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Biology

Indurre un blocco di replica siti specifici in doi: 10.3791/54434 Published: August 21, 2016

Abstract

Ostacoli presenti sul DNA, tra cui proteine ​​strettamente legate e varie lesioni, può seriamente inibire la progressione del meccanismo di replicazione della cellula. Lo stallo di un replisoma può portare alla sua dissociazione dal cromosoma, in parte o integralmente, portando al collasso della forcella di replica. Il recupero da questo collasso è una necessità per la cella di precisione completa la duplicazione dei cromosomi e successivamente dividere. meccanismi diversi Pertanto, quando si verifica il crollo, la cella si è evoluta che si svolgono per ripristinare la forcella del DNA e consentire la replica da completare con l'alta fedeltà. In precedenza, questi percorsi riparazione replicazione nei batteri sono stati studiati utilizzando danni UV, che ha lo svantaggio di non essere localizzato in un sito conosciuto. Questo manoscritto descrive un sistema che utilizza un sistema di fluorescenza Repressor Operator (FROS) per creare un blocco di proteine ​​site-specific che può indurre la fase di stallo e il crollo di replica FORKS in Escherichia coli. Protocolli dettaglio come lo stato della replica può essere visualizzato in singole cellule viventi utilizzando microscopia a fluorescenza e replicazione del DNA intermedi può essere analizzato da 2-dimensionale elettroforesi su gel di agarosio. Mutanti sensibili temperatura dei componenti replisoma (es DnaBts) possono essere incorporati nel sistema per indurre un crollo sincrona delle forche di replicazione. Inoltre, il ruolo delle proteine ​​ricombinazione e elicasi che sono coinvolti in questi processi possono essere studiate usando fori genetiche all'interno di questo sistema.

Introduction

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Durante la replicazione del DNA, la replisoma affronta gli ostacoli sul DNA che compromettono la sua progressione. Danno al DNA comprese lesioni e le lacune così come le strutture aberranti possono impedire la replisoma di procedere 1. Recentemente, si è trovato che le proteine ​​legate al DNA sono la fonte più comune di impedimento alla replica progressione forcella 2. La conoscenza degli eventi seguenti l'incontro del replisoma con un blocco nucleoproteina è stata precedentemente limitata dalla incapacità di indurre un tale blocco nel cromosoma di una cellula vivente in una posizione nota. In vitro analisi ha migliorato la nostra comprensione del comportamento cinetico di un replisoma attiva quando incontra un blocco nucleoproteina 3, nonché i dettagli meccanicistici della replisoma sé 4,5. Comprensione corrente della riparazione di replica viene generalmente effettuata con UV come agente dannoso e studiata utilizzando DNA plasmidico in vivo 6-8 in vivo nucleoproteine ​​sono generalmente inteso da questi studi, se ci sono variazioni di eventi molecolari all'interno delle vie di riparazione a causa della causa distinta nel blocco di replica è ancora ancora essere determinati.

Qui, descriviamo un sistema che permette un blocco nucleoproteina da stabilire in una posizione specifica del cromosoma con un System Operator Repressor fluorescente (FROS). Utilizziamo un ceppo di E. coli che ha avuto una serie di 240 siti Teto incorporati nel cromosoma 9. Ogni sito Teto all'interno della matrice ha un 10 bp sequenza casuale fiancheggiante di aumentare la stabilità della matrice impedendo ricombinazione RecA mediata all'interno della matrice. Questo array, e variazioni di esso, sono stati inizialmente utilizzati per comprendere E. coli dinamica dei cromosomi 10,11, ma sono stati poi adattati alle Prevent in vivo la replicazione 12. L'array è stato trovato per essere stabilmente mantenuto e per bloccare quasi il 100% delle forcelle di replica quando vincolato TetR 10,12. L'uso della matrice simile Laco in vitro ha trovato sole 22 siti erano sufficienti a bloccare il 90% di replica, anche se questa matrice inferiore era meno efficace in vivo 13. Per adattare la matrice per creare un blocco nucleoproteina, la proteina repressore deve essere altamente overproduced in condizioni ottimali in cui si lega poi alla matrice per creare un posto di blocco. La formazione del blocco, e il suo successivo rilascio, possono essere monitorate attraverso l'uso di microscopia a fluorescenza se viene utilizzata una variante fluorescently etichettato del repressore Tet. Lo stato della replica in ciascuna cella è indicato dal numero di focolai visto, in cui un unico punto focale significa solo una copia della matrice è presente all'interno della cellula e multiple foci sono indicativi di replicazione attiva. Questa ri attivaplicatura è abilitata quando il blocco nucleoproteina viene invertita mediante l'aggiunta di induttore gratuito che riduce l'affinità di legame del TetR per il sito dell'operatore sufficientemente per la replisoma procedere attraverso l'array. La proteina repressore è ancora in grado di legarsi al DNA con elevata affinità sufficiente che le società più copie della matrice possono essere visualizzati.

Maggiori dettagli intricati degli eventi presso il blocco nucleoproteina può essere scoperto usando neutro-neutro elettroforesi bidimensionale agarosio e ibridazione Southern 14-16. Queste tecniche permettono l'analisi di strutture di DNA nella popolazione. Gli intermedi di replica che si formano durante l'evento, e potenzialmente rimangono non riparato, può essere visualizzato. Variando l'enzima di restrizione e la sonda utilizzata, gli intermedi possono essere visualizzati non solo nella regione di matrice, ma anche a monte della matrice quando la forca di replicazione regredisce 17,18. Ilregressione verificatosi dopo la dissociazione replisoma; principali ed afflitte filamenti nascenti separano dai fasci modello e ricottura tra loro come i fili template contemporaneamente ri-ricottura conseguente DNA struttura a quattro vie (una giunzione Holliday).

Usando questo sistema è stato dimostrato che la forcella replica non è stabile quando rileva questo blocco 18. Inoltre, derivati ​​termosensibili di componenti replisoma possono essere utilizzati per impedire ricaricare alla forcella di replicazione una volta che è collassata. Una volta che un blocco viene stabilita, il ceppo può essere spostato ad una temperatura non permissive per garantire una disattivazione sincrono del replisoma e prevenzione controllata di ricaricare. La disattivazione di temperatura indotta assicura tutte le forche all'interno della popolazione sono crollati in un dato tempo e permette la valutazione di ciò che accade quando il replisoma collassa, come il DNA viene elaborata, e ciò che è necessario per riavviare il processo di replicazione del DNA.

Un vantaggio del sistema descritto qui è che il blocco nucleoproteina è completamente reversibile; Pertanto, la capacità delle cellule di recuperare dal blocco nucleoproteina può essere seguita. L'aggiunta di anhydrotetracycline alle cellule sarà alleviare la stretta legame del repressore, permettendo una forchetta replica di procedere attraverso la cella e per ritrovare la vitalità. Il rilievo del blocco può essere visualizzata neutro neutro elettroforesi bidimensionale agarosio dopo 5 min, e mediante microscopia entro 10 min. Inoltre, l'analisi redditività può rivelare la capacità del ceppo per recuperare dal blocco replica e continuano a proliferare.

Alterando il background genetico dei ceppi utilizzati nella procedura sperimentale descritta qui, i percorsi di riparazione per questo tipo di blocco possono essere chiarite.

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Protocol

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1. Il blocco della replica con FROS

  1. Indurre la replica Blocco
    1. Diluire una coltura fresca durante la notte di E. coli ceppo portante una matrice TETO e pKM1 18 a OD 600nm = 0.01 in un mezzo complesso diluita (0,1% triptone, 0,05% estratto di lievito, 0,1% NaCl, 0,17 M KH 2 PO 4, 0,72 MK 2 HPO 4) con antibiotici come richiesto per la selezione.
      Nota: non aggiungere tetraciclina per la selezione in quanto non è compatibile con questo sistema. Rendere il volume della coltura equivalente a 10 ml per campione richiesto. Ad esempio, il volume di coltura per il disegno sperimentale in figura 1 è di 60 ml.
    2. Crescere a 30 ° C con agitazione fino a OD 600 nm = 0,05-0,1. Rimuovere un campione di 10 ml per servire come controllo uninduced e aggiungere 0,1% arabinosio alla cultura rimanente per indurre la produzione di TetR-YFP da pKM1. Continuare a crescere sia il non indotte e indottoculture. Dopo 1 ora, verificare la presenza di un unico punto focale all'interno di ogni cellula della cultura indotta utilizzando la microscopia a fluorescenza (vedere paragrafo 2).
    3. Se le cellule indotte sono confermati bloccato (oltre il 70% delle cellule hanno un unico fuoco), registrare l'600nm OD e prendere un campione di 7,5 ml per l'analisi gel 2-D (vedi sezione 3). Prendere un campione equivalente dalla cultura di controllo non indotte.
  2. Rilasciando la replica Blocco
    1. Per rilasciare il blocco di replica, aggiungere 100 ng ml -1 del anhydrotetracycline induttore gratuita (AT) per un campione di cellule bloccate 10 ml. Continua a crescere a 30 ° C per 10 min e prelevare campioni di densità cellulare (1 ml), analisi al microscopio (10 microlitri) e neutro-neutro gel di agarosio 2-dimensionali (7,5 ml).
  3. Indurre Crollo del replisoma
    1. Se le celle contengono un allele sensibile alla temperatura, come ts dnaB o TS dnaC che richiede deactivazione, spostare il pallone contenente le cellule bloccate a 42 ° C. Prelevare campioni per analisi in momenti richiesti (ad esempio, 1 ora dopo l'incubazione). Dopo che le cellule sono incubate a 42 ° C per 1 ora, spostare le cellule a 30 ° C per 10 min (vedere Figura 1).
      Nota: Le cellule possono essere spostati a 30 ° C per l'analisi riavvio.

Figura 1
Figura 1:. Panoramica sulla procedura di blocco e di rilascio sperimentale FROS replica E. ceppi coli che trasportano l'array Teto sono coltivate a 30 ° C. Quando le cellule raggiungono un 600nm OD superiore a 0.05, produzione TetR-YFP è indotta con arabinosio (ara; 0,1%). Continua a crescere una sottopopolazione di cellule indotte ad agire come controlli a 30 ° C. Un campione di cellule indotte viene analizzata tramite microscopia a fluorescenza dopo 1 - 2 h (vedere 2.1). Se la replica èconfermato di essere bloccato, vengono prelevati campioni per l'analisi del gel 2-D indicata dalle provette (vedi 3.1) e test di vitalità (opzionale). Il blocco replica può essere rimosso con anhydrotetracycline (AT; 0,1 mg / ml) e le cellule analizzate 10 min più tardi. Se le cellule portano un allele sensibile alla temperatura (ad esempio dnaB ts), questo può essere inattivato spostando le cellule bloccate a 42 ° C per l'analisi del caso. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

2. microscopia a fluorescenza

  1. Preparare un tampone agarosio pipettando 500 ml di agarosio fuso (1% in acqua) su un vetrino da microscopio; sovrapporre il vetrino immediatamente prima delle solidifica agarosio. Conservare la slitta (s) in tessuti bagnati a 4 ° C fino al momento dell'uso.
  2. Quando l'agarosio si è solidificato, rimuovere il vetrino dal pad agarosio e pipetta 10 ml di battericultura sul centro del pad per impedire il movimento delle cellule durante la visualizzazione. Una volta che il campione è essiccato (circa 5 minuti), sostituire il vetrino. Mettere una goccia di olio di immersione sul vetrino e porre il vetrino sotto l'ottica.
  3. Visualizzare le cellule con la funzione Phase Microscopia a 100X ingrandimento.
    1. Nella finestra di dialogo Acquisisci all'interno del software di imaging, impostare il tempo di esposizione a 100 msec. Acquisire l'immagine selezionando Acquire. Non spostare il palco. Nella finestra di dialogo Acquisisci, selezionare YFP come l'illuminazione per l'otturatore esterno collegato alla fotocamera. Impostare il tempo exporsure a 1.000 msec. Spegnere la luce della fase. Acquisire l'immagine di fluorescenza selezionando Acquire.
      Nota: Il tempo può variare a seconda della fonte di luce, microscopio e fotocamera utilizzata.
    2. Per sovrapporre la fase e le immagini fluorescenti, selezionare Colore Combina dall'interno del menu Display. Nella colore Combina finestra di dialogo, selezionare l'immagine YFP come l'immagine di fase come il bl componente verde ecomponente ue. Fare clic sul colore combinare. Determinare se la popolazione ha avuto replica bloccato da stabilire se la maggior parte delle cellule hanno un fuoco per cella.
      Nota: confronto ad un campione dal controllo senza arabinosio aggiunto è utile per identificare visivamente la differenza nella produzione EYFP.

3. Spine DNA Estrazione / Agarose

  1. Aggiungere azide di sodio (concentrazione finale dello 0,1%) per i campioni di 7,5 ml di coltura da passi 1.1.3 e 1.2.1. Incubare in ghiaccio per almeno 5 minuti.
    Nota: sodio azide è estremamente tossico. Consultare la scheda di sicurezza prima di iniziare il lavoro e non maneggiare fino a quando tutte le misure di sicurezza sono state lette e comprese.
  2. Centrifugare le cellule 5.000 xg per 10 minuti per far sedimentare le cellule. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 200 ml di Pett IV (PIV) tampone (10 mM Tris: HCl (pH 8.0), 1 M NaCl). Microcentrifuga (13, 000 xg per 2 minuti) per far sedimentare le cellule. discard il surnatante. In questa fase, il processo di pellet ulteriormente o conservare a -20 ° C.
  3. Risospendere le cellule con la più bassa densità cellulare in 50 microlitri PIV e posto a 50 ° C. Per tutti gli altri campioni, regolare il volume di PIV così la densità cellulare finale è la stessa in ogni tubo (es Campione 1 (OD 600nm = 0,128) risospeso in 50 microlitri; Campione 2 (OD 600nm = 0,138) risospeso in 54 microlitri).
    1. Aggiungere un volume uguale di soluzione preparata di agarosio allo 0,8% in PIV (conc finale 0,4%;. Es Esempio 1 50 microlitri, Esempio 2 54 microlitri). Assicurarsi che i campioni, agarosio e PIV sono superiori a 50 ° C per evitare la solidificazione.
  4. Trattare un vetrino da microscopio con 40 ml di una soluzione di vetro idrorepellente o silicone appropriata. Strofinare il vetrino con un fazzoletto di carta fino a quando è asciutto.
    Nota: Questo può essere fatto in anticipo e le diapositive trattati conservato a lungo termine a temperatura ambiente.
  5. Mettere 20 gocce microlitri di tegli sospensione cellulare / agarosio sul vetrino per la produzione di tappi che sono emisferica.
    Nota: Il primo campione (risospeso in 50 ul PIV) produrrà 5 spine su una diapositiva.
  6. Quando le spine hanno solidificato, farle scivolare dolcemente in una provetta per microcentrifuga e aggiungere 1 ml di tampone di lisi cellulare (10 mM Tris-HCl [pH 8], 1 M di NaCl, 100 acido mM etilendiamminotetraacetico (EDTA), lo 0,2% di sodio desossicolato, 0,5% sale di N-Lauroylsarcosine sodio (Sarkosyl), 100 mcg ml - 1 lisozima, 50 mcg ml - 1 RNasi A). Incubare a 37 ° C per 2 ore.
  7. Rimuovere il tampone di lisi cellulare e aggiungere la soluzione 1 ml di EDTA / sarcosyl / proteinasi K (ESP) (0,5 M EDTA, 1% sale di sodio N-Lauroylsarcosine (Sarkosyl), 1 mg ml - 1 proteinasi K). Incubare a 50 ° C durante la notte o fino a quando le spine sono trasparenti. Se è necessaria una seconda notte di incubazione, sostituire la soluzione ESP con tampone fresco dopo circa 18 ore.
  8. Rimuovi ilESP tampone e lavare i tappi 5 volte con 12 ml di Tris-EDTA (TE) tampone (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0), consentendo un 30 min in equilibrio con ogni lavaggio. Conservare a 4 ° C in 1 ml di tampone TE.

4. neutro-neutro 2-Dimensional elettroforesi su gel

  1. Trasferire una spina agarosio dal punto 3.8 a una provetta per microcentrifuga fresco e aggiungere 150 ml di tampone enzima di restrizione (1x concentrazione). Aggiungere 25-100 unità di enzima di restrizione (ad esempio, 60 unità di EcoRV; (vedi Figura 3A)). Digest a 37 ° C per 6-8 ore.
  2. Al 4 ° C, versare un gel di agarosio 0,4% (300 ml) in 1x Tris / borato / EDTA (TBE) in un vassoio di gel di circa 25 x 25 cm. Inserire un pettine per rendere pozzetti circa la stessa larghezza del diametro della spina. Quando il gel è impostato, rimuovere il pettine e spostare il gel a temperatura ambiente.
  3. Infilare una delle spine agarosio digeriti in un pozzo, posizionando la slitta piatta della spina contro il lato del pozzo dove tegli DNA entrerà nel gel. Inserire una sola spina nello stesso modo in ogni secondo pozzo.
  4. Pipettare fuso 0,4% agarosio nei pozzetti per sigillare i tappi in posizione.
  5. Carico 1 kb scala del DNA in un pozzo vuoto, lasciando ancora un divario tra la scala e campioni, ed eseguire il gel durante la notte (16 ore, 55 V) a 1x TBE a temperatura ambiente.
  6. Macchia il gel in un bagno di acqua contenente etidio bromuro (0,3 mg ml -1) per 20 min.
    Nota: il bromuro di etidio è considerato un agente mutageno potente ed una tossina. Consultare la scheda di sicurezza prima di iniziare il lavoro e non maneggiare fino a quando tutte le misure di sicurezza sono state lette e comprese.
  7. Visualizzare il DNA con un transilluminatore UV a onde lunghe e tagliare ogni frammento corsie con una retta, anche tagliare, minimizzando l'inclusione di eccesso di agarosio su entrambi i lati della corsia.
    Nota: Ad esempio, se il frammento di interesse è di 5,5 kb, tagliare un frammento di 7,5 centimetri per includere i frammenti di DNA da 5 kb al approximatEly 12 kb (vedi Figura 3A).
  8. Posizionare la corsia di gel asportato in un vassoio di gel a 90 ° direzione di migrazione del DNA.
    Nota: Due file di 3 frammenti di gel può andare bene in un vassoio di gel 25 x 25 2 cm. La prima fila di corsie del gel è nella parte superiore del vassoio, la seconda fila a 12.5 cm.
  9. Preparare 300 ml di agarosio per la seconda gel di dimensione (0,9% nel 1 x TBE con 0,3 mg ml -1 bromuro di etidio). Quando l'agarosio si raffredda a 50 ° C, pipetta la agarosio fuso attorno alle fette di gel a solidificare la loro posizione. Versare il agarosio rimanenti nel vassoio per una profondità che è almeno di livello con le fette di gel.
  10. Una volta che il gel è solidificato, elettroforesi a 4 ° C in TBE 1x contenente 0,3 mg ml -1 bromuro di etidio a 220 V fino a quando il DNA è migrata circa 10 cm.
    Nota: 4 ore è sufficiente per un frammento di 5,5 kb che un frammento più piccolo avrà bisogno di meno tempo.
  11. Asportare i blocchi in cui il DNA genomico è presente ucantare bordo di un righello di metallo, compreso il gel sopra includere il DNA non visibile (Figura 3C).

5. Ibridazione del sud

  1. soluzione Preparazione
    1. Preparare depurinazione tampone (0,125 soluzione M HCl).
      Nota: Questo buffer può essere riutilizzato ed è stabile a temperatura ambiente per 1 mese.
    2. Preparare denaturazione tampone (1,5 M di NaCl, 0,5 M NaOH).
      Nota: denaturazione buffer può essere riutilizzato una volta ed è stabile per un massimo di 3 mesi a temperatura ambiente.
    3. Preparare tampone di neutralizzazione (1,5 M NaCl, 0,5 M Tris). Regolare a pH 7.5 con HCl.
      Nota: tampone di neutralizzazione può essere riutilizzato una volta ed è stabile per 3 mesi a temperatura ambiente.
    4. Preparare 10x Saline citrato di sodio (SSC) tampone (0,15 M citrato trisodico, 1,5 M di NaCl, pH è 7 - 8) per l'uso in passi 5.2.4 e 5.2.6. Da questo buffer, fare una SSC magazzino 2x (per l'uso in fase 5.2.9).
      Nota: 10x SSC e 2x SSC unri stabile a temperatura ambiente per 3 mesi.
    5. Preparare Chiesa e Gilbert Hybridization Buffer 19 Modified (0,5 M tampone fosfato [pH 7,2], 7% (w / v) di sodio dodecil solfato (SDS), 10 mM EDTA). Lasciare a 65 ° C per sciogliere completamente prima dell'uso.
  2. Trasferimento
    1. Sciacquare i blocchi di gel asportati in soluzione depurinazione per 10 minuti a temperatura ambiente su una sedia a dondolo o agitatore orbitale. Mantenere la velocità di agitazione basso per evitare di danneggiare i blocchi agarosio.
    2. Risciacquare i blocchi gel brevemente con acqua distillata e quindi con tampone di denaturazione per 30 min. Risciacquare ancora brevemente in acqua distillata e quindi incubare i blocchi di gel in tampone di neutralizzazione per 30 minuti con agitazione a temperatura ambiente.
    3. Tagliare una membrana di nylon alla dimensione esatta del gel (s). Tagliare un nick in alto a destra per aiutare a orientare la membrana nei passaggi futuri.
      Nota: Due blocchi gel (6 campioni) può essere visualizzato su una membrana.
    4. Versare abbastanza 10x SSC in un TRay modo che non si secca durante la notte. Creare una piattaforma circa 5 cm sopra il livello del buffer. Saturare 3 fogli di carta per cromatografia 3MM con 10x SSC e posto sulla piattaforma. Tagliare la carta cromatografia in modo che sia abbastanza lungo per essere immerso in tampone a entrambe le estremità e largo abbastanza da contenere il gel membrana sulla.
    5. Porre il gel (s) sulla parte superiore della carta cromatografia satura. Inquadrare il gel con involucro di plastica per evitare il buffer by-passando il gel durante il trasferimento. Adagiare la membrana taglio sulla superficie del gel (s). Rimuovere le bolle d'aria tra la membrana e il gel rotolando una bottiglia o una pipetta sierologica dolcemente attraverso la membrana.
    6. Tagliare tre fogli di carta cromatografia 3MM alle stesse dimensioni della membrana. Saturare i fogli di carta per cromatografia con 10x SSC e posto sulla parte superiore della membrana. Rimuovere eventuali bolle d'aria che si sono formate.
    7. tovaglioli di carta Stack di almeno 5 cm sulla parte superiore della carta assorbente seguito da un supporto solido (approPeso ximate di 1 kg per una membrana 23 x 16 cm). Lasciare che il trasferimento di procedere durante la notte.
    8. Esporre la membrana (DNA lato alto) a 1,200 J / m 2 di UV per reticolare il DNA alla membrana. Non sciacquare prima di questo passaggio.
    9. Sciacquare accuratamente la membrana in 2x SSC per evitare fondo elevato sulle immagini macchia. Utilizzare la macchia immediatamente per l'ibridazione (vedi 5.3) o asciugare a temperatura ambiente, avvolgerlo nella pellicola trasparente e conservare a 4 ° C.
  3. ibridazione
    1. fornetto Preriscaldare e bottiglie a 55 ° C.
    2. Aggiungere 100 mcg ml -1 di albumina sierica bovina (BSA) e 10 mg ml -1 DNA non specifico (ad esempio, il salmone DNA spermatico) nel buffer di pre-riscaldato ibridazione.
    3. Per consentire anche per la copertura del tampone di ibridazione quando la membrana viene arrotolata, collocare il blot su un quadrato di dimensioni simili di rete di nylon con il lato DNA-bound della membrana rivolta verso l'alto. Arrotolare la macchia lungo il suo lato lungo. Diapositivala macchia / mesh all'interno di una bottiglia di ibridazione. Aggiungere una quantità appropriata di tampone di ibridazione preriscaldato a srotolare il blot (ad esempio 30 ml per un cm 2 membrana 23 x 16).
    4. Incubare in un forno preriscaldato, ruotare le bottiglie, per 1 ora.
    5. Preparare la sonda mescolando 50 ng purificato omologo prodotto di PCR per la regione di interesse, 150 ng di primer esameriche casuali, tampone per frammento di Klenow e H 2 O per fare un volume di 13 microlitri. Far bollire per 3 minuti poi posto immediatamente sul ghiaccio. Aggiungere 1 ml di 1 mm dCTP / dGTP / dTTP mix, 1 ml di frammento di Klenow (5U) e 50 pCi deossiadenosina radiomarcato 5'-trifosfato sul alfa fosfati (α 32 P-dATP).
    6. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Aggiungere 1 ml di 1 mM dNTP mix e 1 ml di Klenow frammento. Incubare 20 minuti a temperatura ambiente.
    7. Far bollire Sonda per 5 minuti e aggiungere immediatamente ai tubi di ibridazione. Ibridare overnight a 55 ° C, con rotazione.
    8. Decantare il prOBE dalla membrana.
      Nota: La sonda può essere riutilizzato una volta.
    9. Sciacquare la membrana brevemente nel pre-riscaldato, tampone di lavaggio a bassa severità (2x SSC, 0,1% (w / v) di SDS). Aggiungere fresca tampone di lavaggio a bassa severità e incubare per 5 minuti a 55 ° C con rotazione. Ripetere.
    10. Lavare due volte in tampone di lavaggio medio stringenza (1x SSC, 0,1% (w / v) di SDS) per 10 min a 55 ° C con rotazione.
    11. Lavare due volte in tampone di lavaggio stringenza elevata (0.1x SSC, 0.1% (w / v) di SDS) per 5 min a 55 ° C con rotazione.
    12. Rimuovere la membrana e tamponare con il tessuto per rimuovere il liquido in eccesso. Avvolgere nella pellicola garantire che vi sia alcun residuo di umidità sulla pellicola trasparente e posto in cassette di esposizione con uno schermo di memorizzazione fosforo pre-oscurata. Chiudere la cassetta ed esporre per almeno 2 ore prima della visualizzazione utilizzando un imager fosforo.

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Representative Results

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Il FROS è un, blocco nucleoprotein site-specific inducibile che consente intermedi di replicazione da visualizzare nelle cellule viventi 12,18. Un disegno sperimentale generale per il campionamento delle cellule è illustrato in Figura 1. I tempi di campionamento e variazioni in background genetico fanno un sistema versatile per studiare la riparazione di un tale blocco. Lo schema illustra come mutanti sensibili alla temperatura, come ad esempio ts dnaB e TS dnaC che sono stati utilizzati in precedenza 18, possono essere utilizzati in questo sistema.

L'induzione dei FROS è stata effettuata in un E. coli come mostrato in Figura 1 per i ceppi sensibili non-temperatura. Per confermare che un blocco nucleoproteina era stato stabilito, le cellule sono state visualizzate mediante microscopia a fluorescenza, dopo 1 ora di crescita del 0,1% arabinosio. Questolasso di tempo è di solito sufficiente per produrre il blocco in un ceppo di tipo selvatico, ma i ceppi più esigenti possono richiedere l'ottimizzazione. La maggior parte delle cellule conteneva 1 fuoco (figura 2A, + ara), corrispondente ad una sola copia della matrice all'interno della cella indicando così la replicazione era stato bloccato. Il numero di cellule con 1 fuoco, 2 fuochi o più di 2 focolai sono stati contati in una popolazione di più di 100 cellule. Il 92% delle cellule sono stati trovati ad avere 1 messa a fuoco con il restante 8% con 2 fuochi. E 'stato presunto che le cellule che hanno avuto due fuochi ben distanziati, che rappresentano due copie della matrice, avrebbero il prossimo ciclo di replicazione bloccato. Le cellule con due fuochi vicini significano che l'array è stato recentemente replicato e il blocco nucleoproteina non è stato ancora raggiunto.

Il blocco nucleoproteina stato invertito mediante aggiunta di anhydrotetracycline (AT) e successiva duplicazione della matrice visualizzato comeaccumulo di cellule con focolai multipli (Figura 2A, + ara / AT). focolai multipli all'interno di una cella visualizzato mediante fluorescenza Microcopy indicare la matrice è stato replicato con successo e il tempo sufficiente è passato per consentire al loci di muoversi a parte, superando ogni sorella cromosoma coesione che era presente. In questo caso, 10 minuti dopo l'aggiunta di AT, 94% di cellule aveva 2 o più foci e fino a 8 focolai per cella sono state visualizzate.

Per assicurarsi che il blocco nucleoproteina ha effettivamente inibire la replicazione, la vitalità cellulare è stata analizzata (Figura 2B). Le cellule che hanno avuto replica inibito dalle FROS mostrano una diminuzione circa 1000 volte formanti colonia unità rispetto alle cellule che non sono state coltivate in presenza di arabinosio. Le cellule che sono state successivamente coltivate in presenza di anhydrotetracycline mostra inversione di inibizione della crescita. Se le cellule sono state in grado di riparare il DNA dopo il rilasciodel blocco nucleoproteina, una riduzione della vitalità comporterebbe.

Per visualizzare gli intermedi di replicazione, le cellule possono essere lisate all'interno spine agarosio e la proteina e RNA rimossi. Il DNA può essere digerito con un enzima di restrizione appropriato per la regione di interesse. DNA nella Figura 3A è stato digerito con EcoRV che taglia il DNA immediatamente prima matrice, all'interno della matrice e dopo l'array di dare 5,5 kb e 6,7 kb frammenti nella regione di interesse (Figura 3B). I frammenti sono idealmente ~ 3-7 kb per il protocollo descritto qui. Frammenti di fuori di questo intervallo possono richiedere la modifica delle concentrazioni di agarosio utilizzati e le condizioni di elettroforesi per ottenere una buona separazione. Il DNA è stato elettroforesi nella prima dimensione e visualizzata (Figura 3A). Se il DNA ha digerito completamente, tutte le corsie avranno eseguito in modo uniforme e non ci saràuna quantità elevata di basso peso molecolare (inferiore a circa 3 kb, a seconda dell'enzima di restrizione). DNA presente nel pozzo suggerisce lisi cellulare incompleta e un sacco di DNA ad alto peso molecolare (sopra 10 kb) implica incompleta digestione del DNA.

Il DNA di interesse per ogni corsia è stato asportato. Nella Figura 3A, DNA sopra 5 kb era inclusa. La successiva seconda dimensione del gel è stato elettroforesi, causando una diagonale di DNA lineare (Figura 3C). Il DNA matrice all'interno di questo gel è stato poi visualizzato mediante ibridizzazione Southern (Figura 3D). Nel sbloccato (- campione ara), due punti possono essere visti, corrispondenti ai 5,5 kb e 6,7 kb frammenti della matrice, come previsto. Il campione che aveva replica bloccato (+ ara) ha mostrato una diminuzione nel punto 5.5 kb in confronto e l'aggiunta di un segnale ellittica, che indica un accumulo di DNA a forma di Y nel campione. Il segnale èlocalizzate a una posizione, a significare le forche di replicazione stanno arrestando in un posto simile in tutta la popolazione. In aggiunta anhydrotetracyline, il segnale di DNA a forma di Y non è più visibile. Un riavvio recente è indicato dalla presenza di un segnale dell'intera Y-arco, raffigurante forche migrano attraverso la regione.

È importante normalizzare il DNA all'interno di ciascun tappo agarosio per garantire i segnali dei campioni sono ancora. I segnali possono essere quantificati con adeguato software di imaging. Un altro intermedio comune visto è che l'indicazione di giunzione Holliday (HJ) formazione. Un HJ è visualizzato come un segnale di cono nella parte superiore della Y-dell'arco e un picco dal DNA lineare al termine dell'arco Y (Figura 3D).

figura 2
Figura 2: microscopia a fluorescenza e Viab ility. (A) Un E. coli ceppo trasporta la matrice Teto è stato coltivato a 30 ° C in presenza di 0,1% arabinosio (+ ara) per 1 ora e poi anhydrotetracycline (AT) è stato aggiunto per 10 minuti ad una sottopopolazione di rilasciare il blocco di replica. micrografie Rappresentante sono indicati per la produzione di YFP (pannello superiore). Barra di scala = 2 micron. La percentuale di cellule che portano 1, 2 o più di 2 foci erano indicati e sono presentati come percentuale (pannello inferiore). (B) Le cellule coltivate in assenza di arabinosio (- ara), con arabinosio (+ ARA) e sia con arabinosio e anhydrotetracycline (AT; 10 min) erano di serie diluito 10 volte e sia macchiato o diffondere sul solo agar contenente ampicillina ( - / + campioni ARA) o ampicillina con anhydrotetracycline (+ AT campione) e coltivate a 30 ° C per determinare la vitalità cellulare. Top: piatto rappresentativo che mostra la crescita a diluizioni indicate. In basso: grafico che mostra la media CFU / ml +/- SEM.ww.jove.com/files/ftp_upload/54434/54434fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
. Figura 3: Visualizzazione di replicazione del DNA intermedi in una nucleoproteina blocco (A) DNA genomico da cellule (1, - ara, 2, + ara, 3, + Ara / AT) che sono stati lisati all'interno spine agarosio e digerito con enzima di restrizione EcoRV è stato separato su un gel di agarosio 0,4% (55 V, 16 ore). 3 kb, 5 kb e 10 bande kb sono indicati. Il DNA sopra il marcatore 5 kb è stato asportato come indicato dalle caselle bianche. (B) Schema del EcoRV digest della regione array. forchette replica introdotti nella matrice dall'origine diventano bloccati all'interno del frammento 5.5 kb quando le cellule sono state coltivate in presenza di arabinosio. I siti di restrizione utilizzati sono indicati da frecce e array è mostrato come una scatola con linee. (C) Il DNA asportata è stata ruotata di 90 ° e separato su gel di agarosio allo 0,8% (220 V, 4 ore). La scatola bianca indica l'escissione del DNA dopo la separazione. (D) La regione array è stato seguito evidenziata mediante analisi Southern blot con una sonda radioattiva alla regione matrice. Le cellule con un blocco di replica in questa posizione avrà il segnale corrispondente al frammento 5.5 kb situato sulla Y-arc. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptone Sigma-Aldrich 16922 Growth media component
Sodium Chloride VWR 27810.364 Growth media component
Yeast extract Sigma-Aldrich 92144 Growth media component
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P9791 Growth media component; Potassium buffer component
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich P3786 Growth media component; Potassium buffer component
L-Arabinose Sigma-Aldrich A3256 For induction of TetR-YFP production
Anhydrotetracycline hydrochloride Sigma-Aldrich 37919 Release of replication bloackage
Axioskop 2 Fluorescence microscope Zeiss 452310 Visualization of cells
eYFP filter set Chroma Technology 41028 Visualization of YFP
CCD camera Hamamatsu Orca-AG Visualization of cells
MetaMorph  Software (Molecular Devices) SDR Scientific 31282 Version 7.8.0.0 used in the preparation of this manuscript
Agarose Bioline BIO-41025 For agarose plugs and gel electrophoresis
Original Glass Water Repellent (Rain-X) Autobarn DIO1470 For agarose plug manufacture
TRIS VWR VWRC103157P TE, TBE buffer component
Ethylene diaminetetraacetic acid Ajax Finechem AJA180 0.5 M EDTA disodium salt solution adjusted to pH 8.0 with NaOH.
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002 Bacteriostatic agent
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 258148 TE buffer component
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750 Cell lysis buffer component
N-Lauroylsarcosine sodium salt (Sarkosyl) Sigma-Aldrich L5125 Cell lysis and ESP buffer component
Rnase A Sigma-Aldrich R6513 Cell lysis buffer component
Lysozyme Amresco 6300 Cell lysis buffer component
Proteinase K Amresco AM0706 ESP buffer component
Sub-Cell Model 192 Cell BioRad 1704507 Electrophoresis system
UV transilluminator 2000 BioRad 1708110 Visualization of DNA
Ethidium Bromide BioRad 1610433 Visualization of DNA
Boric acid VWR PROL20185.360 TBE component
Hybond-XL nylon memrbane Amersham RPN203S Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) can also be used
3MM Whatman chromatography paper GE Healthcare Life Sciences 3030690 Southern blotting
HL-2000 Hybrilinker UVP 95-0031-01/02 Crosslinking of DNA and hybridization
Deoxyribonucleic acid from salmon sperm Sigma-Aldrich 31149 Hybridization buffer component
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S5881 Denaturation buffer component
Trisodium citrate dihydrate VWR PROL27833.363 Transfer buffer
Sodium dodecyl sulphate (SDS) Amresco 227 Wash buffer component
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7906 Hybridization buffer component
Random Hexamer Primers Bioline BIO-38028
Klenow fragment New England BioLabs M0212L
dNTP Set Bioline BIO-39025
Adenosine 5’-triphosphate-32P-ATP PerkinElmer BLU502A
Storage Phosphor Screen GE Healthcare Life Sciences GEHE28-9564-76 BAS-IP MS 3543 E multipurpose standard 35 cm x 43 cm screen
Typhoon FLA 7000 GE Healthcare Life Sciences 28-9558-09 Visualization of blot
Hybridization bottle UVP 07-0194-02 35 mm x 300 mm

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Indurre un blocco di replica siti specifici in<i&gt; E. coli</i&gt; Utilizzando un sistema fluorescente Repressor Operator
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Mettrick, K. A., Lawrence, N., Mason, C., Weaver, G. M., Corocher, T. A., Grainge, I. Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System. J. Vis. Exp. (114), e54434, doi:10.3791/54434 (2016).More

Mettrick, K. A., Lawrence, N., Mason, C., Weaver, G. M., Corocher, T. A., Grainge, I. Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System. J. Vis. Exp. (114), e54434, doi:10.3791/54434 (2016).

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