Abstract
Forhindringer til stede på DNA, herunder fast-bundne proteiner og forskellige læsioner, kan alvorligt hæmme progressionen af cellens replikationsmaskineri. Den blokering af en replisome kan føre til sin afstandtagen fra kromosomet, enten delvist eller sin helhed, hvilket fører til sammenbrud af replikation gaffel. Opsvinget fra dette sammenbrud er en nødvendighed for cellen til præcist komplet kromosomal dobbeltarbejde og efterfølgende dele. Derfor, når kollapset sker, har cellen udviklet diverse mekanismer, der finder sted for at genoprette DNA gaffel og tillade replikering skal suppleres med high fidelity. Tidligere har disse replikation reparationsveje i bakterier blev undersøgt ved anvendelse af UV-skader, som har den ulempe ikke at blive lokaliseret til et kendt sted. Dette håndskrift beskriver et system udnytter en Fluorescence Repressor Operator System (Frøs) for at skabe et site-specifikt protein blok, der kan inducere stalling og sammenbrud replikation foRKS i Escherichia coli. Protokoller detaljer, hvordan status for replikation kan visualiseres i enkelte levende celler under anvendelse af fluorescens mikroskopi og DNA-replikationsmellemprodukter kan analyseres ved 2-dimensional agarosegelelektroforese. Temperaturfølsomme mutanter af replisome komponenter (f.eks DnaBts) kan inkorporeres i systemet for at inducere en synkron kollaps af replikationsgafler. Desuden kan roller rekombinationsproteiner og helicaser, der er involveret i disse processer studeres ved hjælp af genetiske knockouts i dette system.
Introduction
Under DNA-replikation, den replisome vender forhindringer på DNA, der forringer dens progression. DNA-skader, herunder læsioner og huller samt afvigende strukturer kan forhindre replisome fra fortsætter en. For nylig har det vist sig, at proteiner bundet til DNA'et er den mest almindelige kilde til hindring for replikationsgaffel progression 2. Kendskabet til begivenhederne efter mødet af replisome med et nukleoprotein blok har tidligere været begrænset af den manglende evne til at inducere en sådan blok i kromosomet i en levende celle ved et kendt sted. In vitro analyse har forbedret vores forståelse af den kinetiske adfærd af en aktiv replisome når den møder en nukleoprotein blokering 3, samt de mekanistiske detaljer af selve 4,5 replisome. Nuværende forståelse af reparation af replikation er generelt foretages med UV som skadelige middel og undersøgt ved hjælp af plasmid-DNA in vivo 6-8 in vivo nukleoprotein blok forstås generelt fra disse undersøgelser, om der er variationer i de molekylære begivenheder inden for reparation veje på grund af tydelig årsag i replikation blok stadig endnu mangler at blive afklaret.
Her beskriver vi et system, der tillader en nukleoprotein blok at være etableret i et bestemt sted på kromosomet ved hjælp af en fluorescerende Repressor Operator System (Frøs). Vi benytter en stamme af E. coli, som har haft et array af 240 tetO sites inkorporeret i kromosomet 9. Hver tetO sted inden i arrayet har en 10 bp tilfældig sekvens flankerende det at forøge stabiliteten af arrayet ved at forhindre RecA-medieret rekombination indenfor array'et. Dette array, og variationer af det, der oprindeligt blev brugt til at forstå E. coli kromosom dynamik 10,11 men blev derefter tilpasset Prevent in vivo-replikation 12. Grupperingen har vist sig at opretholdes stabilt og blokere tæt på 100% af replikationsgafler når bundet af TetR 10,12. Anvendelsen af den tilsvarende lacO arrayet in vitro har fundet så få som 22 steder var tilstrækkelig til at blokere 90% af replikation, selv om dette kortere matrix var mindre effektivt in vivo 13. For at tilpasse array til at skabe et nukleoprotein blokering, skal repressorproteinet være højt overproduceres under optimerede betingelser, hvor det derefter binder til arrayet for at skabe en vejspærring. Dannelsen af blokeringen, og dens efterfølgende frigivelse, kan overvåges ved anvendelse af fluorescensmikroskopi, hvis der anvendes en fluorescens mærkede variant af Tet-repressoren. Status for replikation i hver celle er angivet ved antallet af foci set hvor en enkelt brændpunkt betyder kun én kopi af arrayet er til stede i cellen og multiple foci er tegn på aktiv replikation. Denne aktive redelsen aktiveres, når nukleoprotein blokering reverseres ved tilsætning af den umotiveret inducer der reducerer bindingsaffiniteten af TetR for operatøren stedet tilstrækkelig til replisome at fortsætte gennem arrayet. Repressorproteinet er stadig i stand til at binde til DNA med høj nok affinitet, at de nu flere kopier af arrayet kan visualiseres.
Mere indviklede detaljer i begivenhederne på nukleoprotein blokering kan opdages ved hjælp af neutral-neutral todimensional agarosegelelektroforese og Southern hybridisering 14-16. Disse teknikker gør det muligt at analysere DNA-strukturer i befolkningen. Replikation mellemprodukter, der dannes under arrangementet, og potentielt forblive udbedrede, kan visualiseres. Ved at variere restriktionsenzym og probe anvendes, kan mellemprodukterne visualiseres ikke kun i array region, men også opstrøms for grupperingen, når replikationsgaflen regredere 17,18. Detregression finder sted efter den replisome dissociation; de førende og tilbagestående nascente strenge adskilt fra templatestrengene og annealer til hinanden som templatestrengene samtidigt re-annealer resulterer i en fire-vejs DNA-struktur (a Holliday junction).
Anvendelse af dette system er det blevet vist, at replikationsgaflen er ikke stabilt, når det støder på denne blok 18. Desuden kan temperaturfølsomme derivater af replisome komponenter anvendes til at forhindre ladning af replikationsgaflen når den er brudt sammen. Når en blok er etableret, kan stammen forskydes til en ikke-permissiv temperatur for at sikre en synkron deaktivering af replisome og en kontrolleret forebyggelse af ladning. Denne temperatur-induceret deaktivering sikrer alle gaflerne i befolkningen er kollapset på et givet tidspunkt og gør det muligt at vurdere, hvad der sker, når replisome kollapser, hvordan DNA'et er behandlet, og hvad der kræves for at restarte processen af DNA-replikation.
En fordel ved den her beskrevne system er, at nukleoprotein blok er fuldt reversibel; derfor cellernes evne til at komme sig efter nukleoproteinet blok er i stand til at blive fulgt. Tilsætningen af anhydrotetracycline til cellerne vil aflaste tæt binding af repressoren, hvilket tillader en replikationsgaflen at fortsætte gennem og cellen at genvinde levedygtighed. Lindring af blokeringen kan visualiseres ved neutral-neutral todimensional agarosegelelektroforese efter 5 minutter, og ved mikroskopi inden for 10 min. Endvidere kan levedygtighed analyse afsløre Stammens evne til at komme sig efter replikation blokering og fortsætte med at formere sig.
Ved at ændre den genetiske baggrund af stammerne anvendt i den eksperimentelle fremgangsmåde beskrevet her, kan reparation veje for denne type blokering blive belyst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Blokering replikering med Frøs
- Inducere Replication blokering
- Fortynd en frisk overnatskultur af en E. coli-stamme, der bærer en tetO array og pKM1 18 til OD 600 nm = 0,01 i en fortyndet komplekst medium (0,1% trypton, 0,05% gærekstrakt, 0,1% NaCl, 0,17 M KH 2 PO 4, 0,72 MK 2 HPO 4) med antibiotika efter behov for udvælgelse.
Bemærk: Du må ikke tilføje tetracyclin for valg, da det ikke er foreneligt med dette system. Gør volumenet af kulturen svarende til 10 ml pr prøve kræves. For eksempel kulturvolumen for det eksperimentelle design i figur 1 er 60 ml. - Vokse ved 30 ° C under omrystning, indtil OD600 nm = 0,05-0,1. Fjerne en 10 ml prøve til at tjene som den ikke-inducerede kontrol, og der tilsættes 0,1% arabinose til den resterende kultur til at inducere produktion af TetR-YFP fra pKM1. Fortsæt med at vokse både den ikke-inducerede og induceredekulturer. Efter 1 time, kontrollere tilstedeværelsen af et enkelt brændpunkt inden for hver celle i den inducerede kultur ved hjælp af fluorescens mikroskopi (se afsnit 2).
- Hvis de inducerede celler bekræftet blokeret (mere end 70% af cellerne har en enkelt fokus), optage OD 600 nm og tage en 7,5 ml prøve til analyse ved 2-D geler (se afsnit 3). Tag en tilsvarende prøve fra den ikke-inducerede kontrol kultur.
- Fortynd en frisk overnatskultur af en E. coli-stamme, der bærer en tetO array og pKM1 18 til OD 600 nm = 0,01 i en fortyndet komplekst medium (0,1% trypton, 0,05% gærekstrakt, 0,1% NaCl, 0,17 M KH 2 PO 4, 0,72 MK 2 HPO 4) med antibiotika efter behov for udvælgelse.
- Frigørelse af Replication blokering
- For at frigøre replikation blok, tilsættes 100 ng ml-1 af den umotiveret inducer anhydrotetracycline (AT) til en 10 ml prøve af de blokerede celler. Fortsætte med at vokse ved 30 ° C i 10 minutter og tage prøver til celledensitet (1 ml), mikroskopi analyse (10 pi) og neutral-neutrale 2-dimensionale agarosegeler (7,5 ml).
- Induktion Skjul af Replisome
- Hvis cellerne indeholder en temperaturfølsom allel såsom DnaB ts eller dnaC ts der kræver deactivation, kolben indeholdende de blokerede celler flytte til 42 ° C. Tag prøver til analyse på tidspunkter, der er nødvendige (f.eks 1 time efter inkubation). Efter at cellerne er inkuberet ved 42 ° C i 1 time, flytte cellerne til 30 ° C i 10 minutter (se figur 1).
Bemærk: Cellerne kan forskydes til 30 ° C i genstart analyse.
- Hvis cellerne indeholder en temperaturfølsom allel såsom DnaB ts eller dnaC ts der kræver deactivation, kolben indeholdende de blokerede celler flytte til 42 ° C. Tag prøver til analyse på tidspunkter, der er nødvendige (f.eks 1 time efter inkubation). Efter at cellerne er inkuberet ved 42 ° C i 1 time, flytte cellerne til 30 ° C i 10 minutter (se figur 1).
Figur 1:. Oversigt over Frøs Replication Block and Release Eksperimentel Procedure E. coli stammer, der bærer tetO arrayet dyrkes ved 30 ° C. Når cellerne når en OD 600 nm på over 0,05, er TetR-YFP-produktion induceret med arabinose (ara; 0,1%). Fortsæt med at dyrke en subpopulation af ikke-inducerede celler til at fungere som kontrol ved 30 ° C. En prøve af de inducerede celler analyseres via fluorescensmikroskopi efter 1 - 2 ud time (se 2.1). Hvis replikation erbekræftet at være blokeret, udtages der prøver til 2-D gel analyse angivet med reagensglassene (se 3.1) og for levedygtighed tests (valgfrit). Replikationen blokering kan fjernes med anhydrotetracycline (AT; 0,1 ug / ml) og cellerne analyseret 10 min senere. Hvis celler bærer et temperaturfølsomt allel (f.eks DnaB ts), kan dette blive inaktiveret ved at forskyde de blokerede celler til 42 ° C i passende analyse. Klik her for at se en større version af dette tal.
2. Fluorescens mikroskopi
- Forbered en agarose pad ved pipettering 500 pi smeltet agarose (1% i vand) på et objektglas; overlay dækglasset umiddelbart før agarose størkner. Opbevar skyderen (r) i vådt væv ved 4 ° C indtil brug.
- Når agarose er størknet, fjernes dækglas fra agarose pad og pipette 10 pi bakterielkultur på midten af puden at forhindre bevægelse af cellerne under visualisering. Når prøven er tørret (ca. 5 min), udskift dækglasset. Placer en dråbe immersionsolie på dækglasset og placer dias under optik.
- Visualiser de Celler Brug Phase Mikroskopi ved 100X forstørrelse.
- På dialogen Indfang boksen i imaging software, indstille eksponering tid til 100 ms. Tage billedet ved at vælge Hent. Flyt ikke scenen. I Acquire dialogboksen Vælg YFP som belysningen for den eksterne Shutter Knyttet til Kamera. Indstil exporsure tid til 1.000 ms. Sluk scenen lys. Fang fluorescens billede ved at vælge Hent.
Bemærk: Tiden kan variere afhængigt af lyskilden, mikroskop og kamera. - At overlay fasen og fluorescerende billeder, skal du vælge farve Kombiner indefra Display menuen. I Farve Kombiner dialogboksen, skal du vælge YFP billedet som den grønne komponent, og den fase image som den blue komponent. Klik på farve kombinere. Undersøg, om befolkningen har havde replikation held blokeret af fastslå, om de fleste af cellerne har en fokus per celle.
Bemærk: Sammenligning med en prøve fra kontrollen uden tilsat arabinose er nyttigt at visuelt at identificere forskellen i EYFP produktion.
- På dialogen Indfang boksen i imaging software, indstille eksponering tid til 100 ms. Tage billedet ved at vælge Hent. Flyt ikke scenen. I Acquire dialogboksen Vælg YFP som belysningen for den eksterne Shutter Knyttet til Kamera. Indstil exporsure tid til 1.000 ms. Sluk scenen lys. Fang fluorescens billede ved at vælge Hent.
3. DNA-ekstraktion / Agarosepropperne
- Tilføj natriumazid (slutkoncentration på 0,1%) til de 7,5 ml kulturprøver fra trin 1.1.3 og 1.2.1. Der inkuberes på is i mindst 5 min.
Bemærk: Natriumazid er yderst giftigt. Rådfør sikkerhedsdatabladet før arbejdet påbegyndes, og ikke håndtere det, før alle advarsler er læst og forstået. - Centrifuger cellerne 5.000 xg i 10 min for at pelletere cellerne. Supernatanten fjernes, og pellet resuspenderes i 200 pi Pett IV (PIV) puffer (10 mM Tris: HCl (pH 8,0), 1 M NaCl). Mikrocentrifuge (13, 000 xg i 2 min) for at pelletere cellerne. Discard supernatanten. På dette trin i processen pellets yderligere eller opbevares ved -20 ° C.
- Resuspender cellerne med den laveste celletæthed i 50 pi PIV og sted ved 50 ° C. For alle andre prøver, justere volumener PIV så den endelige celledensitet er den samme i hvert rør (f.eks Prøve 1 (OD 600 nm = 0,128) resuspenderet i 50 pi; Prøve 2 (OD 600 nm = 0,138) resuspenderet i 54 pi).
- Tilsættes samme mængde frisk fremstillet 0,8% agaroseopløsning i PIV (slutkoncentration 0,4%;. F.eks Prøve 1 50 pi, prøve 2 54 pi). Sørg for, at prøverne, agarose og PIV er over 50 ° C for at forhindre størkning.
- Behandle et objektglas med 40 pi af en passende glas vandafvisende eller silikone opløsning. Gnid objektglasset med en serviet til den er tør.
Bemærk: Dette kan gøres på forhånd og de behandlede objektglas opbevares langsigtet ved stuetemperatur. - Placer 20 ul dråber than celle / agarose affjedring på dias for at producere stik, der er halvkugleformet.
Bemærk: Den første prøve (resuspenderes i 50 pi PIV) vil producere 5 stik på et dias. - Når propperne er størknet, skubbe dem forsigtigt i et mikrofugerør, og der tilsættes 1 ml cellelyse-buffer (10 mM Tris-HCI [pH 8], 1 M NaCl, 100 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), 0,2% natriumdeoxycholat, 0,5% N-lauroylsarcosin-natriumsalt (Sarkosyl), 100 ug ml - 1 lysozym, 50 pg ml - 1 RNase A). Der inkuberes ved 37 ° C i 2 timer.
- Fjern cellen lysisbuffer og der tilsættes 1 ml EDTA / Sarcosyl / proteinase K (ESP) opløsning (0,5 M EDTA, 1% N-lauroylsarcosin-natriumsalt (Sarkosyl), 1 mg ml - 1 proteinase K). Inkuber ved 50 ° C natten eller indtil propperne er gennemsigtige. Hvis en anden inkubation natten er påkrævet, udskifte ESP opløsningen med frisk puffer efter ca. 18 timer.
- FjernESP buffer og vask propperne 5 gange med 12 ml Tris-EDTA (TE) puffer (10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, pH 8,0), hvilket muliggør en 30 min ækvilibrering med hver vask. Opbevares ved 4 ° C i 1 ml TE-puffer.
4. Neutral-neutral 2-Dimensional Gel Electrophoresis
- Overføre et agaroseprop fra trin 3.8 til et frisk mikrofugerør, og der tilsættes 150 pi restriktionsenzym buffer (1x koncentration). Tilføj 25-100 enheder af restriktionsenzym (f.eks, 60 enheder af EcoRV (se figur 3A)). Fordøje ved 37 ° C i 6-8 timer.
- Ved 4 ° C, hæld en 0,4% agarosegel (300 ml) i 1X Tris / borat / EDTA (TBE) til en gel bakke på ca. 25 x 25 cm. Indsæt en kam til at gøre brønde ca samme bredde som diameteren af stikket. Når gelen er indstillet, fjernes kammen og flytte gelen til stuetemperatur.
- Skub en af de spaltede Agarosepropperne i en brønd, positionering den flade slide af proppen mod siden af brønden, hvor than DNA vil komme ind i gelen. Sæt et enkelt stik på samme måde i hver anden brønd.
- Pipette smeltet 0,4% agarose i brøndene for at forsegle propperne på plads.
- Lasten 1 kb DNA-stige i en tom brønd, igen efterlades en spalte mellem stigen og prøver, og køre gelen natten over (16 timer, 55 V) i 1x TBE ved stuetemperatur.
- Farv gelen i et vandbad indeholdende ethidiumbromid (0,3 ug ml-1) i 20 min.
Bemærk: Ethidiumbromid betragtes som en potent mutagen og et toksin. Rådfør sikkerhedsdatabladet før arbejdet påbegyndes, og ikke håndtere det, før alle advarsler er læst og forstået. - Visualiser DNA med en langbølget UV-transilluminator og skære hver bane fragment med en straight, selv klippe, hvilket minimerer optagelse af overskydende agarose på begge sider af banen.
Bemærk: Hvis f.eks fragmentet af interesse er 5,5 kb, sender en 7,5 cm fragment omfatter DNA-fragmenterne fra 5 kb til approximatEly 12 kb (se figur 3A). - Placer udskårne gel vognbane i en gel bakke ved 90 ° til retningen af DNA migration.
Bemærk: To rækker af 3 gel fragmenter kan passe i en 25 x 25 2 cm gel bakke. Den første række i gelbaner er øverst på bakken, den anden række på 12,5 cm. - Forbered 300 ml agarose for den anden dimension gel (0,9% i 1x TBE med 0,3 ug ml -1 ethidiumbromid). Når agarosen afkøles til 50 ° C, pipette den smeltede agarose omkring gelskiverne at størkne deres position. Hæld de resterende agarose i magasinet til en dybde, der er mindst niveau med gelskiverne.
- Når gelen er størknet, elektroforese ved 4 ° C i 1 x TBE indeholdende 0,3 ug ml -1 ethidiumbromid ved 220 V, indtil DNA'et er migreret ca. 10 cm.
Bemærk: 4 timer er tilstrækkelig til en 5,5 kb fragment, men en mindre fragment behøver mindre tid. - Udskære blokke, hvor det genomiske DNA er til stede usynge kanten af en metal lineal, herunder gelen ovenover til at omfatte DNA, der ikke er synlig (se figur 3C).
5. Southern hybridisering
- Fremstilling af opløsning
- Forbered depurinering puffer (0,125 M HCl-opløsning).
Bemærk: Denne buffer kan genbruges og er stabil ved stuetemperatur i op til 1 måned. - Forbered Denaturering puffer (1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH).
Bemærk: Denaturering buffer kan genbruges én gang og er stabil i op til 3 måneder ved stuetemperatur. - Forbered Neutralisation puffer (1,5 M NaCl, 0,5 M Tris). Juster til pH 7,5 med HCI.
Bemærk: Neutralisation buffer kan genbruges én gang og er stabil i op til 3 måneder ved stuetemperatur. - Forbered 10x Saline natriumcitrat (SSC) buffer (0,15 M trinatriumcitrat, 1,5 M NaCl, pH er 7 - 8) til anvendelse i trin 5.2.4 og 5.2.6. Fra denne buffer, lave en 2x SSC stamopløsning (til anvendelse i trin 5.2.9).
Bemærk: 10x SSC og 2x SSC enre stabil ved stuetemperatur i 3 måneder. - Fremstille modificerede Church og Gilbert hybridiseringsbuffer 19 (0,5 M phosphatpuffer [pH 7,2], 7% (vægt / volumen) natriumdodecylsulfat (SDS), 10 mM EDTA). Efterlad ved 65 ° C til opløsning grundigt før brug.
- Forbered depurinering puffer (0,125 M HCl-opløsning).
- Overførsel
- Skyl udskårne gel blokke i depurinering opløsningen i 10 minutter ved stuetemperatur på en rocker eller orbitalryster. Hold agitation hastighed lav for at undgå at beskadige agarose blokke.
- Skyl gelen blokke kortvarigt med destilleret vand og derefter med denaturering buffer i 30 min. Skyl igen kortvarigt i destilleret vand og derefter inkubere gelen blokke i neutraliseringsbuffer i 30 minutter under forsigtig omrøring ved stuetemperatur.
- Skær en nylonmembran til den nøjagtige størrelse af gelen (s). Skær en nick i øverste højre hjørne for at hjælpe med at orientere membranen i fremtidige skridt.
Bemærk: To gel blokke (6 prøver) kan visualiseres på en membran. - Hæld nok 10x SSC i en tray således at det ikke vil tørre ud natten over. Skabe en platform ca. 5 cm over niveauet af bufferen. Gennemvæd 3 ark 3MM kromatografi papir med 10x SSC og sted på platformen. Skær kromatografi papiret, så den er lang nok til at blive nedsænket i puffer i begge ender og bred nok til at passe membranen gel på.
- Gelen (er) på toppen af den mættede kromatografi papir. Indramme gelen med plastfolie for at forhindre bufferen omgå gelen under overførslen. Læg forsigtigt skåret membran på toppen af gelen (s). Fjerne luftbobler mellem membranen og gelen ved at rulle en flaske eller serologisk pipette forsigtigt over membranen.
- Skær tre ark 3MM kromatografi papir til samme størrelse som membranen. Mætte de kromatografiske papirark med 10x SSC og placere oven på membranen. Fjern eventuelle luftbobler, der har dannet.
- Stack papirhåndklæder mindst 5 cm høje oven på trækpapir efterfulgt af en fast bærer (hensigtsximate vægt på 1 kg til en 23 x 16 cm membran). Tillade overførsel forløbe natten.
- Udsætte membranen (DNA opad) til 1.200 J / m2 UV at tværbinde DNA til membranen. Skyl ikke forud for dette skridt.
- Skyl membranen grundigt i 2 x SSC at forhindre høj baggrund på blottet billeder. Brug blot straks for hybridisering (se 5.3) eller tør det ved RT, wrap i plast wrap og opbevares ved 4 ° C.
- Hybridisering
- Forvarm hybridisering ovn og flasker til 55 ° C.
- Tilsættes 100 ug ml-1 bovint serumalbumin (BSA) og 10 ug ml-1 ikke-specifikt DNA (f.eks laksesperma-DNA) til det foropvarmede hybridiseringspuffer.
- For at muliggøre jævn dækning af hybridiseringsbufferen når membranen er rullet op, placere blottet over på en tilsvarende størrelse kvadrat af nylonnet med DNA-bundne side af membranen, der vender opad. Rul blottet langs dens lange kant. Glideblottet / mesh inde i en hybridisering flaske. Tilsæt en passende mængde forvarmet hybridiseringspuffer at oprulle blot (f.eks 30 ml til en 23 x 16 cm2 membran).
- Inkuber i en forvarmet ovn, roterende flasker, i 1 time.
- Forbered sonden ved at blande 50 ng oprenset PCR-produkt homolog til regionen af interesse, 150 ng af tilfældige hexamere primere, buffer for Klenow-fragment og H2O til at fremstille et 13 pi. Kog i 3 minutter derefter placere straks på is. Tilsæt 1 pi 1 mM dCTP / dGTP / dTTP-mix, 1 pi Klenow-fragment (5U) og 50 pCi deoxyadenosin 5'-triphosphat radiomærket på alfa phosphat- (α 32P-dATP).
- Inkuber ved stuetemperatur i 1 time. Tilsæt 1 pi 1 mM dNTP mix og 1 pi Klenow-fragment. Inkuber 20 minutter ved stuetemperatur.
- Kog probe i 5 minutter og tilsæt straks hybridiseringsbetingelser rør. Hybridisere natten over ved 55 ° C, med rotation.
- Dekanteres PROBE fra membranen.
Bemærk: Proben kan genbruges gang. - Skyl membranen kortvarigt i forvarmet, lav stringens vaskebuffer (2x SSC, 0,1% (vægt / volumen) SDS). Tilføj frisk lav stringens vaskebuffer og inkuberes i 5 minutter ved 55 ° C med rotation. Gentage.
- Vask to gange i medium stringens vaskebuffer (1 x SSC, 0,1% (vægt / volumen) SDS) i 10 minutter ved 55 ° C med rotation.
- Vask to gange i høj stringens vaskebuffer (0,1 x SSC, 0,1% (vægt / volumen) SDS) i 5 min ved 55 ° C med rotation.
- Fjern membranen og ising med væv for at fjerne overskydende væske. Wrap i plastikfolie sikre, at der ikke er nogen resterende fugt på plastfolie og plads i kassette eksponering med en pre-udstanset opbevaring phosphor screen. Luk kassetten og eksponere i mindst 2 timer før visualisering under anvendelse af en phosphorimager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den Frøs er en inducerbar stedspecifik nukleoprotein blok, der gør det muligt replikationsmellemprodukter der skal visualiseres i levende celler 12,18. En generel forsøgsplan til prøveudtagning celler er illustreret i figur 1. Timingen af prøveudtagning og variationer i genetisk baggrund gør dette til et alsidigt system til undersøgelse af reparation af en sådan blok. Den skematiske illustrerer, hvordan temperaturfølsomme mutanter, såsom DnaB ts og dnaC ts som tidligere 18 er blevet anvendt, kan anvendes i dette system.
Induktionen af de Frøs blev udført i en E. coli-stamme, som vist i figur 1 for ikke-temperaturfølsomme stammer. For at bekræfte at et nukleoprotein blok var fastslået, celler blev visualiseret under anvendelse af fluorescensmikroskopi efter 1 time af væksten i 0,1% arabinose. Dennetidsramme er normalt tilstrækkelig til at frembringe den blok i en vildtype-stamme men mere kræsne stammer kan kræve optimering. Størstedelen af cellerne indeholdt 1 fokus (figur 2A, + ara) svarende til kun en kopi af arrayet i cellen hvorved det indikeres replikation var blevet blokeret. Antallet af celler med en fokus, 2 foci eller mere end 2 foci blev talt i en befolkning på mere end 100 celler. 92% af cellerne viste sig at have en fokus med de resterende 8% med 2 foci. Det blev antaget, at celler, der havde to foci fordelt godt fra hinanden, som repræsenterer to kopier af array, ville have den næste runde af replikation blokeret. Celler med to foci tæt sammen betyde, at arrayet nylig er blevet kopieret, og har endnu ikke nået nukleoproteinet blok.
Nukleoproteinet blok blev vendt ved tilsætning af anhydrotetracycline (AT) og efterfølgende overlapning af arrayet visualiseret somakkumulering af celler med multiple foci (figur 2A, + ara / AT). Flere foci i en celle visualiseres ved fluorescens mikroskopi betyde arrayet er blevet replikeret og tilstrækkelig tid er gået til at tillade loci at bevæge sig fra hinanden, overvinde enhver søster kromosom samhørighed, som var til stede. I dette tilfælde 10 minutter efter tilsætningen af AT, 94% af cellerne havde 2 eller flere foci og op til 8 foci per celle blev visualiseret.
For at sikre at nukleoprotein blok faktisk har inhibere replikation, blev cellelevedygtighed analyseret (figur 2B). Celler, som har haft replikation inhiberes af Frøs viser en omtrent 1000 gange fald i kolonidannende enheder sammenlignet med celler, der ikke blev dyrket i nærvær af arabinose. Celler, som blev efterfølgende dyrket i nærvær af anhydrotetracycline show tilbageførsel af denne væksthæmning. Hvis cellerne var ude af stand til at reparere DNA efter frigivelsenaf nukleoprotein blokering, vil en reduktion i levedygtighed være resultatet.
At visualisere replikationsmellemprodukterne kan celler lyseres inden Agarosepropperne og proteinet og RNA fjernes. DNA'et kan derefter spaltes med et passende restriktionsenzym for regionen af interesse. DNA afbilledet i figur 3A blev fordøjet med EcoRV, der skærer DNA'et umiddelbart før array, indenfor array'et og efter arrayet, hvilket gav 5,5 kb og 6,7 kb store fragmenter i området af interesse (figur 3B). Fragmenter er ideelt ~ 3-7 kb for protokollen beskrevet her. Fragmenter uden for dette område kan kræve ændring af agarose anvendte koncentrationer og de elektroforeseforhold at opnå god separation. DNA'et blev elektroforeret i den første dimension og visualiseret (figur 3A). Hvis DNA'et er skåret fuldstændigt, vil alle baner har kørt jævnt og der vil væreen høj mængde lav molekylvægt (mindre end ca. 3 kb, afhængigt af restriktionsenzymet). DNA til stede i brønden antyder ufuldstændig cellelysis og en masse DNA med høj molekylvægt (over 10 kb) indebærer ufuldstændig DNA fordøjelse.
DNA'et af interesse i hver bane blev udskåret. I figur 3A blev DNA over 5 kb inkluderet. Den efterfølgende anden dimension af gelen blev elektroforeret, hvilket resulterer i en diagonal på lineært DNA (figur 3C). Array DNA i denne gel blev derefter visualiseret ved Southern hybridisering (figur 3D). I den ublokerede (- ara prøve), kan to pletter ses, svarende til de 5,5 kb og 6,7 kb store fragmenter i arrayet, som forventet. Prøven, der var replikation blokeret (+ ara) viste et fald i 5,5 kb stedet i sammenligning og tilføjelsen af en elliptisk, som angiver en akkumulering af Y-formede DNA i prøven. Signalet erlokaliseret til en position, der betyder replikationsgaflerne er anholde i en lignende sted hele befolkningen. Ved tilsætning af anhydrotetracyline, kan det Y-formede DNA signal ikke længere ses. En nylig genstart indikeres ved tilstedeværelsen af et signal af hele Y-bue, der viser gaflerne migrerer gennem regionen.
Det er vigtigt at normalisere DNA i hver agaroseprop at sikre signalerne af prøverne er endda. Signalerne kan kvantificeres med passende imaging software. En anden almindelig mellemliggende set, er, at angivelse af Holliday junction (HJ) dannelse. En HJ visualiseres som en kegle signal ved toppen af Y-bue og en stigning fra det lineære DNA ved enden af Y bue (figur 3D).
Figur 2: Fluorescens mikroskopi og viaB ility. (A) En E. coli-stamme, som bærer tetO arrayet blev dyrket ved 30 ° C i nærværelse af 0,1% arabinose (+ ara) i 1 time og derefter anhydrotetracycline (AT) blev tilsat i 10 minutter til en subpopulation at frigive replikation blok. Repræsentative mikrografer er vist for YFP produktion (øverste panel). Scale bar = 2 um. Andelen af celler, der bærer 1, 2 eller mere end 2 foci blev optalt og præsenteres som en procentdel (nedre panel). (B) Celler dyrket i fravær af arabinose (- ara), med arabinose (+ ara) og med både arabinose og anhydrotetracycline (AT; 10 min) var seriel fortyndet 10-fold og enten plettet eller spredt ud på kun agar indeholdende ampicillin ( - / + ara prøver) eller ampicillin med anhydrotetracycline (+ aT prøve) og dyrket ved 30 ° C for at bestemme cellernes levedygtighed. Top: repræsentativ plade viser vækst på angivne fortyndinger. Nederst: graf, der viser de gennemsnitlige CFU / ml +/- SEM.ww.jove.com/files/ftp_upload/54434/54434fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
. Figur 3: Visualisering af DNA-replikation Mellemprodukter ved en nucleoprotein Block (A) Genomisk DNA fra celler (1, - ara, 2, + ara, 3, + ara / AT), der blev lyseret inden Agarosepropperne og fordøjet med EcoRV restriktionsenzym blev separeret på en 0,4% agarosegel (55 V, 16 timer). 3 kb, 5 kb og 10 kb bånd er angivet. DNA'et over 5 kb markør blev udskåret som angivet ved de hvide bokse. (B) Skematisk af EcoRV fordøjelse af array-regionen. Replikationsgafler ind i arrayet fra oprindelsen blive blokeret i 5,5 kb fragmentet, når cellerne er blevet dyrket i nærvær af arabinose. Restriktionssteder anvendes, er angivet med pile og array er vist som en kasse med linjer. (C) Det udskårne DNA blev roteret 90 ° og separeret i en 0,8% agarosegel (220 V, 4 timer). Den hvide boks angiver excision af DNA efter separation. (D) Grupperingen region blev efterfølgende visualiseret ved Southern blot-analyse under anvendelse af en radioaktiv probe til array region. Celler med en replikering blok på denne position vil have signal svarende til 5,5 kb fragmentet placeret på Y-bue. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | 16922 | Growth media component |
| Sodium Chloride | VWR | 27810.364 | Growth media component |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | 92144 | Growth media component |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | Growth media component; Potassium buffer component |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | Growth media component; Potassium buffer component |
| L-Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | For induction of TetR-YFP production |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | 37919 | Release of replication bloackage |
| Axioskop 2 Fluorescence microscope | Zeiss | 452310 | Visualization of cells |
| eYFP filter set | Chroma Technology | 41028 | Visualization of YFP |
| CCD camera | Hamamatsu | Orca-AG | Visualization of cells |
| MetaMorph Software (Molecular Devices) | SDR Scientific | 31282 | Version 7.8.0.0 used in the preparation of this manuscript |
| Agarose | Bioline | BIO-41025 | For agarose plugs and gel electrophoresis |
| Original Glass Water Repellent (Rain-X) | Autobarn | DIO1470 | For agarose plug manufacture |
| TRIS | VWR | VWRC103157P | TE, TBE buffer component |
| Ethylene diaminetetraacetic acid | Ajax Finechem | AJA180 | 0.5 M EDTA disodium salt solution adjusted to pH 8.0 with NaOH. |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Bacteriostatic agent |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | TE buffer component |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | Cell lysis buffer component |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt (Sarkosyl) | Sigma-Aldrich | L5125 | Cell lysis and ESP buffer component |
| Rnase A | Sigma-Aldrich | R6513 | Cell lysis buffer component |
| Lysozyme | Amresco | 6300 | Cell lysis buffer component |
| Proteinase K | Amresco | AM0706 | ESP buffer component |
| Sub-Cell Model 192 Cell | BioRad | 1704507 | Electrophoresis system |
| UV transilluminator 2000 | BioRad | 1708110 | Visualization of DNA |
| Ethidium Bromide | BioRad | 1610433 | Visualization of DNA |
| Boric acid | VWR | PROL20185.360 | TBE component |
| Hybond-XL nylon memrbane | Amersham | RPN203S | Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) can also be used |
| 3MM Whatman chromatography paper | GE Healthcare Life Sciences | 3030690 | Southern blotting |
| HL-2000 Hybrilinker | UVP | 95-0031-01/02 | Crosslinking of DNA and hybridization |
| Deoxyribonucleic acid from salmon sperm | Sigma-Aldrich | 31149 | Hybridization buffer component |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | Denaturation buffer component |
| Trisodium citrate dihydrate | VWR | PROL27833.363 | Transfer buffer |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Amresco | 227 | Wash buffer component |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | Hybridization buffer component |
| Random Hexamer Primers | Bioline | BIO-38028 | |
| Klenow fragment | New England BioLabs | M0212L | |
| dNTP Set | Bioline | BIO-39025 | |
| Adenosine 5’-triphosphate-32P-ATP | PerkinElmer | BLU502A | |
| Storage Phosphor Screen | GE Healthcare Life Sciences | GEHE28-9564-76 | BAS-IP MS 3543 E multipurpose standard 35 cm x 43 cm screen |
| Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare Life Sciences | 28-9558-09 | Visualization of blot |
| Hybridization bottle | UVP | 07-0194-02 | 35 mm x 300 mm |
References
- Mirkin, E. V., Mirkin, S. M. Replication fork stalling at natural impediments. Microbiol Mol Biol Rev. 71 (1), 13-35 (2007).
- Gupta, M. K., et al. Protein-DNA complexes are the primary sources of replication fork pausing in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (18), 7252-7257 (2013).
- McGlynn, P., Guy, C. P. Replication forks blocked by protein-DNA complexes have limited stability in vitro. J Mol Biol. 381 (2), 249-255 (2008).
- Tanner, N. A., et al. Single-molecule studies of fork dynamics in Escherichia coli DNA replication. Nat Struct Mol Biol. 15 (2), 170-176 (2008).
- Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis. Nature. 457 (7227), 336-339 (2009).
- Rudolph, C. J., Upton, A. L., Lloyd, R. G. Replication fork stalling and cell cycle arrest in UV-irradiated Escherichia coli. Genes Dev. 21 (6), 668-681 (2007).
- Jeiranian, H. A., Courcelle, C. T., Courcelle, J. Inefficient replication reduces RecA-mediated repair of UV-damaged plasmids introduced into competent Escherichia coli. Plasmid. 68 (2), 113-124 (2012).
- Le Masson, M., Baharoglu, Z., Michel, B. ruvA and ruvB mutants specifically impaired for replication fork reversal. Mol Microbiol. 70 (2), 537-548 (2008).
- Wang, X., Liu, X., Possoz, C., Sherratt, D. J. The two Escherichia coli chromosome arms locate to separate cell halves. Genes Dev. 20 (13), 1727-1731 (2006).
- Lau, I. F., et al. Spatial and temporal organization of replicating Escherichia coli chromosomes. Mol Microbiol. 49 (3), 731-743 (2003).
- Gordon, G. S., et al. Chromosome and low copy plasmid segregation in E. coli: visual evidence for distinct mechanisms. Cell. 90 (6), 1113-1121 (1997).
- Possoz, C., Filipe, S. R., Grainge, I., Sherratt, D. J. Tracking of controlled Escherichia coli replication fork stalling and restart at repressor-bound DNA in vivo. EMBO J. 25 (11), 2596-2604 (2006).
- Payne, B. T., et al. Replication fork blockage by transcription factor-DNA complexes in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 34 (18), 5194-5202 (2006).
- Brewer, B. J., Fangman, W. L. The localization of replication origins on ARS plasmids in S. cerevisiae. Cell. 51 (3), 463-471 (1987).
- Jeiranian, H. A., Schalow, B. J., Courcelle, J. Visualization of UV-induced replication intermediates in E. coli using two-dimensional agarose-gel analysis. J Vis Exp. (46), (2010).
- Southern, E. M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Biol. 98 (3), 503-517 (1975).
- Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. DNA damage-induced replication fork regression and processing in Escherichia coli. Science. 299 (5609), 1064-1067 (2003).
- Mettrick, K. A., Grainge, I. Stability of blocked replication forks in vivo. Nucleic Acids Res. , (2015).
- Church, G. M., Gilbert, W. Genomic sequencing. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (7), 1991-1995 (1984).
- Michel, B., Grompone, G., Flores, M. J., Bidnenko, V. Multiple pathways process stalled replication forks. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12783-12788 (2004).
- Michel, B., Boubakri, H., Baharoglu, Z., LeMasson, M., Lestini, R. Recombination proteins and rescue of arrested replication forks. DNA Repair (Amst). 6 (7), 967-980 (2007).
- Carl, P. L. Escherichia coli mutants with temperature-sensitive synthesis of DNA. Mol Gen Genet. 109 (2), 107-122 (1970).
- Nawotka, K. A., Huberman, J. A. Two-dimensional gel electrophoretic method for mapping DNA replicons. Mol Cell Biol. 8 (4), 1408-1413 (1988).
- Cole, R. S., Levitan, D., Sinden, R. R. Removal of psoralen interstrand cross-links from DNA of Escherichia coli: mechanism and genetic control. J Mol Biol. 103 (1), 39-59 (1976).
