Summary
的协议，利用聚（N -异丙基丙烯酰胺）（PIPAAm）有效捕获和可行的循环肿瘤细胞（CTC）的温敏缓释包衣微型过滤器呈现。这种方法可以从患者的血液和可行的CTC随后释放CTC的捕获下游片文化，分析和鉴定。
Abstract
我们证明了从全血存活的循环肿瘤细胞（CTC）的大小基于捕获的方法，用这些细胞从芯片释放用于下游分析和/或培养沿。该战略采用采用了新型的C型帕利灵膜孔槽的微过滤器捕获CTC和聚对捕获的CTC的温敏可行的释放涂层（N -异丙基丙烯酰胺）（PIPAAm）。活细胞的捕获是通过利用与特定尺寸的槽孔隙几何形状的设计，以减少通常与过滤过程相关的剪切应力使能。而微滤器表现出高的捕集效率，这些细胞的释放是不平凡的。典型地，使用的技术，如逆流或细胞刮时只有细胞的一小部分被释放。这些上皮癌细胞的C型帕利灵膜的附着力强的原因是非特异性静电相互作用。为了抵消日是影响，我们采用的使用PIPAAm涂层和利用它的热响应界面性能从过滤器释放的细胞。血液是首先在室温下过滤。低于32°C，PIPAAm是亲水性的。此后，将过滤器放置在任一培养基或维持在37℃的缓冲液，这导致在PIPAAm转动疏水性的，并且随后释放静电结合的细胞。
Introduction
转移性疾病是负责大多数癌症死亡。为转移预后开发和伴随诊断的生物标记物是癌症管理和治疗的关键。循环肿瘤细胞（CTC）在肿瘤传播和转移中心作用。此外，作为一个“液体活检”生物标记方便，CTC肿瘤患者的外周血中一直在上升为“癌症生物标志物研究的温床”。 CTC已经被证实为各种癌症的设置，包括乳腺癌，前列腺癌和直肠癌1预后标志物- 3。然而，最近在CTC领域的进展已经表明，这些稀有细胞的单纯列举具有有限的临床效用，如图介入临床试验4。因此，存在对技术，使四氯化碳的分子和功能表征的新兴需求。目前，只有一些技术存在允许FOR无抗原偏差，可行的捕获和CTC的释放，使下游强劲分子和功能分析5,6。这些微加工器件的大多数被耦合到微流体平台，因此具有在可处理的血液量，这从2-4毫升7范围的限制因素- 10。四氯化碳是在抽血（7.5毫升）的单管罕见的事件，因此，进一步降低了可处理血液量，极大地妨碍了捕获和隔离感兴趣的这些细胞的机会。
我们已经开发出两种类型的C型帕利灵膜微过滤装置的四氯化碳的其中采用更大的肿瘤细胞和正常的小血细胞11,12之间的大小差异捕获。我们以前曾报道对圆孔径枚举过滤并用FDA批准的平台，其中该微滤器被证明是在CTC捕获效率优于比较它对于癌症患者的血液样本13,14。然而，圆形过滤器的一个限制是在过滤之前使用基于甲醛固定液的必要性。这个过程会保留细胞形态，同时使它们能够承受在过滤过程的剪切应力和压力。而枚举和分子研究可以片上13来执行，在固定剂削弱以执行功能特性的能力。为了解决此限制，我们开发了一个狭槽的孔的过滤器 ，否定的必要性来修复之前过滤细胞（ 图1）。槽孔隙几何形状（6微米宽度x 40微米长度槽的孔）允许而仅部分闭塞的细孔，从而仍允许用于其它血细胞的分类通道和减轻压力的上升，这将导致细胞损伤要捕获的肿瘤细胞和最终破裂15,16槽孔隙盒由2丙烯酸系片其三明治的顶部和底部件与聚二甲基硅氧烷（PDMS）作为垫圈之间的槽中微孔过滤以提供防漏密封14,15（ 图1）。
而槽细孔过滤器的捕获效率是高的，（ 表1），所捕获的CTC由强的非特异性静电相互作用，而不是介导的粘附15外基质（ECM）结合于C型帕利灵膜。方法，例如逆流或使用细胞刮刀不能有效地从过滤器释放的细胞，或导致细胞损伤和细胞死亡。我们探讨的一个非常规的使用PIPAAm来制定发布策略15。 PIPAAm是经历在液温32℃17的可逆低临界溶液温度（LCST）相转变的聚合物。传统上，PIPAAm的这一特性已被广泛地探讨了组织工程应用。通常，细胞是在PIPAAm培养涂层表面在37℃时PIPAAm是疏水性。当培养温度低于32°C，其中的PIPAAm涂层表面变得水合17,18转移到细胞可以被分离成片状。我们通过在室温（低于32℃）进行过滤处理，然后通过将保持在37℃的培养介质中的过滤器使得细胞释放利用此热性能。在此温度下，PIPAAm聚合物层成为疏水性的，从而释放静电结合的细胞15（ 图1）。
虽然温度响应的方法以及其它方法已成功地实施，以实现可行四氯化碳捕获和释放19 -由这些技术报告共享21，一键潜在的缺点是，它们都采用四氯化碳捕获的抗原依赖性原理。基于抗原捕获CTC，如所示的Previously，可能导致偏CTC分析11,14。例如，许多基于亲和力的技术采用结合EpCAM的四氯化碳捕获抗体。然而，四氯化碳已经显示出表达的EpCAM的各级，通过这些技术导致的EpCAM低和EpCAM的负四氯化碳遗漏。此外，当CTC非上皮起源是在黑色素瘤和肉瘤设置兴趣爱好，如CTC可能发生的局限性。因此，这种技术允许可行CTC捕获和释放无基于抗原捕获引入潜在的偏见是非常可取的。
重要的是，基于微滤器捕获设备纯粹的尺寸和释放的策略是不可知的某些表面标记的存在。我们认为，PIPAAm涂层微孔过滤器的工作将有助于扩大我们的转移过程的理解，通过提供有效且高效地吸收和释放CTC为下游分析的能力。今年5月烈性ially露出的量新型靶向全身治疗可能被定向以及提供一种能够很容易地被监测，并在癌症患者管理助剂的生物标志物的新分子。
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Protocol
道德声明：为了保护人类受试者的权益，根据如下迈阿密机构审查委员会的IRB 20150020下的大学批准的方案知情同意书，获得血液样本。
注：血液要过滤四氯化碳采集应以EDTA管收集，以防血液凝结。
1.涂层用聚（N-异丙丙基丙烯酰胺）（PIPAAm）的精密的过滤
- 称出PIPAAm以制备丁醇10％w / v的溶液。混合使用涡旋直至溶液澄清。
- 切胶显微镜滑入大致12毫米×12平方毫米或者用剪刀或锋利的刀刃的。或者使用断头台。
注意：这些方块将作为在旋涂过程中的过滤器保持器。 - 用锋利的直边剪，切槽孔微过滤片成8毫米×8平方毫米。
- 用聚酰亚胺薄膜胶带固定的截止滤光片到塑料SQUA水库先前切割步骤1.3。应用该膜只对边缘和过滤器的角，使得过滤面积在小于7毫米×7 mm表示未包括的胶带。
图2：在精密的过滤设置为PIPAAm被膜 8毫米×8毫米微滤器的代表性示意图被定位在由塑料显微镜载片12毫米×12毫米塑料方形切割。聚酰亚胺胶带是用来固定微过滤到位，旋涂的PIPAAm.Reproduced与基准15的许可。 请点击此处查看该图的放大版本。
- 放置被固定在塑料方形，上旋涂机的真空吸盘的微过滤。
- 编程旋涂器，以下列配方：开始，500rpm下10秒，6000ř分60秒，500转10秒，停。
- 分配足够的10％w / v的PIPAAm溶液（在1.1中制备）使用一个标准的塑料移液管完全覆盖微过滤表面并启动旋涂机。
- 从旋涂器中取出PIPAAm涂覆微滤器完成包衣过程后。离开储存期间附连到塑料正方形的过滤器。
注：涂布的过滤器，可以在室温下储存长达3个月。
2.过滤盒的组装与PIPAAm涂层微尘
- 通过将仍然固定在塑料平方成培养皿的微滤器再水合室温PIPAAm涂覆微过滤。加1×PBS中，直到微滤器被完全淹没，静置5分钟。
- 水合步骤后，通过切割使用一对剪刀的聚酰亚胺薄膜带释放从塑料正方形的过滤器。
注：请注意其中的过滤器侧面有在PIPAAm涂层。 - 组装微滤器进入过滤盒中，通过与2聚二甲基硅氧烷（PDMS）个用作垫圈/密封沿夹着的顶部和底部的丙烯酸片之间的微过滤。钳夹子来固定过滤器，并提供了一个密封的压克力盒。
注：PIPAAm涂层应朝上，从而将样品过滤通过时，细胞将在过滤器上（ 图1）的PIPAAm涂覆的表面捕获。
3.血液样本过滤从微尘捕获和CTC释放
- 因为每个注射泵品牌都有其自己的用户界面，参阅泵的用户手册和编程注射泵在75毫升/小时的速度流动并定容至20ml。
- 暖3毫升的McCoy的（可商购）细胞培养基至37℃（通过添加10％胎牛血清和1％青霉素和链霉素的方法制备）。
- 添加7.5毫升市售Hank氏平衡盐溶液（HBSS）中来的7.5毫升血液样品和吸此稀释血液进入25毫升注射器。
注：1用HBSS 例如，如果使用的10ml血，然后用等体积的10毫升的HBSS以达到1混合：1稀释，以使血液样品与等体积的1稀释，调整的HBSS的音量。 - 接合用注射器过滤盒，并将其放置到注射泵。放置在50ml的管中，在底部收集通过流动和启动泵。
注：过滤应采取大约10 12分钟所有的过滤步骤是进行出在正常室温下（20-25℃），包括3.8的步骤 - 过滤完成后，脱开过滤盒，注意到这一侧是具有抓PIPAAm涂覆表面上的细胞的顶部。吸1ml所温暖的培养基到一个新的注射器。
- 再接合与包含媒体的注射器过滤盒，但此时，以使滤波器的PIPAAm涂覆表面朝向从注射器远离接合盒的底端。
注意：这将是对释放可以通过施加平缓逆流被嵌入到槽孔隙任何细胞。 - 放置注射器返回到注射泵和右边的过滤盒下保持一小培养皿或6孔板中。设置流速为100毫升/小时，并启动泵。
- 通过所有媒体通过过滤器，并收集在培养皿流通。等待所有的媒体通过，然后停泵，取下注射器从泵浦Nd过滤盒。
- 脱离注射器过滤盒和打开它来检索从盒的过滤器。放置与PIPAAm表面朝下到用于释放从孔中的细胞时，收集逆流相同的培养皿的过滤器。添加温介质的其余部分，培养皿放入设定在37℃的培养箱中。
- 30分钟后，所有的细胞将来自过滤器被释放。然而，离开过滤器在培养皿长达24小时，以确保所有的细胞分离。
注意：可替换地，释放的细胞可以被收集到一个离心管中，以进行进一步的下游分析，如PCR，ELISA，Western印迹，仅举几个例子。 - 在培养24小时，使用镊子小心地取出微型过滤器。
注：该过滤器可以在此时被丢弃的细胞已经从它释放。 - 轻轻吸取培养基上下用1000＆＃181：L移液管，以重新悬浮的红细胞和外周血单核细胞（PBMC），该被捕获在过滤器上，并释放到与四氯化碳的板。小心，轻轻地执行此操作，以避免拆卸松散连接的癌细胞。小心地取出含有再悬浮红细胞和PBMC同时留下附在癌细胞，并以新鲜培养基预先加热到37℃，后面整个介质。
注意：如果过多的红细胞是一次洗涤后，目前，该步骤可重复一次。
4. CTC生存能力评估
- 用活/死测定8评价CTC培养生存能力。
注：众多活/死测定法是市售的。按照制造商的协议是高度宜。请参考材料/试剂列表用于此实验商用测定试剂盒。
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Representative Results
用健康捐献者的血液（迈阿密IRB 20150020的大学批准的方案如下知情同意下而得到的）培养的癌细胞，可行的循环肿瘤细胞（CTC），实现了采集，发布和检索效率的释放温敏技术飙升分别为94％±9％，82％±5％和77％±5％（ 表1）15。通过比较，未涂覆的过滤器的释放和检索效率显著降低（7％±1％的释放效率和6％±1％检索效率）为（ 表1）15。为了评估从过滤器释放的CTC的生存能力，〜1000 SK-BR-3细胞掺入7.5毫升的健康供体的血液通过PIPAAm涂布槽的过滤器过滤，并用上述方法释放。被执行的活/死法秒杀到血液之前评估细胞活力和释放后。尖峰预存活率为98％（592出计数602细胞），并捕获并从血液释放的细胞的存活率为95％（540出567细胞计数）15（ 图3A）。平行地，将细胞捕获并从血液样品中释放出来，过滤后均的McCoy的5A培养基中培养。图像是在第3天和10天采取如在图3B中所示，从过滤器释放的细胞不仅仍然可行，但在培养物迅速扩大，从而确立了其生存能力交过滤。
图1：PIPAAm涂层槽过滤器吸收和释放从血液中循环肿瘤细胞 （上图）（A）PIPAAm涂槽过滤器明场图像;全血的采集CTC（B）过滤。的t（C）示意图他微滤器盒，其中，PIPAAm涂覆槽滤波器被夹在顶部和底部盒之间。该方法的（底部面板）（D）的示意图，以释放从PIPAAm涂布槽的过滤器捕获的CTC。从参考15被许可的。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：捕捉，存活的肿瘤细胞的释放和培养乳腺癌细胞（SKBR-3）掺入在正常供体血液中捕获，并通过一个PIPAAm涂覆微过滤释放。该细胞仍然存活后释放和文化迅速扩大。 （A）活死法从过滤器释放的细胞进行。 95％（540出计数567细胞）的细胞，证实是可行的（绿色）发布之后。死细胞被标记为红色。 （B）3日通过从PIPAAm涂槽过滤器释放细胞10天的文化。将细胞保持存活，并在培养中扩增。比例尺= 100与基准15的许可μm.Reproduced。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：孔参数预处理和后PIPAAm涂层的计量槽过滤器（A）前和（B）后PIPAAm涂层明场图像。后PIPAAm涂层和孔宽度PIPAAm涂后±5.6％，下降了15.3％（C）孔长分别下降7.3％±2.1％。从参考15转载许可。请点击此处查看该图的放大版本。
图5：污染的红细胞和白细胞通过温和淘移除由PIPAAm涂覆时隙过滤从血液中提取大约1000 SKBR-3细胞并铺于一个48孔板。 （a）在培养16小时，粘附到培养板（绿色箭头），而凋亡红细胞和白细胞SKBR-3的肿瘤细胞也沉淀在板（红色箭头）的底部。 （B）的后洗净，非贴壁细胞被除去，留下粘附的肿瘤细胞上的板（绿色箭头）。从参考15转载许可。 请点击此处查看该图的放大版本。
表1：采集，发布和PIPAAm涂层槽过滤器的检索效率捕获效率=之前发布/手机号码过滤器捕获细胞的数量掺入血。发布从发布前的过滤器捕获的过滤器/手机号码公布效率=细胞的数量。检索效率=从过滤器/手机号码公布手机号码掺入blood.Reproduced与许可参考15。
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Discussion
从全血中捕获可行四氯化碳和从微滤器释放他们的方法是相对简单;然而，几个关键点值得一提。这是必要的，因为与无菌条件在整个过程中保持所有细胞培养。涂布PIPAAm过滤器的初始步骤是重要的，因为用于释放从过滤器单元的技术的基础是基于利用PIPAAm的温度响应界面性质。为了确保过滤器已被有效地涂覆到涂覆之前测量在显微镜下在过滤器上的孔（狭缝孔的宽度和长度）的大小，然后再次测量的孔径后涂布。孔隙尺寸应为1μm的宽度和长度（ 图4）都被降低。如所提到的，而有效地捕获的CTC槽滤波器，还捕捉一些大的PBMC细胞，然而这些细胞是非粘附的细胞，并由此杜里纳克步骤3.13从培养而使粘附癌细胞的后面（ 图5）除去。
如果血液不同卷中的实例被过滤或当粘度极高，可能需要少量修改的协议。在协议中所提到的，它是稀释血液1临界：1用HBSS。的血液粘度从患者到患者而变化，但是在大多数情况下，这将不会影响过滤。会有某些实例当粘度过高或大血块存在时，在这种情况下，注射泵将无法通过过滤器，以迫使血液。它是在这些情况下应停止注射泵，从注射器脱离磁带盒中，打开盒的顶部分，但留下仍附着在下部的过滤器。大血块将在过滤器上容易看到。轻轻吸取1毫升的HBSS到过滤器，同时保持磁带在一个很小的昂勒让血块洗掉。一旦凝块已被去除，关闭磁带，它重新接合到注射器和继续过滤。
而PIPAAm涂布过滤器可以分批进行，并储存以备后用，我们已发现，这些预涂覆的过滤器的货架寿命为约3个月。有效捕获和细胞的释放可能部分由于PIPAAm降解随着时间的推移而减小。
一的限制因素，以从患者的CTC建立的培养将位于所存在的血液样品中的CTC数。低的数字将可能使扩大的单元格，如果不是不可能的极其困难的能力。然而，螯合剂具有低细胞计数的样品为更小的培养区域可以帮助，例如在96孔板代替6孔板的单个孔。培养基，或可商购的介质的变形例的鉴定，将提供最佳的环境FOR这些细胞的生长是必须被克服的另一个挑战。
CTC的分子和细胞分析癌症预后提供有价值的信息，并可能有助于驱动精密药15。从捕获过滤器发布了细胞的存活率是向能力培养患者CTC药物的敏感性和筛选试验重点发展。已经早就知道，四氯化碳倾向于从原发肿瘤的不同，因此有必要对待两个相应。作为一个例子，Schneeweiss等。报道，在转移性乳腺癌（MBC），转移性组织和原发肿瘤的抗原型材的不同之处高达20％的患者。预测指标，包括人类表皮生长因子受体2（HER2）的表达，重新评估可能有助于优化MBC治疗。而组织取样是侵入性的并且常常难以重复，四氯化碳分析只需要一个血样，并可能提供一种易于重复，实时＆＃34;液体活检“的做法22。
该技术的重要意义在于，虽然几个平台常用的CTC使用捕捉和分析在分子和细胞分析限制为固定剂是必要的加工样品，或CTC被固定在平台上。此外，基于亲和力的系统，该系统允许可行的CTC捕获和释放，有可能通过靶抗原15的选择偏差。另外，与PIPAAm涂料槽过滤器提供了一个标签免费平台，是从全血采集和可行的CTC释放有效和高效率。这种方法提供了可行的反恐委员会进一步鉴定，包括单细胞的表型和基因组分析以及体外 CTC文化的能力。
目前正在开发采用这种技术的临床应用。的能力，从patien有效的文化CTCŧ样品将导致有效的治疗配方团在患者与患者的基础上，揭示新的药物靶标，并导致有效的化疗药物的发展。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slot Filter | Circulogix Inc. | MSF-01 | Different size filters available based for filtration for CTC from blood or urine (www.circulogixinc.com) |
| poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) | Ploysciences Inc. | 21458 | Non-Hazardous. Store at room temp. |
| 1-Butanol | Sigma Aldrich | B7906 | Use in well ventilated area |
| Plastic Microscope Slides | Cole-Parmer | 48510-30 | Any plastic slides or alternatively any sort of square (Metal, Acrylic etc.) can be used if it will be bale to hold the 8mmx8mm filter square |
| Spin Coater | Specialty Coating Systems | SCS G3 Spin Coater | Instrument |
| Polyimide Tape | Uline | S-7595 | Polyimide is the generic name for Kapton Tape which can be purchased form multiple vendors (Amazon, Kaptontape.com) |
| HBSS- Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14025-092 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Falcon Petri dishes 35 x 10 mm | VWR | 25373-041 | |
| Microfilter Cassette | Circulogix Inc. | FC-01 | Custom catridges are avilable based on filtration for CTC from blood or urine |
| Syringe 20 ml | BD Scientific | 302830 | |
| Syringe Pump | KD scientific | 78-0100V | Any syringe pump capable of holding a 25 ml syringe may be used |
| Cellstar 50 ml Centrifuge tube | VWR | 82050-322 | |
| Greiner Bio One 6 well plate | VWR | 89131-688 | Any brand can be used, as long as the surface is compatiable for cell adesion and not repellant |
| SKBR3 Cells | ATCC | HTB-30 | |
| Live Dead Assay | Life Technologies | L3224 | Any assay that can provide a reasonable analysis to evaluate live cells will work |
| Cell Culture Incubator | VWR | 98000-368 | Any incubator that can be used for cell culture will suffice |
References
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