Summary
Протокол использовать поли (N -iso-пропилакриламид) (PIPAAm) микрофильтр с покрытием для эффективного улавливания и высвобождения thermoresponsive жизнеспособных циркулирующих опухолевых клеток (СТС) представлено. Этот метод позволяет захватывать ТХМ из крови больных и последующим выпуском жизнеспособной КТК для вниз по течению вне кристалла культуры, анализ и характеристика.
Abstract
Демонстрируется способ размера на основе захвата жизнеспособных циркулирующих опухолевых клеток (СТС) из цельной крови, наряду с выпуском этих клеток из чипа для нисходящего анализа и / или культуры. Стратегия использует использование нового Parylene С слот пор мембраны микрофильтр для захвата CTC и покрытие из поли (N -iso-пропилакриламид) (PIPAAm) для thermoresponsive жизнеспособного освобождения захваченного КТК. Захват живых клеток включается за счет использования конструкции геометрии слота пор с конкретными размерами, чтобы уменьшить напряжение сдвига, обычно связанные с процессом фильтрации. В то время как микрофильтр демонстрирует высокую эффективность захвата, высвобождение этих клеток является нетривиальной. Как правило, только небольшой процент клеток высвобождаются, когда такие методы, как обратный поток или клетки соскоба используются. Сильная адгезия этих эпителиальных раковых клеток к мембране Parylene С обусловлено неспецифическим электростатическим взаимодействием. Противодействовать тысявляется эффект, мы использовали использование PIPAAm покрытия и эксплуатировали его термических реагирующие межфазных свойств, чтобы освободить клетки от фильтра. Кровь сначала фильтруют при комнатной температуре. Ниже 32 ° C, PIPAAm является гидрофильным. После этого фильтр помещен в любой из культуральной среды или буфер, поддерживаемую при температуре 37 ° С, что приводит к PIPAAm превращения гидрофобными, а затем отпуская электростатически связанных клеток.
Introduction
Метастатического заболевания несет ответственность за большинство случаев смерти от рака. Разработка прогностической и сопутствующий диагностический биомаркером метастазирования имеет решающее значение в лечении рака и лечения. Циркулирующие опухолевые клетки (КТК) играют центральную роль в распространении опухоли и метастазов. Кроме того, будучи легко доступны в качестве "жидкой биопсии" биомаркеров, CTC у онкологических больных "периферической крови повышался как« рассадник »для исследования биомаркеров рака. КТК были хорошо подтверждены в качестве прогностического биомаркера в различных условиях, в том числе рака молочной железы, простаты и колоректальный рак 1 - 3. Тем не менее, последние достижения в области СТС указал , что простое перечисление этих редких клеток имеет ограниченную клиническую полезность, как показано в интервенционной клинических испытаний 4. Таким образом, существует потребность в новых технологиях, которые позволяют молекулярной и функциональной характеристике КТК. В настоящее время лишь немногие существуют технологии, которые позволяют FOг не-антиген предвзятым, жизнеспособного захват и освобождение КТК, что позволяет надежную вниз по течению молекулярный и функциональный анализ 5,6. Большинство этих устройств микроизготовленном соединены с микрофлюидальных платформ и , таким образом ограничивающим фактором в количестве крови, которая может быть обработана, которая колеблется от 2-4 мл 7 - 10. СТС являются редкими событиями в одной трубе взятия крови (7,5 мл), поэтому дальнейшее уменьшение количества крови, который может быть обработан, в значительной степени препятствует возможности захвата и изоляции этих клеток, представляющих интерес.
Мы разработали два типа устройств мембраны микрофильтр Parylene C для захвата КТК, эксплуатирующие различия в размерах между крупными опухолевыми клетками и небольших нормальных клеток крови 11,12. Ранее мы уже сообщали о круглом пор фильтра подсчета и сравнивали его с FDA утвержденных платформу, где микрофильтр было показано, что превосходит по эффективности захвата СТСдля образцов рака крови пациента 13,14. Тем не менее, ограничение круглого фильтра является необходимость использования формальдегида на основе закрепитель перед фильтрацией. Этот процесс сохраняет морфологию клеток, позволяя им выдержать напряжение сдвига и давление во время процесса фильтрации. В то время как перечисление и молекулярные исследования могут быть выполнены на микросхеме 13, закрепляющий ухудшает способность выполнять функциональную характеристику. Для устранения этого ограничения, мы разработали пористую фильтр слот , который сводит на нет необходимость зафиксировать клетки перед фильтрацией (рисунок 1). Геометрия слот пор (ширина 6 мкм х 40 мкм слот длиной поры) позволяет опухолевым клеткам быть захвачены в то время как лишь частично перекрыта, поры и, таким образом, все еще позволяя свободный проход для других клеток крови и облегчение повышение давления, что приведет к повреждению клеток и в конечном итоге лопнул 15,16 картридж слот пор состоит из 2 -х частей , которые акриловых сэндвичслот поры фильтра между верхней и нижней части с полидиметилсилоксана (PDMS) , действующего в качестве прокладки для обеспечения герметичного уплотнения 14,15 (Рисунок 1).
В то время как эффективность захвата из гнезда пор фильтра является высоким, (таблица 1), захваченное СТС связаны с мембраной из Parylene С сильными неспецифических электростатических взаимодействий вместо внеклеточного матрикса (ЕСМ) , опосредованной адгезии 15. Такие методы, как обратный поток или использование клеточных скребками не эффективно освободить клетки от фильтра, или привести к повреждению клеток и гибели клеток. Мы исследовали нетрадиционный использование PIPAAm разработать стратегию выхода 15. PIPAAm представляет собой полимер , который претерпевает обратимое ниже критической температуры раствора (НКТР) фазового перехода при температуре раствора 32 ° С 17. Традиционно, это свойство PIPAAm широко изучены для тканевой инженерии. Как правило, клеткикультивировали на PIPAAm Поверхности с нанесенным покрытием при температуре 37 ° С, когда PIPAAm является гидрофобным. Клетки затем могут быть отделены , как лист , когда температура культивирования смещается ниже 32 ° С, при которой поверхность PIPAAm покрытием становится гидратированный 17,18. Мы использовали эту термальное свойство путем осуществления процесса фильтрации при комнатной температуре (ниже 32 ° C), а затем позволяя высвобождением клеток путем размещения фильтра в культуральной среде поддерживалась на уровне 37 ° C. При этой температуре, полимерный слой PIPAAm становится гидрофобной, таким образом , освобождая электростатически связанные клетки 15 (фиг.1).
Хотя температура отзывчивым метод, а также другие методы , которые были успешно реализованы для достижения жизнеспособного захвата CTC и выпуска 19 - 21, один ключевой потенциальный недостаток разделяемое этими технологиями сообщенных в том , что все они используют принципу антиген-зависимой для CTC захвата. Антиген на основе CTC захвата, как показано рreviously, может привести к необъективной CTC анализа 11,14. Например, многие сродством на основе технологии используют антитела, которое связывается EpCAM ТХМ захвата. Тем не менее, КТК было показано, чтобы выразить различные уровни EpCAM, что приводит к пропуском EpCAM низкого и EpCAM отрицательного CTC этими технологиями. Кроме того, ограничения могут возникнуть, когда CTC из не эпителиального происхождения представляет интерес, таких, как КТК в меланомой и саркомой настройки. Таким образом, технология, которая позволяет жизнеспособного CTC захвата и освобождения без потенциального смещения, введенного путем захвата антигена на основе является весьма желательным.
Важно отметить, что устройство захвата микрофильтр чисто размера на основе, и стратегия высвобождения является агностиком в присутствии определенных поверхностных маркеров. Мы считаем, что использование микрофильтра с покрытием PIPAAm поможет расширить наше понимание метастатического процесса, путем предоставления возможности для эффективного и действенного захвата и освобождения КТК для последующих анализов. В мае этого года мощнымially выставить новые молекулы, для которых новые целевые системной терапии могут быть направлены, а также обеспечить биомаркеров, которые можно контролировать легко и помощи при раке пациента управления.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этика Заявление: В целях защиты прав человека в качестве субъекта, образцы крови были получены после информированного согласия в соответствии с процедурами, утвержденными Университетом этическими комитетами Майами в рамках IRB 20150020.
Примечание: в крови, чтобы быть отфильтрованы для CTC захвата должны быть собраны в ЭДТА трубки для предотвращения коагуляции.
1. Покрытие микрофильтра с поли (N-изо-пропилакриламид) (PIPAAm)
- Взвесить PIPAAm подготовить 10% вес / об раствора в бутаноле. Смешайте с помощью вихря, пока раствор не станет прозрачным.
- Вырезать из пластика микроскопа скользит в примерно 12 мм х 12 мм квадратов либо с парой ножниц или острым лезвием. В качестве альтернативы использовать гильотину.
Примечание: Эти квадраты будут служить в качестве держателя для фильтров во время процесса нанесения покрытия. - Используя острый пару прямых кромок ножниц, вырезать прорезь пор микрофильтра пластины в 8 мм х 8 мм квадратов.
- Использование полиимидной пленки ленты закрепите разрезанные фильтры на пластиковую squaРез предварительно разрезанную на шаге 1.3. Нанести пленку только до края и угла фильтра таким образом, что по меньшей мере 7 мм х 7 мм площади фильтра является непокрытыми с помощью ленты.
Рис . 2: представитель Иллюстрация микрофильтра установка для PIPAAm покрытия 8 мм х 8 мм микрофильтр расположена на 12 мм х 12 мм пластиковые квадратные , вырезанные из пластиковой предметное стекло микроскопа. Полиимидная лента используется для закрепления микрофильтр на месте крутиться Покройте PIPAAm.Reproduced с разрешения ссылке 15. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
- Поместите микрофильтр, который закреплен на пластиковой площади, на вакуумном патроне спин-устройства для нанесения покрытия.
- Программирование спин-устройства для нанесения покрытий по следующему рецепту: Start, 500 оборотов в минуту в течение 10 сек, 6000 гм в течение 60 сек, 500 оборотов в минуту в течение 10 сек, стоп.
- Разливают достаточно 10% вес / объем раствора PIPAAm (полученного в 1.1), чтобы полностью покрыть поверхность микрофильтра с использованием стандартной пластиковой пипетки передачи и начать спиновый устройства для нанесения покрытия.
- Извлеките микрофильтр PIPAAm покрытую из спин-устройства для нанесения покрытия после того, как процесс нанесения покрытия завершен. Оставьте фильтр, прикрепленный к пластиковой площади во время хранения.
Примечание: с покрытием фильтр можно хранить при комнатной температуре в течение до 3-х месяцев.
2. Монтаж фильтровальной кассеты с PIPAAm покрытием Микрофильтр
- Увлажняет микрофильтр с покрытием PIPAAm при комнатной температуре путем размещения микрофильтр до сих пор закреплен на пластиковой площади в чашку Петри. Добавьте 1x PBS до тех пор, пока микрофильтр полностью погружен и дать постоять в течение 5 мин.
- После стадии гидратации, освободить фильтр из пластиковой площади путем разрезания ленты полиимидной пленки с помощью пары ножниц.
ПРИМЕЧАНИЕ: Примите к сведению, какая сторона фильтра имеетPIPAAm покрытие. - Собрать микрофильтр в фильтрационной кассетой, путем прослаивая микрофильтр между верхней и нижней части акриловой наряду с 2 полидиметилсилоксан (PDMS) штук действует как прокладка / уплотнительное кольцо. Зажмите акриловую кассету с зажимами, крепят фильтр и обеспечивают герметичное уплотнение.
Примечание: Покрытие PIPAAm должна быть обращена вверх, таким образом , образец фильтруют через клетки будут захвачены на PIPAAm поверхности , покрытой фильтра (Рисунок 1).
3. Фильтрация образца крови с захвата и освобождения КТК из микрофильтра
- Поскольку каждый бренд шприцевой насос имеет свой собственный пользовательский интерфейс, обратитесь к руководству по эксплуатации насоса и запрограммировать шприцевой насос течь со скоростью 75 мл / ч и установить объем до 20 мл.
- Теплые 3 мл (коммерчески доступного) для культивирования клеток Маккоя (получают путем добавления в 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллина и стрептомицина) до 37 ° С.
- Добавить 7,5 мл имеющегося в продаже Хэнкса сбалансированный солевой раствор (HBSS) до 7,5 мл крови пробы и аспирацию эту разбавленную кровь в 25 мл шприца.
Примечание: Для регулировки громкости HBSS так , что образец крови разбавляют равным объемом 1: 1 с HBSS , например , если используется 10 мл крови, а затем смешать с равным объемом 10 мл HBSS для достижения 1: 1 . Разведение. - Engage фильтрационную кассету с шприц и поместите его на шприцевой насос. Поместите 50 мл трубки в нижней части, чтобы собрать поток через и запустить насос.
Примечание: Фильтрация следует принимать примерно 10- 12 мин. Все стадии фильтрации должны проводитьсяпри нормальной комнатной температуре (20-25 ° C), включая стадии 3.8 - После фильтрации завершена, расцепить фильтрация кассеты, принимая к сведению, какая сторона является вершина, которая имеет ячейки пойманных на поверхности PIPAAm покрытием. Отберите 1 мл теплой культуральной среды в новый шприц.
- Привлекайте фильтрационную кассету с шприц, содержащий носитель, но в это время заниматься нижний конец кассеты, так что PIPAAm покрытием-поверхность фильтра отворачивается от шприца.
Примечание: Это будет выпускать любые клетки, которые могут быть встроены в поры слот, применяя мягкий поток обратного. - Поместите шприц обратно на шприцевой насос и провести небольшую чашку Петри, или 6-луночный планшет прямо под фильтровальной кассетой. Установка скорости потока 100 мл / ч, и запустить насос.
- Проходят все средства массовой информации через фильтр и собрать Проточный в чашке Петри. Подождите, пока все средства массовой информации, чтобы пройти через, а затем остановите насос и снимите шприцй фильтрации кассета из насоса.
- Отрыв фильтрационную кассету из шприца и открыть его, чтобы извлечь фильтр из кассеты. Поместите фильтр с поверхностью PIPAAm лицевой стороной вниз в ту же чашку Петри, используемой для сбора обратного потока при отпускании клетки из пор. Добавить остальные теплые информации и размещают чашку Петри в культуральную инкубатор при 37 ° С.
- Через 30 минут все клетки будут освобождены из фильтра. Тем не менее, оставить фильтр в чашке Петри в течение до 24 часов, чтобы гарантировать, что все клетки отделяться.
Примечание: В качестве альтернативы, высвобожденные клетки могут быть собраны в микроцентрифужных трубки для выполнения далее вниз по течению анализа, такие как ПЦР, ИФА, вестерн-блот, чтобы назвать несколько примеров. - Через 24 часа в культуре, осторожно удалите микрофильтр с помощью щипцов.
Примечание: Фильтр может быть отброшен в это время, так как клетки были освобождены от него. - Аккуратно пипетки культуральной среды вверх и вниз, используя 1000 & #181, л пипетка, повторно приостановить эритроцитов и мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС), которые были пойманы на фильтре и выпустили в пластину с КТК. Выполнять эту операцию аккуратно и осторожно, чтобы не отсоединяя слабо прикрепленные раковые клетки. Осторожно удалите всю среду, содержащую ресуспендировали эритроциты и РВМС, оставляя за прикрепленного раковых клеток и замены свежей средой, предварительно нагретый до 37 ° С.
Примечание: Этот шаг можно повторить один раз, если чрезмерное эритроцитах присутствуют после одной стирки.
4. CTC Жизнеспособность Оценка
- Оценка культурной жизнеспособности КТК с использованием Live / Dead Пробирной 8.
Примечание: Многочисленные Live / Мертвые анализы коммерчески доступны. Следуя протоколу производителя настоятельно рекомендуется. Пожалуйста, обратитесь к списку материалов / реагентов для коммерческого набора для анализа, используемого для этого эксперимента.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Использование крови здоровых доноров (полученные в соответствии с протоколом, утвержденным в Университете Майами IRB 20150020 следующего информированного согласия) подсыпали культивированных раковых клеток, в thermoresponsive техники для высвобождения жизнеспособных циркулирующих опухолевых клеток (КТК), достигнутый захват, выпуск и эффективность поиска информации 94% ± 9%, 82% ± 5% и 77% ± 5% соответственно (таблица 1) 15. Для сравнения, выпуск и извлечение эффективность без покрытия фильтров значительно ниже (7% ± 1% эффективность высвобождения и 6% ± 1% эффективности поиска информации ) были (таблицы 1) 15. Для того чтобы оценить жизнеспособность ЦОК, освобожденных из фильтра, ~ 1000 клеток SK-BR-3 вносили в 7,5 мл крови здорового донора, фильтруют через прорезь с покрытием фильтра PIPAAm и выпущен с использованием способа, описанного выше. A Режим реального / Мертвая анализ проводили для оценки жизнеспособности клеток, прежде чем шип в кровьи после освобождения. Жизнеспособность предварительно колос составила 98% (592 из 602 подсчитанных клеток) и жизнеспособность клеток , захваченных и освобожденных из крови составила 95% (540 из 567 подсчитанных клеток) 15 (фиг.3А). Параллельно с этим, клетки захватили и выпустили пост-фильтрации из образца крови культивировали в 5A культуральной среде Маккоя. Изображения были приняты на 3 -й день и день 10. Как показано на фигуре 3В, клетки , освобожденные из фильтра не только остаются жизнеспособными, но быстро расширяется в культуре, создав таким образом свою жизнеспособность после фильтрации.
Рисунок 1:. PIPAAm покрытием Слот Фильтры для захвата и освобождения циркулирующих опухолевых клеток из крови (Верхняя панель) (A) Светлое изображение PIPAAm слот с покрытием фильтра; (В) Фильтрация цельной крови для CTC захвата. (С) Схема Тон микрофильтр кассету, где, PIPAAm покрытием слот фильтр, расположенный между верхней и нижней кассеты. (Нижняя панель) (D) Схема процесса с выделением захвачена КТК с PIPAAm покрытием щелевых фильтров. Воспроизводится с разрешения автора из ссылки 15. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Захват., Релиз и культура жизнеспособного опухолевых клеток рака молочной железы клетки (SKBR-3) подскочили в нормальной донорской крови были захвачены и выпущены с использованием микрофильтра с PIPAAm с покрытием. Клетки остаются жизнеспособными после освобождения и расширена в культуре быстро. (А) Живой умершей анализ проводили на клетках , высвобожденных из фильтра. 95% (540 из 567 подсчитанных клеток) клеток показали свою жизнеспособность(Зеленый) после выпуска. Мертвые клетки помечены красным цветом. (B) День 3 через 10 день культуры клеток , освобожденных из PIPAAm покрытием слот фильтра. Клетки остаются жизнеспособными и расширена в культуре. Шкала бар = 100 μm.Reproduced с разрешения ссылке 15. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Измерение порового параметров до и после покрытия PIPAAm Светлое изображения слот - фильтра (А) пред- и (В) пост- PIPAAm покрытием.. Длина (C) Pore уменьшилась на 7,3% ± 2,1% после того, как PIPAAm покрытия и ширина пор была снижена на 15,3% ± 5,6% после того, как PIPAAm покрытия. Воспроизводится с разрешения автора из ссылки 15.Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: Заражение эритроцитах и лейкоцитах, удаляются путем осторожного промывок приблизительно 1000 клеток SKBR-3 были получены из крови с помощью PIPAAm покрытием слот фильтром и высевали на 48-луночный планшет.. (А) В 16 ч в культуре, SKBR-3 опухолевые клетки , прилипшие к культуре пластины (зеленые стрелки), в то время как апоптотических эритроциты и лейкоциты были также усадка в нижней части пластины (красные стрелки). (B) после мытья, не прилипшие клетки удаляют, оставляя прилипшие клетки опухоли на пластине (зеленые стрелки). Воспроизводится с разрешения автора из ссылки 15. Пожалуйста ,Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Таблица 1:. Захват, Release и индексирование Эффективность PIPAAm покрытием Slot фильтры захвата эффективность = число клеток , захваченных на фильтре до чисел высвобождения / клеток в кровь шипами. Освободить эффективность = число клеток, высвобождаемые из числа фильтров / клеток, захваченных на фильтре перед выпуском. Retrieval эффективность = число клеток , высвобождаемые из числа фильтров / клеток в blood.Reproduced подскочили с разрешения ссылки 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Процесс захвата жизнеспособной КТК из цельной крови и освобождая их от микрофильтра относительно проста; Однако несколько критических точек стоит упомянуть. Крайне важно, как и всей культуры клеток, стерильное состояние сохраняется в течение всего процесса. Начальная стадия покрытия фильтра с PIPAAm имеет решающее значение, в качестве основы для техники высвобождения клеток из фильтра основан на использовании температуры реагирующих межфазных свойств PIPAAm в. Для того, чтобы обеспечить фильтр был эффективно покрытием, измерить размер поры (ширина и длина слот поры) на фильтре под микроскопом перед нанесением покрытия, а затем снова измерить размер пор после покрытия. Размер пор должен быть уменьшен на 1 мкм на как по ширине и длине (рисунок 4). Как уже упоминалось, слот фильтра во время захвата КТК эффективно, также захватывает некоторые крупные клетки РВМС, однако эти клетки не являются адгезивные клетки, и, таким образом, Duriнг шаг 3,13 удаляются из культуры , оставив после прилипшие раковых клеток (рисунок 5).
Незначительные изменения в протоколе могут быть необходимы, если разные объемы крови должны быть отфильтрованы или в тех случаях, когда вязкость чрезвычайно высока. Как было упомянуто в протоколе, он имеет решающее значение для разбавления крови 1: 1 с HBSS. Вязкость крови варьирует от пациента к пациенту, тем не менее, по большей части, это не повлияет на фильтрацию. Там будут определенные случаи, когда вязкость является слишком высокой или слишком большие сгустки присутствуют, причем в этом случае шприцевой насос не сможет заставить кровь через фильтр. Рекомендуется в этих случаях, чтобы остановить шприцевой насос, расцепить кассету из шприца, откройте верхнюю часть кассеты, но оставьте фильтр по-прежнему прикрепленный к нижней части. Большие сгустки крови будет легко видна на фильтре. Аккуратно пипеткой 1 мл HBSS на фильтр, удерживая кассету под небольшим англе, чтобы позволить тромб смыть. После того, как комок был удален, закройте кассету, повторно привлечь его к шприцу и продолжить фильтрацию.
В то время как фильтры PIPAAm с покрытием могут быть сделаны в пакетах и сохранены для последующего использования, мы обнаружили, что срок годности этих предварительно покрытых фильтров составляет приблизительно 3 месяца. Эффективный захват и освобождение клеток может быть уменьшена частично из-за деградирующей PIPAAm в течение долгого времени.
Одним из факторов, ограничивающих создать культуру от CTC пациента будет лежать в количестве ТХМ, которые присутствуют в образце крови. Низкие цифры, вероятнее всего, возможность расширить клетки чрезвычайно трудно, если не невозможно. Тем не менее, секвестрации образец с низким подсчетов клеток на меньшие области культуры может помочь, например, в одной лунке 96-луночного планшета вместо пластины 6 скважины. Идентификация культуральной среды или модификации коммерчески доступных средств массовой информации, что обеспечит оптимальную среду FOг эти клетки расти еще одна задача, которую необходимо будет преодолеть.
Молекулярные и клеточные анализы КТК дают ценную информацию для прогнозирования рака и может помочь диск точность медицины 15. Жизнеспособность клеток, высвобожденных из фильтра захвата является ключевым событием в сторону способности к культуре пациента CTC для испытаний чувствительности к лекарственным препаратам и скрининга. Уже давно известно, что КТК, как правило, отличаются от первичной опухоли и, таким образом, необходимость лечения и соответствующим образом. В качестве примера, Schneeweiss и др. Сообщается, что в метастатическим раком молочной железы (MBC), антигенные профили метастатической ткани и первичной опухоли отличаются до 20% больных. Переоценка прогнозирующих маркеров, в том числе 2 выражения (HER2) рецептора эпидермального фактора роста человеческого, может помочь оптимизировать лечение MBC. В то время как отбор проб ткани является инвазивным, и часто трудно повторить, анализ CTC требует только образец крови и может обеспечить легкий для повтора, в режиме реального времени & #34; жидкая биопсия "подход 22.
Основной смысл этой техники заключается в том, что в то время как несколько платформ, обычно используемые в CTC захвата и анализ ограничен в молекулярном и клеточном анализе в качестве закрепителя необходимо для обработки образца, или КТК иммобилизуют на платформе. Кроме того, аффинность на основе системы, которые позволяют жизнеспособный CTC захвата и освобождения, потенциально может быть смещена по выбору антигена - мишени 15. В качестве альтернативы, слот для фильтра с покрытием PIPAAm обеспечивает свободную платформу этикетки, которая является эффективной и эффективной в захвате и освобождении жизнеспособной КТК из цельной крови. Этот метод дает возможность для дальнейшей характеристики жизнеспособной КТК, в том числе одного фенотипического клеток и геномного анализа, а также экс естественных условиях CTC культуры.
В настоящее время ведется использовать эту технологию для клинического применения. Способность эффективно культуры CTC из patienОбразцы т приведет к разработке эффективной терапии полкам на пациента к пациенту основы, выявить новые цели наркотиков, а также привести к развитию эффективных химиопрепаратов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slot Filter | Circulogix Inc. | MSF-01 | Different size filters available based for filtration for CTC from blood or urine (www.circulogixinc.com) |
| poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) | Ploysciences Inc. | 21458 | Non-Hazardous. Store at room temp. |
| 1-Butanol | Sigma Aldrich | B7906 | Use in well ventilated area |
| Plastic Microscope Slides | Cole-Parmer | 48510-30 | Any plastic slides or alternatively any sort of square (Metal, Acrylic etc.) can be used if it will be bale to hold the 8mmx8mm filter square |
| Spin Coater | Specialty Coating Systems | SCS G3 Spin Coater | Instrument |
| Polyimide Tape | Uline | S-7595 | Polyimide is the generic name for Kapton Tape which can be purchased form multiple vendors (Amazon, Kaptontape.com) |
| HBSS- Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14025-092 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Falcon Petri dishes 35 x 10 mm | VWR | 25373-041 | |
| Microfilter Cassette | Circulogix Inc. | FC-01 | Custom catridges are avilable based on filtration for CTC from blood or urine |
| Syringe 20 ml | BD Scientific | 302830 | |
| Syringe Pump | KD scientific | 78-0100V | Any syringe pump capable of holding a 25 ml syringe may be used |
| Cellstar 50 ml Centrifuge tube | VWR | 82050-322 | |
| Greiner Bio One 6 well plate | VWR | 89131-688 | Any brand can be used, as long as the surface is compatiable for cell adesion and not repellant |
| SKBR3 Cells | ATCC | HTB-30 | |
| Live Dead Assay | Life Technologies | L3224 | Any assay that can provide a reasonable analysis to evaluate live cells will work |
| Cell Culture Incubator | VWR | 98000-368 | Any incubator that can be used for cell culture will suffice |
References
- Cristofanilli, M., Budd, G. T., et al. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N Engl J Med. 351 (8), 781-791 (2004).
- de Bono, J. S., Scher, H. I., et al. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).
- Cohen, S. J., Punt, C. J. a, et al. Prognostic significance of circulating tumor cells in patients with metastatic colorectal cancer. Ann. Oncol. 20 (7), 1223-1229 (2009).
- Smerage, J. B., Barlow, W. E., et al. Circulating Tumor Cells and Response to Chemotherapy in Metastatic Breast Cancer: SWOG S0500. J. Clin. Oncol. 32 (31), 3483-3490 (2014).
- Mach, A. J., Kim, J. H., Arshi, A., Hur, S. C., Di Carlo, D. Automated cellular sample preparation using a Centrifuge-on-a-Chip. Lab chip. 11 (17), 2827-2834 (2011).
- Ozkumur, E., Shah, A. M., et al. Inertial Focusing for Tumor Antigen-Dependent and -Independent Sorting of Rare Circulating Tumor Cells. Sci. Transl. Med. 5 (179), 179 (2013).
- Nagrath, S., Sequist, L. V., et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
- Hosokawa, M., Kenmotsu, H., et al. Size-Based Isolation of Circulating Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Microcavity Array System. PLoS ONE. 8 (6), (2013).
- Bhagat, A. A. S., Hou, H. W., Li, L. D., Lim, C. T., Han, J. Pinched flow coupled shear-modulated inertial microfluidics for high-throughput rare blood cell separation. Lab on a chip. 11 (11), 1870-1878 (2011).
- Tan, S. J., Lakshmi, R. L., Chen, P., Lim, W. -T., Yobas, L., Lim, C. T. Versatile label free biochip for the detection of circulating tumor cells from peripheral blood in cancer patients. Biosens. Bioelectron. 26 (4), 1701-1705 (2010).
- Vona, G., Sabile, A., et al. Isolation by size of epithelial tumor cells a new method for the immunomorphological and molecular characterization of circulatingtumor cells. Am. J. Pathol. 156 (1), 57-63 (2000).
- Marrinucci, D., Bethel, K., et al. Case study of the morphologic variation of circulating tumor cells. Human pathology. 38 (3), 514-519 (2007).
- Lin, H. K., Zheng, S., et al. Portable filter-based microdevice for detection and characterization of circulating tumor cells. Clin. Cancer Res. 16 (20), 5011-5018 (2010).
- Williams, A., Rawal, S., et al. Clinical translation of a novel microfilter technology Capture, characterization and culture of circulating tumor cells. PHT. , 220-223 (2013).
- Ao, Z., Parasido, E., et al. Thermoresponsive release of viable microfiltrated Circulating Tumor Cells (CTCs) for precision medicine applications. Lab Chip. 15, 4277-4282 (2015).
- Xu, T., Lu, B., Tai, Y. C., Goldkorn, A. A cancer detection platform which measures telomerase activity from live circulating tumor cells captured on a microfilter. Cancer Res. 70 (16), 6420-6426 (2010).
- Okano, T., Bae, Y. H., Jacobs, H., Kim, S. W. Thermally on-off switching polymers for drug permeation and release. J. Control. Release. 11 (1-3), 255-265 (1990).
- Yamada, N., Okano, T., Sakai, H., Karikusa, F., Sawasaki, Y., Sakurai, Y. Thermo-responsive polymeric surfaces; control of attachment and detachment of cultured cells. Die Makromol. Chemie, Rapid Commun. 11 (11), 571-576 (1990).
- Deng, Y., Zhang, Y., et al. An integrated microfluidic chip system for single-cell secretion profiling of rare circulating tumor cells. Sci. Rep. 4, 7499 (2014).
- Hou, S., Zhao, H., et al. Capture and stimulated release of circulating tumor cells on polymer-grafted silicon nanostructures. Adv. Mater. 25 (11), 1547-1551 (2013).
- Xiao, Y., Zhou, H., et al. Effective and selective cell retention and recovery from whole blood by electroactive thin films. ACS Appl. Mater. Interfaces. 6 (23), 20804-20811 (2014).
- Wallwiener, M., Hartkopf, A. D., et al. The impact of HER2 phenotype of circulating tumor cells in metastatic breast cancer: a retrospective study in 107 patients. BMC cancer. 15 (1), 403 (2015).
