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Biology

में एक साइट विशिष्ट प्रतिकृति रुकावट उत्प्रेरण Published: August 21, 2016 doi: 10.3791/54434
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1School of Environmental and Life Sciences, University of Newcastle

Abstract

कसकर बाध्य प्रोटीन और विभिन्न घावों सहित डीएनए, पर उपस्थित बाधाओं, गंभीर रूप से सेल की प्रतिकृति मशीनरी की प्रगति को बाधित कर सकते हैं। एक replisome के रोकने गुणसूत्र से, या तो भाग या अपनी संपूर्णता में अपने हदबंदी करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, प्रतिकृति कांटा के पतन के लिए अग्रणी। इस पतन से वसूली सेल करने के लिए सही ढंग से पूरा गुणसूत्र दोहराव और बाद में विभाजित के लिए एक जरूरत है। इसलिए, जब पतन होता है, सेल विकसित किया गया है विविध तंत्र है कि डीएनए कांटा बहाल करने और प्रतिकृति अनुमति देने के लिए जगह लेने के लिए उच्च निष्ठा के साथ पूरा किया जाना है। इससे पहले, बैक्टीरिया में इन प्रतिकृति की मरम्मत रास्ते यूवी क्षति है, जो एक ज्ञात साइट के लिए स्थानीय नहीं होने का नुकसान है का उपयोग कर अध्ययन किया गया है। इस पांडुलिपि की एक प्रणाली एक प्रतिदीप्ति repressor ऑपरेटर प्रणाली (FROS) का उपयोग एक साइट विशेष प्रोटीन ब्लॉक कि रोकने के लिए और प्रतिकृति के पतन के लिए प्रेरित कर सकते हैं बनाने के लिए का वर्णनकोलाई में RKS। प्रोटोकॉल विस्तार कैसे प्रतिकृति की स्थिति प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और डीएनए प्रतिकृति मध्यवर्ती का उपयोग कर एक जीवित कोशिकाओं में देखे जा सकते हैं 2-आयामी agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है। Replisome घटकों (जैसे DnaBts) का तापमान संवेदनशील म्यूटेंट प्रतिकृति कांटे की एक तुल्यकालिक पतन के लिए प्रेरित करने के लिए प्रणाली में शामिल किया जा सकता है। इसके अलावा, पुनर्संयोजन प्रोटीन और helicases कि इन प्रक्रियाओं में शामिल रहे हैं की भूमिका इस प्रणाली के भीतर आनुवंशिक नॉकआउट का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है।

Introduction

डीएनए प्रतिकृति के दौरान, replisome डीएनए कि इसकी प्रगति ख़राब पर बाधाओं का सामना करना पड़ता। डीएनए के रूप में अच्छी तरह से घावों और अंतराल सहित नुकसान न्यायपालिका संरचनाओं 1 आगे बढ़ने से रोका जा सकता है replisome। हाल ही में, यह पाया गया है कि डीएनए के लिए बाध्य प्रोटीन बाधा का सबसे आम स्रोत कांटा प्रगति 2 पुनरावृत्ति कर रहे हैं। एक nucleoprotein ब्लॉक के साथ replisome की मुठभेड़ के बाद की घटनाओं का ज्ञान पहले से एक ज्ञात स्थान पर एक जीवित कोशिका के गुणसूत्र में इस तरह के एक ब्लॉक के लिए प्रेरित करने में असमर्थता द्वारा सीमित किया गया है। इन विट्रो विश्लेषण गतिज व्यवहार के बारे में हमारी समझ में इजाफा किया है एक सक्रिय replisome जब यह एक nucleoprotein रुकावट 3, साथ ही replisome खुद 4,5 के यंत्रवत विवरण मिलता है। प्रतिकृति की मरम्मत के वर्तमान को समझने में आम तौर पर हानिकारक एजेंट के रूप में यूवी के साथ किया जाता है और अध्ययन किया है विवो 6-8 में प्लास्मिड डीएनए का उपयोग विवो nucleoprotein ब्लॉक आम तौर पर इन अध्ययनों से समझ रहे हैं मुठभेड़ों के बाद मरम्मत रास्ते प्रतिकृति ब्लॉक में अलग-अलग कारण के कारण भीतर आणविक घटनाओं में बदलाव अभी तक कर रहे हैं कि क्या अब भी है निर्धारित किए जाने हेतु।

यहाँ, हम एक प्रणाली एक nucleoprotein ब्लॉक गुणसूत्र एक फ्लोरोसेंट repressor ऑपरेटर प्रणाली (FROS) का उपयोग करने का एक विशिष्ट स्थान में स्थापित करने की अनुमति देता है कि वर्णन है। हम ई के एक तनाव का उपयोग कोलाई कि 240 teto गुणसूत्र 9 में शामिल साइटों की एक सरणी पड़ा है। सरणी के भीतर प्रत्येक teto साइट ने 10 बीपी यादृच्छिक flanking यह सरणी के भीतर Reca की मध्यस्थता पुनर्संयोजन को रोकने के द्वारा सरणी की स्थिरता को बढ़ाने के अनुक्रम है। इस सरणी, और यह की विविधताओं, मूल रूप से ई समझने के लिए इस्तेमाल किया गया कोलाई गुणसूत्र गतिशीलता 10,11 लेकिन फिर preve करने के लिए अनुकूलित किया गयाNT में विवो प्रतिकृति 12। सरणी पाया गया है स्थिरतापूर्वक बनाए रखा जाए और जब tetr 10,12 से बंधे प्रतिकृति कांटे की 100% के करीब ब्लॉक करने के लिए। इन विट्रो में समान LACO सरणी का उपयोग करते हैं, के रूप में 22 साइटों प्रतिकृति के 90% ब्लॉक करने के लिए पर्याप्त थे कुछ के रूप में पाया गया है, हालांकि यह कम सरणी विवो 13 में कम प्रभावी था। एक nucleoprotein रुकावट पैदा करने के लिए अनुकूल करने के लिए सरणी, repressor प्रोटीन अत्यधिक अनुकूलित शर्तों जहां यह तो सरणी को बांधता एक अंधी गली बनाने के तहत overproduced किया जाना चाहिए। यदि Tet repressor की एक fluorescently टैग संस्करण प्रयोग किया जाता है रुकावट के गठन, और उसके बाद रिहाई, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के प्रयोग के माध्यम से नजर रखी जा सकती है। प्रत्येक कोशिका में प्रतिकृति का दर्जा देखा foci की संख्या, जहां एक ही केन्द्र बिन्दु का मतलब सरणी की केवल एक प्रति कोशिका के भीतर मौजूद है और कई foci सक्रिय प्रतिकृति का संकेत कर रहे हैं ने संकेत दिया है। यह सक्रिय पुनजब nucleoprotein रुकावट अहेतुक inducer कि ऑपरेटर साइट के लिए tetr के बंधन आत्मीयता पर्याप्त कम हो जाती है replisome सरणी के माध्यम से आगे बढ़ने के लिए के अलावा द्वारा उलट है तह सक्षम है। repressor प्रोटीन अभी भी पर्याप्त उच्च आत्मीयता के साथ डीएनए कि सरणी के अब कई प्रतियां देखे जा सकते हैं करने के लिए बाध्य करने में सक्षम है।

Nucleoprotein रुकावट में घटनाओं की अधिक जटिल विवरण तटस्थ तटस्थ दो आयामी agarose जेल वैद्युतकणसंचलन और दक्षिणी संकरण 14-16 का उपयोग कर की खोज की जा सकती है। इन तकनीकों में जनसंख्या भर में डीएनए संरचना का विश्लेषण अनुमति देते हैं। प्रतिकृति मध्यवर्ती कि घटना के दौरान गठित कर रहे हैं, और संभवतः, बिना मरम्मत के रहने देखे जा सकते हैं। प्रतिबंध एंजाइम और जांच के लिए उपयोग अलग करके, मध्यवर्ती सरणी क्षेत्र में बल्कि सरणी नदी के ऊपर जब प्रतिकृति कांटा regresses 17,18 न केवल कल्पना की जा सकती है।प्रतिगमन replisome हदबंदी करने के बाद जगह लेता है; अग्रणी और ठंड नवजात किस्में टेम्पलेट किस्में समवर्ती फिर से पानी रखना एक चार रास्ता डीएनए संरचना (एक अवकाश जंक्शन) में जिसके परिणामस्वरूप के रूप में एक दूसरे के लिए टेम्पलेट किस्में और पानी रखना से अलग।

इस प्रणाली में यह दिखाया गया है कि प्रतिकृति कांटा स्थिर जब यह इस ब्लॉक में 18 मुठभेड़ों नहीं है का उपयोग करना। इसके अलावा, replisome घटकों के तापमान संवेदनशील डेरिवेटिव प्रतिकृति कांटा के पुन: लोड एक बार यह ढह गया है को रोकने के लिए उपयोग किया जा सकता है। एक बार एक ब्लॉक की स्थापना की है, तनाव एक गैर अनुमोदक तापमान को स्थानांतरित किया जा सकता replisome का एक तुल्यकालिक छोड़ना और पुन: लोड के एक नियंत्रित रोकथाम सुनिश्चित करने के लिए। इस तापमान प्रेरित छोड़ना आबादी एक निश्चित समय पर ध्वस्त हो गई है भीतर कांटे के सभी सुनिश्चित करता है और क्या होता है जब replisome, गिर कैसे डीएनए संसाधित किया जाता है, और क्या फिर से करने की आवश्यकता है के मूल्यांकन की अनुमति देताडीएनए प्रतिकृति की प्रक्रिया शुरू करते हैं।

यहाँ वर्णित प्रणाली का एक लाभ यह है कि nucleoprotein ब्लॉक पूरी तरह से प्रतिवर्ती है; इसलिए, nucleoprotein ब्लॉक से उबरने के लिए कोशिकाओं की क्षमता का पालन किया जा करने में सक्षम है। कोशिकाओं को anhydrotetracycline के अलावा तंग repressor के बंधन से राहत मिल जाएगी, एक प्रतिकृति कांटा के माध्यम से आगे बढ़ने की अनुमति देता है और व्यवहार्यता हासिल करने के लिए सेल। रुकावट की राहत के 5 मिनट के बाद तटस्थ तटस्थ दो आयामी agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा देखे जा सकते हैं, और 10 मिनट के भीतर माइक्रोस्कोपी द्वारा। इसके अलावा, व्यवहार्यता विश्लेषण प्रतिकृति रुकावट से उबरने और पैदा करना जारी रखने के लिए तनाव की क्षमता को प्रकट कर सकते हैं।

यहाँ वर्णित प्रयोगात्मक प्रक्रिया में इस्तेमाल उपभेदों की आनुवंशिक पृष्ठभूमि में फेरबदल करके, रुकावट के इस प्रकार के मरम्मत रास्ते elucidated जा सकता है।

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Protocol

1. FROS साथ प्रतिकृति अवरूध्द

  1. प्रतिकृति रुकावट उत्प्रेरण
    1. एक ई की एक ताजा रातोंरात संस्कृति पतला एक teto सरणी और pKM1 18 आयुध डिपो 600nm = एक पतला जटिल माध्यम में 0.01 करने के लिए ले जाने के कोलाई तनाव (0.1% tryptone, 0.05% खमीर निकालने, 0.1% सोडियम क्लोराइड, 0.17 एम एच 2 4 पीओ, 0.72 एमके 2 HPO 4) एंटीबायोटिक दवाओं के साथ आवश्यकता के रूप में चयन के लिए।
      नोट: चयन के लिए टेट्रासाइक्लिन जोड़ नहीं है, क्योंकि यह इस प्रणाली के साथ संगत नहीं है। संस्कृति आवश्यक नमूना प्रति 10 मिलीलीटर के बराबर की मात्रा बनाओ। उदाहरण के लिए, चित्रा 1 में प्रयोगात्मक डिजाइन के लिए संस्कृति मात्रा 60 मिलीग्राम है।
    2. जब तक आयुध डिपो के 600 एनएम = 0.05-0.1 झटकों के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर आगे बढ़ें। uninduced नियंत्रण के रूप में सेवा करते हैं और शेष संस्कृति के लिए 0.1% arabinose जोड़ने pKM1 से tetr-YFP के उत्पादन के लिए प्रेरित करने के लिए एक 10 मिलीलीटर नमूना निकालें। दोनों uninduced और प्रेरित विकास के लिए जारीसंस्कृतियों। 1 घंटे के बाद, प्रेरित संस्कृति प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग की प्रत्येक कोशिका के भीतर एक ही केन्द्र बिन्दु की उपस्थिति के लिए जाँच (धारा 2 देखें)।
    3. प्रेरित कोशिकाओं को अवरुद्ध पुष्टि कर रहे हैं (कोशिकाओं के 70% से अधिक एक ही ध्यान केंद्रित किया है), आयुध डिपो 600nm रिकॉर्ड और 2-डी जैल (धारा 3 देखें) द्वारा विश्लेषण के लिए एक 7.5 मिलीलीटर नमूना ले। uninduced नियंत्रण संस्कृति से एक समकक्ष नमूना ले लो।
  2. प्रतिकृति रुकावट का विमोचन
    1. प्रतिकृति ब्लॉक रिलीज करने के लिए, अवरुद्ध कोशिकाओं के एक 10 मिलीलीटर नमूने के लिए नि: शुल्क inducer anhydrotetracycline (एटी) के 100 एनजी मिलीलीटर -1 जोड़ें। 10 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर आगे बढ़ने और सेल घनत्व (1 मिलीलीटर), माइक्रोस्कोपी विश्लेषण (10 μl) और तटस्थ तटस्थ 2-आयामी agarose जैल (7.5 एमएल) के लिए नमूने लेने के लिए आगे बढ़ें।
  3. उत्प्रेरण Replisome के पतन
    1. कोशिकाओं को इस तरह के dnaB टीएस या dnaC टीएस के रूप में एक तापमान संवेदनशील एलील होते हैं कि deactiva की आवश्यकता हैमोर्चे, 42 डिग्री सेल्सियस को अवरुद्ध कोशिकाओं से युक्त कुप्पी चलते हैं। समय की आवश्यकता बिंदुओं पर विश्लेषण के लिए नमूने ले लो (जैसे, ऊष्मायन के बाद 1 घंटा)। बाद कोशिकाओं 1 घंटे के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर incubated है, 10 मिनट (चित्रा 1 देखें) के लिए 30 डिग्री सेल्सियस के लिए कोशिकाओं पाली।
      नोट: कोशिकाओं को पुनः आरंभ करने के विश्लेषण के लिए 30 डिग्री सेल्सियस के लिए स्थानांतरित किया जा सकता है।

आकृति 1
चित्रा 1:। FROS प्रतिकृति ब्लॉक और रिलीज प्रायोगिक प्रक्रिया का अवलोकन ई teto सरणी ले जाने कोलाई उपभेदों 30 डिग्री सेल्सियस पर उगाए जाते हैं। कोशिकाओं 0.05 से ऊपर के एक आयुध डिपो 600nm तक पहुँचते हैं, tetr-YFP उत्पादन arabinose के साथ प्रेरित है (ए आर ए, 0.1%)। uninduced कोशिकाओं की एक उप-जनसंख्या 30 डिग्री सेल्सियस पर नियंत्रण के रूप में कार्य करने के लिए विकसित करने के लिए जारी रखें। 2 घंटा (2.1 देखें) - प्रेरित कोशिकाओं का एक नमूना 1 के बाद प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से विश्लेषण किया है। यदि प्रतिकृति हैइस बात की पुष्टि करने के लिए अवरुद्ध हो, नमूने टेस्ट ट्यूब (3.1 देखें) ने संकेत 2-डी जेल विश्लेषण के लिए और (वैकल्पिक) व्यवहार्यता परीक्षण के लिए लिया जाता है। प्रतिकृति रुकावट anhydrotetracycline (एटी, 0.1 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ हटाया जा सकता है और कोशिकाओं 10 मिनट के बाद में विश्लेषण किया। यदि कोशिकाओं एक तापमान संवेदनशील एलील ले जाने के लिए (जैसे dnaB टीएस), यह उचित विश्लेषण के लिए 42 डिग्री सेल्सियस को अवरुद्ध कोशिकाओं स्थानांतरण द्वारा निष्क्रिय किया जा सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

2. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी

  1. पिघला हुआ agarose (पानी में 1%) एक खुर्दबीन स्लाइड पर 500 μl pipetting द्वारा एक agarose पैड तैयार करें; agarose solidifies से पहले तुरंत coverslip उपरिशायी। 4 डिग्री सेल्सियस पर गीला ऊतकों में स्लाइड (एस) की दुकान तक की जरूरत है।
  2. जब agarose जम गया है, जीवाणु के 10 μl agarose पैड और पिपेट से coverslip को दूरपैड के केंद्र पर संस्कृति दृश्य के दौरान कोशिकाओं के आंदोलन को रोकने के लिए। एक बार नमूना (लगभग 5 मिनट) सूख गया है, coverslip जगह। विसर्जन के तेल की एक बूंद कवर पर्ची पर रखें और प्रकाशिकी के तहत स्लाइड जगह।
  3. प्रकोष्ठों 100X बढ़ाई चरण माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए कल्पना।
    1. इमेजिंग सॉफ्टवेयर के भीतर मोल संवाद बॉक्स पर, 100 मिसे के लिए जोखिम समय निर्धारित किया है। मोल का चयन करके छवि पर कब्जा है। मंच हिलना मत। मोल संवाद बॉक्स में, कैमरा के लिए लिंक बाहरी शटर के लिए रोशनी के रूप में YFP का चयन करें। 1,000 मिसे के लिए exporsure समय निर्धारित करें। मंच प्रकाश बंद कर दें। मोल का चयन करके प्रतिदीप्ति छवि पर कब्जा है।
      नोट: समय प्रकाश स्रोत, माइक्रोस्कोप और कैमरे का इस्तेमाल किया पर निर्भर करता है भिन्न हो सकते हैं।
    2. चरण और फ्लोरोसेंट छवियों मढ़ी, रंग प्रदर्शन मेनू के भीतर से जुडा है का चयन करें। रंग संवाद बॉक्स में गठबंधन, हरे घटक और बीएल के रूप में चरण छवि के रूप में YFP छवि का चयन करेंUE घटक है। गठबंधन रंग पर क्लिक करें। निर्धारित करें कि क्या आबादी है था प्रतिकृति सफलतापूर्वक स्थापित करने के लिए कि क्या कोशिकाओं के बहुमत सेल प्रति एक ध्यान केंद्रित किया है द्वारा अवरुद्ध।
      नोट: जोड़ा arabinose बिना नियंत्रण से एक नमूना से तुलना उपयोगी है नेत्रहीन EYFP उत्पादन में अंतर की पहचान करने के लिए।

3. डीएनए निष्कर्षण / Agarose प्लग

  1. कदम 1.1.3 और 1.2.1 से 7.5 मिलीलीटर संस्कृति के नमूने लिए सोडियम azide (0.1% की अंतिम एकाग्रता) जोड़ें। कम से कम 5 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं।
    नोट: सोडियम azide अत्यंत विषैला होता है। सुरक्षा डाटा शीट काम शुरू करने से पहले परामर्श करें और इसे संभाल नहीं है जब तक सभी सुरक्षा सावधानियों पढ़ा गया है और समझा है।
  2. कोशिकाओं 5000 XG अपकेंद्रित्र 10 मिनट गोली कोशिकाओं के लिए। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और Pett चतुर्थ (PIV) बफर के 200 μl में गोली resuspend (10 मिमी Tris: एचसीएल (पीएच 8.0), 1 एम NaCl)। Microcentrifuge (13, 2 मिनट के लिए 000 XG) गोली कोशिकाओं। डिसतह पर तैरनेवाला scard। इस स्तर पर, -20 डिग्री सेल्सियस पर प्रक्रिया छर्रों आगे या दुकान पर।
  3. 50 डिग्री सेल्सियस पर 50 μl PIV और जगह में सबसे कम सेल घनत्व के साथ कोशिकाओं Resuspend। अन्य सभी नमूने के लिए, PIV की मात्रा समायोजित तो अंतिम सेल घनत्व प्रत्येक ट्यूब में ही है (उदाहरण के लिए नमूना 1 (आयुध डिपो 600nm = 0.128) 50 μl में resuspended, नमूना 2 (आयुध डिपो 600nm = 0.138) 54 μl में resuspended)।
    1. PIV में हौसले से तैयार 0.8% agarose समाधान की एक समान मात्रा में जोड़ें (अंतिम सान्द्र 0.4%;। उदाहरण के लिए नमूना 1 50 μl, नमूना 2 54 μl)। सुनिश्चित करें कि नमूने, agarose और PIV solidification को रोकने के लिए ऊपर 50 डिग्री सेल्सियस हैं।
  4. एक उचित गिलास पानी से बचाने वाली क्रीम या सिलिकॉन समाधान के 40 μl के साथ एक खुर्दबीन स्लाइड समझो। एक ऊतक के साथ स्लाइड रगड़ो जब तक यह सूखा है।
    नोट: यह अग्रिम में किया जा सकता है और इलाज स्लाइड कमरे के तापमान पर लंबे समय तक संग्रहीत।
  5. टी के 20 μl बूंदों की जगहवह स्लाइड पर सेल / agarose निलंबन प्लग कि अर्धगोल हैं उपज है।
    नोट: पहला नमूना (50 μl PIV में resuspended) एक स्लाइड पर 5 प्लग का उत्पादन होगा।
  6. जब प्लग जम चुके हैं, उन्हें एक microfuge ट्यूब में धीरे स्लाइड और 1 मिलीलीटर सेल बफर (10 मिमी Tris एचसीएल [पीएच 8], 1 एम NaCl, 100 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA), 0.2% सोडियम deoxycholate, 0.5% जोड़ने एन Lauroylsarcosine सोडियम नमक (Sarkosyl), 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर - 1 लाइसोजाइम, 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर - 1 RNase एक)। 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  7. सेल बफर निकालें और 1 मिलीलीटर EDTA / Sarcosyl / proteinase कश्मीर (ईएसपी) समाधान (0.5 एम EDTA, 1% एन Lauroylsarcosine सोडियम नमक (Sarkosyl), 1 मिलीग्राम मिलीलीटर - 1 proteinase कश्मीर) जोड़ें। रात भर या जब तक प्लग पारदर्शी हैं 50 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। एक दूसरी रात ऊष्मायन के लिए आवश्यक है, तो लगभग 18 घंटे के बाद नए सिरे से बफर के साथ ईएसपी समाधान की जगह।
  8. हटाएईएसपी बफर और प्लग, 12 मिलीलीटर Tris EDTA (ते) बफर (10 मिमी Tris एचसीएल, 1 मिमी EDTA, 8.0 पीएच) के साथ 5 बार धोने प्रत्येक धोने के साथ एक 30 मिनट के संतुलन की इजाजत दी। 1 मिलीलीटर ते बफर में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।

4. तटस्थ तटस्थ 2-आयामी जेल वैद्युतकणसंचलन

  1. एक ताजा microfuge ट्यूब के लिए कदम 3.8 से एक agarose प्लग स्थानांतरण और प्रतिबंध एंजाइम बफर (1x एकाग्रता) के 150 μl जोड़ें। प्रतिबंध एंजाइम की 25-100 इकाइयों जोड़ें (जैसे, EcoRV की 60 इकाइयों, (चित्रा 3A देखें))। 6-8 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर डाइजेस्ट।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर, लगभग 25 x 25 सेमी की एक जेल ट्रे में 1x Tris / Borate / EDTA (TBE) में 0.4% agarose जेल (300 मिलीलीटर) डालना। कुओं लगभग प्लग के व्यास के रूप में एक ही चौड़ाई बनाने के लिए एक कंघी डालें। जब जेल में सेट है, कंघी को हटाने और कमरे के तापमान को जेल ले जाते हैं।
  3. पचा agarose प्लग की एक स्लाइड एक कुएं में, स्थिति प्लग के फ्लैट स्लाइड जहां टी अच्छी तरह के पक्ष के खिलाफवह डीएनए जेल में प्रवेश करेंगे। हर दूसरे को अच्छी तरह से में एक ही तरीके से एक ही प्लग डालें।
  4. कुओं में agarose पिपेट पिघला हुआ 0.4% की स्थिति में प्लग सील करने के लिए।
  5. एक खाली कुएं में लोड 1 केबी डीएनए सीढ़ी, फिर सीढ़ी और नमूने के बीच एक खाई जा रही है, और कमरे के तापमान पर जेल में रात भर 1x TBE में (16 घंटा, 55 वी) चलाते हैं।
  6. 20 मिनट के लिए ethidium ब्रोमाइड (0.3 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर -1) युक्त एक पानी के स्नान में जेल दाग।
    नोट: ethidium ब्रोमाइड एक शक्तिशाली उत्परिवर्तजन और एक विष माना जाता है। सुरक्षा डाटा शीट काम शुरू करने से पहले परामर्श करें और इसे संभाल नहीं है जब तक सभी सुरक्षा सावधानियों पढ़ा गया है और समझा है।
  7. एक लंबी लहर यूवी transilluminator के साथ डीएनए कल्पना और एक सीधी के साथ प्रत्येक लेन टुकड़ा काट, भी, कट गली के दोनों ओर अतिरिक्त agarose के शामिल किए जाने को कम।
    नोट: उदाहरण के लिए, अगर ब्याज का टुकड़ा 5.5 केबी, एक 7.5 सेमी टुकड़ा में कटौती करने के लिए 5 approximat केबी से डीएनए टुकड़े शामिल करने के लिएइली 12 केबी (चित्रा 3A देखें)।
  8. डीएनए पलायन की दिशा के लिए 90 डिग्री पर एक जेल ट्रे में excised जेल लेन रखें।
    नोट: 3 जेल टुकड़े की दो पंक्तियों में एक 25 x 25 2 सेमी जेल ट्रे में फिट कर सकते हैं। जेल गलियों की पहली पंक्ति में 12.5 सेमी में ट्रे, दूसरी पंक्ति के शीर्ष पर है।
  9. दूसरा आयाम जेल (0.3 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर -1 ethidium ब्रोमाइड के साथ 1x TBE में 0.9%) के लिए agarose 300 मिलीलीटर की तैयारी। agarose 50 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा किया जाता है, उनकी स्थिति को स्थिर करने के लिए जेल स्लाइस के आसपास पिघला हुआ agarose विंदुक। एक गहराई है कि जेल स्लाइस के साथ कम से कम स्तर के लिए ट्रे में शेष agarose डालो।
  10. एक बार जेल जम जाता है, 1x 220 वी पर 0.3 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर -1 ethidium ब्रोमाइड युक्त TBE में 4 डिग्री सेल्सियस पर Electrophorese जब तक डीएनए लगभग 10 सेमी चले गए है।
    नोट: 4 घंटा एक 5.5 केबी टुकड़ा के लिए पर्याप्त है, लेकिन एक छोटे टुकड़ा भी कम समय की आवश्यकता होगी।
  11. ब्लॉकों जहां जीनोमिक डीएनए वर्तमान यू है आबकारीएक धातु शासक के किनारे गाते हैं, यह ऊपर जेल डीएनए कि दिखाई नहीं है (देखें चित्र -3 सी) में शामिल करने के लिए भी शामिल है।

5. दक्षिणी संकरण

  1. समाधान तैयार
    1. Depurination बफर (0.125 एम एचसीएल समाधान) तैयार करें।
      नोट: यह बफर पुन: उपयोग किया जा सकता है और अप करने के लिए 1 महीने के लिए कमरे के तापमान पर स्थिर है।
    2. विकृतीकरण बफर (1.5 एम NaCl, 0.5 एम NaOH) तैयार करें।
      नोट: विकृतीकरण बफर एक बार पुन: उपयोग किया जा सकता है और कमरे के तापमान पर अप करने के लिए 3 महीने के लिए स्थिर है।
    3. निराकरण बफर (1.5 एम NaCl, 0.5 एम Tris) तैयार करें। एचसीएल के साथ पीएच 7.5 करने के लिए समायोजित करें।
      नोट: निराकरण बफर एक बार पुन: उपयोग किया जा सकता है और कमरे के तापमान पर अप करने के लिए 3 महीने के लिए स्थिर है।
    4. कदम 5.2.4 और 5.2.6 में उपयोग के लिए - 10x खारा सोडियम साइट्रेट (एसएससी) बफर (8 0.15 मीटर त्रिकोणीय सोडियम साइट्रेट, 1.5 एम NaCl, पीएच 7) तैयार करें। इस बफर से, (कदम 5.2.9 में उपयोग के लिए) एक 2x एसएससी शेयर करते हैं।
      नोट: 10x एसएससी और 2x एसएससी एक3 महीने के लिए आरटी पर स्थिर रहे हैं।
    5. संशोधित चर्च और गिल्बर्ट संकरण बफर 19 तैयार (0.5 एम फॉस्फेट बफर [पीएच 7.2], 7% (w / v) सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस), 10 मिमी EDTA)। 65 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दो का उपयोग करने के लिए अच्छी तरह से पहले भंग करने के लिए।
  2. हस्तांतरण
    1. एक घुमाव या कक्षीय प्रकार के बरतन पर आरटी पर 10 मिनट के लिए depurination समाधान में excised जेल ब्लॉकों कुल्ला। आंदोलन की गति agarose ब्लॉकों को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए कम रखें।
    2. 30 मिनट के लिए विकृतीकरण बफर के साथ आसुत जल के साथ संक्षिप्त और फिर जेल ब्लॉकों कुल्ला। आसुत जल में संक्षेप में फिर से कुल्ला और फिर कमरे के तापमान पर कोमल आंदोलन के साथ 30 मिनट के लिए निराकरण बफर में जेल ब्लॉकों सेते हैं।
    3. जेल (एस) की सटीक आकार के लिए एक नायलॉन झिल्ली कट। भविष्य चरणों में झिल्ली orienting में सहायता करने के ऊपरी दाएँ हाथ के कोने में एक निक कट।
      नोट: दो जेल ब्लॉक (6 नमूने) एक झिल्ली पर देखे जा सकते हैं।
    4. एक टीआर में पर्याप्त 10x एसएससी डालोप्र इतना है कि यह रात भर बाहर सूखी नहीं होगा। बफर के स्तर से ऊपर लगभग 5 सेमी एक मंच बनाने। 10x एसएससी और मंच पर जगह के साथ 3 मिमी क्रोमैटोग्राफी कागज के 3 चादरें तर। क्रोमैटोग्राफी कागज कट इतना है कि यह काफी लंबे समय के दोनों सिरों पर बफर में डूबे होने के लिए और काफी व्यापक पर झिल्ली जेल फिट करने के लिए है।
    5. संतृप्त क्रोमैटोग्राफी कागज के शीर्ष पर जेल (s) रखें। द्वारा गुजर स्थानांतरण के दौरान जेल बफर रोकने के लिए प्लास्टिक की चादर के साथ जेल फ़्रेम। ध्यान से जेल (एस) के शीर्ष पर कटौती झिल्ली रखना। धीरे झिल्ली भर में एक बोतल या सीरम वैज्ञानिक पिपेट रोलिंग द्वारा झिल्ली और जेल के बीच हवाई बुलबुले निकालें।
    6. झिल्ली के रूप में एक ही आकार के लिए 3 मिमी क्रोमैटोग्राफी कागज के तीन चादरें कट। 10x एसएससी के साथ क्रोमैटोग्राफी पेपर शीट तर और झिल्ली के शीर्ष पर जगह है। किसी भी हवाई बुलबुले का गठन किया है कि निकालें।
    7. ढेर कागज तौलिए में कम से कम 5 सेमी सोख्ता कागज एक ठोस समर्थन के द्वारा पीछा के शीर्ष पर उच्च (approएक 23 x 16 सेमी झिल्ली के लिए 1 किलो के ximate वजन)। हस्तांतरण रात भर आगे बढ़ने की अनुमति दें।
    8. झिल्ली (डीएनए ऊपर की ओर) 1,200 जम्मू / यूवी की 2 मीटर बेनकाब झिल्ली को डीएनए crosslink करने के लिए। इस कदम से पहले कुल्ला न करें।
    9. धब्बा छवियों पर उच्च पृष्ठभूमि को रोकने के लिए 2x एसएससी में अच्छी तरह से झिल्ली कुल्ला। धब्बा संकरण के लिए तुरंत उपयोग करें (5.3 देखें) या आरटी पर यह शुष्क, 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लास्टिक की चादर और दुकान में लपेट।
  3. संकरण
    1. पहले से गरम ओवन संकरण और 55 डिग्री सेल्सियस के लिए बोतलें।
    2. पूर्व गर्म संकरण बफर करने के लिए गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) और 10 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर -1 गैर विशिष्ट डीएनए (जैसे सामन शुक्राणु डीएनए) 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर जोड़ें -1।
    3. संकरण बफर के भी कवरेज के लिए अनुमति देने के लिए जब झिल्ली लुढ़का हुआ है, नायलॉन की एक समान आकार वर्ग पर धब्बा जगह झिल्ली ऊपर की ओर का सामना करना पड़ के डीएनए बाध्य पक्ष के साथ जाल। अपनी लंबी बढ़त के साथ धब्बा रोल। फिसल पट्टीधब्बा / एक संकरण बोतल के अंदर जाल। पूर्व गर्म संकरण बफर का एक उचित मात्रा धब्बा उतारना में जोड़ें (उदाहरण के लिए एक 23 x 16 सेमी 2 झिल्ली के लिए 30 मिलीलीटर)।
    4. एक पूर्व गर्म ओवन में सेते हैं, बोतलें घूर्णन, 1 घंटे के लिए।
    5. , ब्याज की क्षेत्र के लिए शुद्ध पीसीआर उत्पाद मुताबिक़ के 50 एनजी, यादृच्छिक hexamer प्राइमरों के 150 एनजी के मिश्रण से तैयार की जांच Klenow टुकड़ा और एच 2 ओ के लिए बफर 13 μl की एक मात्रा बनाने के लिए। उबालने के लिए 3 मिनट फिर बर्फ पर तुरंत जगह है। 1 मिमी dCTP / dGTP / dTTP मिश्रण का 1 μl, अल्फा phosphate- (α 32 पी dATP) पर Klenow टुकड़ा (5U) और 50 μCi deoxyadenosine 5'-triphosphate radiolabeled की 1 μl जोड़ें।
    6. 1 घंटे के लिए कमरे में अस्थायी सेते हैं। की 1 मिमी dNTP मिश्रण 1 μl और Klenow टुकड़ा के 1 μl जोड़ें। आरटी पर 20 मिनट सेते हैं।
    7. 5 मिनट के लिए उबाल लें और जांच संकरण ट्यूबों के लिए तुरंत जोड़ें। 55 डिग्री सेल्सियस पर रात भर संकरण, रोटेशन के साथ।
    8. जनसंपर्क छाननाझिल्ली से ओबीई।
      नोट: जांच एक बार पुन: उपयोग किया जा करने में सक्षम है।
    9. में पूर्व गर्म, कम तंगी धो बफर संक्षेप में झिल्ली कुल्ला (2x एसएससी, 0.1% (w / v) एसडीएस)। ताजा कम तंगी धोने बफर जोड़ें और रोटेशन के साथ 55 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेते हैं। दोहराएँ।
    10. मध्यम तंगी धोने बफर में दो बार धो (1x एसएससी, 0.1% (w / v) एसडीएस) रोटेशन के साथ 55 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए।
    11. उच्च तंगी धोने बफर में दो बार धो (0.1x एसएससी, 0.1% (w / v) एसडीएस) रोटेशन के साथ 55 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए।
    12. ऊतक के साथ झिल्ली और थपका हटाये अतिरिक्त तरल हटा दें। प्लास्टिक सुनिश्चित करने के लिए एक पूर्व खाली भंडारण भास्वर स्क्रीन के साथ प्लास्टिक की चादर और जोखिम कैसेट में जगह पर कोई शेष नमी है की चादर में लपेटें। कैसेट बंद करो और एक भास्वर इमेजर का उपयोग कर दृश्य से पहले कम से कम 2 घंटे के लिए बेनकाब।

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Representative Results

FROS एक inducible, साइट विशेष nucleoprotein ब्लॉक कि प्रतिकृति मध्यवर्ती सक्षम बनाता जीवित कोशिकाओं 12,18 में देखे जा रहा है। कोशिकाओं के नमूने के लिए एक सामान्य प्रयोगात्मक डिजाइन चित्रा 1 में सचित्र है। नमूना और आनुवंशिक पृष्ठभूमि में बदलाव के समय इस तरह के एक ब्लॉक की मरम्मत के अध्ययन के लिए एक बहुमुखी प्रणाली बनाते हैं। योजनाबद्ध दिखाता है कि कैसे इस तरह के dnaB टीएस और dnaC टीएस के रूप में तापमान संवेदनशील म्यूटेंट, कि पहले 18 इस्तेमाल किया गया है, इस प्रणाली में उपयोग किया जा सकता है।

FROS की प्रेरण एक ई में किया गया कोलाई तनाव के रूप में चित्र 1 में दिखाया गैर तापमान संवेदनशील उपभेदों के लिए। इस बात की पुष्टि करने के लिए कि एक nucleoprotein ब्लॉक, स्थापित किया गया था कोशिकाओं 0.1% arabinose में विकास के 1 घंटे के बाद प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कल्पना थे। इससमय सीमा आमतौर पर एक जंगली प्रकार के तनाव में ब्लॉक का उत्पादन करने के लिए, लेकिन अधिक दुराराध्य उपभेदों अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है पर्याप्त है। कोशिकाओं के बहुमत 1 फोकस (चित्रा 2A, + ए आर ए) निहित, कोशिका के भीतर सरणी की केवल एक प्रति के लिए इसी जिससे प्रतिकृति का संकेत अवरुद्ध कर दिया गया था। 1 फोकस, 2 foci या अधिक से अधिक 2 foci के साथ कोशिकाओं की संख्या 100 से अधिक कोशिकाओं की आबादी में गिना रहे थे। कोशिकाओं के 92% 2 foci के साथ शेष 8% के साथ 1 ध्यान केंद्रित किया है पाया गया। यह माना जाता था कि कोशिकाओं है कि दो foci अच्छी तरह से अलग स्थान, सरणी की दो प्रतियां का प्रतिनिधित्व करने के लिए किया था, अवरुद्ध प्रतिकृति के अगले दौर के लिए होता है। दो foci के साथ कोशिकाओं करीब एक साथ दर्शाता है कि सरणी हाल ही दोहराया गया है और nucleoprotein ब्लॉक अभी तक हासिल नहीं किया गया है।

nucleoprotein ब्लॉक anhydrotetracycline (एटी) और सरणी के बाद के दोहराव के अलावा के रूप में कल्पना की से उलट थाकई foci (चित्रा 2A, + आरा / एटी) के साथ कोशिकाओं का संचय। एक सेल प्रतिदीप्ति द्वारा कल्पना microcopy सरणी दर्शाता भीतर एकाधिक foci सफलतापूर्वक दोहराया गया है और पर्याप्त समय किसी भी बहन गुणसूत्र सामंजस्य कि उपस्थित थे पर काबू पाने, लोकी के अलावा स्थानांतरित करने के लिए अनुमति देने के लिए पारित कर दिया गया। इस उदाहरण में, 10 मिनट से कम के बाद इसके अलावा, कोशिकाओं के 94% से 2 या अधिक foci था और सेल प्रति अप करने के लिए 8 foci कल्पना थे।

यह सुनिश्चित करें कि nucleoprotein ब्लॉक वास्तव में प्रतिकृति को बाधित किया, सेल व्यवहार्यता विश्लेषण किया गया था (चित्रा 2 बी)। प्रकोष्ठों कि FROS से हिचकते प्रतिकृति पड़ा है कॉलोनी में एक लगभग 1000 गुना कमी कोशिकाओं है कि arabinose की उपस्थिति में हो नहीं कर रहे थे की तुलना में इकाइयों के गठन दिखा। कोशिकाओं है कि बाद में इस विकास निषेध के anhydrotetracycline शो पलटने की उपस्थिति में बड़े हो रहे थे। यदि कोशिकाओं रिलीज होने के बाद डीएनए की मरम्मत करने में असमर्थ थेnucleoprotein रुकावट के, व्यवहार्यता में कमी नतीजा होगा।

प्रतिकृति मध्यवर्ती कल्पना करने के लिए, कोशिकाओं agarose प्लग के भीतर lysed जा सकता है और प्रोटीन और आरएनए हटा दिया। डीएनए तो ब्याज के क्षेत्र के लिए एक उपयुक्त प्रतिबंध एंजाइम के साथ पचा जा सकता है। चित्रा 3 ए में कल्पना डीएनए EcoRV जो ब्याज के क्षेत्र (चित्रा 3 बी) में 5.5 केबी और 6.7 केबी के टुकड़े देने के लिए सरणी से ठीक पहले डीएनए कटौती, सरणी के भीतर और सरणी के बाद से पचा गया था। टुकड़े आदर्श रहे हैं ~ यहां वर्णित प्रोटोकॉल के लिए 3-7 केबी। इस सीमा के बाहर टुकड़े अच्छा जुदाई को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया agarose सांद्रता और वैद्युतकणसंचलन की स्थिति के परिवर्तन की आवश्यकता हो सकती है। डीएनए पहला आयाम में electrophoresed गया था और कल्पना (चित्रा 3 ए)। डीएनए पूरी तरह से पचा गया है, सभी गलियों में समान रूप से चलाने के लिए है और वहाँ हो जाएगा(लगभग 3 KB से कम है, प्रतिबंध एंजाइम पर निर्भर करता है) कम आणविक वजन का एक उच्च राशि। कुएं में डीएनए वर्तमान अधूरा सेल और उच्च आणविक वजन डीएनए का एक बहुत (10 केबी से ऊपर) से पता चलता निकलता अधूरा डीएनए पाचन।

प्रत्येक गली में ब्याज की डीएनए अलग किया गया। चित्रा 3 में, 5 केबी ऊपर डीएनए शामिल किया गया था। जेल के बाद दूसरा आयाम electrophoresed किया गया था, रैखिक डीएनए (चित्रा 3 सी) के एक विकर्ण में जिसके परिणामस्वरूप। इस जेल के भीतर सरणी डीएनए तो दक्षिणी संकरण (चित्रा 3 डी) द्वारा कल्पना की गई थी। (- आरा नमूना) अनब्लॉक में दो स्थानों को देखा जा सकता है, सरणी के 5.5 केबी और 6.7 केबी के टुकड़े करने के लिए इसी उम्मीद के रूप में। नमूना है जो प्रतिकृति अवरुद्ध था (+ ए आर ए) की तुलना में 5.5 केबी स्थान में कमी और एक अण्डाकार संकेत के अलावा दिखाया, नमूने में वाई के आकार का डीएनए का एक संग्रह का संकेत है। संकेत हैएक स्थिति के लिए स्थानीय, वाचक प्रतिकृति कांटे जनसंख्या भर में एक समान जगह में गिरफ्तार कर रहे हैं। anhydrotetracyline के अलावा पर, वाई के आकार का डीएनए संकेत नहीं रह देखा जा सकता है। हाल ही में एक पुनः आरंभ पूरे वाई-चाप का एक संकेत की उपस्थिति ने संकेत दिया है, कांटे क्षेत्र के माध्यम से पलायन का चित्रण है।

यह प्रत्येक agarose प्लग के भीतर डीएनए सामान्य करने के लिए सुनिश्चित करने के लिए नमूने के संकेत भी कर रहे हैं महत्वपूर्ण है। संकेतों उचित इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। एक अन्य आम मध्यवर्ती देखा गया है कि यह दर्शाता अवकाश जंक्शन (HJ) गठन है। एक HJ वाई-चाप के शीर्ष पर एक शंकु संकेत और वाई चाप (चित्रा 3 डी) के अंत में रैखिक डीएनए से एक कील के रूप में कल्पना की है।

चित्र 2
चित्रा 2: प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और Viab बड़प्पन। (ए) एक ई teto सरणी ले जाने कोलाई तनाव 1 घंटे के लिए 0.1% arabinose (+ ए आर ए) की उपस्थिति में 30 डिग्री सेल्सियस पर हो गया था और उसके बाद anhydrotetracycline (एटी) एक उप-जनसंख्या प्रतिकृति ब्लॉक को रिहा करने के लिए 10 मिनट के लिए जोड़ा गया है। प्रतिनिधि micrographs YFP उत्पादन (शीर्ष पैनल) के लिए दिखाए जाते हैं। स्केल बार = 2 माइक्रोन। 1, 2 या अधिक से अधिक 2 foci ले जाने की कोशिकाओं के अनुपात में प्रगणित थे और एक प्रतिशत (कम पैनल) के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं। (बी) कोशिकाओं की arabinose अभाव में उगाया (- ए आर ए), arabinose (+ ए आर ए) के साथ और दोनों arabinose और anhydrotetracycline (एटी, 10 मिनट) के साथ धारावाहिक पतला 10 गुना है और या तो धब्बेदार या केवल अगर युक्त एम्पीसिलीन पर फैल थे ( - / + आरा नमूने) या) anhydrotetracycline (+ नमूना पर साथ एम्पीसिलीन और सेल व्यवहार्यता का निर्धारण करने के लिए 30 डिग्री सेल्सियस से बढ़ी। शीर्ष: प्रतिनिधि प्लेट संकेत दिया dilutions में वृद्धि दर्ज की गई। नीचे: ग्राफ औसत CFU / एमएल दिखा +/- SEM।ww.jove.com/files/ftp_upload/54434/54434fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
। चित्रा 3: एक nucleoprotein ब्लॉक में डीएनए प्रतिकृति मध्यवर्ती के दृश्य (ए) कोशिकाओं से जीनोमिक डीएनए (1, - आरा, 2, + आरा, 3, + आरा / एटी) कि agarose प्लग के भीतर lysed और EcoRV प्रतिबंध एंजाइम के साथ पचा रहे थे एक 0.4% agarose जेल (55 वी, 16 घंटा) पर अलग हो गया था। 3 KB, 5 केबी और 10 केबी बैंड संकेत कर रहे हैं। के रूप में सफेद बक्से ने संकेत डीएनए 5 केबी मार्कर के ऊपर अलग किया गया। (बी) सरणी क्षेत्र के EcoRV डाइजेस्ट के योजनाबद्ध। मूल से सरणी में प्रवेश प्रतिकृति कांटे 5.5 केबी टुकड़ा भीतर अवरुद्ध हो जाते हैं जब कोशिकाओं arabinose की उपस्थिति में विकसित किया गया है। प्रतिबंध साइटों के लिए उपयोग तीर और एआर द्वारा संकेत कर रहे हैंरे लाइनों के साथ एक बॉक्स के रूप में दिखाया गया है। (सी) excised डीएनए 90 डिग्री घुमाया और एक 0.8% agarose जेल (220 वी, 4 घंटा) में अलग हो गया था। सफेद बॉक्स जुदाई के बाद डीएनए के छांटना इंगित करता है। (डी) सरणी क्षेत्र बाद में सरणी क्षेत्र के लिए एक रेडियोधर्मी जांच का उपयोग दक्षिणी धब्बा विश्लेषण द्वारा कल्पना की गई थी। इस स्थिति में एक प्रतिकृति ब्लॉक के साथ कोशिकाओं संकेत 5.5 केबी वाई-चाप पर स्थित टुकड़ा करने के लिए इसी होगा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptone Sigma-Aldrich 16922 Growth media component
Sodium Chloride VWR 27810.364 Growth media component
Yeast extract Sigma-Aldrich 92144 Growth media component
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P9791 Growth media component; Potassium buffer component
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich P3786 Growth media component; Potassium buffer component
L-Arabinose Sigma-Aldrich A3256 For induction of TetR-YFP production
Anhydrotetracycline hydrochloride Sigma-Aldrich 37919 Release of replication bloackage
Axioskop 2 Fluorescence microscope Zeiss 452310 Visualization of cells
eYFP filter set Chroma Technology 41028 Visualization of YFP
CCD camera Hamamatsu Orca-AG Visualization of cells
MetaMorph  Software (Molecular Devices) SDR Scientific 31282 Version 7.8.0.0 used in the preparation of this manuscript
Agarose Bioline BIO-41025 For agarose plugs and gel electrophoresis
Original Glass Water Repellent (Rain-X) Autobarn DIO1470 For agarose plug manufacture
TRIS VWR VWRC103157P TE, TBE buffer component
Ethylene diaminetetraacetic acid Ajax Finechem AJA180 0.5 M EDTA disodium salt solution adjusted to pH 8.0 with NaOH.
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002 Bacteriostatic agent
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 258148 TE buffer component
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750 Cell lysis buffer component
N-Lauroylsarcosine sodium salt (Sarkosyl) Sigma-Aldrich L5125 Cell lysis and ESP buffer component
Rnase A Sigma-Aldrich R6513 Cell lysis buffer component
Lysozyme Amresco 6300 Cell lysis buffer component
Proteinase K Amresco AM0706 ESP buffer component
Sub-Cell Model 192 Cell BioRad 1704507 Electrophoresis system
UV transilluminator 2000 BioRad 1708110 Visualization of DNA
Ethidium Bromide BioRad 1610433 Visualization of DNA
Boric acid VWR PROL20185.360 TBE component
Hybond-XL nylon memrbane Amersham RPN203S Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) can also be used
3MM Whatman chromatography paper GE Healthcare Life Sciences 3030690 Southern blotting
HL-2000 Hybrilinker UVP 95-0031-01/02 Crosslinking of DNA and hybridization
Deoxyribonucleic acid from salmon sperm Sigma-Aldrich 31149 Hybridization buffer component
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S5881 Denaturation buffer component
Trisodium citrate dihydrate VWR PROL27833.363 Transfer buffer
Sodium dodecyl sulphate (SDS) Amresco 227 Wash buffer component
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7906 Hybridization buffer component
Random Hexamer Primers Bioline BIO-38028
Klenow fragment New England BioLabs M0212L
dNTP Set Bioline BIO-39025
Adenosine 5’-triphosphate-32P-ATP PerkinElmer BLU502A
Storage Phosphor Screen GE Healthcare Life Sciences GEHE28-9564-76 BAS-IP MS 3543 E multipurpose standard 35 cm x 43 cm screen
Typhoon FLA 7000 GE Healthcare Life Sciences 28-9558-09 Visualization of blot
Hybridization bottle UVP 07-0194-02 35 mm x 300 mm

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References

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सेलुलर जीवविज्ञान अंक 114 डीएनए प्रतिकृति डीएनए की मरम्मत FROS 2-आयामी agarose जेल प्रतिकृति मध्यवर्ती nucleoprotein ब्लॉक प्रतिकृति कांटा उत्क्रमण
में एक साइट विशिष्ट प्रतिकृति रुकावट उत्प्रेरण<i&gt; ई। कोलाई</i&gt; एक फ्लोरोसेंट repressor ऑपरेटर प्रणाली का उपयोग करते हुए
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