Summary
פרוטוקול לנצל פולי (N -iso-propylacrylamide) (PIPAAm) מצופה Microfilter עבור יעיל ללכוד ולשחרר thermoresponsive של תאים סרטניים קיימא במחזור (CTC) מוצג. שיטה זו מאפשרת ללכוד של CTC מ 'דם בחולים ושחרורו של CTC קיימא עבור במורד הזרם מחוץ שבב תרבות, מנתח ואפיון.
Abstract
אנו מדגימים שיטה ללכוד גודל מבוסס של תא הקיימא מחזור גידול (CTC) מן הדם כולו, יחד עם שחרורו של תאים אלה בין שבב לניתוח במורד זרם ו / או תרבות. האסטרטגיה מעסיקה את השימוש של Microfilter הנקבוביות חריץ קרום Parylene C רומן ללכוד CTC וציפוי של פולי (N -iso-propylacrylamide) (PIPAAm) עבור thermoresponsive שחרור קיימא של CTC בשבי. לכידתו של תאי חיים מופעלת על ידי מינוף העיצוב של גיאומטריה נקבובית חריץ עם ממדים ספציפיים כדי להפחית את לחץ הגזירה מזוהה בדרך כלל עם תהליך הסינון. בעוד Microfilter מפגין יעילות גבוהה ללכוד, השחרור של תאים אלה הוא לא טריוויאלי. בדרך כלל, רק אחוז קטן של תאים משתחררים כאשר טכניקות כגון זרימה הפוכה או גירוד תא משמשות. ההידבקות החזקה של תאי סרטן אפיתל אלה קרום Parylene C נובעת אינטראקצית אלקטרוסטטית הלא ספציפית. כדי לנטרל את ההתוצאה היא, שיישמנו השימוש ציפוי PIPAAm וניצלו נכסים interfacial תגובה תרמית שלה כדי לשחרר את התאים מן הסינון. דם מסונן הראשון בטמפרטורת החדר. להלן 32 ° C, PIPAAm הוא הידרופילי. לאחר מכן, המסנן להציב גם בתקשורת תרבות או חיץ על 37 מעלות צלזיוס, שתוצאתו PIPAAm מפנה הידרופובי, ולאחר מכן משחרר את התאים מאוגדים אלקטרוסטטי.
Introduction
מחלה גרורתית היא אחראית למותם של הסרטן ביותר. פיתוח סמנים ביולוגיים אבחון פרוגנוסטיים וכמלווה גרורות חיוני בניהול וטיפול בסרטן. בתאי גידול במחזור (CTC) לשחק תפקיד מרכזי בהפצת גידול וגרור. יתר על כן, להיות נגיש בקלות כמו ביו-מרקר 'ביופסיה נוזלית', CTC בחולי סרטן דם ההיקפי כבר עולה כ 'חממה' למחקר ביו-מרקר הסרטן. CTC אומתו גם ביומרקר פרוגנוסטיים במסגרות שונות לחולי סרטן, כולל סרטן השד, הערמונית וסרטן המעי הגס 1 - 3. עם זאת, התקדמות בתחום CTC ציינה כי הספירה בלבד של תאים הנדירים אלה הגבילה תועלת קלינית, כפי שמוצגת ניסויים קליניים התערבותיים 4. לפיכך, קיים צורך המתעורר עבור טכנולוגיות המאפשרות אפיון מולקולרי ופונקציונלי של CTC. נכון לעכשיו, רק כמה טכנולוגיות קיימות המאפשרות FOr הלא אנטיגן מוטה, לכידת קיימא ושחרור CTC, מה שמאפשר 5,6 ניתוח מולקולרי ופונקציונלי במורד חזק. רוב התקנים microfabricated אלה הם מצמידים את פלטפורמות microfluidic ולכן יש גורם מגביל את כמות הדם שניתן לעבד, שנעה בין 2-4 מ"ל 7 - 10. CTC הם אירועים נדירים בתוך שפופרת אחת של לקיחת הדם (7.5 מ"ל), ולכן מקטינים עוד יותר את כמות הדם שניתן לעבד, מאוד מעכבת את סיכויי לכידה לבודד תאים אלה של עניין.
פתחנו שני סוגי מכשירי Microfilter קרום Parylene C בתמורה ללכידתו של CTC המנצלת את ההבדלים בגודל בין תאים סרטניים גדולים ואת תאי דם הנורמלים הקטנים 11,12. יש לנו הדיווח בעבר על מסנן הספירה נקבובית העגול והשוו אותו עם פלטפורמת ה- FDA, שבו Microfilter הוצגה להיות מעולה יעיל ללכוד CTCעבור דגימות דם לחולה סרטן 13,14. עם זאת, מגבלה של המסנן העגול הוא הצורך להשתמש מקבעים משחררי פורמלדהיד לפני הסינון. תהליך זה שומר על מורפולוגיה תאים ובמקביל לאפשר להם לעמוד מאמץ הגזירה ולחץ במהלך תהליך הסינון. בעוד ספירה ומחקרים מולקולריים יכולים להתבצע על-שבב 13, מקבע פוגעת ביכולת לבצע אפיון פונקציונלי. כדי לתת מענה על מגבלה זו, פתחנו מסנן נקבובי חריץ השולל את הצורך לתקן תאים לפני הסינון (איור 1). החריץ הנקבובי הגיאומטריה (6 מיקרומטר הרוחב x 40 מיקרומטר נקבוביים חריץ אורך) מאפשרת לתאי הגידול להיות בשבי בזמן חלקי בלבד גורם לחסימה נקבובית ולכן עדיין המתיר מעבר חופשי עבור תאי דם אחרים והקלו על עליית לחץ שתוביל ניזק לתאים עד להתפקע סופי 15,16 מחסנית חריץ הנקבובית הורכב מ -2 חלקים אקרילי אשר כריךהחריץ הנקבובי מסנן בין היצירה העליונה ותחתונה עם polydimethylsiloxane (PDMS) מתנהג כמו אטם לספק דליפת הוכחת חותם 14,15 (איור 1).
בעוד יעילות לכידתו של מסנן חריץ הנקבובי גבוהה, (לוח 1), שנתפס CTC המאוגדים קרום Parylene C על ידי אינטראקציות אלקטרוסטטיות הלא ספציפיות חזקות במקום תאי מטריקס (ECM) בתיווך הידבקות 15. שיטות כגון זרימה הפוכה או שימוש מגרדים תאים מצליחים לשחרר את התאים ביעילות ממסנן, או לגרום נזק לתאים תהליכי המוות התאי. בדקנו שימוש לא שגרתי של PIPAAm לגבש אסטרטגיה שחרור 15. PIPAAm הוא פולימר אשר עובר עיבוד טמפרטורת פתרון הפיך נמוכים קריטית (LCST) המעבר לשלב בטמפרטורת פתרון של 32 מעלות צלזיוס 17. באופן מסורתי, נכס זה של PIPAAm נחקר נרחב עבור יישומי הנדסת רקמות. בדרך כלל, תאיםבתרבית על PIPAAm מצופה משטחים על 37 מעלות צלזיוס כאשר PIPAAm הוא הידרופובי. התאים לאחר מכן ניתן מנותקים כסיד כאשר טמפרטורת התרבות מוסטת אל מתחת ל 32 מעלות צלזיוס, שבו המשטח המצופה PIPAAm הופך 17,18 התייבשות. אנו לנצל נכס תרמית זו על ידי ביצוע תהליך הסינון בטמפרטורת חדר (מתחת ל -32 מעלות צלזיוס) ולאחר מכן המאפשר שחרור תא על ידי צבת המסנן בתקשורת תרבות על 37 מעלות צלזיוס. בטמפרטורה זו, שכבת הפולימר PIPAAm הופך הידרופובי, ובכך לשחרר את כבול אלקטרוסטטי תאים 15 (איור 1).
למרות שיטת טמפרטורת התגובה כמו גם שיטות אחרות יושמה בהצלחה להשיג ללכוד CTC קיימא ולשחרר 19 - 21, חסרון פוטנציאלי עיקרי אחת משותף טכנולוגיות אלה המדווחים כי הם כולם משתמשים עיקרון אנטיגן התלוי עבור לכידת CTC. מבוסס Antigen ללכוד CTC, כמוצג previously, עלול להוביל 11,14 ניתוח CTC מוטה. לדוגמה, טכנולוגיות רבות מבוססי זיקה להעסיק נוגדן אשר נקשר EpCAM עבור לכידת CTC. עם זאת, CTC הוכח מבטאים רמות שונות של EpCAM, שמוביל השמטת EpCAM נמוך EpCAM שלילית CTC על ידי הטכנולוגיות הללו. כמו כן, מגבלות עלולות להתרחש כאשר CTC מהמקור שאינו אפיתל הוא של עניין, כגון CTC במסגרות מלנומה סרקומה. לכן, טכנולוגיה המאפשרת ללכוד קיימא CTC ושחרור ללא הטיה פוטנציאלית הציגה ידי לכיד מבוסס אנטיגן רצויה מאוד.
חשוב לציין, מכשיר Microfilter ללכוד הוא בגודל מבוסס אך ורק ואת אסטרטגיית השחרור היא אגנוסטי לנוכחות של סמני משטח מסוימים. אנו מאמינים כי העסקתו של Microfilter מצופה PIPAAm יסייע להרחיב את הבנתנו את תהליך גרורתי, באמצעות מתן היכולת בצורה אפקטיבית ויעילה ללכוד ולשחרר CTC עבור ניתוחים במורד הזרם. מאי זה חזקially לחשוף מולקולות חדשות עבורו טיפולים מערכתיים ממוקד רומן עשויים להיות מופנים כמו גם לספק סמן ביולוגי כי ניתן לפקח בקלות וסיוע בניהול חולה סרטן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
משפט ואתיקה: כדי להגן על זכויותיהם של בני אדם, דגימות דם נלקחו לאחר הסכמה מדעת לפי הפרוטוקולים שאושרו על ידי אוניברסיטת ועדות בוחנות מוסדיים מיאמי תחת IRB 20,150,020.
הערה: דם להיות מסוננים עבור לכידת CTC יש לאסוף בצינור EDTA כדי למנוע קרישה.
1. ציפוי Microfilter עם midi (N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm)
- תשקול PIPAAm להכין פתרון 10% w / v ב butanol. מערבבים בעזרת מערבולת עד הפתרון הוא ברור.
- מיקרוסקופ פלסטיק Cut מחליק לתוך בערך 12 מ"מ x 12 מ"מ ריבועים או עם זוג מספריים או סכין חדה. לחלופין להשתמש גיליוטינה.
הערה: ריבועים אלה ישמשו כמחזיק לקריטריונים במהלך תהליך ציפוי ספין. - בעזרת זוג מספריים חד קצה ישר, לחתוך את פרוסות Microfilter חריץ הנקבוביות אל 8 מ"מ x 8 ריבועים מ"מ.
- בעזרת סרט סרט polyimide לאבטח את המסננים לחתוך על squa הפלסטיקמיל בעבר לחתוך בשלב 1.3. החל את הסרט רק על קצה בפינת מסנן כך לפחות 7 מ"מ X 7 מ"מ של שטח סינון הוא בלתי מכוסה על ידי הקלטת.
איור 2:. איור נציג של הקמה Microfilter עבור PIPAAm ציפוי 8 מ"מ x Microfilter 8 מ"מ ממוקמת על קיצוץ 12 מ"מ x 12 מ"מ פלסטיק מרובע של שקופית מיקרוסקופ פלסטיק. קלטת Polyimide משמש כדי לאבטח את Microfilter במקום להסתובב המעיל PIPAAm.Reproduced באישור התייחסות 15. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
- מניחים את Microfilter כי הוא מאובטח על ריבוע הפלסטיק, על צ'אק ואקום של coater-ספין.
- לתכנת את coater ספין כדי המתכון הבא: התחל, 500 סל"ד במשך 10 שניות, 6,000 rבערב במשך 60 שניות, 500 סל"ד במשך 10 שניות, עצור.
- לוותר מספיק 10% w / v פתרון PIPAAm (שהוכנו 1.1) כדי לכסות את פני השטח Microfilter לחלוטין בעזרת פיפטה העברת פלסטיק רגיל ולהתחיל את coater ספין.
- הסר את Microfilter PIPAAm מצופה מן-coater הספין לאחר תהליך הציפוי הושלם. השאר את המסנן מצורף ריבוע הפלסטיק במהלך האחסון.
הערה: ניתן לאחסן פילטר מצופה בטמפרטורת החדר למשך עד 3 חודשים.
2. האסיפה של קלטת סינון עם PIPAAm מצופה Microfilter
- רעננותם Microfilter PIPAAm מצופה בטמפרטורת החדר ידי הצבת Microfilter עדיין מאובטחת על ריבוע הפלסטיק לתוך צלחת פטרי. הוסף PBS 1x עד Microfilter הוא שקוע לחלוטין ולתת לעמוד במשך 5 דקות.
- לאחר השלב הידרציה, שחרר את המסנן מכיכר הפלסטיק על ידי חיתוך קלטת סרט polyimide בעזרת זוג מספרי.
הערה: שים לב באיזה צד של המסנן ישציפוי PIPAAm. - הרכב את Microfilter לתוך קלטת הסינון, על ידי רבדת Microfilter בין יצירת אקריליק העליונה ותחתונה יחד עם חתיכות 2 polydimethylsiloxane (PDMS) מתנהגות כמו אטם / חותם. הצמד את קלטת אקרילי עם קליפים לאבטח את המסנן ולספק חותם חזק.
הערה: ציפוי PIPAAm צריך לפנות כלפי מעלה, כדי המדגם מסונן דרך, התא יהיה שנתפס על PIPAAm משטח מצופה של המסנן (איור 1).
סינון 3. דגימת דם עם לכידת שחרור CTC מן Microfilter
- כמו כל מותג מזרק משאבה יש ממשק משתמש משלו, עיין במדריך למשתמש של המשאבה לתכנת את משאבת מזרק לזרום בקצב של 75 מ"ל / שעה ו להגדיר את עוצמת ל -20 מ"ל.
- 3 מיליליטר חם של של מקוי (זמינה מסחרי) תקשורת תרבית תאים (שהוכן על ידי הוספת 10% בסרום שור עוברי 1% פניצילין סטרפטומיצין) ל -37 מעלות צלזיוס.
- להוסיף 7.5 מ"ל של זמינים מסחרית מלח מאוזן של האנק פתרון (HBSS) המדגם 7.5 מ"ל של דם לשאוב דם מדולל זה לתוך מזרק 25 מ"ל.
הערה: כוונן את עוצמת הקול של HBSS כך דגימת דם מדולל עם נפח שווה של 1: 1 עם HBSS לדוגמא אם 10 מ"ל של דם משמש, ואז לערבב עם נפח שווה של 10 מ"ל HBSS כדי להשיג את 1:. דילול 1. - להעסיק את קלטת סינון עם המזרק ומניחים אותו על משאבת מזרק. מניחים שפופרת 50 מ"ל לעבר התחתונה כדי לאסוף את הזרימה דרך ולהתחיל את המשאבה.
הערה: הסינון יארך 10 12 דקות. כל צעדי הסינון נועדו להתבצעבטמפרטורת החדר הרגיל (C ° 20-25) כוללים שלב 3.8 - לאחר הסינון יושלם, לנתק את בשים לב קלטת סינון באיזה צד הוא העליון כי יש התאים נתפסו על המשטח המצופה PIPAAm. לשאוב 1 מיליליטר של התקשורת בתרבות החמה לתוך מזרק חדש.
- לשוב וללבוש את קלטת סינון עם מזרק המכיל התקשורת, אך בשלב זה להעסיק את הקצה התחתון של הקלטת כך את פני השטח מצופה PIPAAm של המסנן מול הרחק מזרק.
הערה: זה יהיה לשחרר את כל תאים שעשויים להיות מוטבע לתוך הנקבוביות חריץ על ידי יישום זרימה הפוכה עדינה. - יש להכניס את המזרק שוב על משאבת המזרק וחזק בצלחת פטרי קטנה או צלחת 6-גם ממש מתחת קלטת הסינון. הגדר את קצב הזרימה 100 מ"ל / שעה ולהתחיל את המשאבה.
- לעבור את כל התקשורת דרך המסנן ולאסוף את הזרימה דרך בצלחת פטרי. חכה כל התקשורת לעבור ולאחר מכן להפסיק את המשאבה ולהסיר את המזרקקלטת סינון nd מהמשאבה.
- ניתקתי את קלטת הסינון מן המזרק ולפתוח אותו כדי לאחזר את המסנן מתוך הקלטת. מניח את המסנן עם משטח PIPAAm פונה כלפי מטה לתוך אותו בצלחת פטרי לאיסוף הזרימה ההפוכה כאשר משחררים את התאים מן הנקבוביות. מוסיפים את שאר כלי התקשורת חמים ומניחים בצלחת פטרי לתוך תרבות חממה נקבע על 37 מעלות צלזיוס.
- אחרי 30 דקות כל התאים ישוחררו מהמסנן. עם זאת, לעזוב מסנן בצלחת פטרי עבור עד 24 שעות על מנת להבטיח את כל התאים לנתק.
הערה: לחילופין, התאים שוחרר ניתן לאסוף לתוך צינור microcentrifuge לבצע ניתוח נוסף במורד הזרם כגון PCR, ELISA, כתם המערבי שם כמה דוגמאות. - לאחר 24 שעות בתרבות, להסיר בזהירות את Microfilter באמצעות מלקחיים.
הערה: המסנן יכול להיות מושלך בשלב זה כמו התאים כבר להשתחרר ממנו. - בעדינות פיפטה מדיום התרבות מעלה ומטה באמצעות 1,000 & #181; פיפטה l, מחדש להשעות אריתרוציטים ותא דם היקפיים mononuclear (PBMC), כי הם נתפסו על המסנן ושוחרר לתוך צלחת עם CTC. בצע פעולה זו בזהירות ובעדינות להימנע ניתוק התאים הסרטניים המצורפים הרופף. מוציאים בזהירות את המדיום כולו המכיל אריתרוציטים מחדש מושעה ו PBMC תוך השארת תאים סרטניים מצ"ב תחליף עם מדיום חדש מחומם מראש ל -37 מעלות צלזיוס.
הערה: שלב זה ניתן לחזור פעם אם אריתרוציטים מוגזמים נוכחים לאחר לשטוף אחד.
4. הערכת כדאיות CTC
- הערכת כדאי CTC תרבותיות באמצעות assay Live / Dead 8.
הערה: רבי Live / מבחני מלח זמינים מסחרי. בעקבות הפרוטוקול של היצרן מומלץ מאוד. עיין ברשימת חומרים / ריאגנטים עבור ערכת assay המסחרית המשמשת לצורך הניסוי הזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות הדם "תורמים בריאים (שהושג תחת פרוטוקול שאושר על ידי אונ' מיאמי IRB 20,150,020 בעקבות הסכמה מדעת) ומשובץ תאים סרטניים בתרבית, טכניקת thermoresponsive לשחרורו של תאים במחזור גידול קיימא (CTC), לכידת מושגת, שחרור ויעיל יחזרו של 94% ± 9%, 82% ± 5% ו -77% ± 5% בהתאמה (לוח 1) 15. לשם השוואה, יעילות השחרור ואחזור של מסננים ללא ציפוי היו נמוך משמעותיות (7% ± 1% יעילי שחרור ו -6% ± 1% יעילים יחזרו) (לוחות 1) 15. על מנת להעריך את הכדאיות של CTCs שוחרר מבית המסנן, ~ 1,000 תאי SK-BR-3 היו זנקו לתוך 7.5 מיליליטר של הדם של התורם הבריא, מסונן דרך מסנן החריץ מצופה PIPAAm ושוחרר באמצעות השיטה המתוארת לעיל. Assay Live / Dead בוצעה על מנת להעריך את כדאיות התא לפני ספייק לדםואחרי שחרורו. הכדאיות מראש ספייק הייתה 98% (592 מתוך 602 תאים נספרו) ואת הכדאיות של תאים בשבי ושוחררו מן הדם היו 95% (540 מתוך 567 תאים נספרו) 15 (איור 3 א). במקביל, התאים בשבי ושוחרר סינון ההודעה במלואה דגימת דם היו בתרבית בינוני תרבות 5A של מקוי. תמונות צולמו יום 3 ויום 10. כפי שניתן לראות בתרשים 3B, תאים שוחררו ממסנן לא רק נשארים קיימא, אך התרחבו במהירות בתרבות, וכך יוצרים סינון פוסט הכדאיות שלהם.
איור 1:. מצופה PIPAAm מסננים חריץ כדי ללכוד ולשחרר תאים סרטניים במחזור מדם (פאנל למעלה) (א) התמונה Brightfield של מסנן חריץ מצופה PIPAAm; (ב) סינון של דם מלא עבור לכידת CTC. (ג) סכמטי של tהוא Microfilter קלטת שבה, מסנן החריץ המצופה PIPAAm הוא דחוק בין החלק העליון הקלטת תחתונה. (תחתית פאנל) (ד) סכמטי של תהליך לשחרר שבויים CTC ממסנני חריץ מצופה PIPAAm. לשכפל באישור בהפניה 15. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3:. לכיד, שחרור ותרבות של תאים סרטניים קיימא תאי סרטן השד (SKBr-3) ממוסמר בדם תורם נורמלי נתפסו ושוחרר באמצעות Microfilter מצופה PIPAAm. התאים נשארו שחרור פוסט קיימא והרחיב בתרבות במהירות. (א) Live-מת assay מבוצע על התאים שוחרר מן הסינון. 95% (540 מתוך 567 תאים נספרו) של התאים הראה להיות בת קיימא(ירוק) לאחר שחרורו. תאים מתים מסומנים באדום. (ב) יום 3 עד יום 10 התרבות של תאים שוחרר מבית מסנן חריץ מצופה PIPAAm. התאים נשארים קיימא והרחיב בתרבות. סרגל קנה מידה = 100 μm.Reproduced באישור התייחסות 15. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: מדידת נקבובית פרמטרים לפני ואחרי PIPAAm ציפוי תמונות Brightfield של מסנן חריץ (א) לפני ואחרי (B) שלאחר ציפוי PIPAAm.. (ג) אורך נקבובי הוקטן 7.3% ± 2.1% לאחר רוחב ציפוי נקבובי PIPAAm הוקטן 15.3% ± 5.6% לאחר ציפוי PIPAAm. לשכפל באישור בהפניה 15.אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: לזהם אריתרוציטים ו Leukocytes יוסרו על ידי עדין רוחצת כ -1,000 SKBr-3 תאים נאספו מן הדם על ידי מסנן חריץ מצופה PIPAAm והיו מצופה על צלחת 48-היטב.. (א) 16 שעות בתרבות, תאי SKBr -3 גידול דבק צלחת תרבות (חצים ירוקים), ואילו אריתרוציטים אפופטוטיים ו לויקוציטים גם התיישבו בחלק התחתון של הצלחת (חצים אדומים). (ב) הודעה לשטוף, תאים שאינם חסידים הוסרו, משאיר תאים סרטניים חסידים על הצלחת (חצים ירוקים). לשכפל באישור בהפניה 15. אנאלחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
טבלה 1:. לכיד, שחרור ואחזור יעיל של מסנני חריץ מצופה PIPAAm לכידה יעיל = המספרים סלולריים שנתפסו על מסנן לפני מספרי שחרור / תא זנקו לתוך דם. שחרר מספרים יעילים = תא שוחררו מן המספרים מסננים / תא שנתפסו על המסנן לפני השחרור. יעיל יחזור = מספרים סלולריים שוחררו מבית המסנן / מספרים סלולריים זנקו לתוך blood.Reproduced באישור התייחסות 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
התהליך לכיד CTC קיימא מהדם כולו ומשחרר אותם מן Microfilter הוא פשוט יחסית; עם זאת כמה נקודות קריטיות שווים אזכור. זה הכרחי, כמו עם כל תרבית התאים כי תנאי סטרילית נשמרים לאורך התהליך כולו. השלב הראשוני של ציפוי המסנן עם PIPAAm הוא קריטי, כבסיס הטכניקה של שחרור התאים ממסנן מבוסס על ניצול מאפייני interfacial תגובת הטמפרטורה של PIPAAm. כדי להבטיח את המסנן כבר מצופה ביעילות, למדוד את הגודל נקבובי (רוחב ואורך של נקבובי חריץ) על המסנן תחת מיקרוסקופ לפני ציפוי ואז שוב למדוד ציפוי פוסט גודל נקבובי. הגודל הנקבובי צריך להיות ירידה של 1μm משני הרוחב והאורך (איור 4). כאמור, מסנן החריץ בעת לכידת CTC ביעילות, גם לוכד כמה תאי PBMC גדולים, לעומת זאת תאים אלה הם תאים שאינם חסידים וכך דורותng צעד 3.13 יוסר מן התרבות משאירה מאחור את תאי הסרטן החסידים (איור 5).
שינויים קלים בצורת פרוטוקול ייתכן שיהיה צורך אם כרכים שונים של דם הם להיות מסוננים או במקרים בהם צמיגות גבוהה מאוד. כאמור בפרוטוקול, חשוב לדלל דם 1: 1 עם HBSS. הצמיגות של הדם משתנה מחולה לחולה, אולם על פי רוב זה לא ישפיע על סינון. יהיו מקרים מסוימים כאשר הצמיגות גבוהה מאוד או קרישים גדולים נוכחים, ובמקרה משאבת המזרק לא תוכל לאלץ את הדם דרך המסנן. מומלץ במקרים אלה כדי לעצור את משאבת מזרק, לנתק את הקלטת מן המזרק, פתח את החלק העליון של קלטת, אך להשאיר את המסנן עדיין מחוברת בחלק התחתון. קרישי דם גדולים יהיו גלויים בקלות על המסנן. בעדינות פיפטה 1 מ"ל של HBSS על המסנן תוך כדי לחיצה על קלטת בכל אנג קלהle לאפשר הקריש כדי לשטוף. לאחר הקריש הוסר, לסגור את הקלטת, ולערב מחדש אותו המזרק ולהמשיך סינון.
בעוד מסנני מצופה PIPAAm יכולה להיעשות בקבוצות ומאוחסנים לשימוש מאוחר יותר, מצאנו כי אורך חיי המדף של מסננים מראש מצופה אלו עומדת על כ 3 חודשים. לכידתו והשחרור היעילה של התאים עשויים להיות ירידה בחלקו בשל משפיל PIPAAm לאורך זמן.
אחד הגורמים המגבילים להקים תרבות מן CTC החולה ישקר במספר CTC שנמצא בתוך דגימת הדם. מספרים נמוכים סבירים יעשו את היכולת להרחיב את התאים מאוד קשה אם לא בלתי אפשרי. עם זאת, sequestering מדגם עם ספירת תאי נמוכה לאזורי תרבות קטנים עשוי לעזור, כמו באר יחיד של 96 צלחת היטב במקום צלחת 6 היטב. זיהוי של תקשורת והתרבות, או שינוי של תקשורת הזמינה מסחרי, אשר יספוק את הסביבה האופטימלית FOr תאים אלה לגדול אתגר נוסף כי יהיה צורך להתגבר.
ניתוחים מולקולריים תאיים של CTC לספק מידע רב ערך עבור הפרוגנוזה בסרטן ועשויים לסייע רפואת דיוק במרחק של 15. הכדאיות של התאים שוחררו ממסנן ללכוד היא התפתחות מפתח לקראת יכולת CTC חולה התרבות לבדיקות סמים רגישות הקרנה. זה כבר זמן רב ידוע כי CTC נוטה להיות שונה מן הגידול הראשוני ובכך את הצורך לטפל גם בהתאם. כדוגמה, Schneeweiss et al. דיווח כי סרטן שד גרורתי (MBC), פרופילים אנטיגן של רקמת גרורתי הגידול הראשוני נבדלים עד 20% מהחולים. בחינה מחדש של סמנים חזויים, כולל 2 הקולטן לגורם גדילה באפידרמיס אדם (HER2) ביטוי, עשויה לעזור כדי לייעל טיפול MBC. בעוד דגימת רקמות היא פולשני ולעתים קרובות קשה לחזור, ניתוח CTC דורש דגימת דם רק ועשוי לספק וקלה חוזר, בזמן אמת & #34; נוזל ביופסיה "הגישה 22.
משמעות עיקרית של הטכניקה נעוצה בעובדה כי בעוד מספר פלטפורמות נפוצות ללכוד CTC וניתוחים מוגבלים ניתוחים מולקולריים תאיים כמו מקבעים הכרחי לעיבוד המדגם, או CTC הם משותקים על פלטפורמה. יתר על כן, מערכות מבוססות זיקה, המאפשרים ללכוד ולשחרר קיימא CTC, יכול להיות מוטה באופן פוטנציאלי על ידי הבחירה של אנטיגן היעד 15. לחלופין, מסנן החריץ עם ציפוי PIPAAm מספק פלטפורמה חופשית תווית כי הוא אפקטיבי ויעיל בלכידה ושחרור CTC קיימא מהדם כולו. שיטה זו מספקת את היכולת של אפיון נוסף של CTC קיימא, כולל פנוטיפי תא בודד ניתוח גנטי וכן vivo לשעבר תרבות CTC.
עבודה מתנהלת כיום להעסיק הטכנולוגיה הזו עבור יישומים קליניים. היכולת ביעילות התרבות CTC מ patienדגימות לא תובלנה לגיבוש גדודי טיפול היעילים על לחולה בסיס, לחשוף מטרות תרופה חדשות, ולהוביל להתפתחות של כימותרפיות יעילה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slot Filter | Circulogix Inc. | MSF-01 | Different size filters available based for filtration for CTC from blood or urine (www.circulogixinc.com) |
| poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) | Ploysciences Inc. | 21458 | Non-Hazardous. Store at room temp. |
| 1-Butanol | Sigma Aldrich | B7906 | Use in well ventilated area |
| Plastic Microscope Slides | Cole-Parmer | 48510-30 | Any plastic slides or alternatively any sort of square (Metal, Acrylic etc.) can be used if it will be bale to hold the 8mmx8mm filter square |
| Spin Coater | Specialty Coating Systems | SCS G3 Spin Coater | Instrument |
| Polyimide Tape | Uline | S-7595 | Polyimide is the generic name for Kapton Tape which can be purchased form multiple vendors (Amazon, Kaptontape.com) |
| HBSS- Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14025-092 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Falcon Petri dishes 35 x 10 mm | VWR | 25373-041 | |
| Microfilter Cassette | Circulogix Inc. | FC-01 | Custom catridges are avilable based on filtration for CTC from blood or urine |
| Syringe 20 ml | BD Scientific | 302830 | |
| Syringe Pump | KD scientific | 78-0100V | Any syringe pump capable of holding a 25 ml syringe may be used |
| Cellstar 50 ml Centrifuge tube | VWR | 82050-322 | |
| Greiner Bio One 6 well plate | VWR | 89131-688 | Any brand can be used, as long as the surface is compatiable for cell adesion and not repellant |
| SKBR3 Cells | ATCC | HTB-30 | |
| Live Dead Assay | Life Technologies | L3224 | Any assay that can provide a reasonable analysis to evaluate live cells will work |
| Cell Culture Incubator | VWR | 98000-368 | Any incubator that can be used for cell culture will suffice |
References
- Cristofanilli, M., Budd, G. T., et al. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N Engl J Med. 351 (8), 781-791 (2004).
- de Bono, J. S., Scher, H. I., et al. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).
- Cohen, S. J., Punt, C. J. a, et al. Prognostic significance of circulating tumor cells in patients with metastatic colorectal cancer. Ann. Oncol. 20 (7), 1223-1229 (2009).
- Smerage, J. B., Barlow, W. E., et al. Circulating Tumor Cells and Response to Chemotherapy in Metastatic Breast Cancer: SWOG S0500. J. Clin. Oncol. 32 (31), 3483-3490 (2014).
- Mach, A. J., Kim, J. H., Arshi, A., Hur, S. C., Di Carlo, D. Automated cellular sample preparation using a Centrifuge-on-a-Chip. Lab chip. 11 (17), 2827-2834 (2011).
- Ozkumur, E., Shah, A. M., et al. Inertial Focusing for Tumor Antigen-Dependent and -Independent Sorting of Rare Circulating Tumor Cells. Sci. Transl. Med. 5 (179), 179 (2013).
- Nagrath, S., Sequist, L. V., et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
- Hosokawa, M., Kenmotsu, H., et al. Size-Based Isolation of Circulating Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Microcavity Array System. PLoS ONE. 8 (6), (2013).
- Bhagat, A. A. S., Hou, H. W., Li, L. D., Lim, C. T., Han, J. Pinched flow coupled shear-modulated inertial microfluidics for high-throughput rare blood cell separation. Lab on a chip. 11 (11), 1870-1878 (2011).
- Tan, S. J., Lakshmi, R. L., Chen, P., Lim, W. -T., Yobas, L., Lim, C. T. Versatile label free biochip for the detection of circulating tumor cells from peripheral blood in cancer patients. Biosens. Bioelectron. 26 (4), 1701-1705 (2010).
- Vona, G., Sabile, A., et al. Isolation by size of epithelial tumor cells a new method for the immunomorphological and molecular characterization of circulatingtumor cells. Am. J. Pathol. 156 (1), 57-63 (2000).
- Marrinucci, D., Bethel, K., et al. Case study of the morphologic variation of circulating tumor cells. Human pathology. 38 (3), 514-519 (2007).
- Lin, H. K., Zheng, S., et al. Portable filter-based microdevice for detection and characterization of circulating tumor cells. Clin. Cancer Res. 16 (20), 5011-5018 (2010).
- Williams, A., Rawal, S., et al. Clinical translation of a novel microfilter technology Capture, characterization and culture of circulating tumor cells. PHT. , 220-223 (2013).
- Ao, Z., Parasido, E., et al. Thermoresponsive release of viable microfiltrated Circulating Tumor Cells (CTCs) for precision medicine applications. Lab Chip. 15, 4277-4282 (2015).
- Xu, T., Lu, B., Tai, Y. C., Goldkorn, A. A cancer detection platform which measures telomerase activity from live circulating tumor cells captured on a microfilter. Cancer Res. 70 (16), 6420-6426 (2010).
- Okano, T., Bae, Y. H., Jacobs, H., Kim, S. W. Thermally on-off switching polymers for drug permeation and release. J. Control. Release. 11 (1-3), 255-265 (1990).
- Yamada, N., Okano, T., Sakai, H., Karikusa, F., Sawasaki, Y., Sakurai, Y. Thermo-responsive polymeric surfaces; control of attachment and detachment of cultured cells. Die Makromol. Chemie, Rapid Commun. 11 (11), 571-576 (1990).
- Deng, Y., Zhang, Y., et al. An integrated microfluidic chip system for single-cell secretion profiling of rare circulating tumor cells. Sci. Rep. 4, 7499 (2014).
- Hou, S., Zhao, H., et al. Capture and stimulated release of circulating tumor cells on polymer-grafted silicon nanostructures. Adv. Mater. 25 (11), 1547-1551 (2013).
- Xiao, Y., Zhou, H., et al. Effective and selective cell retention and recovery from whole blood by electroactive thin films. ACS Appl. Mater. Interfaces. 6 (23), 20804-20811 (2014).
- Wallwiener, M., Hartkopf, A. D., et al. The impact of HER2 phenotype of circulating tumor cells in metastatic breast cancer: a retrospective study in 107 patients. BMC cancer. 15 (1), 403 (2015).
