Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Индуцирование сайта Конкретная репликации засорение Published: August 21, 2016 doi: 10.3791/54434
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1School of Environmental and Life Sciences, University of Newcastle

Abstract

Препятствия, присутствующие на ДНК, в том числе плотно связанных белков и различных повреждений, может серьезно тормозят прогрессирование аппарата репликации клетки. Глохнет из replisome может привести к его диссоциации из хромосомы, либо частично или полностью, что приводит к коллапсу репликативной вилки. Восстановление после этого краха является необходимостью для клетки точно полное дублирование хромосомные и впоследствии разделить. Поэтому, когда происходит коллапс, клетка эволюционировала различные механизмы, которые имеют место, чтобы восстановить вилы ДНК и позволяют репликации должна быть завершена с высокой точностью. Ранее эти ремонтные репликации путей у бактерий были изучены с использованием УФ-повреждения, который имеет тот недостаток, что не локализованы в известном месте. Эта рукопись описывает систему с использованием системы флуоресценция репрессора оператора (FROS), чтобы создать сайт-специфический блок белка, который может вызвать пробуксовки и коллапс репликации FoRKS в кишечной палочки. Протоколы подробно рассматривается, как состояние репликации могут быть визуализированы в одиночных живых клетках с помощью флуоресцентной микроскопии и репликации ДНК промежуточных соединений могут быть проанализированы с помощью 2-мерного электрофореза в агарозном геле. Чувствительные к температуре мутанты replisome компонентов (например , DnaBts) могут быть включены в систему , чтобы вызвать синхронное коллапс вилок репликации. Кроме того, роль рекомбинации белков и геликаз, которые участвуют в этих процессах могут быть изучены с использованием генетических нокаутов в рамках этой системы.

Introduction

Во время репликации ДНК, то replisome сталкивается с препятствиями на ДНК, которые нарушают ее прогрессирование. Повреждение ДНК , включая поражений и пробелов, а также аномальным структуры могут помешать replisome от 1 продолжить. В последнее время было обнаружено , что белки , которые связываются с ДНК , являются наиболее распространенным источником препятствий для репликации вилки прогрессии 2. Знание событий после столкновение с replisome с нуклеопротеидной блока ранее было ограничено неспособностью вызвать такой блок в хромосоме живой клетки в известном месте. В пробирке анализ углубили наше понимание кинетического поведения активного replisome , когда он встречает нуклеопротеидную засорение 3, а также механистические детали самого 4,5 replisome. Современное понимание ремонта репликации , как правило , проводится с УФ в качестве повреждающего агента и исследовали с использованием плазмидной ДНК в естественных условиях 6-8 в естественных условиях , как правило , понятны из этих исследований, есть ли различия в молекулярных событий в пределах ремонтных путей вследствие отчетливой причины в блоке репликации до сих пор еще быть определенным.

Здесь мы описываем систему, которая позволяет нуклеопротеид блок, который будет создан в определенном месте хромосомы с использованием системы Fluorescent репрессора оператора (FROS). Мы используем штамм E. палочка, которая была массив 240 сайтов Teto включенных в хромосоме 9. Каждый сайт Teto в массиве имеет 10 п.н. случайную последовательность фланкирующей это повышение устойчивости массива путем предотвращения RecA-опосредованной рекомбинации в пределах массива. Этот массив, и вариации этого, первоначально использовались , чтобы понять , E. динамика 10,11 палочки хромосом , но затем были адаптированы к Превент в естественных условиях репликации 12. Массив было установлено, стабильно поддерживаться и блокировать близка к 100% вилок репликации при связывании тетр 10,12. Использование подобного массива Laco в пробирке нашел всего лишь 22 сайта было достаточно , чтобы блокировать 90% репликации, хотя этот короткий массив был менее эффективен в естественных условиях 13. Для того, чтобы адаптировать массив для создания нуклеопротеидную засорение, белок репрессор должен быть сильно избыточном в оптимальных условиях, где она затем связывается с массива для создания контрольно-пропускной пункт. Формирование закупорки, и его последующее высвобождение, можно контролировать путем использования флуоресцентной микроскопии, если флуоресцентно меченый вариант репрессора Tet используется. Статус репликации в каждой ячейке указывается числом очагов видно, где один координационный центр означает только одна копия массива присутствует в клетке и множественные фокусы свидетельствуют о активной репликации. Это активное повторноепликация включается, когда нуклеопротеид закупорка восстанавливается добавлением безвозмездное индуктора, что уменьшает сродство связывания тетр для сайта оператора достаточно для replisome пройти через массив. Белок-репрессор по-прежнему способен связываться с ДНК с достаточно высоким сродством, которые могут быть визуализированы в настоящее множественные копии массива.

Более сложные детали событий на нуклеопротеидной закупорки могут быть обнаружены с помощью нейтрально-нейтрального двумерную электрофореза в агарозном геле и гибридизацию 14-16. Эти методы позволяют анализировать структуры ДНК по всей популяции. Промежуточные репликации, которые образуются в ходе мероприятия, и потенциально остаются неотремонтированный, могут быть визуализированы. Изменяя фермента рестрикции и зонд разведения, промежуточные продукты могут быть визуализированы не только в области массива , но и выше по потоку от массива , когда вилка репликации регрессирует 17,18.регрессия происходит вслед за replisome диссоциации; ведущие и отстающие зарождающиеся нити отдельно от нитей шаблонов и отжигу друг с другом в виде нитей шаблона по совместительству повторной отжигу, что приводит к структуре ДНК четырех направлениях (а Holliday соединения).

С помощью этой системы было показано , что вилка репликации не является стабильным , когда он сталкивается с этим блок 18. Кроме того, чувствительные к температуре производные компонентов replisome могут быть использованы для предотвращения перегрузки репликативной вилки, как только она разрушилась. После того, как блок устанавливается, штамм может быть перенесен на непермиссивной температуры, чтобы обеспечить синхронное дезактивацию replisome и контролируемую предотвращение перезарядки. Эта температура индуцированной деактивация обеспечивает все вилами в популяции рухнули в данный момент времени и позволяет оценить то, что происходит, когда replisome рушится, как обрабатывается ДНК, и что требуется повторноначать процесс репликации ДНК.

Преимущество системы, описанной здесь, является то, что блок нуклеопротеид полностью обратимо; Таким образом, способность клеток восстанавливать из блока нуклеопротеидной способен следовать. Добавление anhydrotetracycline к клеткам разгрузит прочное связывание репрессора, что позволяет развилка репликации и пройти через клетку, чтобы восстановить жизнеспособность. Рельеф закупорки может быть визуализированы с помощью нейтрально-нейтрального двумерного электрофореза в агарозном геле после 5 мин, и с помощью микроскопии в течение 10 мин. Кроме того, анализ жизнеспособности может выявить способность штамма восстановиться после закупорки репликации и продолжают размножаться.

Путем изменения генетического фона штаммов, используемых в экспериментальной методике, описанной здесь, ремонт пути для этого типа закупорки может быть выяснена.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Блокирование репликации с FROS

  1. Индуцируя репликации закупорки
    1. Разведите свежий ночной культуры в Е. штамм E.coli , несущий массив Teto и pKM1 от 18 до OD 600 нм = 0,01 в разбавленном комплексной среде (0,1% триптона, 0,05% дрожжевого экстракта, 0,1% NaCl, 0,17 М KH 2 PO 4, 0,72 MK 2 HPO 4) с антибиотиками в соответствии с требованиями для выбора.
      Примечание: Не добавляйте тетрациклин для выбора, как он не совместим с этой системой. Сделать объем культуры, эквивалентной 10 мл на образце требуется. Например, объем культуры для эксперимента на рисунке 1, 60 мл.
    2. Grow при температуре 30 ° C при встряхивании до OD 600 нм = 0,05-0,1. Удалить образец 10 мл, чтобы служить в качестве неиндуцированном управления, и добавьте 0,1% арабинозы к оставшейся культуре, чтобы индуцировать образование TetR-YFP от pKM1. Продолжайте расти как неиндуцированном и индуцированныекультуры. Через 1 ч проверяют наличие единого координационного центра в каждой клетке индуцированной культуры с помощью флуоресцентной микроскопии (см раздел 2).
    3. Если индуцированные клетки подтвердятся заблокированы (более 70% клеток имеют один фокус), запись OD 600нм и взять 7,5 мл образца для анализа с помощью 2-D гелей (смотри раздел 3). Возьмем эквивалентную выборку из неиндуцированном контрольной культуры.
  2. Высвобождение репликации закупорки
    1. Чтобы освободить блок репликации, добавьте 100 нг мл -1 безвозмездным индуктором anhydrotetracycline (AT) к 10 мл образца блокированных клеток. Продолжать расти при 30 ° С в течение 10 мин и берут образцы для плотности клеток (1 мл), микроскопический анализ (10 мкл) и нейтрально-нейтральных 2-мерных гелей агарозы (7,5 мл).
  3. Наводить Крах Replisome
    1. Если клетки содержат чувствительный к температуре аллель , такие как dnaB TS или dnaC TS , которая требует deactivaции, перемещать колбу, содержащую блокированные клетки до 42 ° С. Отбирают образцы для анализа в моменты времени , необходимых (например, 1 час после инкубации). После того , как клетки инкубировали при 42 ° С в течение 1 ч, смещения клеток до 30 ° С в течение 10 мин (см рисунок 1).
      Примечание: Клетки могут быть сдвинуты на 30 ° C для анализа повторного запуска.

Рисунок 1
Рисунок 1:. Обзор FROS репликации Блок и выпуска экспериментальной процедуры Е. палочки штаммов , несущих массив Teto выращивают при 30 ° С. Когда клетки достигают OD 600 нм из выше 0,05, производство TetR-YFP индуцируют арабинозы (АРА; 0,1%). Продолжать расти субпопуляции клеток неиндуцированных действовать в качестве контрольных при 30 ° C. Образец индуцированных клеток анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии через 1 - 2 ч (см 2.1). Если репликацияподтвердил быть заблокированы, отбирают образцы для анализа 2-D гель, обозначенном пробирках (см 3.1) и жизнеспособность испытаний (по желанию). Закупорка репликации можно удалить с помощью anhydrotetracycline (AT; 0,1 мкг / мл) и клетки анализировали через 10 мин. Если клетки несут чувствительный к температуре аллель (например , dnaB Т.С.), это может быть инактивирован путем сдвига блокированных клеток до 42 ° C для соответствующего анализа. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

2. флуоресцентной микроскопией

  1. Подготовить агарозном площадку с помощью пипетки 500 мкл расплавленной агарозы (1% в воде) на предметное стекло микроскопа; наложение покровное непосредственно перед агарозном затвердевает. Храните слайд (ы) во влажных тканях при 4 ° С до тех пор, пока это необходимо.
  2. Когда агароза затвердеет, удалить покровное из агарозного площадки и пипеткой 10 мкл бактериальнойкультуры на центр площадки для предотвращения перемещения клеток во время визуализации. После того, как образец сушат (примерно 5 мин), замените покровное. Поместите каплю иммерсионного масла на покровным и поместите слайд под оптикой.
  3. Визуализация клеток с использованием фазовой микроскопии при 100х.
    1. В диалоговом окне Приобретать в программном обеспечении формирования изображения, установить время экспозиции до 100 мс. Захват изображения, выбрав Acquire. Не перемещайте стадию. В диалоговом окне Acquire, выберите YFP ​​в качестве подсветки для внешнего затвора Связанный с камерой. Установите время exporsure до 1000 мс. Выключите свет этапа. Захват флуоресценции изображение путем выбора Acquire.
      Примечание: Время может варьироваться в зависимости от источника света, микроскопа и фотокамеры.
    2. Наложение фазы и флуоресцентные изображения, выберите цвет зерноуборочный из меню Display. В диалоговом окне Color зерноуборочный, выберите изображение YFP ​​в качестве зеленого компонента и фазы изображения в качестве блуе компонент. Нажмите на цвет комбайна. Определить, является ли население было репликации успешно блокирована путем установления того, большинство клеток имеют один фокус на клетку.
      Примечание: Сравнение с образцом от контроля без добавления арабинозы полезно визуально определить разницу в производстве EYFP.

3. ДНК-экстракции / агарозы Заглушки

  1. Добавить азид натрия (конечная концентрация 0,1%) в 7,5 мл Образцы культур из этапов 1.1.3 и 1.2.1. Инкубируют на льду в течение не менее 5 мин.
    Примечание: азид натрия является чрезвычайно токсичным. Обратитесь к паспорту безопасности перед началом работ и не справиться с этим, пока все меры безопасности не были прочитаны и поняты.
  2. Центрифуга ячеек 5000 мкг в течение 10 мин для осаждения клеток. Жидкость над осадком сливают и вновь суспендируют таблетку в 200 мкл Петт IV (PIV) буфере (10 мМ Трис HCl (рН 8,0), 1 М NaCl). Микроцентрифуга (13, 000 мкг в течение 2 мин), чтобы осадить клетки. диSCard супернатант. На этом этапе процесса гранулы далее или хранить при температуре -20 ° C.
  3. Ресуспендируют клеток с низкой плотностью клеток в 50 мкл PIV и место при 50 ° С. Для всех остальных образцов, регулировать объемы PIV поэтому конечная плотность клеток одинакова в каждой трубке (например , образец 1 (OD 600нм = 0,128) ресуспендировали в 50 мкл; Образец 2 (OD 600нм = 0,138) ресуспендировали в 54 мкл).
    1. Добавить равный объем свежеприготовленного 0,8% -ного раствора агарозы в PIV (конечная концентрация 0,4%;. , Например , образец 1 50 мкл, образца 2 54 мкл). Убедитесь, что образцы, агарозы и PIV выше 50 ° C, чтобы предотвратить затвердевание.
  4. Рассматривать стекло микроскопа с 40 мкл соответствующего стекла водоотталкивающий или силиконовым раствором. Натрите слайд с тканью, пока она не высохнет.
    Примечание: Это может быть сделано заблаговременно, и обработанные слайды хранили длительный срок при комнатной температуре.
  5. Поместите 20 мкл капли тон сота / агарозы суспензию на слайде для производства пробки, которые являются полусферической.
    Примечание: Первый образец (ресуспендировали в 50 мкл PIV) будет производить 5 пробки на одном слайде.
  6. Когда пробки были затвердевает, скользят их осторожно в микроцентрифуге пробирку и добавляют 1 мл буфера для лизиса клеток (10 мМ Трис-HCl [pH 8], 1 М NaCl, 100 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 0,2% дезоксихолат натрия, 0,5% N-лауройлсарконине натриевая соль (саркозила), 100 мкг мл - 1 лизоцима, 50 мкг мл - 1 РНКазы А). Инкубируют при 37 ° С в течение 2 часов.
  7. Удалить буфер для лизиса клеток и добавить саркозил / протеиназы K (ESP) раствор 1 мл ЭДТА / (0,5 М ЭДТА, 1% N-лауройлсарконине натриевая соль (саркозила), 1 мг мл - 1 протеиназы K). Инкубировать при 50 ° С в течение ночи или до пробки являются прозрачными. Если требуется второй инкубации в течение ночи, замените раствор ESP с помощью свежего буфера после приблизительно 18 часов.
  8. УдалитьESP буфер и промыть Заглушки 5 раз с помощью 12 мл Трис-ЭДТА (ТЕ) буфера (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0), что позволяет 30 мин уравновешивания с каждой промывке. Хранить при температуре 4 ° С в 1 мл ТЕ-буфера.

4. Нейтральный нейтральный 2-Dimensional гель электрофорез

  1. Передача агарозы вилку из шага 3.8 в свежую пробирку и микроцентрифуге добавляют 150 мкл рестриктазы буфера (1x концентрации). Добавить 25-100 единиц фермента рестрикции (например, 60 единиц EcoRV (смотри рисунок 3A)). Дайджест при 37 ° С в течение 6-8 ч.
  2. При температуре 4 ° С, заливают 0,4% агарозном геле (300 мл) в 1X Трис / борат / ЭДТА (КЭ) в гель лоток примерно 25 х 25 см. Вставьте расческу, чтобы сделать лунки приблизительно такой же ширины, как и диаметр плунжера. Когда гель установлен, удалите гребень и переместить гель до комнатной температуры.
  3. Вставьте один из переваренной агарозных пробок в скважину, позиционирование плоский слайд штекера против стороны скважины, где тон ДНК будет проникать в гель. Вставить одну пробку таким же образом, в каждый второй скважины.
  4. Пипетировать расплавленной 0,4% агарозы в лунки для уплотнения пробки в заданном положении.
  5. Нагрузка 1 кб ДНК лестницы в пустой колодец, снова оставляя зазор между лестницей и образцов, и запустить гель в течение ночи (16 ч, 55 V) в 1x КЭ при комнатной температуре.
  6. Пятно гель в водяной бане , содержащей бромид этидия (0,3 мкг мл - 1) в течение 20 мин.
    Примечание: этидий бромид считается мощным мутагенным и токсин. Обратитесь к паспорту безопасности перед началом работ и не справиться с этим, пока все меры безопасности не были прочитаны и поняты.
  7. Визуализируйте ДНК, с помощью УФ-просвечивания длинноволновой и вырезать каждый фрагмент полосы движения с прямой, даже вырезать, сводя к минимуму включение избыточного агарозы по обе стороны от полосы.
    Примечание: Например, если фрагмент интереса 5,5 т.п.н., вырезать фрагмент длиной 7,5 см, чтобы включать ДНК-фрагментов от 5 кб в approximatEly 12 кб (смотри рисунок 3А).
  8. Поместите вырезанную полосу геля в лотке геля под углом 90 ° по отношению к направлению миграции ДНК.
    Примечание: Два ряда 3 фрагментов геля может поместиться в лотке геля 25 х 25 см 2. Первый ряд гелевых полос находится в верхней части лотка, второй ряд на 12,5 см.
  9. Подготовьте 300 мл агарозы для второго измерения геля (0,9% в 1x КЭ с 0,3 мкг мл -1 этидий бромид). Когда агарозы охлаждают до 50 ° С, пипеткой расплавленной агарозы вокруг ломтиков геля, чтобы укрепить свою позицию. Налить оставшиеся агарозы в лоток на глубину, которая по меньшей мере на одном уровне с кусочками геля.
  10. После того , как гель затвердевает, electrophorese при 4 ° С в 1X TBE , содержащего 0,3 мкг мл -1 этидийбромид при 220 В до тех пор , пока ДНК мигрировал приблизительно 10 см.
    Примечание: 4 ч достаточно для фрагмента 5,5 кб, но меньший фрагмент потребуется меньше времени.
  11. Иссечь блоки, где геномная ДНК присутствует Uпеть край металлической линейки, в том числе гель над ним , чтобы включать ДНК, которая не видна (рис 3C).

5. Южная Гибридизация

  1. Приготовление раствора
    1. Подготовьте депуринизации буфер (0,125 М раствора HCl).
      Примечание: Этот буфер может быть использован повторно и стабилен при комнатной температуре в течение до 1 месяца.
    2. Подготовка денатурации буфера (1,5 М NaCl, 0,5 М NaOH).
      Примечание: Денатурация буфер может быть использован повторно один раз и стабилен в течение до 3-х месяцев при комнатной температуре.
    3. Подготовка нейтрализационного буфера (1,5 М NaCl, 0,5 М Трис). Доведения рН до 7,5 с помощью HCl.
      Примечание: Нейтрализация буфер может быть использован повторно один раз и стабилен в течение до 3-х месяцев при комнатной температуре.
    4. Приготовьте 10x Солевой цитрата натрия (SSC) буфере (0,15 М цитрат Tri-натрия, 1,5 М NaCl, рН 7 - 8) для использования на этапах 5.2.4 и 5.2.6. Из этого буфера, сделайте 2 x SSC запас (для использования на этапе 5.2.9).
      Примечание: 10x SSC и 2x SSCповторно стабилен при комнатной температуре в течение 3-х месяцев.
    5. Готовят Modified Church и Gilbert буфера гибридизации 19 (0,5 М фосфатном буфере [рН 7,2], 7% (вес / объем) додецилсульфата натрия (SDS), 10 мМ ЭДТА). Оставьте при температуре 65 ° C, чтобы растворить тщательно перед использованием.
  2. Перевод
    1. Промыть Иссеченную гель блоков в депуринизации растворе в течение 10 мин при комнатной температуре на качалке или орбитальном шейкере. Держите скорость перемешивания низкой, чтобы избежать повреждения агарозном блоков.
    2. Промыть гелевые блоки кратко дистиллированной водой, а затем с буфером денатурации в течение 30 мин. Промыть еще раз на короткое время в дистиллированной воде, а затем инкубировать гель блоков в нейтрализации буфера в течение 30 мин при осторожном перемешивании при комнатной температуре.
    3. Обрежьте нейлоновую мембрану к точному размеру геля (ов). Вырезать ник в правом верхнем углу, чтобы помочь в ориентировании мембрану в будущих шагов.
      Примечание: Два гелевых блоков (6 образцов) могут быть визуализированы на одной мембране.
    4. Налейте достаточно 10x SSC в трау, так что она не будет высыхать на ночь. Создание платформы примерно 5 см над уровнем буфера. Пропитайте 3 листов хроматографической бумаги 3MM с 10х SSC и место на платформе. Обрежьте бумагу для хроматографии таким образом, чтобы она достаточно долго, чтобы быть погружен в буфер на обоих концах, и достаточно широкий, чтобы соответствовать гель мембраны на.
    5. Поместите гель (ы) на верхней части насыщенной бумажной хроматографии. Рама гель с полиэтиленовой пленкой, чтобы предотвратить буфер минуя гель во время передачи данных. Осторожно уложить отрезанный мембрану поверх геля (ов). Удаления пузырьков воздуха между мембраной и гель прокаткой бутылку или серологического пипетку осторожно через мембрану.
    6. Вырезать три листа хроматографической бумаги 3 мм до того же размера, что и мембраны. Насытить хроматографии бумажные листы с 10x SSC и размещать на верхней стороне мембраны. Удалите любые воздушные пузырьки, которые сформировались.
    7. Стек бумажные полотенца не менее 5 см на верхней части промокательной бумаги с последующей твердой подложкой (соответствуюximate вес 1 кг для 23 х 16 см мембрану). Разрешить перенос действовать в течение ночи.
    8. Проэкспонируйте мембраны (ДНК стороной вверх) до 1200 Дж / ​​м 2 , УФ сшивать ДНК на мембране. Не смывать до этого шага.
    9. Промойте мембрану тщательно в 2х SSC, чтобы предотвратить высокий фон на Блот изображений. Используйте блот сразу для гибридизации (см 5.3) или высушить при комнатной температуре, завернуть в полиэтиленовую пленку и хранить при температуре 4 ° С.
  3. гибридизация
    1. Предварительно подогревают гибридизация печь и бутылки до 55 ° С.
    2. Добавить 100 мкг мл -1 бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 10 мкг мл -1 неспецифическую ДНК (например , ДНК спермы лосося) на предварительно нагретый буфере для гибридизации.
    3. Для того, чтобы обеспечить равномерное покрытие буфера гибридизации, когда мембрана свернут, поместите блот на аналогичных размеров квадрат нейлоновой сетки с ДНК-связанной стороне мембраны, обращенной вверх. Ролл-блот вдоль его длинного края. Горкаблот / сетка внутри бутылки гибридизация. Добавьте соответствующее количество буфера предварительно нагретой гибридизации раскатать блот (например , 30 мл для 23 х 16 см 2 мембраны).
    4. Выдержите в предварительно нагретую печь, вращая бутылки, в течение 1 часа.
    5. Подготовка зонда путем смешивания 50 нг очищенного гомологичной ПЦР - продукта в области , представляющей интерес, 150 нг случайных гексамере праймеров, буфер для фрагмента Кленова и H 2 O , чтобы сделать объем 13 мкл. Кипение в течение 3 минут, затем поместить сразу на лед. Добавляют 1 мкл 1 мМ дЦТФ / дГТФ / дТТФ смеси 1 мкл фрагмента Кленова (5U) и 50 мкКи дезоксиаденозина 5'-трифосфата , меченый на альфа - фосфатным (α 32 P-дАТФ).
    6. Инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа. Добавляют 1 мкл 1 мМ дНТФ смешать и 1 мкл фрагмента Кленова. Инкубировать 20 мин при комнатной температуре.
    7. Кипение в зонд в течение 5 мин и добавляют непосредственно к гибридизации труб. Гибридизуются в течение ночи при 55 ° С, при вращении.
    8. Слейте прОБЕ из мембраны.
      Примечание: Зонд может быть повторно использован один раз.
    9. Промыть мембрану на короткое время в подогретого, низкая жесткость промывочного буфера (2 × SSC, 0,1% (вес / об) ДСН). Добавить свежий низкой жесткости промывочного буфера и инкубируют в течение 5 мин при 55 ° С с вращением. Повторение.
    10. Промыть два раза в средней жесткости промывочного буфера (1x SSC, 0,1% (вес / объем) SDS) в течение 10 мин при 55 ° С с вращением.
    11. Промыть два раза в высокой жесткости буфера для промывки (0.1x SSC, 0,1% (вес / объем) SDS) в течение 5 мин при 55 ° С с вращением.
    12. Удалите мембрану и мазок с тканью для удаления избытка жидкости. Заверните в полиэтиленовую пленку, обеспечивая там не осталось влаги на полиэтиленовую пленку и поместите в экспозиции кассету с предварительно гасится экран хранения люминофора. Закройте кассету и выставить в течение по крайней мере 2 ч перед визуализации с использованием люминофора томографа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

FROS является индуцибельной, сайт-специфический нуклеопротеид блок , который позволяет промежуточные продукты репликации для визуализации в живых клетках 12,18. Общий план эксперимента для отбора клеток показана на рисунке 1. Сроки отбора проб и вариаций генетического фона делают это универсальная система для изучения ремонта такого блока. Схематически показано , как чувствительных к температуре мутанты, такие как dnaB TS и dnaC TS , которые были использованы ранее 18, могут быть использованы в этой системе.

Индукция FROS проводилась в Е. штамм E.coli , как показано на рисунке 1 для чувствительных штаммов без температуры. Для того, чтобы подтвердить, что нуклеопротеид блок был создан, клетки были визуализированы с помощью флуоресцентной микроскопии после 1 часа роста в 0,1% арабинозы. Этавременные рамки, как правило, достаточно, чтобы произвести блок в штамма дикого типа, но более требовательные штаммы могут потребовать оптимизации. Большинство клеток содержит 1 фокус (рис 2А, + АРА), что соответствует только одна копия массива внутри клетки , таким образом , указывает на репликацию была заблокирована. Число клеток с 1 фокусом, 2 фокусами или более 2 фокусов подсчитывались в популяции более чем 100 клеток. было обнаружено 92% клеток имеют 1 фокус с оставшимися 8% с 2-мя фокусами. Предполагалось, что клетки, которые имели два фокуса на расстоянии друг от друга хорошо, представляя две копии массива, будет иметь следующий раунд репликации заблокирован. Клетки с двумя фокусами близко друг к другу означает, что массив недавно был воспроизведен и блок нуклеопротеид еще не достигнута.

Блок нуклеопротеид было отменено добавлением anhydrotetracycline (AT) и последующего дублирования массива визуализируется какнакопление клеток с множественными очагами (рис 2А, + ARA / AT). Множественные очаги в пределах соты визуализировали с помощью флуоресценции микрокопия означают массив был успешно реплицировать и достаточно времени прошло, чтобы позволить локусы раздвигаться, преодолевая любую сестра хромосом сплоченности, которая присутствовала. В этом случае, через 10 минут после добавления AT, 94% клеток имели 2 или более фокусами и до 8 фокусы на клетку визуализировались.

Для того, чтобы гарантировать , что блок нуклеопротеид действительно ингибируют репликацию, жизнеспособность клеток была проанализирована (Фигура 2В). Клетки, которые имели репликацию ингибируется FROS показывают уменьшение приблизительно в 1000 раз в колониеобразующих единиц по сравнению с клетками, которые не были выращены в присутствии арабинозы. Клетки, которые были затем выращивали в присутствии anhydrotetracycline шоу разворота этого ингибирования роста. Если клетки не могли восстановить ДНК после освобождениянуклеопротеида закупорки, снижение жизнеспособности привело бы.

Для визуализации промежуточных продуктов репликации, клетки могут быть лизированы в агарозных пробок и белка и РНК удалены. ДНК может быть затем расщепляли с помощью соответствующего фермента рестрикции для интересующей области. ДНК изображенный на фигуре 3А, переваривают EcoRV , который разрезает ДНК непосредственно перед массивом, в пределах массива и после того, как массив, получали 5,5 т.п.н. и 6,7 т.п.н. фрагменты в интересующей области (фиг.3В). Фрагменты идеально ~ 3-7 т.п.н. для протокола, описанного здесь. Фрагменты вне этого диапазона может потребоваться изменение концентрации агарозы и используемых условий электрофореза для достижения хорошего разделения. ДНК подвергали электрофорезу в первом измерении и визуализируется (рис 3А). Если ДНК переваривается полностью, все полосы будут работать равномерно и будетвысокое количество с низкой молекулярной массой (приблизительно менее 3 т.п.н., в зависимости от фермента рестрикции). ДНК присутствует в скважине предполагает неполную лизис клеток и много высокой молекулярной массы ДНК (выше 10 кб) означает неполное переваривание ДНК.

Интерес ДНК в каждой полосе, был вырезан. На фигуре 3А, была включена ДНК выше 5 кб. Последующее второе измерение геля подвергали электрофорезу, в результате чего диагональ линейной ДНК (рис 3C). ДНК массив в пределах этого гель затем визуализировали с помощью Саузерн - гибридизации (рис 3D). В Незаблокированное (- Ara образец), два пятна можно увидеть, что соответствует 5,5 т.п.н. и 6,7 т.п.н. фрагментами массива, как и следовало ожидать. Образец, который был заблокирован репликации (+ ара) показал снижение на 5,5 кб месте по сравнению и добавление эллиптическую сигнала, что указывает на накопление Y-образной формы ДНК в образце. Сигналлокализованы в одном положении, означающий вилки репликации арестовывают в подобном месте на протяжении всего населения. При добавлении anhydrotetracyline, Y-образный сигнал ДНК больше не может быть видно. Недавний перезапуск обозначается наличие сигнала всей Y-дуге, изображающий вилы, мигрирующие через область.

Важно, чтобы нормализовать ДНК внутри каждой агарозном пробки, чтобы гарантировать, что все сигналы образцов даже. Сигналы могут быть определены количественно с помощью соответствующего программного обеспечения визуализации. Другой общий промежуточный видно, что указывает на Холлидей перехода (HJ) образование. HJ визуализируется как сигнал конуса в верхней части Y-дуговой и шипом от линейной ДНК в конце Y дуги (рис 3D).

фигура 2
Рисунок 2: флуоресцентной микроскопией и Viab ility. (А) Е. штамм E.coli , несущий массив Teto выращивали при 30 ° С в присутствии 0,1% арабинозы (+ ARA) в течение 1 ч , а затем anhydrotetracycline (АТ) добавляли в течение 10 мин к субпопуляции , чтобы освободить блок репликации. Представитель микрофотографии показаны для производства YFP (верхняя панель). Шкала бар = 2 мкм. Доля клеток, несущих 1, 2 или более 2 фокусы были перечислены и представлены в процентах (нижняя панель). (В) Клетки , выращенные в отсутствие арабинозы (- АРА), с арабинозы (+ ARA) и с обоими арабинозы и anhydrotetracycline (AT; 10 мин) серийный разбавляли в 10 раз , и либо пятнистая или распространяться на исключительно агар , содержащий ампициллин ( - / + образцы ARA) или ампициллин с anhydrotetracycline (+ AT образца) и выращивали при 30 ° с для определения жизнеспособности клеток. Top: представитель пластины, показывающий рост в указанных разведений. Внизу: график, показывающий средние КОЕ / мл +/- SEM.ww.jove.com/files/ftp_upload/54434/54434fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
. Рисунок 3: Визуализация ДНК полупродуктов репликации на нуклеопротеидную блоке (А) геномную ДНК из клеток (1, - ара; 2, + ара; 3, + ара / AT) , которые были лизированы в агарозном пробками и переваривают рестрикции EcoRV фермента разделяли на 0,4% агарозном геле (55 в, 16 ч). 3 кб, 5 кб и 10 кб полосы обозначены. ДНК выше 5 т.п.н. маркер был вырезан, как указано белых боксах. (В) Схема EcoRV дайджестом области массива. Репликация вилки, входящие в массив из начала координат запирание в пределах фрагмента 5,5 кб, когда клетки были выращены в присутствии арабинозы. Сайты рестрикции используются обозначены стрелками и аглуч показан в виде рамки с линиями. (C) вырезают ДНК повернутый на 90 ° , и разделяют в 0,8% -ном агарозном геле (220 В, 4 ч). Белый квадрат показывает, вырезание ДНК после разделения. (D) область массив впоследствии визуализированы с помощью Саузерн - блот - анализа с использованием радиоактивного зонда в области массива. Клетки с блоком репликации в этом положении будет иметь сигнал , соответствующий фрагмент 5,5 кб , расположенный на Y-дуге. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptone Sigma-Aldrich 16922 Growth media component
Sodium Chloride VWR 27810.364 Growth media component
Yeast extract Sigma-Aldrich 92144 Growth media component
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P9791 Growth media component; Potassium buffer component
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich P3786 Growth media component; Potassium buffer component
L-Arabinose Sigma-Aldrich A3256 For induction of TetR-YFP production
Anhydrotetracycline hydrochloride Sigma-Aldrich 37919 Release of replication bloackage
Axioskop 2 Fluorescence microscope Zeiss 452310 Visualization of cells
eYFP filter set Chroma Technology 41028 Visualization of YFP
CCD camera Hamamatsu Orca-AG Visualization of cells
MetaMorph  Software (Molecular Devices) SDR Scientific 31282 Version 7.8.0.0 used in the preparation of this manuscript
Agarose Bioline BIO-41025 For agarose plugs and gel electrophoresis
Original Glass Water Repellent (Rain-X) Autobarn DIO1470 For agarose plug manufacture
TRIS VWR VWRC103157P TE, TBE buffer component
Ethylene diaminetetraacetic acid Ajax Finechem AJA180 0.5 M EDTA disodium salt solution adjusted to pH 8.0 with NaOH.
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002 Bacteriostatic agent
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 258148 TE buffer component
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750 Cell lysis buffer component
N-Lauroylsarcosine sodium salt (Sarkosyl) Sigma-Aldrich L5125 Cell lysis and ESP buffer component
Rnase A Sigma-Aldrich R6513 Cell lysis buffer component
Lysozyme Amresco 6300 Cell lysis buffer component
Proteinase K Amresco AM0706 ESP buffer component
Sub-Cell Model 192 Cell BioRad 1704507 Electrophoresis system
UV transilluminator 2000 BioRad 1708110 Visualization of DNA
Ethidium Bromide BioRad 1610433 Visualization of DNA
Boric acid VWR PROL20185.360 TBE component
Hybond-XL nylon memrbane Amersham RPN203S Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) can also be used
3MM Whatman chromatography paper GE Healthcare Life Sciences 3030690 Southern blotting
HL-2000 Hybrilinker UVP 95-0031-01/02 Crosslinking of DNA and hybridization
Deoxyribonucleic acid from salmon sperm Sigma-Aldrich 31149 Hybridization buffer component
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S5881 Denaturation buffer component
Trisodium citrate dihydrate VWR PROL27833.363 Transfer buffer
Sodium dodecyl sulphate (SDS) Amresco 227 Wash buffer component
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7906 Hybridization buffer component
Random Hexamer Primers Bioline BIO-38028
Klenow fragment New England BioLabs M0212L
dNTP Set Bioline BIO-39025
Adenosine 5’-triphosphate-32P-ATP PerkinElmer BLU502A
Storage Phosphor Screen GE Healthcare Life Sciences GEHE28-9564-76 BAS-IP MS 3543 E multipurpose standard 35 cm x 43 cm screen
Typhoon FLA 7000 GE Healthcare Life Sciences 28-9558-09 Visualization of blot
Hybridization bottle UVP 07-0194-02 35 mm x 300 mm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mirkin, E. V., Mirkin, S. M. Replication fork stalling at natural impediments. Microbiol Mol Biol Rev. 71 (1), 13-35 (2007).
  2. Gupta, M. K., et al. Protein-DNA complexes are the primary sources of replication fork pausing in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (18), 7252-7257 (2013).
  3. McGlynn, P., Guy, C. P. Replication forks blocked by protein-DNA complexes have limited stability in vitro. J Mol Biol. 381 (2), 249-255 (2008).
  4. Tanner, N. A., et al. Single-molecule studies of fork dynamics in Escherichia coli DNA replication. Nat Struct Mol Biol. 15 (2), 170-176 (2008).
  5. Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis. Nature. 457 (7227), 336-339 (2009).
  6. Rudolph, C. J., Upton, A. L., Lloyd, R. G. Replication fork stalling and cell cycle arrest in UV-irradiated Escherichia coli. Genes Dev. 21 (6), 668-681 (2007).
  7. Jeiranian, H. A., Courcelle, C. T., Courcelle, J. Inefficient replication reduces RecA-mediated repair of UV-damaged plasmids introduced into competent Escherichia coli. Plasmid. 68 (2), 113-124 (2012).
  8. Le Masson, M., Baharoglu, Z., Michel, B. ruvA and ruvB mutants specifically impaired for replication fork reversal. Mol Microbiol. 70 (2), 537-548 (2008).
  9. Wang, X., Liu, X., Possoz, C., Sherratt, D. J. The two Escherichia coli chromosome arms locate to separate cell halves. Genes Dev. 20 (13), 1727-1731 (2006).
  10. Lau, I. F., et al. Spatial and temporal organization of replicating Escherichia coli chromosomes. Mol Microbiol. 49 (3), 731-743 (2003).
  11. Gordon, G. S., et al. Chromosome and low copy plasmid segregation in E. coli: visual evidence for distinct mechanisms. Cell. 90 (6), 1113-1121 (1997).
  12. Possoz, C., Filipe, S. R., Grainge, I., Sherratt, D. J. Tracking of controlled Escherichia coli replication fork stalling and restart at repressor-bound DNA in vivo. EMBO J. 25 (11), 2596-2604 (2006).
  13. Payne, B. T., et al. Replication fork blockage by transcription factor-DNA complexes in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 34 (18), 5194-5202 (2006).
  14. Brewer, B. J., Fangman, W. L. The localization of replication origins on ARS plasmids in S. cerevisiae. Cell. 51 (3), 463-471 (1987).
  15. Jeiranian, H. A., Schalow, B. J., Courcelle, J. Visualization of UV-induced replication intermediates in E. coli using two-dimensional agarose-gel analysis. J Vis Exp. (46), (2010).
  16. Southern, E. M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Biol. 98 (3), 503-517 (1975).
  17. Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. DNA damage-induced replication fork regression and processing in Escherichia coli. Science. 299 (5609), 1064-1067 (2003).
  18. Mettrick, K. A., Grainge, I. Stability of blocked replication forks in vivo. Nucleic Acids Res. , (2015).
  19. Church, G. M., Gilbert, W. Genomic sequencing. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (7), 1991-1995 (1984).
  20. Michel, B., Grompone, G., Flores, M. J., Bidnenko, V. Multiple pathways process stalled replication forks. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12783-12788 (2004).
  21. Michel, B., Boubakri, H., Baharoglu, Z., LeMasson, M., Lestini, R. Recombination proteins and rescue of arrested replication forks. DNA Repair (Amst). 6 (7), 967-980 (2007).
  22. Carl, P. L. Escherichia coli mutants with temperature-sensitive synthesis of DNA. Mol Gen Genet. 109 (2), 107-122 (1970).
  23. Nawotka, K. A., Huberman, J. A. Two-dimensional gel electrophoretic method for mapping DNA replicons. Mol Cell Biol. 8 (4), 1408-1413 (1988).
  24. Cole, R. S., Levitan, D., Sinden, R. R. Removal of psoralen interstrand cross-links from DNA of Escherichia coli: mechanism and genetic control. J Mol Biol. 103 (1), 39-59 (1976).

Tags

Клеточная биология выпуск 114 репликация ДНК восстановление ДНК FROS 2-Dimensional агарозном геле промежуточные продукты репликации нуклеопротеид блок реверс вилки репликации
Индуцирование сайта Конкретная репликации засорение<i&gt; E. палочки</i&gt; Использование системы Люминесцентные репрессора оператора
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mettrick, K. A., Lawrence, N.,… More

Mettrick, K. A., Lawrence, N., Mason, C., Weaver, G. M., Corocher, T. A., Grainge, I. Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System. J. Vis. Exp. (114), e54434, doi:10.3791/54434 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter