Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Cancer Research

Capture og Frigivelse af levedygtige Cirkulerende tumorceller fra Blood

doi: 10.3791/54435 Published: October 28, 2016

Summary

En protokol til at udnytte en poly (N so-propylacrylamid) (PIPAAm) belagt mikrofilter til effektiv indfangning og termoresponsiv frigivelse af levedygtige cirkulerende tumorceller (CTC) præsenteres. Denne metode giver mulighed for indfangning af CTC fra patienternes blod og efterfølgende frigivelse af levedygtige CTC for nedstrøms off-chip kultur, analyser og karakterisering.

Abstract

Vi viser en metode til størrelse baseret fangst af levedygtige cirkulerende tumorceller (CTC) fra fuldblod, sammen med udgivelsen af ​​disse celler fra chip til nedstrøms analyse og / eller kultur. Strategien beskæftiger anvendelsen af en hidtil ukendt parylen C membran slot pore mikrofilter at indfange CTC og en belægning af poly (N -ISO-propylacrylamid) (PIPAAm) for termoresponsiv levedygtig frigivelse af det indfangede CTC. Indfangning af levende celler er aktiveret ved at udnytte konstruktionen af ​​en spalte poregeometri med specifikke dimensioner for at reducere forskydningsspændingen typisk er forbundet med filtreringen. Mens mikrofilteret udviser en høj indfangningseffektivitet, frigivelsen af ​​disse celler er ikke-triviel. Typisk kun en lille procentdel af cellerne frigives, når der anvendes teknikker såsom tilbageflow eller celle skrabning. Den stærke adhæsion af disse epitelcancerceller til parylen C membranen skyldes ikke-specifik elektrostatisk interaktion. For at modvirke ther virkning, anvendte vi brug af PIPAAm belægning og udnyttet sine termiske responsive grænsefladeegenskaber at frigøre cellerne fra filteret. Blod først filtreres ved stuetemperatur. Under 32 ° C, PIPAAm er hydrofil. Derefter filter, placeret enten dyrkningsmedier eller en puffer holdt ved 37 ° C, hvilket resulterer i PIPAAm drejning hydrofob, og efterfølgende frigivelse af de elektrostatisk bundne celler.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Metastatisk sygdom er ansvarlig for de fleste kræftdødsfald. Udvikling prognostisk og companion diagnostisk biomarkør for metastaser er afgørende i kræftbehandlingen og behandling. Cirkulerende tumorceller (CTC) spiller en central rolle i formidling tumor og metastase. Desuden er nemt at komme som en "flydende biopsi 'biomarkør, CTC i kræftpatienters er perifert blod været stigende som en" arnested "for kræft biomarkør forskning. CTC er blevet grundigt valideret som prognostisk biomarkør i forskellige indstillinger kræft, herunder bryst-, prostata- og tarmkræft 1 - 3 ud. Men de seneste fremskridt i CTC felt har tilkendegivet, at den blotte opregning af disse sjældne celler har begrænset klinisk anvendelighed, som vist i kliniske interventionsforsøg 4. Således er der et stigende behov for teknologier, som gør for molekylær og funktionel karakterisering af CTC. I øjeblikket findes der kun få teknologier, der gør det muligt for ikke-antigen forudindtaget, levedygtig indfangning og frigivelse af CTC, så robust nedstrøms molekylære og funktionel analyse 5,6. Størstedelen af disse microfabrikerede anordninger er koblet til mikrofluide platforme og har således en begrænsende faktor i mængden af blod, der kan behandles, som varierer fra 2-4 ml 7-10. CTC er sjældne begivenheder i et enkelt rør af blod draw (7,5 ml), og derfor er yderligere at reducere mængden af ​​blod, der kan behandles, i høj grad hindrer chancerne for at fange og isolering af disse celler af interesse.

Vi har udviklet to typer af parylen C membranfilter udstyr til indfangning af CTC, som udnytter størrelse forskelle mellem større tumorceller og de mindre normale blodceller 11,12. Vi har tidligere rapporteret på den runde pore tælling filter og sammenlignede den med en FDA-godkendt platform, hvor mikrofilteret blev vist at være overlegen i CTC indfangningseffektivitettil kræftpatient blodprøver 13,14. Men en begrænsning af runde filter er det nødvendigt at anvende et formaldehyd-baseret fiksativ inden filtrering. Denne proces bevarer celler morfologi samtidig giver dem mulighed for at modstå forskydningsspænding og tryk under filtreringen. Mens optælling og molekylære undersøgelser kan udføres on-chip 13, fiksativet svækker evnen til at udføre funktionel karakterisering. For at løse denne begrænsning, har vi udviklet en slot pore filter, der ophæver nødvendigheden af at fastsætte celler før filtrering (figur 1). Spalten poregeometri (6 um bredde x 40 um længde slot porer) tillader tumorcellerne, der skal indfanges mens kun delvis okkludere en pore og dermed stadig tillades fri passage for andre blodceller og afhjælpe trykforøgelsen der ville føre til celleskader og eventuel sprængning 15,16 slot pore patron består af 2 akryl stykker som sandwichspalten pore filter mellem de øverste og nederste stykke med Polydimethylsiloxan (PDMS), der virker som en pakning til tilvejebringelse af en læksikret tætning 14,15 (figur 1).

Mens indfangning effektiviteten af spalten pore filter er høj, er (tabel 1), det opfangede CTC bundet til parylen C membran ved stærke ikke-specifikke elektrostatiske interaktioner i stedet for ekstracellulære matrix (ECM) medieret adhæsion 15. Fremgangsmåder, såsom tilbageflow eller anvendelse af celle- skrabere ikke effektivt frigive cellerne fra filteret, eller medføre cellebeskadigelse og celledød. Vi udforskede en utraditionel brug af PIPAAm at formulere en release strategi 15. PIPAAm er en polymer, der undergår en reversibel lavere kritisk opløsningstemperatur (LCST) faseovergang ved en opløsningstemperatur på 32 ° C 17. Traditionelt denne egenskab af PIPAAm er blevet bredt udforsket til vævsdyrkningsapplikationer. Typisk er cellerdyrket på PIPAAm overflader ved 37 ° C, når PIPAAm er hydrofob. Cellerne kan derefter frigøres som et ark, når kulturen temperaturen er forskudt til under 32 ° C, hvor PIPAAm belagte overflade bliver hydratiseret 17,18. Vi udnyttede denne termiske egenskab ved at udføre filtreringsprocessen ved stuetemperatur (under 32 ° C) og derefter muliggør celle frigivelse ved at placere filteret i dyrkningsmedier holdt ved 37 ° C. Ved denne temperatur den PIPAAm polymerlaget bliver hydrofobt, derved frigøre elektrostatisk bundne celler 15 (figur 1).

Selvom temperaturen lydhør metode såvel som andre metoder er blevet gennemført med succes at opnå levedygtige CTC opsamling og frigive 19-21, en nøgle potentiel ulempe deles af disse teknologier rapporteret, er, at de alle anvender et antigen-afhængige princip for CTC fange. Antigen baseret CTC capture, som vist previously, kan føre til forudindtaget CTC analyse 11,14. For eksempel er mange affinitet-baserede teknologier ansætte antistof, der binder EpCAM for CTC fange. CTC er dog vist, at udtrykke forskellige EpCAM, hvilket fører til udeladelse af EpCAM lav og EpCAM negative CTC af disse teknologier. Ligeledes kan der opstå begrænsninger, når CTC fra ikke-epitel oprindelse er af interesse, såsom CTC i melanom og sarkom indstillinger. Således er en teknologi, der giver mulighed for levedygtige CTC indfangning og frigivelse uden potentiel skævhed indført ved antigen baseret capture er meget ønskeligt.

Vigtigere er mikrofilteret capture enhed rent størrelse baseret og strategi udgivelsen er agnostiker på tilstedeværelsen af ​​bestemte overflademarkører. Vi mener, at ansættelse af PIPAAm belagt mikrofilter vil bidrage til at udvide vores forståelse af den metastatiske proces, ved at give mulighed for at effektivt fange og frigive CTC for downstream analyser. Dette kan potentially eksponere nye molekyler, for hvilke nye målrettede systemiske behandlinger kan rettes samt give en biomarkør, der kan overvåges nemt og støtte i kræftpatient ledelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Etik Statement: For at beskytte rettighederne for mennesker blev blodprøver opnået efter et informeret samtykke under protokoller, der er godkendt af University of Miami institutionelle anmeldelse boards under IRB 20.150.020.
BEMÆRK: Blood, der skal filtreres for CTC capture skal indsamles i et EDTA-rør for at forhindre koagulation.

1. Belægning mikrofilteret med Poly (N-iso-propylacrylamid) (PIPAAm)

  1. Afvejes PIPAAm til fremstilling af en 10% vægt / volumen opløsning i butanol. Bland ved hjælp af en vortex, indtil opløsningen er klar.
  2. Cut plast mikroskop glider ind omtrent 12 mm x 12 mm firkanter enten med en saks eller skarp kniv. Alternativt kan en guillotine.
    BEMÆRK: Disse kvadrater vil tjene som en holder til filtrene under spin coating proces.
  3. Brug en skarp par lige kant saks, klippe slot pore mikrofilter wafer i 8 mm x 8 mm firkanter.
  4. Ved hjælp af en polyimid film tape fastgør de afskårne filtre på plasten squares tidligere skæres i trin 1.3. Påfør filmen kun til kanten og hjørnet af filteret, således at mindst 7 mm x 7 mm af filterareal er un-dækket af båndet.

Figur 2
Figur 2:. Repræsentant Illustration af Pollenfilter Set-up for PIPAAm Coating 8 mm x 8 mm mikrofilter er placeret på 12 mm x 12 mm plast firkantet skåret fra en plastik objektglas. Polyimid tape bruges til at sikre mikrofilteret på plads til at spinde pels PIPAAm.Reproduced med tilladelse fra henvisning 15. Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Placer mikrofilteret, der er fastgjort på plastik firkant, på vakuum borepatron af spin-coater.
  2. Programmere spin-coater til følgende opskrift: Start, 500 rpm i 10 sek, 6.000 rpm til 60 sek, 500 rpm i 10 sek, Stop.
  3. Dispensere nok 10% vægt / volumen PIPAAm opløsning (fremstillet i 1.1) til helt at dække mikrofilteret overflade ved anvendelse af en standard plast transfer pipette og starte spin coater.
  4. Fjern PIPAAm overtrukket mikrofilter fra spin-coater efter belægningen er fuldført. Efterlad filteret fastgjort til plast firkant under opbevaring.
    BEMÆRK: Den belagte-filter kan opbevares ved stuetemperatur i op til 3 måneder.

2. Montering af Filtration Cassette med PIPAAm Coated Pollenfilter

  1. Rehydrér PIPAAm overtrukket mikrofilter ved stuetemperatur ved at placere mikrofilteret stadig fastgjort på plast firkant i en petriskål. Tilføj 1x PBS indtil mikrofilteret er fuldt neddykket og lad stå i 5 min.
  2. Efter hydrering trin frigøre filteret fra plastik firkant ved at skære polyimid film tape hjælp af et par saks.
    BEMÆRK: Vær opmærksom på hvilken side af filteret harden PIPAAm belægning.
  3. Saml mikrofilteret ind i filtreringskassette, ved indlægning mikrofilteret mellem de øverste og nederste akryl stykke sammen med de 2 Polydimethylsiloxan (PDMS) stykker virker som en pakning / forsegling. Spænd akryl kassette med clips til at fastgøre filteret og give en tæt forsegling.
    BEMÆRK: PIPAAm belægning skal vende opad, så prøven filtreres igennem, vil cellerne blive fanget på PIPAAm coatede overflade af filteret (Figur 1).

3. Filtrering af blodprøve med Capture og Frigivelse af CTC fra Pollenfilter

  1. Som hver sprøjte pumpe mærke har sin egen brugerflade, henvises til brugermanualen for pumpen og programmere sprøjtepumpen til at flyde med en hastighed på 75 ml / time, og indstille lydstyrken til 20 ml.
  2. Varm 3 ml McCoys (kommercielt tilgængelig) cellekulturmedier (fremstillet ved tilsætning i 10% kalvefosterserum og 1% penicillin og streptomycin) til 37 ° C.
  3. Tilsættes 7,5 ml kommercielt tilgængelig Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) til 7,5 ml blodprøve og aspirere denne fortyndede blod i en 25 ml sprøjte.
    BEMÆRK: Indstil lydstyrken HBSS således at blodprøven fortyndes med samme volumen 1: 1 med HBSS Eg hvis der anvendes 10 ml blod, derefter blandes med samme volumen 10 ml HBSS for at opnå den 1:. Fortynding 1.
  4. Engagere filtrering kassette med sprøjten og placer den på sprøjtepumpen. Anbring en 50 ml rør ved bunden for at indsamle gennemstrømningen og starte pumpen.
    BEMÆRK: filtreringen bør tage omkring 10- 12 min. Alle filtreringstrin skal gennemføresud ved normal stuetemperatur (20-25 ° C), herunder trin 3.8
  5. Efter filtrering er færdig, frigøre filtreringskassette som noterer hvilken side der er øverst, der har cellerne fanget på PIPAAm overflade. Aspirer 1 ml af den varme dyrkningsmedier i en ny sprøjte.
  6. Re-engagere filtreringskassette med sprøjten med medierne, men på dette tidspunkt i indgreb med den nederste ende af kassetten, således at PIPAAm overtrukne overflade af filteret vender væk fra sprøjten.
    BEMÆRK: Denne vil være at frigive eventuelle celler, der kan indlejres i slot porer ved at anvende blid omvendt flow.
  7. Placer sprøjten tilbage på sprøjtepumpen og holde en lille petriskål eller 6-brønds plade lige under filtrering kassetten. Indstil strømningshastigheden til 100 ml / time og starte pumpen.
  8. Passere hele mediet gennem filteret og indsamle gennemløbet i petriskålen. Vent til alle medier til at passere gennem og derefter stoppe pumpen og fjern sprøjten ennd filtrering kassette fra pumpen.
  9. Frigør filtrering kassetten fra sprøjten og åbne den for at hente filteret fra kassetten. Placer filteret med PIPAAm nedad i den samme petriskål bruges til at indsamle den omvendte flow, når frigive cellerne fra porerne. Tilsæt resten af ​​de varme medier og placere petriskålen i en kultur inkubator indstillet til 37 ° C.
  10. Efter 30 min alle celler vil blive frigjort fra filteret. Imidlertid efterlader filter i petriskålen i op til 24 timer for at sikre alle celler løsnes.
    BEMÆRK: Alternativt kan de frigivne celler opsamles i et mikrocentrifugerør at udføre længere nedstrøms analyse såsom PCR, ELISA, Western blot for at nævne nogle få eksempler.
  11. Efter 24 timer i kultur, fjern forsigtigt mikrofilteret med pincet.
    BEMÆRK: Filteret kan kasseres på dette tidspunkt, da cellerne er blevet løsladt fra det.
  12. pipette forsigtigt dyrkningsmediet op og ned ved en 1.000 & #181; l pipette, at re-suspendere erythrocytter og perifert mononukleære blodceller (PBMC), som er fanget på filteret og frigives til pladen med CTC. Udfør denne handling omhyggeligt og forsigtigt for at undgå afmontering af de løst-vedhæftede cancerceller. Fjern forsigtigt hele medium, der indeholder de genindførte suspenderet erytrocytter og PBMC mens bag vedhæftet-kræftceller og erstatning med frisk medium præ-opvarmet til 37 ° C.
    BEMÆRK: Dette trin kan gentages én gang, hvis overdrevne erythrocytter er til stede efter en vask.

4. CTC Levedygtighed Evaluation

  1. Vurdere kulturperler CTC levedygtighed ved hjælp af en live / Dead Assay 8.
    BEMÆRK: Talrige Levende / Dead assays er kommercielt tilgængelige. Efter fabrikantens protokol meget anbefales. Der henvises til listen materialer / reagenser for den kommercielle assaykit anvendes til dette eksperiment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Brug raske donorer blod (opnået under en protokol godkendt af University of Miami IRB 20.150.020 efter et informeret samtykke) tilsat dyrkede kræftceller, den termoresponsive teknik til frigivelse af levedygtige cirkulerende tumorceller (CTC), opnåede capture, frigivelse og hentning effektivitet af 94% ± 9%, 82% ± 5% og 77% ± 5% (tabel 1) 15. Til sammenligning, frigivelse og genfinding effektivitet af ikke-coatede filtre var signifikant lavere (7% ± 1% frigivelse effektivitet og 6% ± 1% genfinding effektivitet) (tabel 1) 15. For at vurdere levedygtigheden af ​​CTCs frigives fra filter, ~ 1.000 SK-BR-3-celler blev tilsat til 7,5 ml af sunde donorens blod, filtreret gennem PIPAAm belagt slot filter og frigives ved anvendelse af fremgangsmåden beskrevet ovenfor. En live / dead assay blev udført for at vurdere cellernes levedygtighed før spidsen ind blodog efter udgivelsen. Den præ-spike levedygtighed var 98% (592 ud af 602 celler talt) og levedygtigheden af celler tilfangetagne og frigivet fra blod var 95% (540 ud 567 celler talt) 15 (figur 3A). Parallelt hermed cellerne fanget og frigivet efter filtrering fra blodprøven blev dyrket i McCoys 5A dyrkningsmedium. Billeder blev taget på dag 3 og dag 10. Som vist i figur 3B, celler frigivet fra filteret ikke kun forblev levedygtige, men voksede hurtigt i kultur og dermed skaber deres levedygtighed efter filtrering.

figur 1
Figur 1:. PIPAAm Coated Slot Filtre til Capture and Release Cirkulerende tumorceller fra Blood (Top panel) (A) Lysfelt billede af PIPAAm belagt slot filter; (B) Filtrering af fuldblod til CTC fange. (C) Skematisk af than mikrofilter kassette, hvor, PIPAAm overtrukne slot filter er indlagt mellem det øverste og nederste kassette. (Bundpanel) (D) Skematisk af processen til at frigive fanget CTC fra PIPAAm belagte slot filtre. Gengivet med tilladelse fra henvisning 15. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3:. Capture, udledning og kultur af levedygtige tumorceller Brystkræft celler (SKBR-3) tilsat i normal donorblod blev fanget og udgivet ved hjælp af en PIPAAm belagt mikrofilter. Cellerne forblev levedygtige indlæg frigivelse og udvidet i kultur hurtigt. (A) Levende-dead assay udført på cellerne frigives fra filteret. 95% (540 ud af 567 celler tælles) af cellerne viste sig at være levedygtige(Grøn) efter udgivelsen. Døde celler er mærket med rødt. (B) Dag 3 til og med dag 10 kultur af cellerne frigives fra PIPAAm belagt slot filter. Cellerne forblev levedygtige og udvidet i kultur. Scale bar = 100 μm.Reproduced med tilladelse fra henvisning 15. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4: Måling af Pore parametre før og efter PIPAAm Coating lysfelt billeder af slot filter (A) før og (B) post PIPAAm belægning.. (C) Pore længde blev reduceret med 7,3% ± 2,1% efter PIPAAm belægning og pore bredde blev reduceret med 15,3% ± 5,6% efter PIPAAm coating. Gengivet med tilladelse fra henvisning 15.Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5: Kontaminerende Erythrocytter og Leukocytter fjernes ved forsigtig Vasker Ca. 1.000 SKBR-3-celler blev hentet fra blod ved PIPAAm belagt slot filter og blev udpladet på en 48-brønds plade.. (A) ved 16 timer i kultur blev SKBR-3-tumorceller klæbet til dyrkningsplade (grønne pile), hvorimod apoptotiske erythrocytter og leukocytter også afregning i bunden af pladen (røde pile). (B) Post-vask blev ikke-adhærente celler fjernet, efterlader adhærente tumorceller på pladen (grønne pile). Gengivet med tilladelse fra henvisning 15. Venligstklik her for at se en større version af dette tal.

tabel 1
Tabel 1:. Capture, udledning og Retrieval Effektivitet af PIPAAm Coated Slot Filtre Capture effektivitet = celletal fanget på filteret før release / celletal tilsat i blodet. Slip effektivitet = celletal frigivet fra filter / celletal fanget på filteret, inden de frigives. Retrieval effektivitet = celletal frigivet fra filter / celle numre tilsat ind blood.Reproduced med tilladelse fra henvisning 15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Processen med at indfange levedygtige CTC fra fuldblod og frigive dem fra mikrofilteret er forholdsvis ligetil; men et par kritiske punkter er værd at nævne. Det er bydende nødvendigt, som med alle cellekultur som en steril tilstand opretholdes gennem hele processen. Det indledende trin til coating filteret med PIPAAm er kritisk, som grundlag for teknikken med at frigive cellerne fra filteret er baseret på at udnytte PIPAAm s temperaturafhængige grænsefladeegenskaber. At sikre filtret er blevet coatet effektivt, måle størrelsen af ​​en pore (bredde og længde af en spalte pore) på filtret under et mikroskop inden coating og derefter igen måle en porestørrelse efter belægning. Porestørrelsen bør reduceres med 1 um på både bredden og længden (figur 4). Som nævnt slidsen filter mens fanger CTC effektivt, indfanger også nogle store PBMC-celler, men disse celler er ikke-adhærente celler og dermed during trin 3.13 fjernes fra kulturen efterlader de adhærente cancerceller (figur 5).

kan være nødvendige mindre ændringer af protokollen hvis der skal filtreres eller i tilfælde forskellige volumener blod, når viskositeten er meget høj. Som nævnt i protokollen, er det vigtigt at fortynde blodet 1: 1 med HBSS. Viskositeten af ​​blod varierer fra patient til patient, men for det meste vil dette ikke påvirke filtrering. Der vil være visse tilfælde, når viskositeten er ekstremt høj eller store blodpropper er til stede, i hvilket tilfælde sprøjtepumpen vil ikke være i stand til at tvinge blodet gennem filteret. Det anbefales i disse tilfælde at stoppe sprøjtepumpen, frigør kassetten fra sprøjten, åbne den øverste del af kassetten, men lader filteret stadig fastgjort til bunddelen. Store blodpropper vil være let synlig på filteret. Forsigtigt pipette 1 ml HBSS på filteret, mens du holder kassetten i en lille angle til at tillade blodproppen at vaske af. Når koaglet er fjernet, lukke kassetten, re-engagere den på sprøjten og fortsætte filtrering.

Mens PIPAAm coatede filtre kan fremstilles i batches og opbevares til senere anvendelse, har vi fundet, at holdbarheden af ​​disse præcoatede filtre er cirka 3 måneder. Den effektive indfangning og frigivelse af cellerne kan være nedsat til dels skyldes den PIPAAm nedbrydende over tid.

En af de begrænsende faktorer for at etablere en kultur fra patient CTC vil ligge i antallet af CTC, der er til stede i blodprøven. Lavt antal vil sandsynligvis gøre evnen til at ekspandere cellerne yderst vanskeligt om ikke umuligt. sekvestrering af en prøve med lave celletal i mindre kulturområder, kan imidlertid hjælpe, såsom i en enkelt brønd på 96-brønds plade i stedet for en 6-brønds plade. Identifikationen af ​​dyrkningsmedier, eller ændring af kommercielt tilgængelige medier, vil der giver den optimale miljø for disse celler til at vokse er en anden udfordring, som skal overvindes.

Molekylære og cellulære analyser af CTC give værdifulde oplysninger til kræft prognose og kan hjælpe drev præcision medicin 15. Levedygtigheden af ​​cellerne frigives fra capture filter er en vigtig udvikling mod evnen til kultur patient CTC for lægemiddelfølsomhed og screeningstest. Det har længe været kendt, at CTC tendens til at afvige fra den primære tumor og således nødvendigheden af ​​at behandle både i overensstemmelse hermed. Som et eksempel, Schneeweiss et al. rapporterede, at i metastatisk brystcancer (MBC), antigen profiler af metastatisk væv og primær tumor forskellige med op til 20% af patienterne. Revurdering af prædiktive markører, herunder human epidermal vækstfaktor receptor 2 (HER2) udtryk, kan bidrage til at optimere MBC behandling. Mens væv prøveudtagning er invasiv og ofte svært at gentage, CTC analyse kræver kun en blodprøve og kan give en nem at repeat, real-time & #34; flydende biopsi "tilgang 22.

En større betydning af teknikken ligger i det faktum, at mens flere platforme almindeligt anvendt i CTC opsamling og analyser er begrænset i molekylære og cellulære analyser som et fiksativ er nødvendigt for behandling af prøven, eller CTC immobiliseres på platformen. Endvidere kan affinitet-baserede systemer, som giver mulighed for levedygtige CTC indfangning og frigivelse, potentielt påvirket af valg af mål-antigen 15. Alternativt slot filter med PIPAAm belægning giver en etiket gratis platform, der er effektiv og effektiv i capture og frigivelse af levedygtige CTC fra fuldblod. Denne metode giver mulighed for yderligere karakterisering af levedygtige CTC, herunder enkelt celle fænotypiske og genomisk analyse samt ex vivo CTC kultur.

Der arbejdes i øjeblikket at ansætte denne teknologi til kliniske anvendelser. Evnen til effektivt at kultur CTC fra patienT sampler vil føre til formulering af effektive terapi regimenter på en patient til patient basis, afsløre nye lægemiddelmål, og føre til udvikling af effektive kemoterapeutiske midler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Slot Filter Circulogix Inc. MSF-01 Different size filters available based for filtration for CTC from blood or urine (www.circulogixinc.com)
poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm)  Ploysciences Inc. 21458 Non-Hazardous. Store at room temp.
1-Butanol Sigma Aldrich B7906 Use in well ventilated area
Plastic Microscope Slides Cole-Parmer 48510-30 Any plastic slides or alternatively any sort of square (Metal, Acrylic etc.) can be used if it will be bale to hold the 8mmx8mm filter square
Spin Coater Specialty Coating Systems SCS G3 Spin Coater Instrument
Polyimide Tape Uline S-7595 Polyimide is the generic name for Kapton Tape which can be purchased form multiple vendors (Amazon, Kaptontape.com)
HBSS- Hank's Balanced Salt Solution Gibco 14025-092
1x PBS Gibco 10010-023
Falcon Petri dishes 35 x 10 mm VWR 25373-041
Microfilter Cassette Circulogix Inc. FC-01 Custom catridges are avilable based on filtration for CTC from blood or urine 
Syringe 20 ml BD Scientific 302830
Syringe Pump KD scientific  78-0100V Any syringe pump capable of holding a 25 ml syringe may be used
Cellstar 50 ml Centrifuge tube VWR 82050-322
Greiner Bio One 6 well plate VWR 89131-688 Any brand can be used, as long as the surface is compatiable for cell adesion and not repellant
SKBR3 Cells ATCC HTB-30
Live Dead Assay Life Technologies L3224 Any assay that can provide a reasonable analysis to evaluate live cells will work
Cell Culture Incubator VWR 98000-368 Any incubator that can be used for cell culture will suffice

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cristofanilli, M., Budd, G. T., et al. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N Engl J Med. 351, (8), 781-791 (2004).
  2. de Bono, J. S., Scher, H. I., et al. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin Cancer Res. 14, (19), 6302-6309 (2008).
  3. Cohen, S. J., Punt, C. J. a, et al. Prognostic significance of circulating tumor cells in patients with metastatic colorectal cancer. Ann. Oncol. 20, (7), 1223-1229 (2009).
  4. Smerage, J. B., Barlow, W. E., et al. Circulating Tumor Cells and Response to Chemotherapy in Metastatic Breast Cancer: SWOG S0500. J. Clin. Oncol. 32, (31), 3483-3490 (2014).
  5. Mach, A. J., Kim, J. H., Arshi, A., Hur, S. C., Di Carlo, D. Automated cellular sample preparation using a Centrifuge-on-a-Chip. Lab chip. 11, (17), 2827-2834 (2011).
  6. Ozkumur, E., Shah, A. M., et al. Inertial Focusing for Tumor Antigen-Dependent and -Independent Sorting of Rare Circulating Tumor Cells. Sci. Transl. Med. 5, (179), 179 (2013).
  7. Nagrath, S., Sequist, L. V., et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450, (7173), 1235-1239 (2007).
  8. Hosokawa, M., Kenmotsu, H., et al. Size-Based Isolation of Circulating Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Microcavity Array System. PLoS ONE. 8, (6), (2013).
  9. Bhagat, A. A. S., Hou, H. W., Li, L. D., Lim, C. T., Han, J. Pinched flow coupled shear-modulated inertial microfluidics for high-throughput rare blood cell separation. Lab on a chip. 11, (11), 1870-1878 (2011).
  10. Tan, S. J., Lakshmi, R. L., Chen, P., Lim, W. -T., Yobas, L., Lim, C. T. Versatile label free biochip for the detection of circulating tumor cells from peripheral blood in cancer patients. Biosens. Bioelectron. 26, (4), 1701-1705 (2010).
  11. Vona, G., Sabile, A., et al. Isolation by size of epithelial tumor cells a new method for the immunomorphological and molecular characterization of circulatingtumor cells. Am. J. Pathol. 156, (1), 57-63 (2000).
  12. Marrinucci, D., Bethel, K., et al. Case study of the morphologic variation of circulating tumor cells. Human pathology. 38, (3), 514-519 (2007).
  13. Lin, H. K., Zheng, S., et al. Portable filter-based microdevice for detection and characterization of circulating tumor cells. Clin. Cancer Res. 16, (20), 5011-5018 (2010).
  14. Williams, A., Rawal, S., et al. Clinical translation of a novel microfilter technology Capture, characterization and culture of circulating tumor cells. PHT. 220-223 (2013).
  15. Ao, Z., Parasido, E., et al. Thermoresponsive release of viable microfiltrated Circulating Tumor Cells (CTCs) for precision medicine applications. Lab Chip. 15, 4277-4282 (2015).
  16. Xu, T., Lu, B., Tai, Y. C., Goldkorn, A. A cancer detection platform which measures telomerase activity from live circulating tumor cells captured on a microfilter. Cancer Res. 70, (16), 6420-6426 (2010).
  17. Okano, T., Bae, Y. H., Jacobs, H., Kim, S. W. Thermally on-off switching polymers for drug permeation and release. J. Control. Release. 11, (1-3), 255-265 (1990).
  18. Yamada, N., Okano, T., Sakai, H., Karikusa, F., Sawasaki, Y., Sakurai, Y. Thermo-responsive polymeric surfaces; control of attachment and detachment of cultured cells. Die Makromol. Chemie, Rapid Commun. 11, (11), 571-576 (1990).
  19. Deng, Y., Zhang, Y., et al. An integrated microfluidic chip system for single-cell secretion profiling of rare circulating tumor cells. Sci. Rep. 4, 7499 (2014).
  20. Hou, S., Zhao, H., et al. Capture and stimulated release of circulating tumor cells on polymer-grafted silicon nanostructures. Adv. Mater. 25, (11), 1547-1551 (2013).
  21. Xiao, Y., Zhou, H., et al. Effective and selective cell retention and recovery from whole blood by electroactive thin films. ACS Appl. Mater. Interfaces. 6, (23), 20804-20811 (2014).
  22. Wallwiener, M., Hartkopf, A. D., et al. The impact of HER2 phenotype of circulating tumor cells in metastatic breast cancer: a retrospective study in 107 patients. BMC cancer. 15, (1), 403 (2015).
Capture og Frigivelse af levedygtige Cirkulerende tumorceller fra Blood
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rawal, S., Ao, Z., Agarwal, A. Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood. J. Vis. Exp. (116), e54435, doi:10.3791/54435 (2016).More

Rawal, S., Ao, Z., Agarwal, A. Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood. J. Vis. Exp. (116), e54435, doi:10.3791/54435 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter