten de sterke binding van de repressor, waardoor een replicatie vork om door te gaan en de cel om de levensvatbaarheid te herwinnen. De verlichting van de blokkering kan worden gevisualiseerd door neutrale neutraal tweedimensionale agarosegelelektroforese na 5 min en met behulp van microscopie binnen 10 minuten. Bovendien kan levensvatbaarheid van het vermogen van de stam om van de replicatie blokkade en blijven prolifereren onthullen.
Door het veranderen van de genetische achtergrond van de stammen die in de experimentele hier beschreven, kan de herstelmechanismen voor dergelijke blokkade worden toegelicht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Het blokkeren van replicatie met FROS
- Induceren van de Replication Verstopping
- Verdun een frisse 's nachts cultuur van een E. coli stam die een tetO array en pKM1 18 OD 600 nm = 0,01 in een verdunde complex medium (0,1% trypton, 0,05% gistextract, 0,1% NaCl, 0,17 M KH 2PO 4, 0,72 MK 2 HPO 4) met antibiotica behoefte voor selectie.
Opmerking: Weet tetracycline niet toe te voegen voor de selectie, omdat het niet compatibel is met dit systeem. Maak het volume van de kweek equivalent aan 10 ml per monster nodig. Bijvoorbeeld, de kweekvolume voor proefopzet in figuur 1 is 60 ml. - Groeien bij 30 ° C onder schudden totdat OD 600 nm = 0,05-0,1. Verwijderen van een 10 ml monster te dienen als de geïnduceerde controle en voeg 0,1% arabinose om de resterende cultuur aan de productie van TetR-YFP van pKM1 induceren. Blijven zowel de niet-geïnduceerde en geïnduceerde te groeienculturen. Na 1 uur, controleren op de aanwezigheid van één centraal punt binnen elke cel van de geïnduceerde cultuur met behulp van fluorescentie microscopie (zie hoofdstuk 2).
- Als de geïnduceerde cellen bevestigd geblokkeerd (meer dan 70% van de cellen een enkele focus), noteer de OD 600 nm en neem een 7,5 ml monster voor analyse door 2-D gels (zie paragraaf 3). Neem een gelijkwaardig monster van de niet-geïnduceerde controle cultuur.
- Verdun een frisse 's nachts cultuur van een E. coli stam die een tetO array en pKM1 18 OD 600 nm = 0,01 in een verdunde complex medium (0,1% trypton, 0,05% gistextract, 0,1% NaCl, 0,17 M KH 2PO 4, 0,72 MK 2 HPO 4) met antibiotica behoefte voor selectie.
- Het loslaten van de Replication Verstopping
- Om de replicatie blok los, voeg 100 ng ml -1 van de onnodige inducerende anhydrotetracycline (AT) om een 10 ml monster van de geblokkeerde cellen. Verder groeien bij 30 ° C gedurende 10 minuten en monsters voor celdichtheid (1 ml), microscopie analyse (10 ui) en neutraal neutraal 2-dimensionale agarosegels (7,5 ml).
- Inducerende Instorting van de replisome
- Als de cellen bevatten een temperatuurgevoelige allel zoals dnaB ts of dnaC ts dat deactiva vereisttie, verplaats de kolf die de geblokkeerde cellen tot 42 ° C. Monsters nemen voor analyse op tijdstippen vereist (bijv, 1 uur na incubatie). Nadat de cellen bij 42 ° C gedurende 1 uur geïncubeerd hebben, verschuiven de cellen tot 30 ° C gedurende 10 minuten (zie figuur 1).
Opmerking: De cellen kunnen opnieuw voor analyse worden verschoven naar 30 ° C.
- Als de cellen bevatten een temperatuurgevoelige allel zoals dnaB ts of dnaC ts dat deactiva vereisttie, verplaats de kolf die de geblokkeerde cellen tot 42 ° C. Monsters nemen voor analyse op tijdstippen vereist (bijv, 1 uur na incubatie). Nadat de cellen bij 42 ° C gedurende 1 uur geïncubeerd hebben, verschuiven de cellen tot 30 ° C gedurende 10 minuten (zie figuur 1).
Figuur 1:. Overzicht van de FROS Replication Block and Release Experimentele procedure E. coli stammen die de tetO matrix worden gekweekt bij 30 ° C. Wanneer de cellen een OD 600 nm van meer dan 0,05 te bereiken, is TetR-YFP productie geïnduceerd met arabinose (ara; 0,1%). Blijven groeien een subpopulatie van geïnduceerde cellen om als controles bij 30 ° C. Een monster van de geïnduceerde cellen geanalyseerd via fluorescentiemicroscopie na 1-2 uur (zie 2.1). Als replicatiebevestigd worden geblokkeerd, worden monsters voor 2-D gel analyse gaf de reageerbuizen (zie 3.1) en testen op levensvatbaarheid (optioneel). De replicatie verstopping kan worden verwijderd met anhydrotetracycline (AT, 0,1 gg / ml) en cellen geanalyseerd 10 minuten later. Als cellen dragen een temperatuurgevoelig allel (bijv dnaB ts), kan deze worden geïnactiveerd door het verschuiven van de geblokkeerde cellen tot 42 ° C voor de juiste analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2. fluorescentiemicroscopie
- Bereid een agarose pad pipetteren 500 ul van gesmolten agarose (1% in water) op een microscoopglaasje; overlay het dekglaasje onmiddellijk vóór de agarose stolt. Bewaar de schuif (s) in vochtige doekjes bij 4 ° C totdat het nodig is.
- Wanneer de agar is gestold, verwijder de dekglaasje uit de agarose pad en pipet 10 ul van bacteriëlecultuur op het midden van het kussen om beweging van de cellen tijdens visualisatie voorkomen. Zodra het monster is opgedroogd (ongeveer 5 min), vervang dan de dekglaasje. Breng een druppel immersie olie op de cover slip en plaats de dia onder optiek.
- Visualiseer de cellen met behulp van Phase Microscopy bij 100X vergroting.
- In het dialoogvenster Acquire vak in het imaging software, ingesteld belichtingstijd tot 100 msec. Leg het beeld door het selecteren van Acquire. Niet bewegen het podium. In het dialoogvenster Acquire selecteert YFP als de verlichting voor de externe Shutter Gekoppeld aan Camera. Stel de exporsure tijd tot 1000 msec. Schakel het podium in het licht. Leg het beeld fluorescentie door het selecteren van Acquire.
Opmerking: De tijd kan variëren afhankelijk van de lichtbron, microscoop en gebruikte camera. - Om de fase en fluorescerende beelden overlay, selecteer Color Combineer vanuit het menu Weergave. In de Color Combineer dialoogvenster selecteert u de YFP afbeelding als de fase afbeelding als de bl de groene component enue component. Klik op kleur te combineren. Bepaal of de bevolking had replicatie met succes geblokkeerd door vast te stellen of de meerderheid van de cellen hebben één doel per cel.
Opmerking: Vergelijking met een monster van de controle zonder toegevoegde arabinose is zeer handig zijn het verschil in EYFP productie identificeren.
- In het dialoogvenster Acquire vak in het imaging software, ingesteld belichtingstijd tot 100 msec. Leg het beeld door het selecteren van Acquire. Niet bewegen het podium. In het dialoogvenster Acquire selecteert YFP als de verlichting voor de externe Shutter Gekoppeld aan Camera. Stel de exporsure tijd tot 1000 msec. Schakel het podium in het licht. Leg het beeld fluorescentie door het selecteren van Acquire.
3. DNA Extraction / agarosestukjes
- Voeg natriumazide (eindconcentratie 0,1%) aan de kweek monsters 7,5 ml van stap 1.1.3 en 1.2.1. Incubeer op ijs gedurende tenminste 5 min.
Opmerking: Natriumazide is uiterst giftig. Raadpleeg het veiligheidsinformatieblad alvorens te beginnen werken en hoeft het niet aan nadat u alle veiligheidsvoorschriften gelezen en begrepen. - Centrifugeer de cellen 5000 xg gedurende 10 minuten om de cellen te pelleteren. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 200 pl Pett IV (PIV) buffer (10 mM Tris HCl (pH 8,0), 1 M NaCl). Microcentrifuge (13, 000 xg gedurende 2 minuten) om cellen te pelleteren. discard de bovenstaande vloeistof. In deze fase, de werkwijze verder de pellets of bewaar bij -20 ° C.
- Resuspendeer de cellen met de laagste celdichtheid in 50 gl PIV en plaats bij 50 ° C. Voor alle andere monsters, stel het volume van PIV zodat de uiteindelijke celdichtheid is hetzelfde in elke buis (bijvoorbeeld Voorbeeld 1 (OD 600 nm = 0,128) geresuspendeerd in 50 pl; Monster 2 (OD 600 nm = 0,138) geresuspendeerd in 54 ui).
- Voeg een gelijk volume van vers bereide 0,8% agarose oplossing PIV (eindconcentratie 0,4%, bijv. Voorbeeld 1 50 pl, Sample 2 54 pi). Waarborgen dat de monsters, agarose en PIV boven 50 ° C om stolling te voorkomen.
- Behandel een microscoop dia met 40 ul van een geschikt glas waterafstotend of silicone oplossing. Wrijf de dia met een tissue totdat het droog is.
Opmerking: Dit kan van tevoren de behandelde objectglaasjes opgeslagen op lange termijn bij kamertemperatuur. - Plaats 20 ul druppels tHij cel / agarose ophanging op de dia te pluggen die halfronde te produceren.
Opmerking: De eerste monster (gesuspendeerd in 50 ui PIV) zal 5 stekkers produceren op één dia. - Wanneer de pluggen gestold, schuif ze zachtjes in een microfugebuis en voeg 1 ml lysis buffer (10 mM Tris-HCl [pH 8], 1 M NaCl, 100 mM Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), 0,2% natriumdeoxycholaat, 0,5% N-lauroylsarcosine-natriumzout (Sarkosyl), 100 ug ml - 1 lysozym, 50 ug ml - 1 RNase A). Incubeer bij 37 ° C gedurende 2 uur.
- De cel lysis buffer en voeg / oplossing 1 ml EDTA Sarcosyl / Proteinase K (ESP) (0,5 M EDTA, 1% N-lauroylsarcosine-natriumzout (Sarkosyl), 1 mg ml - 1 proteinase K). Incubeer bij 50 ° C geïncubeerd of totdat de pluggen transparant. Als er een tweede incubatie gedurende de nacht nodig is, vervangt u de ESP-oplossing met verse buffer na ongeveer 18 uur.
- Verwijder deESP buffer en was de pluggen 5 maal met 12 ml Tris-EDTA (TE) -buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0), waardoor een 30 min equilibreren bij elke wasbeurt. Bewaren bij 4 ° C in 1 ml TE-buffer.
4. Neutraal neutraal 2-dimensionale gel elektroforese
- Transfer een agarose stekker uit stap 3.8 een nieuwe microfugebuis en voeg 150 ul restrictie-enzym buffer (1x concentratie). 25-100 eenheden van restrictie-enzym (bijvoorbeeld 60 eenheden EcoRV, (zie figuur 3A)). Digest bij 37 ° C gedurende 6-8 uur.
- Bij 4 ° C, giet een 0,4% agarosegel (300 ml) in 1 x Tris / boraat / EDTA (TBE) in een gel schaal van ongeveer 25 x 25 cm. Plaats een kam om putjes ongeveer dezelfde breedte als de diameter van de plug maken. Wanneer de gel wordt verwijderd, de kam en zet de gel tot kamertemperatuur.
- Schuif een van de gedigereerde agarose pluggen in een put, het positioneren van de vlakke schuif van de plug tegen de zijde van de put waarbij tHij DNA zal de gel in te voeren. Steek één stekker op dezelfde manier in elk tweede put.
- Pipetteer 0,4% gesmolten agarose aan de putjes om de stekkers verzegelen positie.
- Laad 1 kb DNA ladder in een lege put, wederom met een afstand tussen de ladder en monsters en een nacht laat de gel (16 uur, 55 V) in 1 x TBE bij kamertemperatuur.
- Vlekken op de gel in een waterbad met ethidiumbromide (0,3 ug ml-1) gedurende 20 min.
Opmerking: Ethidiumbromide wordt beschouwd als een sterk mutageen en een toxine. Raadpleeg het veiligheidsinformatieblad alvorens te beginnen werken en hoeft het niet aan nadat u alle veiligheidsvoorschriften gelezen en begrepen. - Visualiseren van het DNA met een langegolf UV transilluminator en knip elke rij fragment met een rechte, zelfs gesneden, minimaliseert het opnemen van overtollige agarose aan weerszijden van de baan.
Opmerking: Als bijvoorbeeld het fragment van belang is 5,5 kb, snijd een 7,5 cm fragment DNA fragmenten omvatten van 5 kb tot approximatEly 12 kb (zie figuur 3A). - Plaats de uitgesneden gel baan in een gel lade 90 ° Richtingsafhankelijke DNA migratie.
Opmerking: Twee rijen van 3 gel fragmenten kunnen passen in een 25 x 25 cm 2 gel lade. De eerste rij gel lanes is bovenaan van de bak, de tweede rij 12,5 cm. - Bereid 300 ml agarose voor de tweede dimensie gel (0,9% in 1x TBE met 0,3 ug ml-1 ethidiumbromide). Wanneer de agarose is afgekoeld tot 50 ° C, pipet gesmolten agarose rond de gelplakjes hun positie te versterken. Giet de resterende agarose in de lade een diepte die tenminste gelijk met de gelplakjes.
- Zodra de gel stolt, Electrophorese bij 4 ° C in 1 x TBE met 0,3 ug ml-1 ethidiumbromide bij 220 V totdat het DNA ongeveer 10 cm is gemigreerd.
Opmerking: 4 uur is voldoende voor een 5,5 kb fragment maar een kleiner fragment minder tijd nodig. - Uitsnijden de blokken waar de genomische DNA aanwezig uzingen de rand van een metalen liniaal, waaronder de gel erboven om het DNA die niet zichtbaar is (zie figuur 3C) omvatten.
5. Southern hybridisatie
- oplossingspreparaat
- Bereid depurinering buffer (0,125 M HCl oplossing).
Opmerking: Deze buffer kan worden hergebruikt en is stabiel bij kamertemperatuur gedurende 1 maand. - Bereid denaturatie buffer (1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH).
Opmerking: denaturatie buffer kan één keer worden hergebruikt en stabiel tot 3 maanden bij kamertemperatuur. - Bereid Neutralisatie buffer (1,5 M NaCl, 0,5 M Tris). Op pH 7,5 met HCl.
Opmerking: Neutralisatie buffer kan één keer worden hergebruikt en stabiel tot 3 maanden bij kamertemperatuur. - Bereid 10x Saline natriumcitraat (SSC) buffer (0,15 M trinatriumcitraat, 1,5 M NaCl, pH 7-8) voor gebruik in stappen 5.2.4 en 5.2.6. Vanuit deze buffer, maak een 2x SSC voorraad (voor gebruik in stap 5.2.9).
Opmerking: 10x SSC en 2x SSC eenopnieuw stabiel bij kamertemperatuur gedurende 3 maanden. - Bereid Gemodificeerde Church en Gilbert Hybridization Buffer 19 (0,5 M fosfaatbuffer [pH 7,2], 7% (w / v) natriumdodecylsulfaat (SDS), 10 mM EDTA). Reactie bij 65 ° C grondig vóór gebruik op te lossen.
- Bereid depurinering buffer (0,125 M HCl oplossing).
- Overdracht
- Spoel de gel uitgesneden blokken depurinering oplossing gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op een rocker of rondschudapparaat. Houd de roersnelheid laag om te voorkomen dat schade aan de agarose blokken.
- Spoel de gel blokken kort met gedestilleerd water en daarna met denaturatie buffer gedurende 30 min. Spoel opnieuw kort in gedestilleerd water en vervolgens incubeer de gel blokken neutralisatie buffer gedurende 30 minuten onder zacht schudden bij kamertemperatuur.
- Snijd een nylonmembraan de exacte grootte van de gel (s). Snijd een inkeping in de rechter bovenhoek om te helpen bij het oriënteren van de membraan in de toekomst stappen.
Noot: Twee gel blokken (6 monsters) kan worden gevisualiseerd op een membraan. - Giet genoeg 10x SSC in een tray, zodat het zal niet 's nachts uitdrogen. Een platform ongeveer 5 cm boven het niveau van de buffer. Verzadigen 3 vellen 3MM chromatografie papier met 10x SSC en leg ze op het platform. Snijd de chromatografie papier, zodat het lang genoeg om te worden ondergedompeld in buffer aan beide uiteinden en breed genoeg om het membraan gel op passen.
- Plaats de gel (s) bovenop de verzadigde chromatografiepapier. Frame van de gel met plasticfolie om de buffer te voorkomen door-het passeren van de gel tijdens de overdracht. Zorgvuldig lag de cut membraan op de top van de gel (s). Verwijder luchtbellen tussen het membraan en de gel door het werpen van een fles of serologische pipet zachtjes over het membraan.
- Snijd drie vellen 3MM chromatografiepapier dezelfde grootte als het membraan. Verzadigen chromatografie papiervellen met 10x SSC en bovenop het membraan. Verwijder eventuele luchtbellen die zijn gevormd.
- Stapel papieren handdoeken tenminste 5 cm boven het vloeipapier gevolgd door een vaste drager (voorkomendximate gewicht van 1 kg voor een 23 x 16 cm membraan). Laat de overdracht aan 's nachts te gaan.
- Expose het membraan (DNA-kant boven) tot 1200 J / m2 UV tot het DNA aan het membraan te verknopen. Niet uitspoelen voorafgaand aan deze stap.
- Spoel het membraan grondig in 2x SSC te hoog achtergrondinformatie over de vlek foto's te voorkomen. Gebruik de vlek onmiddellijk voor hybridisatie (zie 5.3) of drogen bij kamertemperatuur, wikkel in plasticfolie en bewaar bij 4 ° C.
- Hybridisatie
- Verwarm hybridisatieoven en flessen 55 ° C.
- Voeg 100 ug ml -1 runderserumalbumine (BSA) en 10 ug ml-1 niet-specifiek DNA (bijvoorbeeld zalmsperma DNA) aan de voorverwarmde hybridisatiebuffer.
- Met het oog op gelijkmatige verspreiding van de hybridisatiebuffer wanneer het membraan wordt opgerold, plaatst de blot op een vergelijkbare grootte kwadraat van nylon mesh met het DNA gebonden zijde van het membraan naar boven. Rol de vlek langs de lange zijde. glijbaande vlek / gaas in een hybridisatie fles. Voeg een geschikte hoeveelheid voorverwarmde hybridisatiebuffer de blot ontrollen (bijvoorbeeld 30 ml voor een 23 x 16 cm2 membraan).
- Incubeer in een voorverwarmde oven roteren de flessen voor 1 uur.
- Bereid de sonde door 50 ng gezuiverd PCR product homoloog aan het gebied van belang, 150 ng van willekeurige hexameer primers, Klenow fragment van buffer en H 2 O tot een volume van 13 pl maken. Kook gedurende 3 minuten plaats dan onmiddellijk op ijs. Voeg 1 ui 1 mM dCTP / dGTP / dTTP mix, 1 pl Klenow-fragment (5U) en 50 uCi deoxyadenosine 5'-trifosfaat radiolabeled op de alfa fosfaat (α 32 P-dATP).
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Voeg 1 pl 1 mM dNTP mix en 1 pl Klenow-fragment. Incubeer 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Kook probe voor 5 min en voeg onmiddellijk hybridisatie buizen. Hybridiseren gedurende de nacht bij 55 ° C met rotatie.
- Schenk de probe van membraan.
Opmerking: De probe kan eenmaal worden hergebruikt. - Spoel het membraan kort voorverwarmde lage stringentie wasbuffer (2x SSC, 0,1% (w / v) SDS). Voeg frisse lage stringentie wasbuffer en incubeer gedurende 5 minuten bij 55 ° C met rotatie. Herhaling.
- Was tweemaal matige stringentie wasbuffer (1 x SSC, 0,1% (w / v) SDS) gedurende 10 minuten bij 55 ° C met rotatie.
- Was tweemaal in hoge stringentie wasbuffer (0,1 x SSC, 0,1% (w / v) SDS) gedurende 5 minuten bij 55 ° C met rotatie.
- Verwijder het membraan en deppen met tissue om overtollige vloeistof te verwijderen. Wikkel in plasticfolie zodat er geen resterende vocht op de plastic omslag en plaats in de blootstelling cassette met een pre-blanked opslag fosforscherm. Sluit de cassette en blootgesteld gedurende ten minste 2 uur voor beeldvorming met een fosforbeeldvormer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De FROS een induceerbare, plaatsspecifieke nucleoproteïne blok dat replicatie-intermediairen mogelijk maakt worden gevisualiseerd in levende cellen 12,18. Een algemene experimentele opzet voor het bemonsteren cellen wordt geïllustreerd in figuur 1. De timing van de bemonstering en verschillen in genetische achtergrond maken dit een veelzijdig systeem voor het bestuderen van het herstel van een dergelijk blok. Het schema illustreert hoe temperatuurgevoelige mutanten, zoals dnaB ts en ts dnaC die eerder 18 gebruikt, kunnen worden gebruikt in dit systeem.
De inductie van de FROS werd uitgevoerd in een E. uitgevoerd coli stam zoals weergegeven in figuur 1 voor niet-temperatuurgevoelige stammen. Om te bevestigen dat een nucleoproteïne blok is vastgesteld, cellen werden gevisualiseerd met behulp van fluorescentiemicroscopie na 1 uur groei in 0,1% arabinose. Dezetijdsbestek doorgaans voldoende om de blokkade in een wildtype stam maar meer veeleisende stammen kunnen optimalisatie vereisen. Het merendeel van de cellen bevatte 1 scherpstelling (figuur 2A + ARA), overeenkomt met één exemplaar van de matrix in de cel waardoor replicatie aangeeft was geblokkeerd. Het aantal cellen met 1 focus brandpunten 2 of meer dan 2 foci werden geteld in een populatie van meer dan 100 cellen. 92% van de cellen bleken 1 focus met de resterende 8% met 2 brandpunten. Aangenomen werd dat cellen die twee foci was goed afstand van elkaar, die twee kopieën van de reeks, zou de volgende ronde van replicatie laten blokkeren. Cellen met twee brandpunten dicht bij elkaar betekenen dat de matrix is onlangs gerepliceerd en het nucleoproteïne blok nog niet bereikt.
Het nucleoproteïne blok werd omgekeerd door toevoeging van anhydrotetracycline (AT) en vervolgens dubbel de matrix gevisualiseerd als deaccumulatie van cellen met meervoudige foci (figuur 2A + ARA / AT). Meerdere foci binnen een cel gevisualiseerd door fluorescentie microkopie betekenen de matrix met succes herhaald en voldoende tijd is verstreken om de loci uit elkaar te bewegen, het overwinnen van zuster chromosoom cohesie aanwezig was. In dit geval 10 minuten na de toevoeging van AT, 94% van de cellen had 2 of meer foci en maximaal 8 foci per cel werden gevisualiseerd.
Opdat het nucleoproteïne blok inderdaad replicatie heeft belet, werd de cellevensvatbaarheid geanalyseerd (Figuur 2B). Cellen die replicatie geremd door FROS hebben vertonen een ongeveer 1000-voudige verlaging in kolonievormende eenheden in vergelijking met cellen die niet werden gekweekt in de aanwezigheid van arabinose. Cellen die vervolgens in aanwezigheid van anhydrotetracycline tonen omkering van deze groeiremming werden gekweekt. Als de cellen Fout bij DNA na introductie herstellenvan het nucleoproteïne blokkade zou een vermindering van de levensvatbaarheid leiden.
De replicatie tussenproducten visualiseren, kunnen de cellen worden gelyseerd in agarose pluggen en het eiwit en RNA verwijderd. Het DNA kan daarna worden gedigereerd met een geschikt restrictie-enzym voor het interessegebied. DNA afgebeeld in figuur 3A werd gedigereerd met EcoRV waarin het DNA direct voordat de array snijdt binnen de matrix en na de array 5,5 kb en 6,7 kb fragmenten geven in het gebied van belang (figuur 3B). Fragmenten zijn ideaal ~ 3-7 kb voor de hier beschreven protocol. Fragmenten buiten dit bereik kan verandering van de agarose gebruikte concentraties en elektroforese condities vereisen goede scheiding te bereiken. Het DNA werd aan elektroforese in de eerste dimensie en zichtbaar (Figuur 3A). Als het DNA volledig geknipt, alle lanen gelijkmatig werking hebben en er zaleen hoog gehalte aan laag molecuulgewicht (minder dan ongeveer 3 kb, afhankelijk van het restrictie-enzym). DNA aanwezig in de put suggereert incomplete cellysis en veel hoog moleculair gewicht DNA (boven 10 kb) DNA impliceert onvolledige digestie.
Het DNA van belang in elke laan werd uitgesneden. In figuur 3A, DNA boven 5 kb werd opgenomen. De daaropvolgende tweede dimensie van de gel aan elektroforese, waardoor een diagonaal van lineair DNA (Figuur 3C). De matrix DNA in deze gel werd vervolgens gevisualiseerd door Southern hybridisatie (Figuur 3D). In de niet-geblokkeerde (- ara sample), kunnen twee spots te zien, corresponderend met de 5,5 kb en 6,7 kb fragmenten van de array, zoals verwacht. Het monster dat was replicatie geblokkeerd (+ ARA) een daling in de 5,5 kb plek in vergelijking en de toevoeging van een elliptische signaal, waarbij een accumulatie van Y-vormige DNA in het monster. Het signaalgelokaliseerd op een positie, betekent de replicatie vorken arresteren in een vergelijkbare plaats in de hele bevolking. Bij toevoeging van anhydrotetracyline, kan de Y-vormige DNA-signaal niet meer te zien is. Een recent opnieuw wordt aangegeven door de aanwezigheid van een signaal van de volledige Y-boog, die de vorken migreren door het gebied.
Het is belangrijk om het DNA normaliseren binnen elke agaroseplug te zorgen voor de signalen van de monsters nog. De signalen kunnen worden gekwantificeerd met geschikte beeldverwerkingssoftware. Een andere veel voorkomende intermediaire gezien is dat aangeeft Holliday knooppunt (HJ) formatie. Een HJ wordt gevisualiseerd als een kegel signaal aan de bovenkant van de Y-boog en een piek van het lineaire DNA aan het einde van de Y boog (Figuur 3D).
Figuur 2: fluorescentiemicroscopie en Viab iliteit. (A) Een E. coli stam die de tetO-array werd gekweekt bij 30 ° C in aanwezigheid van 0,1% arabinose (+ ara) gedurende 1 uur en daarna werd anhydrotetracycline (AT) gedurende 10 min toegevoegd aan een subpopulatie de replicatie blok los. Representatieve microfoto worden getoond voor YFP productie (bovenste paneel). Schaal bar = 2 micrometer. Het percentage cellen die 1, 2 of meer dan 2 foci werden geteld en weergegeven als percentage (onderste paneel). (B) Cellen gekweekt in afwezigheid van arabinose (- ARA), met arabinose (+ ara) en met zowel arabinose en anhydrotetracycline (AT; 10 min) werden serieel verdunde 10-voudige en ofwel bevlekte of uitgespreid op slechts agar dat ampicilline ( - / + ARA monsters) of ampicilline met anhydrotetracycline (+ AT monster) en gekweekt bij 30 ° C om cellevensvatbaarheid te bepalen. Top: vertegenwoordiger plaat die de groei tegen de aangegeven verdunningen. Bottom: grafiek die de gemiddelde CFU / ml +/- SEM.ww.jove.com/files/ftp_upload/54434/54434fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
. Figuur 3: Visualisatie van DNA Replication Intermediates in een nucleoproteïne blok (A) Genoom DNA uit cellen (1, - ara, 2, + ara, 3, + ARA / AT) waarop agarosestukjes werden gelyseerd en geknipt met EcoRV restrictie-enzym werd gescheiden op een 0,4% agarose gel (55 V, 16 uur). 3 kb, 5 kb en 10 kb banden zijn aangegeven. De DNA boven de 5 marker kb werd uitgesneden als aangegeven door de gearceerde vakken. (B) Schematische voorstelling van de EcoRV digest van de array regio. Replicatievorken die in de matrix van de oorsprong worden geblokkeerd in de 5,5 kb fragment wanneer de cellen werden gekweekt in de aanwezigheid van arabinose. Restrictieplaatsen gebruikt zijn aangegeven met pijlen en array wordt weergegeven als een doos met lijnen. (C) Het uitgesneden DNA werd geroteerd 90 ° en gescheiden op een 0,8% agarosegel (220 V, 4 uur). De witte doos geeft de uitsnijding van DNA na scheiding. (D) De array gebied werd vervolgens gevisualiseerd door Southern blot analyse met een radioactieve probe aan de matrix gebied. Cellen met een replicatie blok op deze positie wordt het signaal dat overeenkomt met de 5.5 kb fragment op de Y-arc hebben. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | 16922 | Growth media component |
| Sodium Chloride | VWR | 27810.364 | Growth media component |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | 92144 | Growth media component |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | Growth media component; Potassium buffer component |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | Growth media component; Potassium buffer component |
| L-Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | For induction of TetR-YFP production |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | 37919 | Release of replication bloackage |
| Axioskop 2 Fluorescence microscope | Zeiss | 452310 | Visualization of cells |
| eYFP filter set | Chroma Technology | 41028 | Visualization of YFP |
| CCD camera | Hamamatsu | Orca-AG | Visualization of cells |
| MetaMorph Software (Molecular Devices) | SDR Scientific | 31282 | Version 7.8.0.0 used in the preparation of this manuscript |
| Agarose | Bioline | BIO-41025 | For agarose plugs and gel electrophoresis |
| Original Glass Water Repellent (Rain-X) | Autobarn | DIO1470 | For agarose plug manufacture |
| TRIS | VWR | VWRC103157P | TE, TBE buffer component |
| Ethylene diaminetetraacetic acid | Ajax Finechem | AJA180 | 0.5 M EDTA disodium salt solution adjusted to pH 8.0 with NaOH. |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Bacteriostatic agent |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | TE buffer component |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | Cell lysis buffer component |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt (Sarkosyl) | Sigma-Aldrich | L5125 | Cell lysis and ESP buffer component |
| Rnase A | Sigma-Aldrich | R6513 | Cell lysis buffer component |
| Lysozyme | Amresco | 6300 | Cell lysis buffer component |
| Proteinase K | Amresco | AM0706 | ESP buffer component |
| Sub-Cell Model 192 Cell | BioRad | 1704507 | Electrophoresis system |
| UV transilluminator 2000 | BioRad | 1708110 | Visualization of DNA |
| Ethidium Bromide | BioRad | 1610433 | Visualization of DNA |
| Boric acid | VWR | PROL20185.360 | TBE component |
| Hybond-XL nylon memrbane | Amersham | RPN203S | Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) can also be used |
| 3MM Whatman chromatography paper | GE Healthcare Life Sciences | 3030690 | Southern blotting |
| HL-2000 Hybrilinker | UVP | 95-0031-01/02 | Crosslinking of DNA and hybridization |
| Deoxyribonucleic acid from salmon sperm | Sigma-Aldrich | 31149 | Hybridization buffer component |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | Denaturation buffer component |
| Trisodium citrate dihydrate | VWR | PROL27833.363 | Transfer buffer |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Amresco | 227 | Wash buffer component |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | Hybridization buffer component |
| Random Hexamer Primers | Bioline | BIO-38028 | |
| Klenow fragment | New England BioLabs | M0212L | |
| dNTP Set | Bioline | BIO-39025 | |
| Adenosine 5’-triphosphate-32P-ATP | PerkinElmer | BLU502A | |
| Storage Phosphor Screen | GE Healthcare Life Sciences | GEHE28-9564-76 | BAS-IP MS 3543 E multipurpose standard 35 cm x 43 cm screen |
| Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare Life Sciences | 28-9558-09 | Visualization of blot |
| Hybridization bottle | UVP | 07-0194-02 | 35 mm x 300 mm |
References
- Mirkin, E. V., Mirkin, S. M. Replication fork stalling at natural impediments. Microbiol Mol Biol Rev. 71 (1), 13-35 (2007).
- Gupta, M. K., et al. Protein-DNA complexes are the primary sources of replication fork pausing in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (18), 7252-7257 (2013).
- McGlynn, P., Guy, C. P. Replication forks blocked by protein-DNA complexes have limited stability in vitro. J Mol Biol. 381 (2), 249-255 (2008).
- Tanner, N. A., et al. Single-molecule studies of fork dynamics in Escherichia coli DNA replication. Nat Struct Mol Biol. 15 (2), 170-176 (2008).
- Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis. Nature. 457 (7227), 336-339 (2009).
- Rudolph, C. J., Upton, A. L., Lloyd, R. G. Replication fork stalling and cell cycle arrest in UV-irradiated Escherichia coli. Genes Dev. 21 (6), 668-681 (2007).
- Jeiranian, H. A., Courcelle, C. T., Courcelle, J. Inefficient replication reduces RecA-mediated repair of UV-damaged plasmids introduced into competent Escherichia coli. Plasmid. 68 (2), 113-124 (2012).
- Le Masson, M., Baharoglu, Z., Michel, B. ruvA and ruvB mutants specifically impaired for replication fork reversal. Mol Microbiol. 70 (2), 537-548 (2008).
- Wang, X., Liu, X., Possoz, C., Sherratt, D. J. The two Escherichia coli chromosome arms locate to separate cell halves. Genes Dev. 20 (13), 1727-1731 (2006).
- Lau, I. F., et al. Spatial and temporal organization of replicating Escherichia coli chromosomes. Mol Microbiol. 49 (3), 731-743 (2003).
- Gordon, G. S., et al. Chromosome and low copy plasmid segregation in E. coli: visual evidence for distinct mechanisms. Cell. 90 (6), 1113-1121 (1997).
- Possoz, C., Filipe, S. R., Grainge, I., Sherratt, D. J. Tracking of controlled Escherichia coli replication fork stalling and restart at repressor-bound DNA in vivo. EMBO J. 25 (11), 2596-2604 (2006).
- Payne, B. T., et al. Replication fork blockage by transcription factor-DNA complexes in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 34 (18), 5194-5202 (2006).
- Brewer, B. J., Fangman, W. L. The localization of replication origins on ARS plasmids in S. cerevisiae. Cell. 51 (3), 463-471 (1987).
- Jeiranian, H. A., Schalow, B. J., Courcelle, J. Visualization of UV-induced replication intermediates in E. coli using two-dimensional agarose-gel analysis. J Vis Exp. (46), (2010).
- Southern, E. M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Biol. 98 (3), 503-517 (1975).
- Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. DNA damage-induced replication fork regression and processing in Escherichia coli. Science. 299 (5609), 1064-1067 (2003).
- Mettrick, K. A., Grainge, I. Stability of blocked replication forks in vivo. Nucleic Acids Res. , (2015).
- Church, G. M., Gilbert, W. Genomic sequencing. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (7), 1991-1995 (1984).
- Michel, B., Grompone, G., Flores, M. J., Bidnenko, V. Multiple pathways process stalled replication forks. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12783-12788 (2004).
- Michel, B., Boubakri, H., Baharoglu, Z., LeMasson, M., Lestini, R. Recombination proteins and rescue of arrested replication forks. DNA Repair (Amst). 6 (7), 967-980 (2007).
- Carl, P. L. Escherichia coli mutants with temperature-sensitive synthesis of DNA. Mol Gen Genet. 109 (2), 107-122 (1970).
- Nawotka, K. A., Huberman, J. A. Two-dimensional gel electrophoretic method for mapping DNA replicons. Mol Cell Biol. 8 (4), 1408-1413 (1988).
- Cole, R. S., Levitan, D., Sinden, R. R. Removal of psoralen interstrand cross-links from DNA of Escherichia coli: mechanism and genetic control. J Mol Biol. 103 (1), 39-59 (1976).
