Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

الأمر الذي أدى إلى انسداد النسخ المتماثل الموقع المحدد في doi: 10.3791/54434 Published: August 21, 2016

Abstract

العقبات موجودة على الحمض النووي، بما في ذلك البروتينات بإحكام والآفات المختلفة، يمكن أن تمنع بشدة تطور ماكينات النسخ المتماثل الخلية. وتوقف لجسيم مكرر يمكن أن يؤدي إلى التفكك لها من كروموسوم، سواء في جزء أو مجملها، مما أدى إلى انهيار شوكة النسخ المتماثل. الشفاء من هذا الانهيار هو ضرورة للخلية لبدقة كاملة ازدواج الكروموسومات وتقسيم وقت لاحق. آليات متنوعة لذلك، عند حدوث الانهيار، الخلية تطورت التي تجري لاستعادة شوكة الحمض النووي والسماح النسخ المتماثل إلى أن تكتمل مع الدقة العالية. سابقا، وقد تم دراسة هذه المسارات إصلاح تكرارها في البكتيريا باستخدام أضرار الأشعة فوق البنفسجية، والتي لديها عيب عدم المترجمة إلى موقع معروف. توضح هذه المخطوطة على نظام يستخدم نظام الإسفار كاظمة المشغل (FROS) لإنشاء كتلة البروتين في مواقع محددة يمكن أن تحفز المماطلة وانهيار تكرار FOركس في القولونية. البروتوكولات بالتفصيل كيفية وضع النسخ المتماثل يمكن تصور في الخلايا الحية واحدة باستخدام المجهر مضان وتكرار الحمض النووي وسيطة يمكن تحليلها من قبل 2-الأبعاد الكهربائي للهلام الاغاروز. ويمكن إدراج درجة الحرارة المسوخ الحساسة من مكونات جسيم مكرر (على سبيل المثال DnaBts) في النظام للحث على انهيار متزامن من تكرار الشوك. وعلاوة على ذلك، فإن الأدوار من البروتينات إعادة التركيب وhelicases التي تشارك في هذه العمليات يمكن دراستها باستخدام بالضربة القاضية الجينية داخل هذا النظام.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

خلال تكرار الحمض النووي، وجسيم مكرر يواجه عقبات على الحمض النووي التي تعيق تقدمه. الحمض النووي من التلف بما في ذلك الآفات والثغرات فضلا عن الهياكل الشاذة يمكن أن تمنع جسيم مكرر من المضي 1. في الآونة الأخيرة، فقد وجد أن البروتينات منضمة إلى الحمض النووي هي المصدر الأكثر شيوعا للإعاقة على النسخ المتماثل تطور شوكة 2. معرفة الأحداث التي أعقبت لقاء للجسيم مكرر مع كتلة البروتين النووي قد سبق محدودة بسبب عدم القدرة على إحداث مثل كتلة في الكروموسوم من خلية حية في مكان معروف. في المختبر تحليل عززت فهمنا للسلوك الحركي من جسيم مكرر نشطة عندما تجتمع انسداد البروتين النووي فضلا عن تفاصيل الآلية للجسيم مكرر نفسها 4،5. ويتم الاضطلاع الفهم الحالي للإصلاح النسخ المتماثل عادة مع الأشعة فوق البنفسجية وكيلا ضررا وتدرس باستخدام الحمض النووي البلازميد في الجسم الحي 6-8 في الجسم الحي كتلة البروتين النووي مفهومة عموما من هذه الدراسات ما إذا كانت هناك اختلافات في الأحداث الجزيئية ضمن مسارات الإصلاح نظرا لسبب واضح في كتلة تكرارها لا يزال حتى الآن يحدد لاحقا.

هنا، نحن تصف النظام الذي يسمح للكتلة البروتين النووي التي ستنشأ في مكان معين من الكروموسوم باستخدام كاظمة نظام التشغيل نيون (FROS). علينا الاستفادة من سلالة من E. القولونية التي تمت زيارتها مجموعة من 240 مواقع تيتو دمجها في كروموسوم 9. كل موقع TETO ضمن مجموعة لديه 10 نقطة أساس تسلسل عشوائي المرافقة لزيادة استقرار مجموعة عن طريق منع إعادة التركيب بوساطة RECA داخل المصفوفة. هذه المجموعة، والاختلافات منه، واستخدمت أصلا لفهم E. القولونية ديناميات كروموسوم 10،11 ولكن تم بعد ذلك تكييفها لpreveالإقليم الشمالي في الجسم الحي تكرار 12. تم العثور على مجموعة إلى الحفاظ عليها بشكل مستقر ولمنع ما يقرب من 100٪ من الشوك النسخ المتماثل عند ملزمة TetR 10،12. وقد وجدت استخدام مجموعة LACO مماثلة في المختبر عدد قليل من كانت 22 موقعا كافية لمنع 90٪ من التكرار، على الرغم من أن هذه المجموعة أقصر كانت أقل فعالية في الجسم الحي 13. للتكيف مع مجموعة لإنشاء انسداد البروتين النووي، والبروتين كاظمة يجب أن يفرط إنتاجها للغاية في ظل الظروف الأمثل حيث أنه بعد ذلك بربط مجموعة لإنشاء حاجز. تشكيل انسداد، والإفراج لاحقا، يمكن رصدها من خلال استخدام المجهر مضان إذا تم استخدام البديل الموسومة fluorescently من قامع تيت. يشار إلى حالة تكرارها في كل خلية من قبل عدد من البؤر ينظر، حيث نقطة محورية واحدة تعني نسخة واحدة فقط من مجموعة موجودة داخل الخلية وبؤر متعددة تدل على تكرار النشط. هذا إعادة النشطةيتم تمكين الثني عندما يتم عكس انسداد البروتين النووي من خلال إضافة محفز مبرر له أن يقلل من تقارب ملزمة من TetR للموقع المشغل بما فيه الكفاية لجسيم مكرر على المضي قدما من خلال مجموعة. بروتين كاظمة لا يزال قادرا على ربط الحمض النووي مع قابلية عالية بما فيه الكفاية أن النسخ الآن متعددة من مجموعة يمكن تصور.

يمكن اكتشاف تفاصيل أكثر تعقيدا من الأحداث في انسداد البروتين النووي باستخدام محايد محايد ثنائي الأبعاد الاغاروز الكهربائي للهلام والتهجين الجنوبي 14-16. هذه التقنيات تسمح للتحليل الهياكل الحمض النووي عبر السكان. وسيطة النسخ التي يتم تشكيلها خلال هذا الحدث، وربما لا تزال دون اصلاح، يمكن تصور. من خلال تغيير انزيم التقييد وتحقيق الاستفادة منها، وسيطة يمكن تصور ليس فقط في المنطقة ولكن أيضا مجموعة من المنبع مجموعة عندما يرتد شوكة تكرار 17،18. الالانحدار يقام لاحقا إلى التفكك جسيم مكرر. فروع الوليدة الرائدة والمتخلفة منفصلة عن مسارات قالب ويصلب لبعضها البعض كما فروع قالب بالتزامن إعادة يصلب، مما أدى إلى بنية الحمض النووي رباعية (أ تقاطع هوليداي).

باستخدام هذا النظام فقد تبين أن شوكة تكرار غير مستقر عندما يواجه هذه الكتلة 18. وبالإضافة إلى ذلك، ودرجة الحرارة المشتقات الحساسة من مكونات جسيم مكرر يمكن استخدامها لمنع إعادة الشوكة تكرارها بعد أن يكون قد انهارت. مرة واحدة يتم تأسيس كتلة، سلالة يمكن تحويل إلى درجة حرارة غير متساهلة لضمان التعطيل متزامن من جسيم مكرر والوقاية التي تتحكم فيها من إعادة شحن. هذا التعطيل الناجم عن الحرارة يضمن كل من الشوك في أوساط السكان قد انهار في وقت معين، ويسمح تقييم ما يحدث عندما ينهار جسيم مكرر، وكيف يتم معالجة الحمض النووي، وما هو المطلوب لإعادةبدء عملية تكرار الحمض النووي.

ميزة من النظام المذكور هنا هو أن كتلة البروتين النووي هو عكسها تماما. وبالتالي فإن قدرة الخلايا على التعافي من كتلة البروتين النووي هي قادرة على أن يتبع. وإضافة إلى anhydrotetracycline الخلايا تخفيف الربط ضيق من كاظمة، والسماح لشوكة النسخ المتماثل إلى المضي قدما من خلال والخلية لاستعادة قدرتها على البقاء. تخفيف من انسداد يمكن تصور بواسطة محايد محايد ثنائي الأبعاد الكهربائي للهلام الاغاروز بعد 5 دقائق، وبواسطة المجهر في غضون 10 دقيقة. وعلاوة على ذلك، يمكن تحليل الجدوى تكشف عن قدرة سلالة للتعافي من انسداد التكرار والاستمرار لتتكاثر.

عن طريق تغيير الخلفية الوراثية للسلالات المستخدمة في إجراء التجارب وصفها هنا، مسارات إصلاح لهذا النوع من انسداد يمكن إجمال.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. حجب النسخ المتماثل مع FROS

  1. تحريض انسداد النسخ المتماثل
    1. تمييع ثقافة بين عشية وضحاها جديدة من E. كولاي سلالة تحمل مجموعة وتيتو وpKM1 18 إلى OD ل 600Nm = 0.01 في المتوسط ​​تمييع المعقدة (0.1٪ تريبتون، 0.05٪ مستخلص الخميرة، 0.1٪ كلوريد الصوديوم، 0.17 M KH 2 PO 0.72 MK 2 هبو 4) مع المضادات الحيوية كما هو مطلوب للاختيار.
      ملاحظة: لا تقم بإضافة التتراسيكلين لاختيار لأنه غير متوافق مع هذا النظام. جعل حجم الثقافة أي ما يعادل 10 مل لكل عينة المطلوبة. على سبيل المثال، وحجم ثقافة التصميم التجريبي في الشكل رقم 1 هو 60 مل.
    2. ينمو بمعدل 30 درجة مئوية مع الهز حتى OD 600 نانومتر = 0،05-،1. إزالة عينة 10 مل لتكون بمثابة سيطرة uninduced وإضافة 0.1٪ الارابينوز للثقافة المتبقية للحث على إنتاج TetR-YFP من pKM1. تستمر في النمو على حد سواء uninduced والتي يسببهاالثقافات. بعد 1 ساعة، والتحقق من وجود نقطة اتصال واحدة داخل كل خلية من الثقافة التي يسببها باستخدام المجهر مضان (انظر القسم 2).
    3. وإذا تأكدت منعت الخلايا المستحثة (أكثر من 70٪ من الخلايا لديها تركيز واحد)، سجل ل 600Nm OD واتخاذ 7.5 مل عينة لتحليلها من قبل المواد الهلامية 2-D (انظر القسم 3). أخذ عينة ما يعادلها من ثقافة السيطرة uninduced.
  2. الافراج عن انسداد النسخ المتماثل
    1. الافراج عن كتلة التكرار، إضافة 100 نانوغرام -1 مل من محفز anhydrotetracycline مبرر (AT) لعينة 10 مل من الخلايا المحظورة. تستمر في النمو عند 30 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، وأخذ عينات للكثافة الخلية (1 مل)، والتحليل المجهري (10 ميكرولتر) ومحايد محايدة المواد الهلامية الاغاروز 2-الأبعاد (7.5 مل).
  3. حمل انهيار جسيم مكرر
    1. إذا كانت الخلايا تحتوي على أليل درجة الحرارة حساسة مثل نهاية الخبر dnaB أو نهاية الخبر dnaC يتطلب deactivaنشوئها، نقل قارورة تحتوي على خلايا سدت إلى 42 درجة مئوية. أخذ عينات لتحليلها في نقاط زمنية المطلوبة (على سبيل المثال، 1 ساعة بعد الحضانة). بعد الخلايا والمحتضنة في 42 درجة مئوية لمدة 1 ساعة، وتحول الخلايا إلى 30 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة (انظر الشكل 1).
      ملاحظة: يمكن تحويل الخلايا إلى 30 درجة مئوية لتحليل الشوط الثاني.

شكل 1
الشكل 1: لمحة عامة عن إجراء كتلة والإصدار التجريبي FROS النسخ المتماثل E. تزرع سلالات بكتيريا تحمل مجموعة تيتو عند 30 درجة مئوية. عندما تصل الخلايا ول 600Nm OD من فوق 0.05، والناجم عن إنتاج TetR-YFP مع الارابينوز (آرا؛ 0.1٪). تستمر في النمو جزء من السكان من الخلايا uninduced لتكون بمثابة الضوابط عند 30 درجة مئوية. ويتم تحليل عينة من الخلايا التي يسببها عبر المجهر مضان بعد 1-2 ساعة (انظر 2.1). إذا النسخ المتماثلوأكد أن يكون قد تم حظره، يتم أخذ عينات للتحليل هلام 2-D يتبين من أنابيب الاختبار (انظر 3.1) واختبارات الجدوى (اختياري). انسداد النسخ المتماثل يمكن إزالتها مع anhydrotetracycline (AT؛ 0.1 ميكروغرام / مل)، وخلايا تحليلها بعد 10 دقيقة. إذا كانت الخلايا تحمل أليل درجة الحرارة حساسة (مثل dnaB نهاية الخبر)، وهذا يمكن أن يكون المعطل عن طريق تحويل الخلايا سدت إلى 42 درجة مئوية لمدة التحليل المناسب. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. الإسفار المجهر

  1. إعداد وحة agarose من قبل pipetting 500 ميكرولتر من الاغاروز المنصهر (1٪ في الماء) على شريحة المجهر. تراكب ساترة على الفور قبل أن يتصلب الاغاروز. تخزين الشريحة (ق) في الأنسجة الرطب في 4 درجات مئوية لحين الحاجة إليها.
  2. عندما وقد عززت الاغاروز، إزالة ساترة من لوحة الأغاروس وماصة 10 ميكرولتر من بكتيرياثقافة على وسط لوحة لمنع الحركة من الخلايا خلال التصور. مرة واحدة العينة قد جفت (حوالي 5 دقائق)، استبدال ساترة. وضع قطرة من زيت الغمر على انزلاق الغطاء ووضع الشريحة تحت البصريات.
  3. تصور الخلايا عن طريق الميكروسكوب المرحلة في 100X التكبير.
    1. في مربع الحوار اكتساب ضمن برامج التصوير، تعيين وقت التعرض إلى 100 مللي ثانية. التقاط الصور عن طريق اختيار اكتساب. لا تتحرك المرحلة. في مربع الحوار اكتساب، حدد YFP كما الإضاءة لمصراع خارجية تتصل الكاميرا. ضبط الوقت exporsure إلى 1000 ميللي ثانية. إيقاف ضوء المرحلة. التقاط صورة مضان عن طريق اختيار اكتساب.
      ملاحظة: الوقت قد تختلف تبعا لمصدر الضوء، والمجهر والكاميرا المستخدمة.
    2. تراكب مرحلة والصور الفلورسنت، وتحديد اللون الجمع من داخل قائمة العرض. في لون مربع الحوار الجمع، حدد الصورة YFP باعتبارها العنصر الأخضر وصورة المرحلة كما ازعنصر رق. انقر على اللون الجمع. تحديد ما إذا كان السكان قد كان تكرار سدت بنجاح من خلال تأسيس ما إذا كانت الغالبية العظمى من الخلايا لديها تركيز واحد لكل خلية.
      ملاحظة: مقارنة على عينة من السيطرة من دون الارابينوز المضافة هي مفيدة لتحديد بصريا الفرق في الإنتاج EYFP.

3. استخراج الحمض النووي / الاغاروز المقابس

  1. إضافة أزيد الصوديوم (تركيز النهائي من 0.1٪) للعينات ثقافة 7.5 مل من خطوات 1.1.3 و 1.2.1. احتضان على الجليد لمدة 5 دقائق على الأقل.
    ملاحظة: أزيد الصوديوم هي سامة للغاية. الاطلاع على ورقة بيانات السلامة قبل بدء العمل وليس التعامل معها إلا بعد قراءة جميع احتياطات السلامة وفهمها.
  2. الطرد المركزي الخلايا 5000 x ج لمدة 10 دقيقة لتكوير الخلايا. تجاهل طاف و resuspend بيليه في 200 ميكرولتر من PETT الرابع (التعريف الشخصية) العازلة (10 ملي تريس: حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.0)، 1 M كلوريد الصوديوم). microcentrifuge ل(13، 000 x ج لمدة 2 دقيقة) لتكوير الخلايا. ديscard طاف. في هذه المرحلة، وعملية الكريات أخرى أو مخزن في -20 درجة مئوية.
  3. resuspend الخلايا مع أقل كثافة الخلية في التعريف الشخصية 50 ميكرولتر ومكان عند 50 درجة مئوية. لجميع العينات الأخرى، وضبط كميات من التعريف الشخصية بحيث كثافة الخلية النهائية هي نفسها في كل أنبوب (على سبيل المثال نموذج 1 (OD ل 600Nm = 0.128) معلق في 50 ميكرولتر، نموذج 2 (OD ل 600Nm = 0.138) معلق في 54 ميكرولتر).
    1. إضافة حجم مساو من الطازجة حل الاغاروز 0.8٪ في التعريف الشخصية (اضرب النهائي 0.4٪؛ على سبيل المثال نموذج 1 50 ميكرولتر، نموذج 2 54 ميكرولتر). تأكد من أن العينات، الاغاروز والتعريف الشخصية هم فوق 50 درجة مئوية إلى منع التصلب.
  4. علاج شريحة المجهر مع 40 ميكرولتر من الزجاج بالماء طارد أو السيليكون الحل المناسب. فرك الشريحة بمنديل حتى يجف.
    ملاحظة: يمكن ان يتم ذلك في وقت مبكر والشرائح تعامل تخزين على المدى الطويل في درجة حرارة الغرفة.
  5. وضع 20 قطرات ميكرولتر من ركان تعليق خلية / الاغاروز على الشريحة لإنتاج المقابس التي هي نصف كروية.
    ملاحظة: إن العينة الأولى (معلق في 50 ميكرولتر التعريف الشخصي) تنتج 5 شمعات على شريحة واحدة.
  6. عندما توطد المقابس، وشريحة منهم بلطف إلى أنبوب microfuge وإضافة 1 مل العازلة خلية تحلل (10 ملم تريس، حمض الهيدروكلوريك [الحموضة 8]، 1 M كلوريد الصوديوم، 100 حمض ملي Ethylenediaminetetraacetic (EDTA)، 0.2٪ deoxycholate الصوديوم، 0.5٪ N-Lauroylsarcosine ملح الصوديوم (Sarkosyl)، 100 ميكروغرام مل - 1 الليزوزيم، 50 ميكروغرام مل - 1 ريبونوكلياز A). احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
  7. إزالة المنطقة العازلة خلية تحلل وإضافة / Sarcosyl / بروتين كاف (ESP) حل 1 مل EDTA (0.5 M EDTA، 1٪ N-Lauroylsarcosine ملح الصوديوم (Sarkosyl)، 1 ملغ مل - 1 بروتين K). احتضان عند 50 درجة مئوية خلال الليل أو حتى المقابس شفافة. إذا كنت بحاجة لحضانة بين عشية وضحاها الثانية، يحل محل الحل ESP مع العازلة جديدة بعد ما يقرب من 18 ساعة.
  8. مسح الESP العازلة وغسل المقابس 5 مرات مع 12 مل تريس، EDTA (TE) العازلة (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، 1 ملم EDTA، ودرجة الحموضة 8.0)، والسماح لموازنة 30 دقيقة مع كل غسل. تخزينها في 4 درجة مئوية في 1 مل العازلة TE.

4. محايد محايد 2-الأبعاد جل الكهربائي

  1. نقل أحد المكونات الاغاروز من الخطوة 3.8 إلى أنبوب microfuge جديدة وإضافة 150 ميكرولتر من العازلة انزيم التقييد (1X التركيز). إضافة 25-100 وحدة من انزيم التقييد (على سبيل المثال، 60 وحدة من EcoRV. (انظر الشكل 3A)). الهضم عند 37 درجة مئوية لمدة 6-8 ساعة.
  2. في 4 درجات مئوية، صب جل الاغاروز 0.4٪ (300 مل) في 1X تريس / بورات / EDTA (TBE) في علبة جل ما يقرب من 25 × 25 سم. إدراج مشط لجعل الآبار تقريبا نفس عرض قطرها من المكونات. عندما يتم تعيين هلام، وإزالة المشط ونقل الجل إلى درجة حرارة الغرفة.
  3. شريحة واحدة من المقابس الأغاروس هضمها في بئر، وتحديد المواقع الشريحة مسطحة من المكونات ضد الجانب من البئر حيث tوقال انه الحمض النووي دخول هلام. إدراج سد واحد بنفس الطريقة في كل بئر ثانية.
  4. ماصة المنصهرة 0.4٪ الاغاروز في الآبار لختم المقابس في الموقف.
  5. تحميل 1 كيلو بايت سلم الحمض النووي في بئر فارغة، تغادر مرة أخرى وجود فجوة بين السلم والعينات، وتشغيل هلام بين عشية وضحاها (16 ساعة و 55 V) في 1X TBE في درجة حرارة الغرفة.
  6. وصمة عار الجل في حمام مائي يحتوي على إيثيديوم بروميد (0.3 ميكروغرام مل -1) لمدة 20 دقيقة.
    ملاحظة: يعتبر بروميد إيثيديوم المغير قوية والسم. الاطلاع على ورقة بيانات السلامة قبل بدء العمل وليس التعامل معها إلا بعد قراءة جميع احتياطات السلامة وفهمها.
  7. تصور الحمض النووي مع موجة طويلة نقل transilluminator الأشعة فوق البنفسجية وقطع كل جزء حارة مع مباشرة، حتى قطع، والتقليل من إدراج الاغاروز الزائد على جانبي الممر.
    ملاحظة: على سبيل المثال، إذا كان جزء من الفائدة 5.5 كيلوبايت، وقطع جزء 7.5 سم لتشمل أجزاء من الحمض النووي من 5 كيلو بايت إلى approximatاعل 12 كيلو بايت (انظر الشكل 3A).
  8. ضع حارة هلام المستأصل في علبة الجل على 90 درجة إلى اتجاه الهجرة الحمض النووي.
    ملاحظة: صفين من 3 شظايا هلام يمكن أن يصلح في علبة هلام 25 × 25 سم 2. الصف الأول من الممرات هلام في الجزء العلوي من الدرج، والصف الثاني في 12.5 سم.
  9. إعداد 300 مل الاغاروز لهلام البعد الثاني (0.9٪ في 1X TBE مع 0.3 ميكروغرام مل -1 بروميد إيثيديوم). عندما يتم تبريد الاغاروز إلى 50 درجة مئوية، ماصة للالاغاروز المنصهر حول شرائح هلام لترسيخ موقفهم. صب الاغاروز المتبقية في علبة لعمق هذا هو مستوى على الأقل مع شرائح هلام.
  10. بمجرد عزز الجل، electrophorese في 4 درجات مئوية في 1X TBE تحتوي على 0.3 ميكروغرام مل -1 بروميد إيثيديوم في 220 فولت حتى هاجر الحمض النووي حوالي 10 سم.
    ملاحظة: 4 ساعات كافية لجزء 5.5 كيلوبايت ولكن جزء أصغر تحتاج إلى وقت أقل.
  11. استئصال كتل حيث الحمض النووي الجيني هو ش الحاليالغناء حافة مسطرة معدنية، بما في ذلك جل فوقه لتشمل الحمض النووي التي هي غير مرئية (انظر الشكل 3C).

5. التهجين الجنوبي

  1. إعداد الحل
    1. إعداد عازلة نزع البورينات (0.125 M حمض الهيدروكلوريك الحل).
      ملاحظة: هذا المخزن يمكن إعادة استخدامها وغير مستقر في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 1 في الشهر.
    2. إعداد تمسخ العازلة (1.5 M كلوريد الصوديوم، و 0.5 M هيدروكسيد الصوديوم).
      ملاحظة: تمسخ عازلة يمكن إعادة استخدامها مرة واحدة وغير مستقر لمدة تصل إلى 3 أشهر في درجة حرارة الغرفة.
    3. إعداد العازلة تحييد (1.5 M كلوريد الصوديوم، و 0.5 M تريس). ضبط لدرجة الحموضة 7.5 مع حمض الهيدروكلوريك.
      ملاحظة: يمكن إعادة استخدامها عازلة تحييد مرة واحدة ومستقر لمدة تصل إلى 3 أشهر في درجة حرارة الغرفة.
    4. إعداد 10X المالحة سترات الصوديوم (SSC) العازلة (0.15 م سترات ثلاثي الصوديوم، كلوريد الصوديوم 1.5 M، درجة الحموضة 7-8) لاستخدامها في الخطوات 5.2.4 و5.2.6. من هذا المخزن المؤقت، وجعل الأسهم SSC 2X (للاستخدام في الخطوة 5.2.9).
      ملاحظة: SSC 10X و 2x SSC لإعادة مستقرة عند RT لمدة 3 أشهر.
    5. إعداد التعديل الكنيسة وجيلبرت التهجين العازلة 19 (0.5 M الفوسفات العازلة [الرقم الهيدروجيني 7.2]، 7٪ (ث / ت) كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS)، 10 ملي EDTA). ترك عند 65 درجة مئوية إلى حل قبل تماما للاستخدام.
  2. تحويل
    1. شطف كتل هلام رفعه في حل نزع البورينات لمدة 10 دقيقة في RT على الكرسي الهزاز أو شاكر المداري. حافظ على سرعة الإثارة منخفضة لتجنب إتلاف كتل الاغاروز.
    2. شطف كتل هلام لفترة وجيزة مع الماء المقطر ثم مع العازلة تمسخ لمدة 30 دقيقة. شطف مرة أخرى لفترة وجيزة في الماء المقطر ثم احتضان كتل هلام العازلة في تحييد لمدة 30 دقيقة مع الإثارة لطيف في درجة حرارة الغرفة.
    3. قطع غشاء النايلون لحجم الدقيق للهلام (ق). قطع نيك في أعلى الزاوية اليمنى للمساعدة في توجيه الغشاء في الخطوات المستقبلية.
      ملاحظة: كتلتان هلام (6 عينات) يمكن تصور على غشاء واحد.
    4. صب ما يكفي من 10X SSC في آرعبد المنعم يوسف بحيث لا تجف بين عشية وضحاها. إنشاء منصة حوالي 5 سم فوق مستوى المخزن المؤقت. تشبع 3 ورقة اللوني 3MM مع 10x SSC ومكان على المنصة. قطع ورقة اللوني بحيث تكون طويلة بما فيه الكفاية لتكون مغمورة في المخزن عند كلا الطرفين واسعة بما يكفي لتناسب هلام غشاء جرا.
    5. وضع الجل (ق) على رأس ورقة اللوني المشبعة. تأطير هلام مع غلاف بلاستيكي لمنع العازلة-اجتياز جل أثناء النقل. وضع بعناية الغشاء قطع على رأس هلام (ق). إزالة فقاعات الهواء بين الغشاء وهلام من قبل المتداول زجاجة أو ماصة المصلية بلطف عبر الغشاء.
    6. قطع ثلاثة ورقة اللوني 3MM إلى نفس حجم الغشاء. تشبع ورقة ورقة اللوني مع 10x SSC ووضع على رأس الغشاء. إزالة أي فقاعات الهواء التي شكلت.
    7. كومة المناشف الورقية لا يقل عن 5 سم ارتفاع فوق ورقة نشاف تليها دعم قوي (APPROالوزن ximate من 1 كجم للغشاء 23 × 16 سم). السماح بنقل بالمضي قدما بين عشية وضحاها.
    8. فضح غشاء (DNA جانب متابعة) إلى 1200 J / م 2 من الأشعة فوق البنفسجية إلى تشعبي الحمض النووي للغشاء. لا شطف قبل هذه الخطوة.
    9. شطف الغشاء تماما في SSC 2X لمنع خلفية عالية على الصور وصمة عار. استخدام وصمة عار على الفور لتهجين (انظر 5.3) أو جففه في RT، والتفاف في غلاف بلاستيكي وتخزينها في 4 درجات مئوية.
  3. تهجين
    1. فرن التهجين سخن والزجاجات إلى 55 درجة مئوية.
    2. إضافة 100 ميكروغرام مل -1 زلال المصل البقري (BSA) و 10 ميكروغرام مل -1 الحمض النووي غير محددة (مثل سمك السلمون الحمض النووي الحيوانات المنوية) إلى المخزن المؤقت التهجين استعد مسبقا.
    3. للسماح حتى تغطية العازلة التهجين عندما يتم إرجاع غشاء يصل، وضع وصمة عار على مربع الحجم المماثل من شبكة النايلون مع الجانب محدد الحمض النووي للغشاء متجهة لأعلى. لفة وصمة عار على طول حافة طويلة. الانزلاقوصمة عار / شبكة داخل زجاجة التهجين. إضافة كمية مناسبة من العازلة التهجين قبل ساخنة في انبسط وصمة عار (على سبيل المثال 30 مل لمدة 23 × 16 سم 2 غشاء).
    4. احتضان في الفرن الساخن مسبقا، تدوير زجاجات، لمدة 1 ساعة.
    5. إعداد التحقيق عن طريق خلط 50 نانوغرام من المنقى مثلي المنتج PCR إلى المنطقة من الفائدة، 150 نانوغرام من الاشعال مسدوس عشوائية، عازلة للKlenow جزء وH 2 O لجعل حجم 13 ميكرولتر. يغلي لمدة 3 دقائق ثم وضع على الفور على الجليد. إضافة 1 ميكرولتر من 1 مزيج ملي dCTP / dGTP / dTTP، 1 ميكرولتر من Klenow جزء (5U) و 50 μCi deoxyadenosine رديولبلد 5'-ثلاثي على الفوسفات ألفا (α 32 P-dATP).
    6. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. إضافة 1 ميكرولتر من 1 مزيج ملي dNTP و 1 ميكرولتر من Klenow شظية. احتضان 20 دقيقة في RT.
    7. تغلي التحقيق لمدة 5 دقائق وعلى الفور إضافة إلى أنابيب التهجين. هجن بين عشية وضحاها في 55 درجة مئوية، مع دوران.
    8. صب العلاقات العامةوسام الإمبراطورية البريطانية من الغشاء.
      ملاحظة: وهذا التحقيق هو قادرة على إعادة استخدامها مرة واحدة.
    9. شطف الغشاء لفترة وجيزة في درجة حرارة ما قبل، وانخفاض صرامة غسل العازلة (2X SSC، 0.1٪ (ث / ت) SDS). منخفضة إضافة إلى غسل العازلة صرامة الطازجة واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة 55 مئوية مع دوران. كرر.
    10. يغسل مرتين في غسل العازلة التشدد المتوسطة (1X SSC، 0.1٪ (ث / ت) SDS) لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة 55 مئوية مع دوران.
    11. يغسل مرتين في ارتفاع غسل العازلة صرامة (SSC 0.1X، 0.1٪ (ث / ت) SDS) لمدة 5 دقائق عند 55 درجة مئوية مع التناوب.
    12. إزالة الغشاء والداب مع الأنسجة لإزالة السائل الزائد. التفاف في غلاف بلاستيكي ضمان عدم وجود الرطوبة المتبقية على غلاف بلاستيكي ووضعه في شريط التعرض مع ما قبل مموها شاشة تخزين الفوسفور. إغلاق الكاسيت وفضح لا يقل عن 2 ساعة قبل التصور باستخدام جهاز تصوير الفوسفور.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وFROS هو، كتلة البروتين النووي في مواقع محددة محرض تمكن سيطة النسخ إلى أن تصور في الخلايا الحية 12،18. ويتضح تصميم تجريبي العام لأخذ عينات الخلايا في الشكل 1، وتوقيت أخذ العينات والاختلافات في الخلفية الوراثية جعل هذا النظام تنوعا لدراسة إصلاح مثل هذه الكتلة. يوضح التخطيطي كيف درجة الحرارة حساسة المسوخ، مثل نهاية الخبر dnaB والخبر dnaC التي استخدمت سابقا 18، يمكن أن تستخدم في هذا النظام.

وجرى تحريض على FROS خارج في E. سلالة القولونية كما هو مبين في الشكل رقم 1 لسلالات حساسة غير درجة الحرارة. للتأكد من أن كتلة البروتين النووي قد أنشئت، وتصور الخلايا باستخدام المجهر مضان بعد 1 ساعة من النمو في 0.1٪ أرابينوز. هذاالإطار الزمني هو عادة كافية لإنتاج كتلة في نوع السلالة البرية ولكن سلالات أكثر الحساسية قد تتطلب التحسين. تحتوي معظم الخلايا 1 التركيز (الشكل 2A، + آرا)، الموافق نسخة واحدة فقط من مجموعة داخل الخلية مما يدل تكرار قد تم حظره. احصي عدد الخلايا مع 1 التركيز، 2 بؤر أو أكثر من 2 بؤر في عدد سكانها أكثر من 100 خلية. تم العثور على 92٪ من الخلايا لديك 1 التركيز مع ال 8٪ مع 2 البؤر. وكان يفترض أن الخلايا التي كان اثنين من بؤر جيدا متباعدة عن بعضها البعض، تمثل نسختين من مجموعة، سيكون في الجولة المقبلة من تكرار المحظورة. الخلايا مع اثنين من بؤر قريبة من بعضها البعض يعني أن مجموعة تم مؤخرا تكرارها ولم يتحقق كتلة البروتين النووي بعد.

وقد انعكس كتلة البروتين النووي عن طريق إضافة anhydrotetracycline (AT) والازدواجية اللاحقة للمجموعة تصور مثلتراكم الخلايا مع بؤر متعددة (الشكل 2A، + آرا / AT). بؤر متعددة داخل الخلية التي تصور مضان microcopy دلالة على مجموعة لقد تم نسخ بنجاح ولقد مر وقت كاف للسماح للمواضع للتحرك بعيدا، والتغلب على أي أخت كروموسوم التماسك التي كانت موجودة. في هذه الحالة، وبعد 10 دقيقة إضافة AT، كان 94٪ من الخلايا 2 أو أكثر من البؤر وكانت تصور ما يصل إلى 8 بؤر لكل خلية.

للتأكد من أن كتلة البروتين النووي لم تمنع في الواقع تكرار، تم تحليل بقاء الخلية (الشكل 2B). الخلايا التي كان تكرار مستعمل من قبل FROS تظهر انخفاضا حوالي 1000 أضعاف في مستعمرة تشكيل وحدة مقارنة ب الخلايا التي لم تزرع في وجود أرابينوز. الخلايا التي كانت تزرع بعد ذلك في وجود anhydrotetracycline تظهر عكس هذا تثبيط النمو. إذا كانت الخلايا غير قادرة على إصلاح الحمض النووي بعد الإفراجمن انسداد البروتين النووي، فإن انخفاض في قابلية ينتج.

لتصور سيطة النسخ، وخلايا يمكن هي lysed داخل المقابس الأغاروس والبروتين والحمض النووي الريبي إزالتها. الحمض النووي يمكن بعد ذلك يتفاعل مع انزيم تقييد المناسبة للمنطقة من الفائدة. تم هضمها الحمض النووي في الصورة في الشكل 3A مع EcoRV الذي يقطع الحمض النووي مباشرة قبل مجموعة، ضمن مجموعة وبعد مجموعة لإعطاء 5.5 كيلو بايت و 6.7 كيلوبايت شظايا في المنطقة من اهتمام (الشكل 3B). شظايا هي مثالي ~ 3-7 كيلو بايت للبروتوكول وصفها هنا. شظايا خارج هذا النطاق قد تتطلب تغيير في تركيز الاغاروز المستخدمة وظروف الكهربائي لتحقيق الانفصال جيد. وقد electrophoresed الحمض النووي في البعد الأول وتصور (الشكل 3A). إذا تمت هضم الحمض النووي تماما، وسوف يكون تشغيل جميع الممرات بالتساوي، وستكون هناكعلى كمية عالية من الوزن الجزيئي المنخفض (أقل من حوالي 3 كيلو بايت، اعتمادا على انزيم التقييد). الحمض النووي موجودة في البئر تشير تحلل الخلايا غير مكتملة والكثير من ارتفاع الوزن الجزيئي الحمض النووي (فوق 10 كيلو بايت) يعني غير كاملة الهضم الحمض النووي.

تم رفعه الحمض النووي للاهتمام في كل حارة. في الشكل 3A، أدرج الحمض النووي فوق 5 كيلو بايت. وقد electrophoresed البعد الثاني لاحق من هلام، مما أدى إلى قطري من الحمض النووي الخطي (الشكل 3C). الحمض النووي مجموعة داخل هذا الجل ثم تصور بواسطة التهجين الجنوبي (الشكل 3D). في الافراج (- عينة آرا)، مركزين يمكن أن يرى، الموافق 5.5 كيلو بايت و 6.7 كيلوبايت أجزاء من مجموعة، كما هو متوقع. وأظهرت العينة التي تكرار المحظورة (+ آرا) انخفاض في بقعة 5.5 كيلو بايت في المقارنة وإضافة إشارة بيضاوي الشكل، مما يشير إلى تراكم الحمض النووي على شكل حرف Y في العينة. والإشارةالمترجمة إلى موقف واحد، مما يدل على تكرار الشوك واعتقال في مكان مماثل بين السكان. على إضافة anhydrotetracyline، لم يعد من الممكن النظر إلى إشارة DNA على شكل حرف Y. يشار إلى إعادة تشغيل صدر مؤخرا عن وجود إشارة من كامل Y-قوس، والتي تصور الشوك المهاجرة عبر المنطقة.

ومن المهم لتطبيع DNA داخل كل المكونات الاغاروز لضمان إشارات من العينات حتى. إشارات يمكن قياسها كميا مع برنامج التصوير المناسب. آخر سيطة شيوعا ينظر هو أن تشير هوليداي مفرق (HJ) تشكيل. هو تصور وHJ كإشارة مخروط في الجزء العلوي من Y-قوس وارتفاع من الحمض النووي الخطي في نهاية قوس Y (الشكل 3D).

الشكل 2
الشكل 2: مضان المجهر وViab ility. (أ) E. كانت تزرع القولونية سلالة تحمل مجموعة تيتو عند 30 درجة مئوية في وجود من 0.1٪ الارابينوز (+ آرا) لمدة 1 ساعة ثم anhydrotetracycline (AT) وأضيف لمدة 10 دقيقة لجزء من السكان للافراج عن كتلة النسخ المتماثل. وتظهر الميكروسكوب تمثيلية للإنتاج YFP (أعلى هيئة). شريط مقياس = 2 ميكرون. تم تعداد نسبة الخلايا التي تحمل 1 أو 2 أو أكثر من 2 بؤر وتعرض كنسبة مئوية (اللوحة السفلى). (ب) الخلايا المزروعة في غياب الارابينوز (- آرا)، مع الارابينوز (+ آرا) ومع كل الارابينوز وanhydrotetracycline (AT و 10 دقيقة) كانت التسلسلية مخففة 10 أضعاف، وإما رصدت أو نشرها على أجار التي تحتوي على الأمبيسلين فقط ( - / + عينات آرا) أو الأمبيسلين مع anhydrotetracycline (+ AT العينة) ونمت عند 30 درجة مئوية لتحديد بقاء الخلية. الأعلى: لوحة تمثيلية تظهر نمو في التخفيفات المشار إليها. أسفل: رسم بياني يوضح متوسط ​​كفو / مل + ووزارة شؤون المرأة.ww.jove.com/files/ftp_upload/54434/54434fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
. الشكل (3): التصور من الحمض النووي وسيطة النسخ المتماثل في كتلة البروتين النووي (A) الحمض النووي الجيني من الخلايا (1 - آرا، 2، + آرا؛ 3، + آرا / AT) التي هي lysed داخل المقابس الاغاروز ويتفاعل مع انزيم التقييد EcoRV تم فصل على هلام الاغاروز 0.4٪ (55 V، 16 ساعة). يشار إلى 3 كيلوبايت، 5 كيلو و 10 كيلو بايت العصابات. تم رفعه الحمض النووي فوق علامة 5 كيلو بايت كما يتضح من المربعات البيضاء. (ب) تخطيطي لEcoRV هضم المنطقة مجموعة. تكرار الشوك دخول مجموعة من أصل انسداد في جزء 5.5 كيلوبايت عندما تم نمت الخلايا في وجود أرابينوز. مواقع تقييد استخدام بالرمز السهام وعيظهر شعاع على شكل مربع مع خطوط. وقد تناوب (C) والحمض النووي رفعه 90 درجة وفصل في هلام الاغاروز 0.8٪ (220 V، 4 ساعة). يشير مربع أبيض على الختان من الحمض النووي بعد الانفصال. وقد تصور (D) المنطقة مجموعة في وقت لاحق عن طريق تحليل لطخة الجنوبي باستخدام مسبار المشعة إلى المنطقة مجموعة. والخلايا مع كتلة تكرارها في هذا الموقف يكون إشارة المقابلة للجزء 5.5 كيلوبايت تقع على الصبغي Y-القوس. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptone Sigma-Aldrich 16922 Growth media component
Sodium Chloride VWR 27810.364 Growth media component
Yeast extract Sigma-Aldrich 92144 Growth media component
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P9791 Growth media component; Potassium buffer component
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich P3786 Growth media component; Potassium buffer component
L-Arabinose Sigma-Aldrich A3256 For induction of TetR-YFP production
Anhydrotetracycline hydrochloride Sigma-Aldrich 37919 Release of replication bloackage
Axioskop 2 Fluorescence microscope Zeiss 452310 Visualization of cells
eYFP filter set Chroma Technology 41028 Visualization of YFP
CCD camera Hamamatsu Orca-AG Visualization of cells
MetaMorph  Software (Molecular Devices) SDR Scientific 31282 Version 7.8.0.0 used in the preparation of this manuscript
Agarose Bioline BIO-41025 For agarose plugs and gel electrophoresis
Original Glass Water Repellent (Rain-X) Autobarn DIO1470 For agarose plug manufacture
TRIS VWR VWRC103157P TE, TBE buffer component
Ethylene diaminetetraacetic acid Ajax Finechem AJA180 0.5 M EDTA disodium salt solution adjusted to pH 8.0 with NaOH.
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002 Bacteriostatic agent
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 258148 TE buffer component
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750 Cell lysis buffer component
N-Lauroylsarcosine sodium salt (Sarkosyl) Sigma-Aldrich L5125 Cell lysis and ESP buffer component
Rnase A Sigma-Aldrich R6513 Cell lysis buffer component
Lysozyme Amresco 6300 Cell lysis buffer component
Proteinase K Amresco AM0706 ESP buffer component
Sub-Cell Model 192 Cell BioRad 1704507 Electrophoresis system
UV transilluminator 2000 BioRad 1708110 Visualization of DNA
Ethidium Bromide BioRad 1610433 Visualization of DNA
Boric acid VWR PROL20185.360 TBE component
Hybond-XL nylon memrbane Amersham RPN203S Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) can also be used
3MM Whatman chromatography paper GE Healthcare Life Sciences 3030690 Southern blotting
HL-2000 Hybrilinker UVP 95-0031-01/02 Crosslinking of DNA and hybridization
Deoxyribonucleic acid from salmon sperm Sigma-Aldrich 31149 Hybridization buffer component
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S5881 Denaturation buffer component
Trisodium citrate dihydrate VWR PROL27833.363 Transfer buffer
Sodium dodecyl sulphate (SDS) Amresco 227 Wash buffer component
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7906 Hybridization buffer component
Random Hexamer Primers Bioline BIO-38028
Klenow fragment New England BioLabs M0212L
dNTP Set Bioline BIO-39025
Adenosine 5’-triphosphate-32P-ATP PerkinElmer BLU502A
Storage Phosphor Screen GE Healthcare Life Sciences GEHE28-9564-76 BAS-IP MS 3543 E multipurpose standard 35 cm x 43 cm screen
Typhoon FLA 7000 GE Healthcare Life Sciences 28-9558-09 Visualization of blot
Hybridization bottle UVP 07-0194-02 35 mm x 300 mm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mirkin, E. V., Mirkin, S. M. Replication fork stalling at natural impediments. Microbiol Mol Biol Rev. 71, (1), 13-35 (2007).
  2. Gupta, M. K., et al. Protein-DNA complexes are the primary sources of replication fork pausing in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (18), 7252-7257 (2013).
  3. McGlynn, P., Guy, C. P. Replication forks blocked by protein-DNA complexes have limited stability in vitro. J Mol Biol. 381, (2), 249-255 (2008).
  4. Tanner, N. A., et al. Single-molecule studies of fork dynamics in Escherichia coli DNA replication. Nat Struct Mol Biol. 15, (2), 170-176 (2008).
  5. Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis. Nature. 457, (7227), 336-339 (2009).
  6. Rudolph, C. J., Upton, A. L., Lloyd, R. G. Replication fork stalling and cell cycle arrest in UV-irradiated Escherichia coli. Genes Dev. 21, (6), 668-681 (2007).
  7. Jeiranian, H. A., Courcelle, C. T., Courcelle, J. Inefficient replication reduces RecA-mediated repair of UV-damaged plasmids introduced into competent Escherichia coli. Plasmid. 68, (2), 113-124 (2012).
  8. Le Masson, M., Baharoglu, Z., Michel, B. ruvA and ruvB mutants specifically impaired for replication fork reversal. Mol Microbiol. 70, (2), 537-548 (2008).
  9. Wang, X., Liu, X., Possoz, C., Sherratt, D. J. The two Escherichia coli chromosome arms locate to separate cell halves. Genes Dev. 20, (13), 1727-1731 (2006).
  10. Lau, I. F., et al. Spatial and temporal organization of replicating Escherichia coli chromosomes. Mol Microbiol. 49, (3), 731-743 (2003).
  11. Gordon, G. S., et al. Chromosome and low copy plasmid segregation in E. coli: visual evidence for distinct mechanisms. Cell. 90, (6), 1113-1121 (1997).
  12. Possoz, C., Filipe, S. R., Grainge, I., Sherratt, D. J. Tracking of controlled Escherichia coli replication fork stalling and restart at repressor-bound DNA in vivo. EMBO J. 25, (11), 2596-2604 (2006).
  13. Payne, B. T., et al. Replication fork blockage by transcription factor-DNA complexes in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 34, (18), 5194-5202 (2006).
  14. Brewer, B. J., Fangman, W. L. The localization of replication origins on ARS plasmids in S. cerevisiae. Cell. 51, (3), 463-471 (1987).
  15. Jeiranian, H. A., Schalow, B. J., Courcelle, J. Visualization of UV-induced replication intermediates in E. coli using two-dimensional agarose-gel analysis. J Vis Exp. (46), (2010).
  16. Southern, E. M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Biol. 98, (3), 503-517 (1975).
  17. Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. DNA damage-induced replication fork regression and processing in Escherichia coli. Science. 299, (5609), 1064-1067 (2003).
  18. Mettrick, K. A., Grainge, I. Stability of blocked replication forks in vivo. Nucleic Acids Res. (2015).
  19. Church, G. M., Gilbert, W. Genomic sequencing. Proc Natl Acad Sci U S A. 81, (7), 1991-1995 (1984).
  20. Michel, B., Grompone, G., Flores, M. J., Bidnenko, V. Multiple pathways process stalled replication forks. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, (35), 12783-12788 (2004).
  21. Michel, B., Boubakri, H., Baharoglu, Z., LeMasson, M., Lestini, R. Recombination proteins and rescue of arrested replication forks. DNA Repair (Amst). 6, (7), 967-980 (2007).
  22. Carl, P. L. Escherichia coli mutants with temperature-sensitive synthesis of DNA. Mol Gen Genet. 109, (2), 107-122 (1970).
  23. Nawotka, K. A., Huberman, J. A. Two-dimensional gel electrophoretic method for mapping DNA replicons. Mol Cell Biol. 8, (4), 1408-1413 (1988).
  24. Cole, R. S., Levitan, D., Sinden, R. R. Removal of psoralen interstrand cross-links from DNA of Escherichia coli: mechanism and genetic control. J Mol Biol. 103, (1), 39-59 (1976).
الأمر الذي أدى إلى انسداد النسخ المتماثل الموقع المحدد في<i&gt; E. القولونية</i&gt; استخدام نظام نيون كاظمة المشغل
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mettrick, K. A., Lawrence, N., Mason, C., Weaver, G. M., Corocher, T. A., Grainge, I. Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System. J. Vis. Exp. (114), e54434, doi:10.3791/54434 (2016).More

Mettrick, K. A., Lawrence, N., Mason, C., Weaver, G. M., Corocher, T. A., Grainge, I. Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System. J. Vis. Exp. (114), e54434, doi:10.3791/54434 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter