Abstract
Hinder som förekommer på DNA, inklusive tätt bundna proteiner och olika skador, kan allvarligt hämma utvecklingen av cellens replikering maskiner. Stall av en replisome kan leda till dess dissociation från kromosomen, eller delvis sin helhet, vilket leder till en kollaps av replikationsgaffeln. Återhämtningen från denna kollaps är en nödvändighet för cellen att exakt fullständig kromosomdubbelarbete och därefter dela. Därför, när kollapsen inträffar har cellen utvecklats olika mekanismer som äger rum för att återställa DNA gaffel och tillåta replikering kompletteras med high fidelity. Tidigare har dessa replikeringsreparationsvägar i bakterier studerats med användning av UV-skada, vilket har nackdelen av att inte vara lokaliserad till en känd plats. Detta manuskript beskriver ett system som utnyttjar en Fluorescence repressor Operator System (FROS) för att skapa ett sätesspecifikt proteinblock som kan inducera stall och kollaps av replikering foRKS i Escherichia coli. Protokoll detalj hur status för replikering kan visualiseras i enstaka levande celler med användning av fluorescensmikroskopi och DNA-replikationsmellanprodukter kan analyseras med två-dimensionell elektrofores på agarosgel. Temperaturkänsliga mutanter av replisome komponenter (t.ex. DnaBts) kan införlivas i systemet för att inducera ett synkront kollaps av replikationsgafflar. Dessutom kan roller rekombinationsproteiner och helikaser som är inblandade i dessa processer studeras med hjälp av genetiska knockouts i detta system.
Introduction
Under DNA-replikation, vänd mot replisome hinder på DNA som försämrar dess utveckling. DNA-skador, inklusive skador och brister samt avvikande strukturer kan hindra replisome från att fortsätta en. Nyligen har det visat sig att proteiner bundna till DNA är den vanligaste källan till hinder för replikationsgaffeln progression 2. Kunskapen om händelserna efter mötet i replisome med ett nukleoprotein block har tidigare begränsats av oförmågan att framkalla ett sådant block i kromosomen hos en levande cell på en känd plats. In vitro-analys har ökat vår förståelse av den kinetiska beteende av en aktiv replisome när den möter ett nukleoprotein blockering 3, liksom de mekanistiska detaljerna i replisome sig 4,5. Aktuell kunskap om reparation av replikering är i allmänhet genomförs med UV som skadliga medlet och studeras med hjälp av plasmid-DNA in vivo 6-8 in vivo nukleoprotein blocket i allmänhet förstås från dessa studier, om det finns variationer i de molekylära händelser inom reparationsvägar på grund av den distinkta orsaken i replikeringsblocket fortfarande ännu att vara bestämd.
Här beskriver vi ett system som tillåter ett nukleoprotein block som skall etableras i ett visst läge av kromosomen med hjälp av en fluorescerande repressor Operator System (FROS). Vi använder en stam av E. coli som har haft en rad 240 Teto platser som ingår i kromosom 9. Varje tetO ställe inuti matrisen har en 10 bp slumpmässig sekvens som flankerar den för att öka stabiliteten hos arrayen genom att förhindra RecA-medierad rekombination inom arrayen. Denna grupp, och varianter av det, ursprungligen användas för att förstå E. coli-kromosomen dynamik 10,11 men sedan anpassas till Prevent in vivo replikation 12. Matrisen har visat sig vara stabilt upprätthållas och för att blockera nära 100% av replikationsgafflar när den är bunden av TetR 10,12. Användningen av liknande lacO array in vitro har funnit så få som 22 platser var tillräcklig för att blockera 90% av replikation, även om detta kortare array var mindre effektivt in vivo 13. Att anpassa uppsättningen för att skapa ett nukleoprotein blockering, måste repressor-proteinet i hög grad överproduceras under optimerade betingelser där den sedan binder till matrisen för att skapa en spärr. Bildandet av blockeringen, och dess efterföljande frisättning, kan övervakas genom användning av fluorescensmikroskopi om en fluorescensmärkta variant av Tet-repressor används. Statusen för replikation i varje cell indikeras av antalet foci sett, där en enda kontaktpunkt betyder bara en kopia av uppsättningen är närvarande i cellen och flera härdar indikerar aktiv replikation. Denna aktiva relämpning är aktiverad när nukleoproteinet blockering reverseras genom tillsats av omotiverade inducerare som minskar bindningsaffiniteten hos TetR för operatören platsen tillräckligt för replisome fortgå genom uppsättningen. Repressorproteinet är fortfarande i stånd att binda till DNA med tillräckligt hög affinitet att de nu flera kopior av matrisen kan visualiseras.
Mer intrikata detaljer om händelserna på nukleoprotein blockering kan upptäckas med hjälp av neutral-neutral tvådimensionell agarosgelelektrofores och Southern hybridisering 14-16. Dessa tekniker tillåter analys av DNA-strukturer över befolkningen. Replikerings intermediärer som bildas under evenemanget, och potentiellt förblir oreparerade kan visualiseras. Genom att variera restriktionsenzym och prob utnyttjas, kan mellanprodukterna visualiseras inte bara i arrayen regionen men även uppströms av arrayen när replikationsgaffeln regresses 17,18. Deregression sker efter det att replisome dissociation; de ledande och eftersläpande begynnande strängar separat från mallsträngarna och glödgning till varandra som mallsträngarna samtidigt åter glödga som resulterar i en fyrvägs DNA-strukturen (en Holliday korsning).
Med användning av detta system har det visats att den replikationsgaffeln inte är stabil när den stöter detta block 18. Dessutom kan temperaturkänsliga derivat av replisome komponenter utnyttjas för att förhindra omlastning av replikationsgaffeln när den har kollapsat. När ett block är etablerad, kan den stam förskjutas till en icke-permissiv temperatur för att säkerställa en synkron avaktivering av replisome och en reglerad förebyggande av omlastning. Denna temperatur-inducerad deaktivering garanterar alla gafflarna inom befolkningen har kollapsat vid en given tidpunkt och möjligt att bedöma vad som händer när replisome kollapsar, hur DNA bearbetas, och vad som krävs för att återstarta processen med DNA-replikation.
En fördel med systemet som beskrivs här är att nukleoprotein blocket är helt reversibel; Därför är förmågan hos cellerna att återhämta sig från nukleoproteinet blocket kunna följas. Tillsatsen av anhydrotetracyklin till cellerna kommer att lindra den snäva bindning av repressom, vilket gör att en replikationsgaffeln att gå igenom och cellen att återfå lönsamhet. Lindring av blockeringen kan visualiseras genom neutral-neutral två-dimensionell elektrofores på agarosgel efter 5 min och genom mikroskopi inom 10 min. Vidare kan livskraft analys avslöjar förmågan hos stammen att återhämta sig från replikerings blockering och fortsätter att proliferera.
Genom att ändra den genetiska bakgrunden till de stammar som användes i det experimentella förfarande som beskrivs här, kan de reparationsvägar för denna typ av blockering att belysas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Blockering replikering med FROS
- Induktion replikerings Blockering
- Späd en färsk nattgammal kultur av en E. coli-stam som bär en tetO array och pKM1 18 till OD 600 nm = 0,01 i en utspädd komplext medium (0,1% trypton, 0,05% jästextrakt, 0,1% NaCl, 0,17 M KH 2 PO 4, 0,72 MK 2 HPO 4) med antibiotika efter behov för val.
Obs: Lägg inte till tetracyklin för val eftersom det inte är förenligt med detta system. Att volymen av kulturen ekvivalent med 10 ml per prov krävs. Till exempel, är odlingsvolymen för den experimentella designen i Figur 1 60 ml. - Växa vid 30 ° C med skakning till dess att OD 600 nm = 0,05-0,1. Ta en 10 ml prov för att fungera som icke-inducerade kontroll och tillsätt 0,1% arabinos till den återstående kulturen att inducera produktion av TetR-YFP från pKM1. Fortsätter att växa både oinducerade och induceradekulturer. Efter en timme, ta med avseende på närvaro av en enda kontaktpunkt inom varje cell hos den inducerade kulturen med hjälp av fluorescensmikroskopi (se avsnitt 2).
- Om de inducerade cellerna bekräftade blockerade (mer än 70% av cellerna har ett enda fokus), spela OD 600 nm och ta en 7,5 ml prov för analys av 2-D-geler (se avsnitt 3). Ta en motsvarande prov från icke-inducerade kontrollkulturen.
- Späd en färsk nattgammal kultur av en E. coli-stam som bär en tetO array och pKM1 18 till OD 600 nm = 0,01 i en utspädd komplext medium (0,1% trypton, 0,05% jästextrakt, 0,1% NaCl, 0,17 M KH 2 PO 4, 0,72 MK 2 HPO 4) med antibiotika efter behov för val.
- Släpper replikerings Blockering
- Att frigöra replikeringsblocket, tillsätt 100 ng ml -1 i omotiverat induceraren anhydrotetracyklin (AT) till ett 10 ml prov av de blockerade cellerna. Fortsätta att växa i 30 ° C under 10 min och ta prover för celltäthet (1 ml), mikroskopi-analys (10 | j, l) och neutral-neutral två-dimensionella agarosgeler (7,5 ml).
- Inducerande Kollaps av Replisome
- Om cellerna innehåller en temperaturkänslig allel såsom DnaB ts eller dnaC ts som kräver deactivation, flytta kolven innehållande de blockerade cellerna till 42 ° C. Ta prover för analys vid tidpunkter som krävs (t.ex. en timme efter inkubation). Efter att cellerna har inkuberats vid 42 ° C under 1 h, växla cellerna till 30 ° C under 10 min (se figur 1).
Notera: Cellerna kan skiftas till 30 ° C under återstart analys.
- Om cellerna innehåller en temperaturkänslig allel såsom DnaB ts eller dnaC ts som kräver deactivation, flytta kolven innehållande de blockerade cellerna till 42 ° C. Ta prover för analys vid tidpunkter som krävs (t.ex. en timme efter inkubation). Efter att cellerna har inkuberats vid 42 ° C under 1 h, växla cellerna till 30 ° C under 10 min (se figur 1).
Figur 1:. Översikt över FROS Replication Block och Release Experimentellt förfarande E. coli-stammar som bär tetO array odlas vid 30 ° C. När cellerna når ett OD 600 nm av över 0,05, har TetR-YFP-produktion inducerad med arabinos (ara; 0,1%). Fortsätter att växa en subpopulation av icke-inducerade celler för att fungera som kontroller vid 30 ° C. Ett prov av de inducerade cellerna analyseras via fluorescensmikroskopi efter 1-2 h (se 2,1). Om replikation ärbekräftade att blockeras, tas prover för 2-D gel analys indikerade av provrören (se 3.1) och för genomförbarhetstest (tillval). Replikerings blockeringen kan avlägsnas med anhydrotetracyklin (AT; 0,1 | j, g / ml) och cellerna analyserades 10 min senare. Om celler bär en temperaturkänslig allel (t.ex. DnaB ts), kan detta inaktiveras genom att förskjuta de blockerade cellerna till 42 ° C under lämplig analys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
2. fluorescensmikroskopi
- Förbered en agarosen pad genom att pipettera 500 l av smält agaros (1% i vatten) på ett objektglas; överlagra täckglas omedelbart före agarosen stelnar. Lagra sliden (er) i våtservetter vid 4 ° C tills det behövs.
- När agarosen har stelnat, ta bort täck från agarosen pad och pipett 10 ul av bakteriellkultur på mitten av dynan för att förhindra förflyttning av cellerna under visualisering. När provet har torkat (ca 5 min), byt ut täck. Placera en droppe immersionsolja på täckglas och placera bilden i optik.
- Visualisera celler med fasmikroskopi vid 100 gångers förstoring.
- På dialog Acquire rutan i bildbehandlingsprogram, ställa exponeringstid till 100 ms. Ta bilden genom att välja Acquire. Inte flytta scenen. I Acquire dialogrutan väljer YFP som belysningen för den yttre Shutter Kopplat till kameran. Ställa in exporsure tid till 1000 msek. Stäng av scenen ljus. Fånga fluorescens bild genom att välja Acquire.
OBS! Tiden kan variera beroende på ljuskällan, mikroskop och kamera som används. - Att överlagra fas och fluorescerande bilder, väljer färg Kombinera inifrån Display menyn. I färg Kombinera dialogrutan väljer YFP bilden som den gröna komponenten och fas bild som blue komponent. Klicka på färg kombinera. Ta reda på om befolkningen har hade replikering framgångsrikt blockerat genom att fastställa huruvida de flesta av cellerna har en inriktning per cell.
Notera: Jämförelse till ett prov från kontroll utan tillsatt arabinos är användbart för att visuellt identifiera skillnaden i EYFP produktion.
- På dialog Acquire rutan i bildbehandlingsprogram, ställa exponeringstid till 100 ms. Ta bilden genom att välja Acquire. Inte flytta scenen. I Acquire dialogrutan väljer YFP som belysningen för den yttre Shutter Kopplat till kameran. Ställa in exporsure tid till 1000 msek. Stäng av scenen ljus. Fånga fluorescens bild genom att välja Acquire.
3. DNA-extraktion / Agarose Plugs
- Lägg natriumazid (slutlig koncentration av 0,1%) till de 7,5 ml odlingsprover från steg 1.1.3 och 1.2.1. Inkubera på is i minst 5 min.
Obs: Natriumazid är extremt giftigt. Rådgör säkerhetsdatabladet innan arbetet påbörjas och inte hantera det förrän alla säkerhetsåtgärder har läst och förstått. - Centrifugera cellerna 5000 xg under 10 min för att pelletera cellerna. Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 200 | il av Pett IV (PIV) buffert (10 mM Tris: HCl (pH 8,0), 1 M NaCl). Mikrocentrifug (13, 000 x g under 2 min) för att pelletisera cellerna. discard supernatanten. I detta skede av processen pelletsen vidare eller förvara vid -20 ° C.
- Återsuspendera cellerna med den lägsta celldensiteten i 50 | il PIV och rum vid 50 ° C. För alla andra prover, justera volymerna av PIV så att den slutliga celltätheten är densamma i varje rör (t.ex. prov 1 (OD 600 nm = 0,128) suspenderades i 50 pl; Prov 2 (OD 600 nm = 0,138) suspenderades i 54 pl).
- Tillsätt en lika volym av nyberedd 0,8% agaros-lösning i PIV (slutlig konc 0,4%,. T.ex. Prov en 50 | j, l, prov 2 54 | il). Se till att proven, agaros och PIV är över 50 ° C för att förhindra stelning.
- Behandla ett objektsglas med 40 pl av lämplig glasvattenavstötande eller silikonlösning. Gnugga sliden med en vävnad till dess att den är torr.
Obs: Detta kan göras i förväg och de behandlade objektglas förvaras lång sikt vid rumstemperatur. - Placera 20 l droppar av than cell / agaros suspension på bilden för att producera pluggar som är halvsfärisk.
Obs: Det första provet (suspenderades i 50 pl PIV) kommer att producera 5 pluggar på en bild. - När pluggarna har stelnat, skjut dem försiktigt i ett mikrofugrör och tillsätt 1 ml cell-lys-buffert (10 mM Tris-HCl [pH 8], 1 M NaCl, 100 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA), 0,2% natriumdeoxikolat, 0,5% N-lauroylsarkosin natriumsalt (Sarkosyl), 100 pg ml - ett lysozym, 50 ug ml - en RNas A). Inkubera vid 37 ° C under 2 h.
- Ta bort cellslys buffert och tillsätt 1 ml EDTA / Sarcosyl / Proteinas K (ESP) lösning (0,5 M EDTA, 1% N-lauroylsarkosin natriumsalt (Sarkosyl), 1 mg ml - 1 proteinas K). Inkubera vid 50 ° C över natten eller tills pluggarna är öppet. Om en andra natten inkubation behov ersätta ESP lösning med färsk buffert efter cirka 18 timmar.
- Ta bortESP-buffert och tvätta pluggarna 5 gånger med 12 ml Tris-EDTA (TE) buffert (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0), vilket gör att en 30 min jämviktning med varje tvätt. Lagra vid 4 ° C i 1 ml TE-buffert.
4. Neutral-neutral två-dimensionell gelelektrofores
- Överför en agarosplugg från steg 3,8 till en ny mikrofugrör och tillsätt 150 pl restriktionsenzymbuffert (1x koncentration). Lägg 25-100 enheter av restriktionsenzym (t.ex., 60 enheter EcoRV, (se figur 3A)). Smälta vid 37 ° C under 6-8 h.
- Vid 4 ° C, häll en 0,4% agarosgel (300 ml) i 1 x Tris / Borat / EDTA (TBE) till en gel bricka med ca 25 x 25 cm. Sätt en kam för att göra brunnar ungefär samma bredd som diametern på pluggen. När gelén är inställd, ta bort kammen och flytta gelén till rumstemperatur.
- Skjut en av de digererade agaros pluggar i en brunn, positionera den plana glid av pluggen mot sidan av brunnen där tHan DNA in i gelén. Sätt en enda plugg på samma sätt i varje andra brunnen.
- Pipettera smält 0,4% agaros i brunnarna för att täta pluggama i läge.
- Belastning 1 kb DNA-stege i en tom också, återigen lämnar ett gap mellan stegen och prover, och kör gelén över natten (16 h, 55 V) i 1x TBE vid rumstemperatur.
- Färga gelén i ett vattenbad innehållande etidiumbromid (0,3 ^ g ml -1) under 20 min.
Obs: Etidiumbromid anses vara en potent mutagen och ett toxin. Rådgör säkerhetsdatabladet innan arbetet påbörjas och inte hantera det förrän alla säkerhetsåtgärder har läst och förstått. - Visualisera DNA: t med en långvågig UV-transilluminator och skär ut varje bana fragment med en rak, jämnt snitt, vilket minimerar införlivandet av överskott av agaros på endera sidan av banan.
Obs: Om exempelvis fragmentet av intresse är 5,5 kb, skär en 7,5 cm-fragment till att omfatta de DNA-fragment från 5 kb till approximately 12 kb (se figur 3A). - Placera utskurna gel körfält i en gel bricka vid 90 ° riktning av DNA migration.
Obs: Två rader med 3 gel fragment kan passa in i en 25 x 25 2 cm gelbricka. Den första raden av gelbanorna är vid toppen av magasinet, den andra raden på 12.5 cm. - Bered 300 ml agaros för den andra dimensionen gel (0,9% i 1x TBE med 0,3 mikrogram ml -1 etidiumbromid). När agarosen kyls till 50 ° C, pipettera den smälta agarosen runt gelskivorna att konsolidera sin position. Pour de återstående agaros i facket till ett djup som är åtminstone i nivå med de gelskivor.
- När gelén stelnar, elektrofores vid 4 ° C i 1 x TBE innehållande 0,3 | ig ml -1 etidiumbromid vid 220 V till dess att DNA har migrerat ca 10 cm.
Obs: 4 h är tillräcklig för en 5,5 kb fragment men en mindre fragment kommer att behöva mindre tid. - Skära blocken där det genomiska DNA är närvarande usjunga kanten av en metallinjal, inklusive gelén ovanför den till att omfatta det DNA som inte är synlig (se fig 3C).
5. Southern-hybridisering
- lösning Framställning
- Förbereda depurinering-buffert (0,125 M HCl-lösning).
Notera: Denna buffert kan återanvändas och är stabil vid rumstemperatur under upp till en månad. - Förbereda Denaturering-buffert (1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH).
Notera: Denaturering buffert kan återanvändas gång och är stabil under upp till 3 månader vid rumstemperatur. - Förbereda Neutralisation buffert (1,5 M NaCl, 0,5 M Tris). Justera till pH 7,5 med HCl.
Notera: Neutralisation buffert kan återanvändas gång och är stabil under upp till 3 månader vid rumstemperatur. - Förbereda 10x Saline Natriumcitrat (SSC) -buffert (0,15 M Tri-natriumcitrat, 1,5 M NaCl, är pH 7-8) för användning i steg 5.2.4 och 5.2.6. Från denna buffert, göra en 2x SSC lager (för användning i steg 5.2.9).
Obs: 10x SSC och 2x SSC enre stabil vid RT i 3 månader. - Förbereda Modifierad Church och Gilbert hybridiseringsbuffert 19 (0,5 M fosfatbuffert [pH 7,2], 7% (vikt / volym) natriumdodecylsulfat (SDS), 10 mM EDTA). Lämna vid 65 ° C för att lösa grundligt före användning.
- Förbereda depurinering-buffert (0,125 M HCl-lösning).
- Överföring
- Skölj de exciderade gel block i depurinering lösning under 10 min vid RT på en rocker eller orbitalskak. Håll omrörningshastigheten låg för att undvika att skada agarosen block.
- Skölj gelen blockerar snabbt med destillerat vatten och sedan med denatureringsbuffert under 30 minuter. Skölj igen en kort stund i destillerat vatten och därefter inkubera gelen block i neutraliseringsbuffert under 30 min med försiktig omrörning vid rumstemperatur.
- Skära ett nylonmembran till den exakta storleken på gel (er). Skär en nick i det övre högra hörnet för att hjälpa till att orientera membranet i framtida åtgärder.
Obs: Två gel block (6 prover) kan visualiseras på ett membran. - Häll tillräckligt 10x SSC i en stay så att det inte kommer att torka ut under natten. Skapa en plattform ca 5 cm över nivån av bufferten. Mätta 3 ark 3MM kromatografi papper med 10x SSC och plats på plattformen. Skär kromatografi papper så att den är tillräckligt lång för att vara nedsänkt i buffert i båda ändar och tillräckligt bred för att passa membranet gel på.
- Placera gel (er) på toppen av den mättade kromatografi papper. Rama gelen med plastfolie för att förhindra att bufferten förbi gelén under överföringen. Lägg försiktigt den skurna membranet på toppen av gelén (er). Ta bort luftbubblor mellan membranet och gelén genom att rulla en flaska eller serologisk pipett försiktigt över membranet.
- Skär tre ark 3MM kromatografi papper i samma storlek som membranet. Mätta kromatografi pappersark med 10x SSC och placera ovanpå membranet. Ta bort eventuella luftbubblor som har bildats.
- Stack pappershanddukar minst 5 cm höga på toppen av läskpapper följt av en fast bärare (lämpximate vikt av 1 kg för en 23 x 16 cm membran). Möjliggöra överföring fortgå över natten.
- Exponera membranet (DNA sidan upp) till 1200 J / m 2 av UV för att tvärbinda DNA till membranet. Skölj inte innan det här steget.
- Skölj membranet noggrant i 2x SSC för att förhindra hög bakgrund på blot bilderna. Använd blot omedelbart för hybridisering (se 5.3) eller torka vid RT, linda in i plastfolie och förvara vid 4 ° C.
- hybridisering
- Förvärm hybridiseringsugn och flaskor till 55 ° C.
- Tillsätt 100 | j, g ml -1 bovint serumalbumin (BSA) och 10 | ig ml -1 icke-specifik DNA (t.ex. laxsperma-DNA) till den förvärmda hybridiseringsbuffert.
- För att möjliggöra jämn täckning av hybridiseringsbufferten då membranet rullas upp, placera blotten på ett liknande storlek kvadrat av nylonnät med DNA-bundna sida av membranet som vetter uppåt. Rulla blot längs dess långsidan. Glidablotten / mesh inuti en hybridisering flaska. Tillsätta en lämplig mängd av förvärmd hybridiseringsbuffert att rulla blotten (t.ex. 30 ml för ett 23 x 16 cm 2-membran).
- Inkubera i en förvärmd ugn, roterande flaskorna, under 1 timme.
- Förbereda sonden genom att blanda 50 ng av renad PCR-produkt homolog med regionen av intresse, 150 ng av slumpmässiga hexamer-primrar, buffert för Klenow-fragment och H2O för att göra en volym av 13 | il. Koka i 3 minuter placera sedan omedelbart på is. Tillsätt 1 pl av 1 mM dCTP / dGTP / dTTP mix, 1 pl Klenowfragment (5U) och 50 jiCi deoxiadenosin 5'-trifosfat radiomärkt på alfa fosfat (α 32 P-dATP).
- Inkubera vid rumstemperatur under 1 timme. Tillsätt 1 pl 1 mM dNTP-blandning och 1 pl Klenowfragment. Inkubera 20 min vid RT.
- Koka sond i 5 minuter och tillsätt omedelbart hybridisering rör. Hybridisera över natt vid 55 ° C, med rotation.
- Dekantera probe från membranet.
Obs: Sonden kan återanvändas gång. - Skölj membranet kort i förvärmda, låg stringens tvättbuffert (2 x SSC, 0,1% (vikt / volym) SDS). Tillsätta färsk låg stringens tvättbuffert och inkubera under 5 min vid 55 ° C med rotation. Upprepa.
- Tvätta två gånger i medium buffertstringenstvätt (1 x SSC, 0,1% (vikt / volym) SDS) under 10 min vid 55 ° C med rotation.
- Tvätta två gånger i hög stringens tvättbuffert (0,1 x SSC, 0,1% (vikt / volym) SDS) under 5 min vid 55 ° C med rotation.
- Ta bort membranet och dab med vävnad för att avlägsna överskottsvätska. Wrap i plastfolie säkerställa det inte finns någon kvarvarande fukt på plastfolie och placera i exponering kassett med en pre-blanked lagringsfosforskärm. Stäng kassetten och exponera minst två timmar innan visualisering med hjälp av en fosfor kameran.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den FROS är en inducerbar, platsspecifik nukleoprotein block som möjliggör replikationsintermediärer som skall visualiseras i levande celler 12,18. En allmän experimentell design för provtagning celler illustreras i figur 1. Tidpunkten för provtagning och variationer i genetisk bakgrund gör detta ett mångsidigt system för att studera reparation av ett sådant block. Den schematiska illustrerar hur temperaturkänsliga mutanter, såsom DnaB ts och dnaC ts som har använts tidigare 18, kan utnyttjas i detta system.
Induktionen av de FROS utfördes i en E. coli-stam som visas i figur 1 för icke-temperaturkänsliga stammar. För att bekräfta att en nukleoprotein blocket hade upprättats, celler visualiseras med fluorescensmikroskopi efter en timme av tillväxt i 0,1% arabinos. Dettatidsram är vanligtvis tillräcklig för att producera block i en vild typ stam men mer kräsna stammar kan kräva optimering. Majoriteten av celler innehöll ett fokus (figur 2A, + ara), vilket motsvarar endast en kopia av arrayen inom cellen och därigenom indikerar replikation hade blockerats. Antalet celler med ett fokus, 2 härdar eller mer än 2 härdar räknades i en befolkning på mer än 100 celler. 92% av cellerna befanns ha ett fokus med de återstående 8% med 2 härdar. Det förmodades att celler som hade två härdar placerade långt isär, vilket motsvarar två kopior av matrisen, skulle ha nästa omgång av replikation blockeras. Celler med två brännpunkter nära varandra beteckna att arrayen har nyligen replikeras och nukleoproteinet blocket ännu inte har uppnåtts.
Nukleoproteinet blocket omkastades genom tillsats av anhydrotetracyklin (AT) och efterföljande duplicering av arrayen visualiseras som denackumulering av celler med flera foci (figur 2A + ara / AT). Flera härdar inom en cell visualiseras genom fluorescens microcopy beteckna gruppen har framgångsrikt replikeras och tillräcklig tid har gått för att göra det möjligt för loci för att flytta isär, att övervinna alla systerkromosomen sammanhållning som var närvarande. I detta fall 10 minuter efter tillsatsen av AT, hade 94% av cellerna 2 eller flera foci och upp till 8 foci per cell visualiserades.
För att säkerställa att nukleoprotein blocket verkligen hämmade replikering, var cellviabiliteten analyseras (Figur 2B). Celler som har haft replikering inhiberas av FROS visar en cirka 1000-faldig minskning i kolonibildande enheter jämfört med celler som inte odlades i närvaro av arabinos. Celler som sedan odlades i närvaro av anhydrotetracyklin show återföring av denna tillväxthämning. Om cellerna inte kunde reparera DNA efter frisläppandetav nukleoproteinet blockering, skulle en minskning av viabilitet resultera.
Att visualisera replikationsintermediärer kan celler lyseras inom agaros pluggar och proteinet och RNA avlägsnades. DNA: t kan sedan digereras med ett lämpligt restriktionsenzym för regionen av intresse. DNA avbildas i figur 3A digererades med EcoRV, som kapar DNA omedelbart före arrayen, inne i uppsättningen och efter uppsättningen för att ge 5,5 kb och 6,7 kb fragmenten i regionen av intresse (Figur 3B). Fragment är idealiskt ~ 3-7 kb för det protokoll som beskrivs här. Fragment utanför detta område kan kräva ändring av agaros koncentrationer som används och elektroforesförhållanden för att uppnå god separation. DNA: t genomgick elektrofores i den första dimensionen och visualiseras (figur 3A). Om DNA har digererades fullständigt, kommer alla banor har kört jämnt och det kommer att finnasen stor mängd av låg molekylvikt (mindre än ca 3 kb, beroende på restriktionsenzym). DNA närvarande i brunnen antyder ofullständig cellys och en massa med hög molekylvikt DNA (över 10 kb) antyder ofullständig DNA digestion.
DNA av intresse i varje spår skars ut. I figur 3A, var DNA ovan 5 kb ingår. Den efterföljande andra dimensionen av gelén elektroforerades, vilket resulterade i en diagonal av linjärt DNA (figur 3C). Arrayen DNA inom denna gel visualiserades sedan genom Southern-hybridisering (figur 3D). I den oblockerade (- ara prov), kan två fläckar ses, som motsvarar de 5,5 kb och 6,7 kb fragment av arrayen, som förväntat. Provet som hade replikation blockeras (+ ara) visade en minskning i den 5,5 kb plats i jämförelse och tillsats av en elliptisk signal, vilket indikerar en ackumulering av Y-formade DNA i provet. Signalen ärlokaliserad till en position, vilket innebär replikeringsgafflar arresterar på en liknande plats i hela befolkningen. Vid tillsats av anhydrotetracyline, kan den Y-formade DNA signalen inte längre ses. En nyligen omstart indikeras av närvaron av en signal av hela Y-båge, som skildrar de gafflar som migrerar genom regionen.
Det är viktigt att normalisera DNA inom varje agarosplugg att säkerställa signalerna för proverna är jämna. Signalerna kan kvantifieras med lämplig bildprogram. En annan vanlig mellan sett är att anger Holliday korsning (HJ) bildning. En HJ visualiseras som en kon signal vid början av Y-bågen och en spik från den linjära DNA vid slutet av Y båge (figur 3D).
Figur 2: fluorescensmikroskopi och VIAB bilitet. (A) En E. coli-stam som bär tetO array odlades vid 30 ° C i närvaro av 0,1% arabinos (+ ara) i 1 h och därefter anhydrotetracyklin (AT) tillsattes under 10 min till en subpopulation för att frigöra replikeringsblock. Representativa mikrofotografier visas för YFP produktion (övre panelen). Skalstreck = 2 ^ m. Andelen celler som bär en, två eller fler än 2 foci räknades och presenteras som en procentsats (lägre panelen). (B) Celler som fått växa i frånvaro av arabinos (- ara), med arabinos (+ ara) och med både arabinos och anhydrotetracyklin (AT; 10 min) var serieutspäddes 10-faldigt och antingen fläckig eller spreds ut på agar innehållande endast ampicillin ( - / + Ara prover) eller ampicillin med anhydrotetracyklin (+ AT prov) och odlades vid 30 ° C för att bestämma cellviabilitet. Top: representativ platta visar tillväxt på angivna utspädningar. Botten: graf som visar de genomsnittliga CFU / ml +/- SEM.ww.jove.com/files/ftp_upload/54434/54434fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Fig. 3: Visualisering av DNA-replikering intermediärer vid en nukleoprotein block (A) Genomiskt DNA från celler (1 - ara, 2, + ara, 3, + ara / AT) som lyserades i agaros pluggar och klövs med EcoRV restriktionsenzym separerades på en 0,4% agarosgel (55 V, 16 h). 3 kb, 5 kb och 10 kb banden är angivna. DNA: t över det 5 kb markör skars ut såsom indikeras av de vita rutorna. (B) Schematisk bild av EcoRV-digere av arrayen regionen. Replikationsgafflar som kommer in i matrisen från origo bli blockerad inom 5,5 kb-fragmentet när cellerna har odlats i närvaro av arabinos. Restriktionsställen utnyttjas indikeras med pilar och array visas som en låda med linjer. (C) Det utskurna DNA: t roterades 90 ° och separerades i en 0,8% agarosgel (220 V, 4 h). Den vita rutan anger excision av DNA efter separation. (D) Arrayen regionen därefter visualiseras genom Southern blot-analys med användning av en radioaktiv sond till arrayen regionen. Celler med ett replikeringsblock vid denna position kommer att ha den signal som motsvarar 5,5 kb fragmentet ligger på Y-bågen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | 16922 | Growth media component |
| Sodium Chloride | VWR | 27810.364 | Growth media component |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | 92144 | Growth media component |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | Growth media component; Potassium buffer component |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | Growth media component; Potassium buffer component |
| L-Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | For induction of TetR-YFP production |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | 37919 | Release of replication bloackage |
| Axioskop 2 Fluorescence microscope | Zeiss | 452310 | Visualization of cells |
| eYFP filter set | Chroma Technology | 41028 | Visualization of YFP |
| CCD camera | Hamamatsu | Orca-AG | Visualization of cells |
| MetaMorph Software (Molecular Devices) | SDR Scientific | 31282 | Version 7.8.0.0 used in the preparation of this manuscript |
| Agarose | Bioline | BIO-41025 | For agarose plugs and gel electrophoresis |
| Original Glass Water Repellent (Rain-X) | Autobarn | DIO1470 | For agarose plug manufacture |
| TRIS | VWR | VWRC103157P | TE, TBE buffer component |
| Ethylene diaminetetraacetic acid | Ajax Finechem | AJA180 | 0.5 M EDTA disodium salt solution adjusted to pH 8.0 with NaOH. |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Bacteriostatic agent |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | TE buffer component |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | Cell lysis buffer component |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt (Sarkosyl) | Sigma-Aldrich | L5125 | Cell lysis and ESP buffer component |
| Rnase A | Sigma-Aldrich | R6513 | Cell lysis buffer component |
| Lysozyme | Amresco | 6300 | Cell lysis buffer component |
| Proteinase K | Amresco | AM0706 | ESP buffer component |
| Sub-Cell Model 192 Cell | BioRad | 1704507 | Electrophoresis system |
| UV transilluminator 2000 | BioRad | 1708110 | Visualization of DNA |
| Ethidium Bromide | BioRad | 1610433 | Visualization of DNA |
| Boric acid | VWR | PROL20185.360 | TBE component |
| Hybond-XL nylon memrbane | Amersham | RPN203S | Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) can also be used |
| 3MM Whatman chromatography paper | GE Healthcare Life Sciences | 3030690 | Southern blotting |
| HL-2000 Hybrilinker | UVP | 95-0031-01/02 | Crosslinking of DNA and hybridization |
| Deoxyribonucleic acid from salmon sperm | Sigma-Aldrich | 31149 | Hybridization buffer component |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | Denaturation buffer component |
| Trisodium citrate dihydrate | VWR | PROL27833.363 | Transfer buffer |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Amresco | 227 | Wash buffer component |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | Hybridization buffer component |
| Random Hexamer Primers | Bioline | BIO-38028 | |
| Klenow fragment | New England BioLabs | M0212L | |
| dNTP Set | Bioline | BIO-39025 | |
| Adenosine 5’-triphosphate-32P-ATP | PerkinElmer | BLU502A | |
| Storage Phosphor Screen | GE Healthcare Life Sciences | GEHE28-9564-76 | BAS-IP MS 3543 E multipurpose standard 35 cm x 43 cm screen |
| Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare Life Sciences | 28-9558-09 | Visualization of blot |
| Hybridization bottle | UVP | 07-0194-02 | 35 mm x 300 mm |
References
- Mirkin, E. V., Mirkin, S. M. Replication fork stalling at natural impediments. Microbiol Mol Biol Rev. 71 (1), 13-35 (2007).
- Gupta, M. K., et al. Protein-DNA complexes are the primary sources of replication fork pausing in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (18), 7252-7257 (2013).
- McGlynn, P., Guy, C. P. Replication forks blocked by protein-DNA complexes have limited stability in vitro. J Mol Biol. 381 (2), 249-255 (2008).
- Tanner, N. A., et al. Single-molecule studies of fork dynamics in Escherichia coli DNA replication. Nat Struct Mol Biol. 15 (2), 170-176 (2008).
- Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis. Nature. 457 (7227), 336-339 (2009).
- Rudolph, C. J., Upton, A. L., Lloyd, R. G. Replication fork stalling and cell cycle arrest in UV-irradiated Escherichia coli. Genes Dev. 21 (6), 668-681 (2007).
- Jeiranian, H. A., Courcelle, C. T., Courcelle, J. Inefficient replication reduces RecA-mediated repair of UV-damaged plasmids introduced into competent Escherichia coli. Plasmid. 68 (2), 113-124 (2012).
- Le Masson, M., Baharoglu, Z., Michel, B. ruvA and ruvB mutants specifically impaired for replication fork reversal. Mol Microbiol. 70 (2), 537-548 (2008).
- Wang, X., Liu, X., Possoz, C., Sherratt, D. J. The two Escherichia coli chromosome arms locate to separate cell halves. Genes Dev. 20 (13), 1727-1731 (2006).
- Lau, I. F., et al. Spatial and temporal organization of replicating Escherichia coli chromosomes. Mol Microbiol. 49 (3), 731-743 (2003).
- Gordon, G. S., et al. Chromosome and low copy plasmid segregation in E. coli: visual evidence for distinct mechanisms. Cell. 90 (6), 1113-1121 (1997).
- Possoz, C., Filipe, S. R., Grainge, I., Sherratt, D. J. Tracking of controlled Escherichia coli replication fork stalling and restart at repressor-bound DNA in vivo. EMBO J. 25 (11), 2596-2604 (2006).
- Payne, B. T., et al. Replication fork blockage by transcription factor-DNA complexes in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 34 (18), 5194-5202 (2006).
- Brewer, B. J., Fangman, W. L. The localization of replication origins on ARS plasmids in S. cerevisiae. Cell. 51 (3), 463-471 (1987).
- Jeiranian, H. A., Schalow, B. J., Courcelle, J. Visualization of UV-induced replication intermediates in E. coli using two-dimensional agarose-gel analysis. J Vis Exp. (46), (2010).
- Southern, E. M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Biol. 98 (3), 503-517 (1975).
- Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. DNA damage-induced replication fork regression and processing in Escherichia coli. Science. 299 (5609), 1064-1067 (2003).
- Mettrick, K. A., Grainge, I. Stability of blocked replication forks in vivo. Nucleic Acids Res. , (2015).
- Church, G. M., Gilbert, W. Genomic sequencing. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (7), 1991-1995 (1984).
- Michel, B., Grompone, G., Flores, M. J., Bidnenko, V. Multiple pathways process stalled replication forks. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12783-12788 (2004).
- Michel, B., Boubakri, H., Baharoglu, Z., LeMasson, M., Lestini, R. Recombination proteins and rescue of arrested replication forks. DNA Repair (Amst). 6 (7), 967-980 (2007).
- Carl, P. L. Escherichia coli mutants with temperature-sensitive synthesis of DNA. Mol Gen Genet. 109 (2), 107-122 (1970).
- Nawotka, K. A., Huberman, J. A. Two-dimensional gel electrophoretic method for mapping DNA replicons. Mol Cell Biol. 8 (4), 1408-1413 (1988).
- Cole, R. S., Levitan, D., Sinden, R. R. Removal of psoralen interstrand cross-links from DNA of Escherichia coli: mechanism and genetic control. J Mol Biol. 103 (1), 39-59 (1976).
