Abstract
Les obstacles présents sur l'ADN, y compris des protéines étroitement liés et lésions diverses, peuvent gravement entraver la progression de la machinerie de réplication de la cellule. Le blocage d'un replisome peut conduire à sa dissociation du chromosome, en partie ou intégralement, ce qui conduit à l'effondrement de la fourche de réplication. La récupération de cet effondrement est une nécessité pour la cellule de précision complète de duplication chromosomique et diviser ultérieurement. divers mécanismes Par conséquent, lorsque l'effondrement se produit, la cellule a évolué qui ont lieu pour restaurer la fourche de l'ADN et permettre la réplication à compléter avec une grande fidélité. Auparavant, ces voies réplication de réparation dans les bactéries ont été étudiés en utilisant les dommages UV, ce qui présente l'inconvénient de ne pas être localisée sur un site connu. Ce manuscrit décrit un système utilisant un système Fluorescence répresseur opérateur (FROS) pour créer un bloc de protéine spécifique au site qui peut induire le blocage et l'effondrement de la réplication forks dans Escherichia coli. Protocoles détail comment l'état de la réplication peut être visualisée dans des cellules vivantes simples en utilisant la microscopie de fluorescence et de réplication d'ADN intermédiaires peut être analysée par électrophorèse sur gel d'agarose à 2 dimensions. Des mutants sensibles à la température des composants de replisome (par exemple DnaBts) peuvent être incorporés dans le système pour provoquer un effondrement synchrone des fourches de réplication. En outre, les rôles des protéines de recombinaison et hélicases qui sont impliqués dans ces processus peuvent être étudiés en utilisant débouchures génétiques au sein de ce système.
Introduction
Lors de la réplication de l'ADN, l'replisome fait face à des obstacles sur l'ADN qui entrave sa progression. Lésions de l' ADN , y compris les lésions et les lacunes ainsi que des structures aberrantes peuvent empêcher la replisome de procéder 1. Récemment, il a été découvert que les protéines liées à l'ADN sont la source la plus courante d'obstacle à la progression de la replication fourche 2. La connaissance des événements suivants la rencontre de l'replisome avec un bloc de nucléoprotéine a déjà été limitée par l'incapacité à induire un tel bloc dans le chromosome d'une cellule vivante à un endroit connu. Analyse in vitro a permis d' améliorer notre compréhension du comportement cinétique d'un replisome actif lorsqu'il rencontre un blocage de la nucléoprotéine 3, ainsi que les détails mécanistiques de la replisome lui - même 4,5. La compréhension actuelle de la réparation de la réplication est généralement réalisée avec UV comme agent dommageable et étudié en utilisant l' ADN plasmidique in vivo 6-8 in vivo bloc de nucléoprotéine sont généralement compris à partir de ces études, s'il y a des variations dans les événements moléculaires dans les voies de réparation en raison de la cause distincte dans le bloc de réplication est toujours encore être déterminé.
Ici, nous décrivons un système qui permet à un bloc de nucléoprotéine à établir dans un emplacement spécifique du chromosome en utilisant un système opérateur répresseur Fluorescent (FROS). Nous utilisons une souche de E. coli qui a eu un réseau de 240 sites de tetO incorporés dans le chromosome 9. Chaque site tetO dans la matrice présente une séquence aléatoire de 10 pb flanquant pour augmenter la stabilité du réseau , en empêchant la recombinaison médiée par RecA dans le tableau. Ce tableau, et les variations de celle - ci, ont été initialement utilisées pour comprendre E. coli dynamique des chromosomes 10,11 , mais ont ensuite été adaptés à prevent in vivo de la réplication 12. Le tableau a été trouvé pour être maintenu de manière stable et de bloquer près de 100% des fourches de réplication lorsqu'ils sont liés par TetR 10,12. L'utilisation de la matrice lacO similaire in vitro a trouvé aussi peu que 22 sites étaient suffisants pour bloquer 90% de la replication, bien que cette gamme courte est moins efficace in vivo 13. Pour adapter le réseau pour créer un blocage de la nucléoprotéine, la protéine répresseur doit être fortement surproduit dans des conditions optimisées où il se lie alors à la matrice pour créer un barrage routier. La formation du blocage, et sa libération subséquente, peuvent être contrôlés par l'utilisation de la microscopie à fluorescence si un variant étiqueté par fluorescence du répresseur Tet est utilisé. L'état de la réplication dans chaque cellule est indiquée par le nombre de foyers vu, où un point focal unique signifie une seule copie du tableau est présent dans la cellule et plusieurs foyers sont révélateurs de la réplication active. Cette nouvelle activitéplicature est activé lorsque le blocage de la nucléoprotéine est inversée par l'addition de l'inducteur gratuit qui diminue l'affinité de liaison de TetR pour le site de l'opérateur suffisamment pour que le replisome se fasse à travers la matrice. La protéine répresseur est encore capable de se lier à l'ADN avec une affinité suffisamment élevée pour que les maintenant des copies multiples du réseau peut être visualisée.
Plus de détails complexes des événements au blocage de la nucléoprotéine peuvent être découverts en utilisant neutre neutre à deux dimensions électrophorèse sur gel d' agarose et hybridation Southern 14-16. Ces techniques permettent l'analyse des structures d'ADN dans la population. Les intermédiaires de réplication qui sont formés lors de l'événement, et potentiellement restent unrepaired, peuvent être visualisées. En faisant varier l'enzyme de restriction et des sondes utilisées, les intermédiaires peuvent être visualisées non seulement dans la région de matrice mais aussi en amont de la matrice lorsque la fourche de réplication régresse 17,18. lerégression a lieu à la suite de la dissociation de replisome; les brins avancés et retardés naissants se séparent des brins de matrice et recuire les uns aux autres les brins de matrice simultanément ré-annelage résultant en une structure d'ADN à quatre voies (une jonction de Holliday).
En utilisant ce système , il a été démontré que la fourche de réplication est instable lorsqu'il rencontre ce bloc 18. En outre, des dérivés sensibles à la température des composants de replisome peuvent être utilisés pour empêcher le rechargement de la fourche de réplication lorsqu'elle est effondrée. Une fois qu'un bloc est établie, la déformation peut être déplacé à une température non permissive pour assurer une désactivation synchrone du réplisome et la prévention contrôlée de rechargement. Cette désactivation induite par la température assure toutes les fourches au sein de la population se sont effondrés à un moment donné et permet l'évaluation de ce qui se passe lorsque le replisome effondre, comment l'ADN est traité, et ce qui est nécessaire pour rétablircommencer le processus de réplication de l'ADN.
Un avantage du système décrit ici est que le bloc de nucléoprotéine est totalement réversible; Par conséquent, la capacité des cellules à récupérer à partir du bloc de nucléoprotéine est susceptible d'être suivie. L'ajout de anhydrotétracycline les cellules soulagera la liaison étanche du répresseur, ce qui permet une fourche de réplication pour passer à travers et la cellule de retrouver la viabilité. Le soulagement de l'obstruction peut être visualisée par électrophorèse neutre neutre sur un gel d'agarose à deux dimensions, après 5 min, et par la microscopie à 10 min. En outre, l'analyse de la viabilité peut révéler l'aptitude de la souche à récupérer le blocage de réplication et continuent à proliférer.
En modifiant le fond génétique des souches utilisées dans le mode opératoire expérimental décrit ici, les voies de réparation de ce type de blocage peut être élucidés.
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Protocol
1. Blocage de réplication avec FROS
- Induire le blocage de la réplication
- Diluer une culture fraîche nuit d'un E. souche de E. coli portant une matrice tetO et PKM1 18 à DO 600nm = 0,01 dans un milieu complexe dilué (0,1% de tryptone, 0,05% d' extrait de levure, 0,1% de NaCl, 0,17 M de KH 2 PO 4, 0,72 MK 2 HPO 4) avec des antibiotiques comme l' exige pour la sélection.
Remarque: Ne pas ajouter de la tétracycline pour la sélection comme il est pas compatible avec ce système. Rendre le volume de la culture équivalente à 10 ml par échantillon requis. Par exemple, le volume de culture pour la conception expérimentale de la figure 1 est de 60 ml. - Cultivez à 30 ° C avec agitation jusqu'à ce que la DO 600 nm = 0,05-0,1. Prélever un échantillon de 10 ml pour servir de témoin non induit et ajoute 0,1% d'arabinose à la culture restante à induire la production de TetR-YFP à partir PKM1. Continuer à croître à la fois la non induite et induitedes cultures. Après 1 heure, vérifier la présence d'un seul point focal au sein de chaque cellule de la culture induite en utilisant la microscopie à fluorescence (voir la section 2).
- Si les cellules induites sont confirmés bloqués (plus de 70% des cellules ont un seul foyer), enregistrer la DO 600nm et prélever un échantillon de 7,5 ml pour l' analyse par des gels 2-D (voir section 3). Prendre un échantillon équivalent de la culture de contrôle non induit.
- Diluer une culture fraîche nuit d'un E. souche de E. coli portant une matrice tetO et PKM1 18 à DO 600nm = 0,01 dans un milieu complexe dilué (0,1% de tryptone, 0,05% d' extrait de levure, 0,1% de NaCl, 0,17 M de KH 2 PO 4, 0,72 MK 2 HPO 4) avec des antibiotiques comme l' exige pour la sélection.
- Relâcher le blocage de la réplication
- Pour libérer le bloc de réplication, ajouter 100 ng ml -1 de l'inducteur anhydrotétracycline gratuite (AT) à un échantillon de 10 ml des cellules bloquées. Continuer à croître à 30 ° C pendant 10 min et prélever des échantillons de la densité cellulaire (1 ml), on analyse au microscope (10 ul) et des gels d'agarose à 2 dimensions neutre neutre (7,5 ml).
- Induire Effondrement du replisome
- Si les cellules contiennent un allèle sensible à la température tel que le DnaB ts ts ou des ADNc qui nécessite deactivation, déplacer le ballon contenant les cellules bloquées à 42 ° C. Prélever des échantillons pour l' analyse à des points de temps nécessaires (par exemple, 1 h après incubation). Après que les cellules ont incubé à 42 ° C pendant 1 heure, décaler les cellules à 30 ° C pendant 10 min (voir Figure 1).
Remarque: Les cellules peuvent être décalées à 30 ° C pour une analyse de redémarrage.
- Si les cellules contiennent un allèle sensible à la température tel que le DnaB ts ts ou des ADNc qui nécessite deactivation, déplacer le ballon contenant les cellules bloquées à 42 ° C. Prélever des échantillons pour l' analyse à des points de temps nécessaires (par exemple, 1 h après incubation). Après que les cellules ont incubé à 42 ° C pendant 1 heure, décaler les cellules à 30 ° C pendant 10 min (voir Figure 1).
Figure 1:. Présentation de la procédure Block et dissémination expérimentale FROS réplication E. souches coli portant le réseau tetO sont cultivées à 30 ° C. Lorsque les cellules atteignent une DO 600nm supérieure à 0,05, la production TetR-YFP est induite par l' arabinose (ara; 0,1%). Continuer à développer une sous-population de cellules non induites à agir en tant que témoins à 30 ° C. Un échantillon des cellules induites est analysée par microscopie de fluorescence après 1 - 2 h (voir 2.1). Si la réplication estconfirmé être bloqués, des échantillons sont prélevés pour l'analyse sur gel 2-D indiquée par les tubes à essai (voir 3.1) et pour les tests de viabilité (facultatif). Le blocage de la replication peut être enlevée avec anhydrotétracycline (AT; 0,1 pg / ml) et on a analysé les cellules 10 minutes plus tard. Si les cellules portent un allèle sensible à la température (par exemple DnaB ts), cela peut être inactivé en déplaçant les cellules bloquées à 42 ° C pour une analyse appropriée. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
2. Fluorescence Microscopy
- Préparer un tampon d'agarose par pipetage de 500 ul d'agarose fondu (1% dans l'eau) sur une lame de microscope; superposer immédiatement la lamelle avant la solidification d'agarose. Stocker le coulisseau (s) dans les tissus humides à 4 ° C jusqu'à leur utilisation.
- Lorsque l'agarose est solidifié, retirer la lamelle du tampon d'agarose et pipette 10 pl de bactériesla culture sur le centre du pavé pour empêcher le mouvement des cellules pendant la visualisation. Une fois que l'échantillon a séché (environ 5 min), remplacer la lamelle. Déposer une goutte d'huile d'immersion sur la lamelle et placez la lame sous l'optique.
- Visualisez les cellules en utilisant la phase Microscopie à 100X Grossissement.
- Dans la boîte de dialogue Acquire dans le logiciel d'imagerie, régler le temps d'exposition à 100 msec. Capturer l'image en sélectionnant Acquire. Ne pas déplacer la scène. Dans la boîte de dialogue Acquire, sélectionnez YFP comme l'illumination pour l'obturateur externe lié à l'appareil photo. Réglez le temps de exporsure 1000 msec. Éteignez la lumière de la scène. Capturez l'image de fluorescence en sélectionnant Acquire.
Remarque: Le temps peut varier en fonction de la source de lumière, microscope et caméra utilisée. - Pour superposer la phase et des images fluorescentes, sélectionnez Couleur Combine à partir dans le menu Affichage. Dans la boîte de dialogue Couleur Combiner, sélectionnez l'image YFP que la composante verte et l'image de phase que le blcomposant équipement utilisateur. Cliquez sur la couleur combiner. Déterminer si la population a réussi à bloquer la réplication avait en établissant si la majorité des cellules ont un foyer par cellule.
Remarque: La comparaison à un échantillon de contrôle sans arabinose supplémentaire est utile pour identifier visuellement la différence dans la production EYFP.
- Dans la boîte de dialogue Acquire dans le logiciel d'imagerie, régler le temps d'exposition à 100 msec. Capturer l'image en sélectionnant Acquire. Ne pas déplacer la scène. Dans la boîte de dialogue Acquire, sélectionnez YFP comme l'illumination pour l'obturateur externe lié à l'appareil photo. Réglez le temps de exporsure 1000 msec. Éteignez la lumière de la scène. Capturez l'image de fluorescence en sélectionnant Acquire.
3. ADN Extraction / Agarose Plugs
- Ajouter de l'azoture de sodium (concentration finale de 0,1%) à 7,5 ml d'échantillons de culture à partir des étapes 1.1.3 et 1.2.1. Incuber sur de la glace pendant au moins 5 min.
Remarque: L'azoture de sodium est extrêmement toxique. Consulter la fiche de données de sécurité avant de commencer le travail et ne pas manipuler jusqu'à ce que toutes les mesures de sécurité ont été lu et compris. - Centrifuger les cellules 5000 x g pendant 10 minutes pour sédimenter les cellules. Jeter le surnageant et remettre le culot dans 200 ul de Pett IV (PIV) tampon (10 mM Tris: HCl (pH 8,0), 1 M de NaCl). Microcentrifugeuse (13, 000 g pendant 2 min) pour sédimenter les cellules. DiScard le surnageant. A ce stade, le processus des pastilles plus ou conserver à -20 ° C.
- Resuspendre les cellules avec une densité cellulaire le plus bas dans 50 ul PIV et lieu à 50 ° C. Pour tous les autres échantillons, ajuster les volumes de PIV de sorte que la densité cellulaire finale est la même dans chaque tube (par exemple , l' échantillon 1 (DO 600nm = 0,128) , remises en suspension dans 50 ul; Echantillon 2 (DO 600nm = 0,138) , remises en suspension dans 54 ul).
- Ajouter un volume égal d' une solution fraîchement préparée d'agarose à 0,8% en PIV (conc 0,4%;. Par exemple l' échantillon 1 50 pi, Echantillon 2 54 pi). Faire en sorte que les échantillons, l'agarose et le PIV sont supérieures à 50 ° C pour empêcher la solidification.
- Traiter une lame de microscope avec 40 pi d'une solution de verre hydrofuge ou de silicone approprié. Frottez la lame avec un tissu jusqu'à ce qu'il soit sec.
Remarque: Il peut être effectué à l'avance et les lames traitées stockées à long terme à la température ambiante. - Placer 20 ul de gouttes de til cellulaire / agarose suspension sur la lame pour produire des bouchons qui sont hémisphérique.
Remarque: Le premier échantillon (remises en suspension dans 50 pi PIV) produira 5 bouchons sur une diapositive. - Lorsque les bouchons sont solidifiées, les glisser doucement dans un tube de microcentrifugation et ajouter 1 ml de tampon de lyse cellulaire (10 mM Tris-HCl [pH 8], NaCl 1 M, de l'acide 100 mM éthylènediaminetétraacétique (EDTA), le désoxycholate de sodium à 0,2%, 0,5% sel de N-Lauroylsarcosine sodium (Sarkosyl), 100 pg de lysozyme ml - 1, 50 - 1 pg ml RNase A). Incuber à 37 ° C pendant 2 heures.
- Retirer le tampon de lyse des cellules et ajouter / Sarcosyl / protéinase K (ESP) 1 ml de solution d'EDTA (0,5 M d' EDTA, le sel de sodium de N-Lauroylsarcosine 1% (Sarkosyl), 1 mg ml - 1 proteinase K). Incuber à 50 ° C pendant une nuit ou jusqu'à ce que les bouchons sont transparents. Si une seconde incubation d'une nuit est nécessaire, remplacer la solution ESP avec un tampon frais après environ 18 heures.
- Retirer leESP tampon et laver les bouchons 5 fois avec 12 ml de Tris-EDTA (TE) du tampon (10 mM Tris-HCl, 1 mM d'EDTA, pH 8,0), ce qui permet un équilibrage de 30 minutes à chaque lavage. Conserver à 4 ° C dans 1 ml de tampon TE.
4. Neutre neutre 2-Dimensional Gel Electrophoresis
- Transférer un bouchon d'agarose provenant de l'étape 3.8 dans un tube de microcentrifugation frais et ajouter 150 ul de tampon d'enzyme de restriction (concentration 1 x). Ajouter 25-100 unités d'enzyme de restriction (par exemple, 60 unités de EcoRV; (voir la figure 3A)). Digest à 37 ° C pendant 6-8 heures.
- À 4 ° C, verser un gel d'agarose à 0,4% (300 ml) dans 1 x Tris / Borate / EDTA (TBE) dans un plateau de gel d'environ 25 x 25 cm. Insérez un peigne pour faire des puits approximativement la même largeur que le diamètre du bouchon. Lorsque le gel est fixé, retirer le peigne et déplacer le gel à la température ambiante.
- Faites glisser l'un des bouchons d'agarose digérés dans un puits, le positionnement de la lame plate du bouchon contre le côté du puits où til ADN va entrer dans le gel. Insérez une seule prise de la même manière dans tous les deuxième puits.
- Pipeter fondu de 0,4% d'agarose dans les puits pour sceller les bouchons en position.
- Charge 1 kb échelle d'ADN dans un puits vide, laissant à nouveau un écart entre l'échelle et des échantillons, et exécuter le gel pendant la nuit (16 h, 55 V) 1x TBE à la température ambiante.
- Colorer le gel dans un bain d'eau contenant du bromure d' éthidium (0,3 pg ml - 1) pendant 20 min.
Remarque: Le bromure d'éthidium est considéré comme un agent mutagène puissant et une toxine. Consulter la fiche de données de sécurité avant de commencer le travail et ne pas manipuler jusqu'à ce que toutes les mesures de sécurité ont été lu et compris. - Visualisez l'ADN avec un transilluminateur UV à ondes longues et découper chaque fragment de voie avec une ligne droite, même coupé, ce qui minimise l'inclusion de l'excès d'agarose de chaque côté de la voie.
Note: Par exemple, si le fragment d'intérêt est de 5,5 kb, couper un fragment de 7,5 cm pour inclure les fragments d'ADN de 5 kb à approximately 12 kb (voir la figure 3A). - Placer la voie de gel excisée dans un bac de gélification à 90 ° par rapport à la direction de la migration de l'ADN.
Note: Deux rangées de 3 fragments de gel peuvent tenir dans un plateau de gel 25 x 25 cm 2. La première rangée de pistes de gel est au sommet du plateau, la deuxième rangée à 12,5 cm. - Préparer 300 ml d' agarose pour la deuxième gel de dimension (0,9% en TBE 1x avec 0,3 pg ml -1 bromure d' éthidium). Lorsque la gélose est refroidie à 50 ° C, une pipette de l'agarose fondu autour des tranches de gel de se solidifier leur position. Verser le reste d'agarose dans le bac jusqu'à une profondeur qui est au moins au niveau des tranches de gel.
- Une fois que le gel est solidifié, l' électrophorèse à 4 ° C dans du TBE 1X contenant 0,3 pg ml - 1 bromure d' éthidium à 220 V jusqu'à ce que l'ADN a migré environ 10 cm.
Note: 4 h est suffisante pour un fragment de 5,5 kb, mais un fragment plus petit aura besoin de moins de temps. - Exciser les blocs où l'ADN génomique est présent uchanter le bord d'une règle métallique, y compris le gel ci - dessus pour inclure l'ADN qui ne sont pas visibles (voir la figure 3C).
5. Hybridation Southern
- Préparation de la solution
- Préparer tampon dépurination (0,125 solution HCl M).
Remarque: Ce tampon peut être réutilisé et est stable à la température ambiante pendant 1 mois. - Préparer Dénaturation tampon (1,5 M de NaCl, NaOH 0,5 M).
Remarque: un tampon de dénaturation peut être réutilisé une fois et reste stable pendant 3 mois à température ambiante. - Préparer le tampon de neutralisation (1,5 M de NaCl, 0,5 M Tris). Ajuster le pH à 7,5 avec du HCl.
Note: Le tampon de neutralisation peut être réutilisé une fois et reste stable pendant 3 mois à température ambiante. - Préparer 10x Saline Citrate de sodium (SSC) tampon (M citrate 0,15 Tri-sodium, 1,5 M de NaCl, pH est 7-8) pour une utilisation dans les étapes 5.2.4 et 5.2.6. De ce tampon, faire un bouillon SSC 2x (pour une utilisation à l'étape 5.2.9).
Remarque: 10x SSC et 2x SSC unere stable à la température ambiante pendant 3 mois. - Préparer Church et Gilbert Hybridation 19 modifié (tampon phosphate 0,5 M [pH 7,2], 7% (p / v) de dodécylsulfate de sodium (SDS), EDTA 10 mM). Laisser à 65 ° C pour dissoudre complètement avant d'utiliser.
- Préparer tampon dépurination (0,125 solution HCl M).
- Transfert
- Rincer les blocs de gel excisés dans une solution de dépurination pendant 10 min à température ambiante sur un agitateur ou agitateur orbital. Gardez la faible vitesse pour éviter d'endommager les blocs d'agarose d'agitation.
- Rincer les blocs de gel brièvement avec de l'eau distillée, puis avec un tampon de dénaturation pendant 30 min. Rincer à nouveau brièvement dans de l'eau distillée, puis incuber les blocs de gel dans un tampon de neutralisation pendant 30 minutes avec agitation douce à température ambiante.
- Couper une membrane en nylon à la taille exacte du gel (s). Couper une entaille dans le coin en haut à droite pour aider à orienter la membrane dans les étapes à venir.
Note: Deux blocs de gel (6 échantillons) peut être visualisé sur une membrane. - Verser suffisamment 10x SSC dans un tray afin qu'elle ne sèche pas pendant la nuit. Créer une plate-forme d'environ 5 cm au-dessus du niveau de la mémoire tampon. Saturer 3 feuilles de papier de Chromatographie 3MM avec 10x SSC et placer sur la plate-forme. Découper le papier de chromatographie de sorte qu'il est assez long pour être immergé dans un tampon à ses deux extrémités et suffisamment larges pour être compatibles avec le gel sur la membrane.
- Placer le gel (s) sur le dessus du papier de Chromatographie saturée. Cadre du gel avec une pellicule de plastique pour empêcher le tampon en contournant le gel pendant le transfert. Disposez soigneusement la membrane de coupe sur le dessus du gel (s). Retirer les bulles d'air entre la membrane et le gel en faisant rouler une bouteille ou d'une pipette sérologique doucement à travers la membrane.
- Couper trois feuilles de papier chromatographique 3 MM de la même taille que la membrane. Saturer les feuilles de papier de chromatographie avec 10x SSC et placer sur le dessus de la membrane. Retirer les bulles d'air qui se sont formées.
- Stack serviettes au moins 5 cm de hauteur au-dessus du papier buvard suivi d'un support solide de papier (appropoids ximate de 1 kg pour une membrane 23 x 16 cm). Permettre le transfert de procéder pendant la nuit.
- Exposer la membrane (ADN vers le haut) à 1200 J / m 2 d'UV pour réticuler l'ADN à la membrane. Ne pas rincer avant cette étape.
- Rincer la membrane à fond dans 2x SSC pour empêcher un bruit de fond sur les images blot. Utilisez le blot immédiatement pour l'hybridation (voir 5.3) ou le sécher à la température ambiante, envelopper dans une pellicule plastique et conserver à 4 ° C.
- Hybridation
- Préchauffer le four d'hybridation et des bouteilles à 55 ° C.
- Ajouter 100 ug ml - 1 d' albumine de sérum bovin (BSA) et 10 pg ml - 1 d' ADN non spécifique (par exemple , ADN de sperme de saumon) dans le tampon d' hybridation préchauffé.
- Pour permettre une couverture uniforme du tampon d'hybridation lorsque la membrane est enroulée, placer la tache sur un carré de taille similaire en nylon mesh avec le côté lié à l'ADN de la membrane vers le haut. Rouler la tache le long de son bord. Faire glisserblot / mesh intérieur d'une bouteille d'hybridation. Ajouter une quantité appropriée de tampon d'hybridation préchauffé à dérouler le transfert (par exemple 30 ml d'une membrane de 23 cm 2 x 16).
- Incuber dans un four préchauffé, faire tourner les bouteilles, pendant 1 heure.
- Préparer la sonde en mélangeant 50 ng du produit purifié de PCR homologue à la région d'intérêt, 150 ng d'amorces hexamères aléatoires, un tampon pour le fragment de Klenow et H 2 O pour obtenir un volume de 13 ul. Faire bouillir pendant 3 minutes, puis placer immédiatement sur de la glace. Ajouter 1 pi de 1 mM dCTP / dGTP / dTTP mix, 1 pl de fragment de Klenow (5U) et 50 uCi désoxyadénosine radiomarqué 5'-triphosphate sur l'alpha phosphate (α 32 P-dATP).
- Incuber à température ambiante pendant 1 h. Ajouter 1 pi de 1 mM dNTP mix et 1 pl de fragment de Klenow. Incuber 20 min à température ambiante.
- Faire bouillir la sonde pendant 5 minutes et ajouter immédiatement à des tubes d'hybridation. Hybridation pendant la nuit à 55 ° C avec rotation.
- Décanter le probe de la membrane.
Remarque: La sonde peut être réutilisée qu'une seule fois. - Rincer la membrane brièvement préchauffée, du tampon de lavage à faible stringence (2x SSC, 0,1% (p / v) de SDS). Ajouter un tampon frais de lavage de faible stringence et incuber pendant 5 min à 55 ° C avec rotation. Répéter.
- Laver deux fois dans du tampon de lavage à stringence moyenne (1 x SSC, 0,1% (p / v) de SDS) pendant 10 min à 55 ° C avec rotation.
- Laver deux fois dans un tampon de lavage de stringence élevée (0,1x SSC, 0,1% (p / v) SDS) pendant 5 min à 55 ° C avec rotation.
- Retirer la membrane et tamponner avec le tissu pour éliminer l'excès de liquide. Envelopper dans une pellicule plastique assurant qu'il ne reste aucune humidité sur la pellicule de plastique et placer dans la cassette d'exposition avec un écran de pré-masquée phosphore de stockage. Fermez la cassette et exposer pendant au moins 2 heures avant la visualisation en utilisant un imageur de phosphore.
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Representative Results
Le FROS est un bloc de nucléoprotéine spécifique au site inductible qui permet des intermédiaires de réplication à visualiser dans les cellules vivantes 12,18. Une conception expérimentale générale pour l' échantillonnage des cellules est illustrée à la figure 1. Le moment de l'échantillonnage et des variations de fond génétique font un système polyvalent pour l' étude de la réparation d'un tel bloc. Le schéma illustre comment des mutants sensibles à la température, tels que ts DnaB et ts DNAC qui ont été utilisés précédemment 18, peuvent être utilisés dans ce système.
L'induction des FROS a été réalisée dans un E. coli comme le montre la Figure 1 pour les souches non sensibles à la température. Pour confirmer qu'un bloc de nucléoprotéine a été établie, les cellules ont été visualisées en utilisant un microscope à fluorescence après 1 h de croissance à 0,1% d'arabinose. Cedélai est généralement suffisant pour produire le bloc dans une souche de type sauvage, mais des souches plus exigeants peuvent nécessiter l'optimisation. La majorité des cellules contenait une mise au point (figure 2A, ara +), correspondant à une seule copie de la matrice au sein de la cellule indiquant ainsi la réplication a été bloqué. Les nombres de cellules avec une mise au point, des foyers 2 ou plus de 2 foyers ont été dénombrés dans une population de plus de 100 cellules. 92% des cellules ont été trouvés à avoir 1 point avec les 8% restants avec 2 foyers. Il a été présumé que les cellules qui avaient deux foyers bien espacées, ce qui représente deux copies du tableau, auraient le prochain cycle de réplication bloqué. Les cellules avec deux foyers rapprochés signifient que le réseau a récemment été reproduit et le bloc de nucléoprotéine n'a pas encore été atteint.
Le bloc de nucléoprotéine a été inversée par l'addition de anhydrotétracycline (AT) et la duplication ultérieure du réseau visualisé commeaccumulation de cellules avec de multiples foyers (figure 2A, + ara / AT). foyers multiples dans une cellule visualisés par fluorescence microcopy signifier le tableau a été reproduit avec succès et suffisamment de temps a passé pour permettre au loci de se déplacer en dehors, en surmontant toute soeur chromosome cohésion qui était présent. Dans ce cas, 10 minutes après l'addition de l'AT, 94% des cellules ont 2 ou plus de foyers et jusqu'à 8 foyers par cellule ont été visualisés.
Faire en sorte que le bloc de nucléoprotéine a effectivement inhiber la replication, la viabilité cellulaire a été analysée (figure 2B). Les cellules qui ont subi la réplication inhibée par les FROS montrent une diminution d'environ 1000 fois plus unités formant des colonies par rapport aux cellules qui ne sont pas cultivées en présence d'arabinose. Les cellules qui ont ensuite été cultivées en présence d'anhydrotétracycline présentent une inversion de cette inhibition de la croissance. Si les cellules ont été incapables de réparer l'ADN après la libérationdu blocage de la nucléoprotéine, une réduction de la viabilité entraînerait.
Pour visualiser les intermédiaires de replication, les cellules peuvent être lysées à l'intérieur des bouchons d'agarose et la protéine et l'ARN enlevés. L'ADN peut alors être digéré par une enzyme de restriction appropriée pour la région d'intérêt. ADN représenté dans la figure 3A a été digéré par EcoRV qui coupe l'ADN immédiatement avant que la matrice, au sein de la matrice et après la matrice pour donner 5,5 kb et 6,7 kb des fragments dans la région d'intérêt (figure 3B). Les fragments sont idéalement ~ 3-7 kb pour le protocole décrit ici. Les fragments en dehors de cette plage peuvent nécessiter la modification des concentrations d'agarose utilisées et les conditions d'électrophorèse pour obtenir une bonne séparation. L'ADN a été soumis à une électrophorèse dans la première dimension et visualisée (figure 3A). Si l'ADN est digéré complètement, toutes les voies auront fonctionner uniformément et il y auraune quantité élevée de bas poids moléculaire (moins d'environ 3 kb, en fonction de l'enzyme de restriction). ADN présent dans le puits suggère la lyse cellulaire incomplète et beaucoup d'ADN de poids moléculaire élevé (supérieur à 10 kb) implique incomplète la digestion de l'ADN.
L'ADN d'intérêt dans chaque voie a été excisée. Sur la figure 3A, l' ADN ci - dessus 5 kb a été inclus. La deuxième dimension subséquente du gel a été soumis à une électrophorèse, ce qui entraîne une diagonale de l' ADN linéaire (figure 3C). L'ADN de la matrice au sein de ce gel a ensuite été visualisée par hybridation Southern (Figure 3D). Dans le déblocage (- échantillon de ara), deux spots peuvent être vus, correspondant aux 5,5 kb et 6,7 kb fragments du tableau, comme prévu. L'échantillon qui a bloqué la replication (+ ara) a montré une diminution de la tache de 5,5 kb dans la comparaison et l'addition d'un signal de forme elliptique, ce qui indique une accumulation d'ADN en forme de Y dans l'échantillon. Le signal estlocalisé à une position, ce qui signifie les fourches de réplication arrêtent dans un endroit semblable dans toute la population. Par addition d'anhydrotetracyline, le signal d'ADN en forme de Y ne peut plus être vu. Un redémarrage récent est indiquée par la présence d'un signal de l'ensemble de l'arc Y, représentant les fourches qui migrent à travers la région.
Il est important de normaliser l'ADN au sein de chaque bouchon d'agarose pour garantir que les signaux des échantillons sont encore. Les signaux peuvent être quantifiés avec un logiciel d'imagerie approprié. Un autre intermédiaire commun vu est celle qui indique la jonction Holliday (HJ) formation. Un HJ est visualisé sous la forme d' un signal de cône au sommet de l'arc Y et une pointe de l'ADN linéaire à l'extrémité de l'arc Y (figure 3D).
Figure 2: Fluorescence Microscopy and Viab ilité. (A) Une E. souche de E. coli portant la matrice tetO a été cultivée à 30 ° C en présence de 0,1% d' arabinose (+ ara) pendant 1 heure, puis anhydrotétracycline (AT) a été ajoutée pendant 10 min à une sous - population de libérer le bloc de réplication. micrographies représentatifs sont présentés pour la production YFP (panneau supérieur). Barre d'échelle = 2 pm. La proportion de cellules portant 1, 2 ou plus de 2 foyers ont été dénombrés et sont présentés sous forme de pourcentage (panneau inférieur). (B) Les cellules cultivées en l'absence d'arabinose (- ara), avec arabinose (+ ara) et à la fois avec arabinose et anhydrotétracycline (AT; 10 min) ont été dilués en série de 10 fois et soit tacheté ou étalée sur une gélose contenant de l' ampicilline seulement ( - / + échantillons ara) ou ampicilline avec anhydrotétracycline (+ AT échantillon) et cultivées à 30 ° C pour déterminer la viabilité des cellules. Top: plaque représentative montrant la croissance à des dilutions indiquées. Bottom: graphique montrant la moyenne UFC / ml +/- SEM.ww.jove.com/files/ftp_upload/54434/54434fig2large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
. Figure 3: Visualisation des intermédiaires de réplication d' ADN à un bloc nucléoprotéine (A) l' ADN génomique à partir de cellules (1, - ara, 2, + ara; 3, + ara / AT) qui ont été lysées dans les bouchons d'agarose et digéré par restriction EcoRV enzyme a été séparé sur un gel d'agarose à 0,4% (55 V, 16 h). 3 kb, 5 kb et 10 bandes de kb sont indiqués. L'ADN marqueur au-dessus de la 5 kb a été excisée comme indiqué par les cases blanches. (B) Schéma de l'EcoRV digest de la région de la baie. fourches de réplication entrant dans le tableau à partir de l'origine deviennent bloqués dans le fragment de 5,5 kb lorsque les cellules ont été cultivées en présence d'arabinose. Les sites de restriction utilisés sont indiqués par des flèches et l'array est affiché comme une boîte avec des lignes. (C) L'ADN excisé a été mis en rotation à 90 ° et on le sépare dans un gel d' agarose à 0,8% (220 V, 4 h). La boîte blanche indique l'excision de l'ADN après la séparation. (D) La région à réseau a ensuite été visualisée par analyse par transfert de Southern en utilisant une sonde radioactive dans la région de tableau. Les cellules avec un bloc de réplication à ce poste auront le signal correspondant au fragment de 5,5 kb situé sur le Y-arc. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | 16922 | Growth media component |
| Sodium Chloride | VWR | 27810.364 | Growth media component |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | 92144 | Growth media component |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | Growth media component; Potassium buffer component |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | Growth media component; Potassium buffer component |
| L-Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | For induction of TetR-YFP production |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | 37919 | Release of replication bloackage |
| Axioskop 2 Fluorescence microscope | Zeiss | 452310 | Visualization of cells |
| eYFP filter set | Chroma Technology | 41028 | Visualization of YFP |
| CCD camera | Hamamatsu | Orca-AG | Visualization of cells |
| MetaMorph Software (Molecular Devices) | SDR Scientific | 31282 | Version 7.8.0.0 used in the preparation of this manuscript |
| Agarose | Bioline | BIO-41025 | For agarose plugs and gel electrophoresis |
| Original Glass Water Repellent (Rain-X) | Autobarn | DIO1470 | For agarose plug manufacture |
| TRIS | VWR | VWRC103157P | TE, TBE buffer component |
| Ethylene diaminetetraacetic acid | Ajax Finechem | AJA180 | 0.5 M EDTA disodium salt solution adjusted to pH 8.0 with NaOH. |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Bacteriostatic agent |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | TE buffer component |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | Cell lysis buffer component |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt (Sarkosyl) | Sigma-Aldrich | L5125 | Cell lysis and ESP buffer component |
| Rnase A | Sigma-Aldrich | R6513 | Cell lysis buffer component |
| Lysozyme | Amresco | 6300 | Cell lysis buffer component |
| Proteinase K | Amresco | AM0706 | ESP buffer component |
| Sub-Cell Model 192 Cell | BioRad | 1704507 | Electrophoresis system |
| UV transilluminator 2000 | BioRad | 1708110 | Visualization of DNA |
| Ethidium Bromide | BioRad | 1610433 | Visualization of DNA |
| Boric acid | VWR | PROL20185.360 | TBE component |
| Hybond-XL nylon memrbane | Amersham | RPN203S | Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) can also be used |
| 3MM Whatman chromatography paper | GE Healthcare Life Sciences | 3030690 | Southern blotting |
| HL-2000 Hybrilinker | UVP | 95-0031-01/02 | Crosslinking of DNA and hybridization |
| Deoxyribonucleic acid from salmon sperm | Sigma-Aldrich | 31149 | Hybridization buffer component |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | Denaturation buffer component |
| Trisodium citrate dihydrate | VWR | PROL27833.363 | Transfer buffer |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Amresco | 227 | Wash buffer component |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | Hybridization buffer component |
| Random Hexamer Primers | Bioline | BIO-38028 | |
| Klenow fragment | New England BioLabs | M0212L | |
| dNTP Set | Bioline | BIO-39025 | |
| Adenosine 5’-triphosphate-32P-ATP | PerkinElmer | BLU502A | |
| Storage Phosphor Screen | GE Healthcare Life Sciences | GEHE28-9564-76 | BAS-IP MS 3543 E multipurpose standard 35 cm x 43 cm screen |
| Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare Life Sciences | 28-9558-09 | Visualization of blot |
| Hybridization bottle | UVP | 07-0194-02 | 35 mm x 300 mm |
References
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