Summary
Un protocolo para utilizar un poli (N-iso propilacrilamida) (PIPAAm) microfiltro recubierto para la captura eficaz y la liberación de respuesta térmica de las células tumorales circulantes viables (CTC) se presenta. Este método permite la captura de CTC de la sangre de los pacientes y la posterior liberación de CTC viables para el cultivo aguas abajo fuera del chip, análisis y caracterización.
Abstract
Se demuestra un método para la captura basado tamaño de viable circulantes de células tumorales (CTC) de la sangre entera, junto con la liberación de estas células de chip para análisis y / o cultivo de aguas abajo. La estrategia emplea el uso de una novela parileno C microfiltro poro ranura membrana para capturar CTC y un revestimiento de poli (N-iso propilacrilamida) (PIPAAm) para termosensible liberación viable de la CTC capturado. La captura de células vivas se habilita al aprovechar el diseño de una geometría de poro ranura con dimensiones específicas para reducir la tensión de corte típicamente asociados con el proceso de filtración. Mientras que el microfiltro exhibe una alta eficacia de captura, la liberación de estas células no es trivial. Típicamente, sólo un pequeño porcentaje de las células se liberan cuando se utilizan técnicas tales como el flujo inverso o raspado celular. La fuerte adhesión de estas células cancerosas epiteliales a la membrana de parileno C es atribuible a la interacción electrostática no específica. Para contrarrestar THes efecto, hemos empleado el uso de recubrimiento PIPAAm y explotaron sus propiedades interfaciales de respuesta térmica para liberar las células del filtro. La sangre se filtró primero a temperatura ambiente. Por debajo de 32 ° C, PIPAAm es hidrofílico. A partir de entonces, el filtro se coloca en cualquiera de los dos medios de cultivo o un tampón mantenido a 37 ° C, lo que resulta en la PIPAAm girando hidrófobo, y posteriormente la liberación de las células electrostáticamente consolidados.
Introduction
La enfermedad metastásica es responsable de la mayoría de las muertes por cáncer. El desarrollo de biomarcadores de diagnóstico y pronóstico compañero para la metástasis es crucial en el manejo y tratamiento del cáncer. Las células tumorales circulantes (CTC) desempeñan un papel central en la diseminación tumoral y la metástasis. Además, al ser de fácil acceso como un biomarcador 'biopsia líquida', CTC en pacientes con cáncer de la sangre periférica ha ido en aumento como un "caldo de cultivo" para la investigación de biomarcadores de cáncer. CTC han sido bien validado como un biomarcador de pronóstico en diversos entornos de cáncer, incluyendo cáncer de mama, de próstata y el cáncer colorrectal 1-3. Sin embargo, los recientes avances en el campo de CTC ha indicado que la simple enumeración de estas células raras ha limitado la utilidad clínica, como se muestra en los ensayos clínicos de intervención 4. Por lo tanto, hay una necesidad emergente de tecnologías que permiten la caracterización molecular y funcional de CTC. En la actualidad, sólo existen pocas tecnologías que permiten for antígeno no sesgada, la captura viable y liberación de CTC, lo que permite robusto 5,6 análisis molecular y funcional de aguas abajo. La mayoría de estos dispositivos microfabricados se acoplan a las plataformas de microfluidos y por lo tanto tienen un factor limitante en la cantidad de sangre que que se pueden procesar, que oscila desde 2 hasta 4 ml 7-10. CTC son eventos raros en un único tubo de extracción de sangre (7,5 ml), por lo tanto reduciendo aún más la cantidad de sangre que puede ser procesada, dificulta en gran medida las posibilidades de capturar y aislar estas células de interés.
Hemos desarrollado dos tipos de dispositivos de microfiltro de membrana parileno C para la captura de CTC que explotan las diferencias de tamaño entre las células tumorales más grandes y las más pequeñas células sanguíneas normales 11,12. Hemos informado anteriormente en el filtro de poro enumeración ronda y lo comparó con una plataforma aprobada por la FDA, en el que el microfiltro se demostró que era superior en eficiencia de la captura de CTCpara las muestras de sangre de pacientes de cáncer 13,14. Sin embargo, una limitación del filtro redondo es la necesidad de utilizar un fijador a base de formaldehído antes de la filtración. Este proceso conserva la morfología de las células, mientras que lo que les permite resistir el esfuerzo cortante y presión durante el proceso de filtración. Mientras que la enumeración y los estudios moleculares se pueden realizar en el chip 13, el fijador deteriora la capacidad para llevar a cabo la caracterización funcional. Para hacer frente a esta limitación, hemos desarrollado un filtro de poro ranura que niega la necesidad de fijar las células antes de la filtración (Figura 1). La geometría de poros ranura (6 m de ancho x 40 micras poros de ranura longitud) permite que las células tumorales a ser capturados mientras ocluir sólo parcialmente un poro y por lo tanto aún permite el paso libre para otras células de la sangre y aliviar el aumento de presión que daría lugar a daño celular y eventual ruptura 15,16 El cartucho de poro ranura se compone de 2 piezas de acrílico que sándwichel filtro de poro ranura entre la pieza superior e inferior con polidimetilsiloxano (PDMS) que actúa como una junta para proporcionar una fuga sello a prueba de 14,15 (Figura 1).
Mientras que la eficacia de la captura del filtro de poro ranura es alta, (Tabla 1), el CTC capturado están unidos a la membrana de parileno C por fuertes interacciones electrostáticas no específicas en lugar de la matriz extracelular (ECM) de adhesión 15 mediada. Métodos tales como el flujo inverso o el uso de rascadores de células no liberan eficazmente las células del filtro, o resultar en el daño celular y la muerte celular. Exploramos un uso no convencional de PIPAAm para formular una estrategia de liberación 15. PIPAAm es un polímero que experimenta una transición de fase reversible de temperatura de solución crítica inferior (LCST) a una temperatura de la solución de 32 ° C 17. Tradicionalmente, esta propiedad de PIPAAm ha sido ampliamente explorada para aplicaciones de ingeniería de tejidos. Típicamente, las células sonsuperficies cultivadas en PIPAAm revestido a 37 ° C cuando PIPAAm es hidrófobo. Las células luego se pueden separar como una hoja cuando la temperatura de cultivo se desplaza por debajo de 32 ° C, donde la superficie de PIPAAm recubierto se hidrata 17,18. Hemos explotado esta propiedad térmica mediante la realización del proceso de filtración a temperatura ambiente (por debajo de 32 ° C) y luego permitiendo la liberación de células colocando el filtro en medios de cultivo se mantuvo a 37 ° C. A esta temperatura, la capa de polímero PIPAAm se convierte en hidrófobo, liberando de este modo las células unidas electrostáticamente 15 (Figura 1).
Aunque el método sensible a la temperatura, así como otros métodos se han aplicado con éxito para lograr la captura de CTC viable y liberar 19 - 21, un inconveniente potencial de clave compartida por estas tecnologías reportados es que todos ellos emplean un principio dependiente de antígeno para la captura de CTC. Antígeno de captura CTC base, como se muestra pestaba viendo anteriormente, puede dar lugar a 11,14 sesgado análisis de CTC. Por ejemplo, muchas tecnologías basadas en la afinidad emplean anticuerpo que se une EpCAM para la captura de CTC. Sin embargo, CTC se ha demostrado que expresan varios niveles de EpCAM, que conduce a la omisión de EpCAM baja y EpCAM CTC negativa por estas tecnologías. Además, las limitaciones se pueden producir cuando CTC de origen no epitelial es de interés, tal como en la configuración de CTC de melanoma y el sarcoma. Por lo tanto, una tecnología que permite la captura y liberación CTC viables y sin sesgo potencial introducido por captura basada antígeno es altamente deseable.
Es importante destacar que el dispositivo de captura de microfiltro es puramente basado tamaño y la estrategia de liberación es agnóstico a la presencia de ciertos marcadores de superficie. Creemos que el empleo del microfiltro recubierto PIPAAm ayudará a ampliar nuestra comprensión del proceso metastásico, a través de proporcionar la capacidad de capturar y liberar CTC para los análisis posteriores con eficacia y eficiencia. Esto puede potenteially exponer nuevas moléculas para las cuales terapias novedosas sistémicos pueden ser dirigidas, así como proporcionar un biomarcador que puede controlarse fácilmente y ayuda en la gestión de los pacientes de cáncer.
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Protocol
Declaración de Ética: Para proteger los derechos de los sujetos humanos, las muestras de sangre se obtuvieron después de un consentimiento informado en virtud de los protocolos aprobados por la Universidad de Miami juntas de revisión institucional bajo el IRB 20150020.
NOTA: La sangre que se filtra para la captura de CTC se debe recoger en un tubo con EDTA para prevenir la coagulación.
1. Recubrimiento de la microfiltro con poli (N-iso-propilacrilamida) (PIPAAm)
- Pesar PIPAAm para preparar una solución 10% w / v en butanol. Mezclar utilizando un vortex hasta que la solución es clara.
- microscopio plástico corte se desliza dentro de más o menos 12 mm x 12 mm cuadrados o bien con un par de tijeras o cuchilla afilada. Alternativamente, puede utilizar una guillotina.
NOTA: Estos cuadrados servirán como soporte para los filtros durante el proceso de recubrimiento por rotación. - Con un par de tijeras afiladas borde recto, corte la ranura de poro del microfiltro oblea en 8 mm x 8 mm cuadrados.
- Utilizando una cinta de película de poliamida asegurar los filtros de corte en el plástico squares cortada previamente en el paso 1.3. Aplicar la película sólo para el borde y la esquina del filtro de modo que al menos 7 mm x 7 mm de área de filtro es un-cubierto por la cinta.
Figura 2:. Ilustración representativa del microfiltro Set-up para PIPAAm revestimiento de 8 mm x 8 mm microfiltro se coloca en el 12 mm x mm de plástico 12 de corte cuadrado de un portaobjetos de microscopio de plástico. Cinta de poliimida se utiliza para asegurar el microfiltro en su lugar para hacer girar el escudo PIPAAm.Reproduced con permiso de referencia 15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Coloque el microfiltro que se asegura en la plaza de plástico, sobre el mandril vacío del spin-revestidor.
- Programar el spin-revestidor con la siguiente receta: Inicio, 500 rpm durante 10 seg, 6.000 rh durante 60 segundos, 500 rpm durante 10 segundos, en Detener.
- Dispensar suficiente 10% w / v solución PIPAAm (preparado en 1.1) para cubrir completamente la superficie microfiltro con una pipeta de transferencia de plástico estándar y comenzar la recubridora de rotación.
- Retire el microfiltro PIPAAm recubierto de la escisión recubridor después de completar el proceso de recubrimiento. Deje el filtro unido al cuadrado de plástico durante el almacenamiento.
NOTA: El filtro revestido se puede almacenar a temperatura ambiente durante un máximo de 3 meses.
2. Conjunto de filtración de casete con microfiltro PIPAAm Coated
- Rehidratar microfiltro recubierto PIPAAm a temperatura ambiente colocando el microfiltro todavía protegido en el cuadrado de plástico en una placa de Petri. Añadir 1x PBS hasta que el microfiltro está totalmente sumergido y dejar reposar durante 5 minutos.
- Después de la etapa de hidratación, suelte el filtro de la plaza de plástico mediante la reducción de la cinta de la película de poliimida con un par de tijeras.
NOTA: Tome nota de qué lado del filtro tieneel recubrimiento de PIPAAm. - Montar el microfiltro en el casete de filtración, intercalando el microfiltro entre la pieza de acrílico parte superior e inferior junto con las piezas 2 polidimetilsiloxano (PDMS) que actúa como una junta / sello. Sujetar el casete acrílico con clips para asegurar el filtro y proporcionar un sello hermético.
NOTA: El recubrimiento PIPAAm debe estar mirando hacia arriba, de manera que la muestra se filtró a través de, las células serán capturadas en la superficie recubierta PIPAAm del filtro (Figura 1).
3. La filtración de la muestra de sangre con la captura y liberación de CTC del microfiltro
- Como cada marca bomba de jeringa tiene su propia interfaz de usuario, consulte el manual de usuario de la bomba y programar la bomba de jeringa a fluir a una velocidad de 75 ml / h, y ajustar el volumen a 20 ml.
- Caliente 3 ml de medio (comercialmente disponible) de cultivo de células de McCoy (preparado mediante la adición de 10% de suero bovino fetal y 1% de penicilina y estreptomicina) a 37 ° C.
- Añadir 7,5 ml de solución salina equilibrada de Hank disponible comercialmente (HBSS) a la muestra 7,5 ml de sangre y aspirar esta sangre diluida en una jeringa de 25 ml.
NOTA: Ajuste el volumen de HBSS para que la muestra de sangre se diluye con un volumen igual de 1: 1 con HBSS Por ejemplo, si se utilizan 10 ml de sangre, a continuación, mezclar con igual volumen de 10 ml de HBSS para alcanzar el 1:. Dilución 1. - Enganche el casete de filtración con la jeringa y colocarlo en la bomba de jeringa. Colocar un tubo de 50 ml en la parte inferior para recoger el flujo a través de la bomba y comenzar.
NOTA: La filtración debe tener más o menos 10- 12 min. Todas las etapas de filtración se deben llevar aa temperatura ambiente normal (20-25 ° C), que incluye el paso 3.8 - Después de la filtración es completa, desenganchar el cartucho de filtración toma nota de qué lado está la parte superior que tiene las células atrapadas en la superficie recubierta de PIPAAm. Aspirar 1 ml de medio de cultivo caliente en una nueva jeringa.
- Volver a participar el casete de filtración con la jeringa que contiene los medios de comunicación, pero en este momento enganchar el extremo inferior de la casete de manera que el recubrimiento de superficie PIPAAm del filtro está de espaldas a la jeringa.
NOTA: Esta será la de liberar las células que pueden estar dentro de los poros de la ranura mediante la aplicación de flujo inverso suave. - Coloque la jeringa de nuevo en la bomba de jeringa y mantener una pequeña placa de Petri o placa de 6 pocillos justo debajo de la casete de filtración. Ajuste la velocidad de flujo de 100 ml / hora y arrancar la bomba.
- Pasar todos los medios de comunicación a través del filtro y se recoge el flujo a través de la placa de Petri. Espere a que todos los medios de comunicación para pasar a través y luego detener la bomba y retire la jeringa unand casete de filtración de la bomba.
- Desconectar el casete de filtración de la jeringa y abrirlo para recuperar el filtro de la cassette. Colocar el filtro con la superficie de PIPAAm hacia abajo en la misma placa de Petri utilizada para recoger el flujo inverso al liberar las células de los poros. Añadir el resto de los medios de comunicación cálidos y colocar la placa de Petri en un incubador de cultivo a 37 ° C.
- Después de 30 minutos todas las células se liberan del filtro. Sin embargo, dejar de filtro en la placa de Petri para un máximo de 24 horas para asegurarse de que todas las células se separan.
NOTA: Como alternativa, las células liberadas se pueden recoger en un tubo de microcentrífuga para llevar a cabo un análisis más detallado de aguas abajo, tales como PCR, ELISA, Western Blot para nombrar algunos ejemplos. - Después de 24 horas en cultivo, retirar con cuidado el microfiltro el uso de fórceps.
NOTA: El filtro se puede descartar en este momento ya que las células se han liberado de ella. - pipeta suavemente el medio de cultivo arriba y hacia abajo usando un & # 1000181; l pipeta, para volver a suspender los eritrocitos y células mononucleares de sangre periférica (CMSP) que son capturados en el filtro y se libera en la placa con la CTC. Realizar esta acción con cuidado y suavemente para evitar separando las células cancerosas unidos débilmente. Retirar con cuidado el medio completo que contiene los eritrocitos resuspendidas y PBMC, dejando detrás de las células del cáncer adjunta y sustituto con medio fresco precalentado a 37 ° C.
NOTA: Este paso puede repetirse una vez si los eritrocitos excesivas están presentes después de un lavado.
4. Evaluación de Viabilidad CTC
- Evaluar la viabilidad cultivaron CTC usando un / Ensayo Dead Live 8.
NOTA: Numerosos ensayos Live / Dead están disponibles comercialmente. Siguiendo el protocolo del fabricante, es muy recomendable. Por favor refiérase a la lista de materiales y / o reactivos para el kit de ensayo comercial utilizado para este experimento.
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Representative Results
El uso de la sangre de donantes sanos '(obtenida bajo un protocolo aprobado por la Universidad de Miami IRB 20150020 después de un consentimiento informado) enriquecida con células cancerosas cultivadas, la técnica de respuesta térmica para la liberación de células viables circulantes tumorales (CTC), la captura lograda, la liberación y la eficiencia de recuperación de 94% ± 9%, 82% ± 5% y 77% ± 5%, respectivamente (Tabla 1) 15. En comparación, la eficiencia de liberación y recuperación de filtros no recubiertos fueron significativamente menores (eficiencia de recuperación de 7% ± eficiencia de liberación 1% y 6% ± 1%) (Tablas 1) 15. Con el fin de evaluar la viabilidad de las CTC liberados de filtro, ~ 1,000 SK-BR-3 células se enriquecieron en 7,5 ml de sangre de donante sano, se filtra a través del filtro de ranura recubierto PIPAAm y liberado utilizando el método descrito anteriormente. Un ensayo Live / Dead se realizó para evaluar la viabilidad de las células antes de pico en sangrey después de la liberación. La viabilidad de pre-pico fue del 98% (592 de 602 células contadas) y la viabilidad de las células capturadas y liberadas a partir de sangre fue del 95% (540 fuera de 567 células contadas) 15 (Figura 3A). En paralelo, las células capturadas y liberadas después de la filtración de la muestra de sangre se cultivaron en medio de cultivo 5A de McCoy. Se tomaron imágenes en el día 3 y el día 10. Como se muestra en la Figura 3B, las células liberadas del filtro no sólo permanecieron viables, pero se expandieron rápidamente en cultivo, estableciendo así su filtración poste viabilidad.
Figura 1:. PIPAAm Coated Slot Filtros para capturar y liberar células tumorales circulantes de la sangre (Panel superior) (A) Imagen de campo claro de filtro de ranura recubierta PIPAAm; (B) La filtración de la sangre total para la captura de CTC. (C) Esquema de tque microfiltro casete en el que, filtro de ranura PIPAAm recubierto se intercala entre la parte superior y la parte inferior de casete. (Panel inferior) (D) Esquema del proceso para liberar capturado CTC de los filtros de ranura PIPAAm recubiertos. Reproducido con permiso de referencia 15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Las células de cáncer de mama de captura, lanzamiento y cultivo de células tumorales viables (RBSK-3) se disparó en la normalidad fueron capturados sangre del donante y puesto en libertad utilizando un microfiltro PIPAAm recubierto: Figura 3.. Las células se mantuvieron después de la liberación viable y expanden en cultivo rápidamente. (A) ensayo de Live-muerto lleva a cabo en las células liberadas del filtro. 95% (540 de 567 células contadas) de las células mostró ser viable(Verde) después de la liberación. Las células muertas se marcan en rojo. (D) Día 3 hasta el día 10 de cultivo de las células liberadas de filtro de ranura PIPAAm recubierto. Las células se mantuvieron viables y se expanden en cultivo. Barra de escala = 100 μm.Reproduced con permiso de referencia 15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Medición de Pore Parámetros pre- y post- PIPAAm Recubrimiento imágenes de campo claro de filtro de ranura (A) antes y (B) post-recubrimiento PIPAAm.. Longitud (C) del poro se redujo en un 7,3% ± 2,1% después de PIPAAm revestimiento y de poro ancho se redujo en un 15,3% ± 5,6% después del recubrimiento PIPAAm. Reproducido con permiso de referencia 15.Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: La contaminación de eritrocitos y leucocitos se eliminan mediante lavados suaves Aproximadamente 1.000 RBSK-3 células fueron recuperados de la sangre por el filtro de ranura PIPAAm revestido y se sembraron en una placa de 48 pocillos.. (A) A las 16 h en cultivo, las células tumorales RBSK-3 adheridas a la placa de cultivo (flechas verdes), mientras que los eritrocitos y leucocitos apoptóticos también estaban asentando en la parte inferior de la placa (flechas rojas). (B) Post-lavado, se eliminaron las células no adherentes, dejando las células tumorales adherentes en la placa (flechas verdes). Reproducido con permiso de referencia 15. Por favor,clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1:. Captura, la versión y la eficiencia de recuperación de PIPAAm ranura recubierto filtros de captura eficiencia = número de células capturadas en el filtro antes de los números de liberación / celulares añadidos en la sangre. Liberar el número de células de eficiencia = liberados de los números de filtro / celulares capturados en el filtro antes de la liberación. La eficiencia de recuperación = número de células liberadas de los números de filtro / celulares añadidos en blood.Reproduced con permiso de referencia 15.
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Discussion
El proceso de captura de CTC viable de la sangre entera y de liberarlos del microfiltro es relativamente sencilla; Sin embargo algunos puntos críticos son dignos de mención. Es imperativo, como con todo el cultivo de células que una condición estéril se mantiene a través de todo el proceso. El paso inicial de recubrir el filtro con PIPAAm es crítica, como la base para la técnica de la liberación de las células del filtro se basa en la explotación de propiedades interfaciales sensibles a la temperatura de PIPAAm. Para asegurar que el filtro ha sido recubierto con eficacia, medir el tamaño de un poro (anchura y longitud de un poro de la ranura) en el filtro bajo un microscopio antes del recubrimiento y de nuevo medir un recubrimiento de poros poste tamaño. El tamaño de poro debe ser disminuido por 1μm en la anchura y la longitud (Figura 4). Como se ha mencionado, el filtro de ranura de tiempo que captura de manera eficiente CTC, también captura algunas grandes células PBMC, sin embargo estas células son células no adherentes y por lo tanto During paso 3.13 se eliminan de la cultura dejando atrás las células de cáncer de adherentes (Figura 5).
modificaciones menores en el protocolo pueden ser necesarias si los diferentes volúmenes de sangre deben ser filtrada o en casos en los que la viscosidad es extremadamente alta. Como se mencionó en el protocolo, es fundamental para diluir la sangre 1: 1 con HBSS. La viscosidad de la sangre varía de paciente a paciente, sin embargo para la mayor parte, esto no afectará a la filtración. Habrá ciertos casos cuando la viscosidad es demasiado alta o coágulos grandes están presentes, en cuyo caso la bomba de jeringa no será capaz de forzar la sangre a través del filtro. Se recomienda en estos casos para detener la bomba de jeringa, desenganche el cassette de la jeringa, abrir la parte superior del casete, pero dejar el filtro todavía unido a la parte inferior. Grandes coágulos de sangre serán fácilmente visible en el filtro. pipeta suavemente 1 ml de HBSS en el filtro mientras sostiene el cassette en un ligero angLe permite al coágulo de lavar. Una vez que el coágulo se ha eliminado, cierre el casete, volver a comprometer a la jeringa y continuar filtración.
Mientras que los filtros PIPAAm recubiertos se pueden obtener en lotes y se almacenan para su uso posterior, se ha encontrado que la vida útil de estos filtros pre-revestido es de aproximadamente 3 meses. La captura y liberación de las células eficaz puede disminuir en parte debido a la degradación PIPAAm con el tiempo.
Uno de los factores limitantes para establecer una cultura de CTC paciente se acuesta en el número de CTC que están presentes en la muestra de sangre. Los números bajos probablemente hará que la capacidad de expandir las células extremadamente difícil, si no imposible. Sin embargo, el secuestro de una muestra con recuentos de células bajos en áreas de cultivo más pequeñas puede ayudar, tal como en un solo pocillo de placa de 96 pocillos en lugar de una placa de 6 pocillos. La identificación de los medios de cultivo, o la modificación de los medios de comunicación disponibles en el mercado, que proporcionará el ambiente óptimo for estas células para crecer es otro de los retos que tendrá que superar.
Los análisis moleculares y celulares de la CTC proporcionan información valiosa para el pronóstico del cáncer y pueden ayudar a la medicina de precisión unidad 15. La viabilidad de las células liberadas del filtro de captura es un desarrollo clave hacia la capacidad de paciente cultura CTC para las pruebas de sensibilidad a los fármacos y cribado. Se ha sabido durante mucho tiempo que CTC tienden a diferir de tumor primario y por lo tanto la necesidad de tratar tanto en consecuencia. Como un ejemplo, Schneeweiss et al. informaron que en el cáncer de mama metastásico (MBC), los perfiles de antígeno de tejido metastásico y tumor primario difieren en hasta el 20% de los pacientes. Nueva evaluación de los marcadores predictivos, incluyendo 2 en la expresión del receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2), podría ayudar a optimizar el tratamiento de MBC. Mientras que el muestreo de tejido es invasiva y, a menudo difícil de repetir, el análisis CTC requiere sólo una muestra de sangre y podría proporcionar una herramienta fácil de repetición, en tiempo real y #34; estrategia de la biopsia líquida "22.
Un gran importancia de la técnica radica en el hecho de que mientras que varias plataformas comúnmente usados en la captura de CTC y los análisis están limitados en los análisis moleculares y celulares como fijador es necesario para el procesamiento de la muestra, o el CTC se inmovilizan en la plataforma. Además, los sistemas basados en afinidad, que permiten la captura y la liberación viable CTC, potencialmente pueden estar sesgados por la elección del antígeno objetivo 15. Alternativamente, el filtro de ranura con el revestimiento PIPAAm proporciona una plataforma libre de etiqueta que es eficaz y eficiente en la captura y liberación de CTC viable de la sangre entera. Este método proporciona la capacidad para una caracterización adicional de CTC viable, incluyendo fenotípica de células individuales y el análisis genómico, así como ex vivo cultura CTC.
Actualmente se está trabajando para emplear esta tecnología para aplicaciones clínicas. La capacidad para efectivamente la cultura de CTC patient muestras dará lugar a la formulación de los regimientos terapia eficaz en un paciente a otro base, revelar nuevas dianas farmacológicas, y conducir al desarrollo de agentes quimioterapéuticos eficaces.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slot Filter | Circulogix Inc. | MSF-01 | Different size filters available based for filtration for CTC from blood or urine (www.circulogixinc.com) |
| poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) | Ploysciences Inc. | 21458 | Non-Hazardous. Store at room temp. |
| 1-Butanol | Sigma Aldrich | B7906 | Use in well ventilated area |
| Plastic Microscope Slides | Cole-Parmer | 48510-30 | Any plastic slides or alternatively any sort of square (Metal, Acrylic etc.) can be used if it will be bale to hold the 8mmx8mm filter square |
| Spin Coater | Specialty Coating Systems | SCS G3 Spin Coater | Instrument |
| Polyimide Tape | Uline | S-7595 | Polyimide is the generic name for Kapton Tape which can be purchased form multiple vendors (Amazon, Kaptontape.com) |
| HBSS- Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14025-092 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Falcon Petri dishes 35 x 10 mm | VWR | 25373-041 | |
| Microfilter Cassette | Circulogix Inc. | FC-01 | Custom catridges are avilable based on filtration for CTC from blood or urine |
| Syringe 20 ml | BD Scientific | 302830 | |
| Syringe Pump | KD scientific | 78-0100V | Any syringe pump capable of holding a 25 ml syringe may be used |
| Cellstar 50 ml Centrifuge tube | VWR | 82050-322 | |
| Greiner Bio One 6 well plate | VWR | 89131-688 | Any brand can be used, as long as the surface is compatiable for cell adesion and not repellant |
| SKBR3 Cells | ATCC | HTB-30 | |
| Live Dead Assay | Life Technologies | L3224 | Any assay that can provide a reasonable analysis to evaluate live cells will work |
| Cell Culture Incubator | VWR | 98000-368 | Any incubator that can be used for cell culture will suffice |
References
- Cristofanilli, M., Budd, G. T., et al. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N Engl J Med. 351 (8), 781-791 (2004).
- de Bono, J. S., Scher, H. I., et al. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).
- Cohen, S. J., Punt, C. J. a, et al. Prognostic significance of circulating tumor cells in patients with metastatic colorectal cancer. Ann. Oncol. 20 (7), 1223-1229 (2009).
- Smerage, J. B., Barlow, W. E., et al. Circulating Tumor Cells and Response to Chemotherapy in Metastatic Breast Cancer: SWOG S0500. J. Clin. Oncol. 32 (31), 3483-3490 (2014).
- Mach, A. J., Kim, J. H., Arshi, A., Hur, S. C., Di Carlo, D. Automated cellular sample preparation using a Centrifuge-on-a-Chip. Lab chip. 11 (17), 2827-2834 (2011).
- Ozkumur, E., Shah, A. M., et al. Inertial Focusing for Tumor Antigen-Dependent and -Independent Sorting of Rare Circulating Tumor Cells. Sci. Transl. Med. 5 (179), 179 (2013).
- Nagrath, S., Sequist, L. V., et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
- Hosokawa, M., Kenmotsu, H., et al. Size-Based Isolation of Circulating Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Microcavity Array System. PLoS ONE. 8 (6), (2013).
- Bhagat, A. A. S., Hou, H. W., Li, L. D., Lim, C. T., Han, J. Pinched flow coupled shear-modulated inertial microfluidics for high-throughput rare blood cell separation. Lab on a chip. 11 (11), 1870-1878 (2011).
- Tan, S. J., Lakshmi, R. L., Chen, P., Lim, W. -T., Yobas, L., Lim, C. T. Versatile label free biochip for the detection of circulating tumor cells from peripheral blood in cancer patients. Biosens. Bioelectron. 26 (4), 1701-1705 (2010).
- Vona, G., Sabile, A., et al. Isolation by size of epithelial tumor cells a new method for the immunomorphological and molecular characterization of circulatingtumor cells. Am. J. Pathol. 156 (1), 57-63 (2000).
- Marrinucci, D., Bethel, K., et al. Case study of the morphologic variation of circulating tumor cells. Human pathology. 38 (3), 514-519 (2007).
- Lin, H. K., Zheng, S., et al. Portable filter-based microdevice for detection and characterization of circulating tumor cells. Clin. Cancer Res. 16 (20), 5011-5018 (2010).
- Williams, A., Rawal, S., et al. Clinical translation of a novel microfilter technology Capture, characterization and culture of circulating tumor cells. PHT. , 220-223 (2013).
- Ao, Z., Parasido, E., et al. Thermoresponsive release of viable microfiltrated Circulating Tumor Cells (CTCs) for precision medicine applications. Lab Chip. 15, 4277-4282 (2015).
- Xu, T., Lu, B., Tai, Y. C., Goldkorn, A. A cancer detection platform which measures telomerase activity from live circulating tumor cells captured on a microfilter. Cancer Res. 70 (16), 6420-6426 (2010).
- Okano, T., Bae, Y. H., Jacobs, H., Kim, S. W. Thermally on-off switching polymers for drug permeation and release. J. Control. Release. 11 (1-3), 255-265 (1990).
- Yamada, N., Okano, T., Sakai, H., Karikusa, F., Sawasaki, Y., Sakurai, Y. Thermo-responsive polymeric surfaces; control of attachment and detachment of cultured cells. Die Makromol. Chemie, Rapid Commun. 11 (11), 571-576 (1990).
- Deng, Y., Zhang, Y., et al. An integrated microfluidic chip system for single-cell secretion profiling of rare circulating tumor cells. Sci. Rep. 4, 7499 (2014).
- Hou, S., Zhao, H., et al. Capture and stimulated release of circulating tumor cells on polymer-grafted silicon nanostructures. Adv. Mater. 25 (11), 1547-1551 (2013).
- Xiao, Y., Zhou, H., et al. Effective and selective cell retention and recovery from whole blood by electroactive thin films. ACS Appl. Mater. Interfaces. 6 (23), 20804-20811 (2014).
- Wallwiener, M., Hartkopf, A. D., et al. The impact of HER2 phenotype of circulating tumor cells in metastatic breast cancer: a retrospective study in 107 patients. BMC cancer. 15 (1), 403 (2015).
