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Cancer Research

キャプチャと血液から生存循環腫瘍細胞のリリース

doi: 10.3791/54435 Published: October 28, 2016

Summary

プロトコルは、ポリ(N -iso-プロピル)効果的な捕獲、生存循環腫瘍細胞(CTC)の熱応答性放出のための(PIPAAm)コーティングされたマイクロフィルター提示さを利用します。この方法は、患者の血液と下流オフチップの文化のための実行可能なCTCの今後のリリースからのCTCの捕獲を可能に分析し、特性評価。

Abstract

私たちは、下流の分析および/または培養のためのチップからのこれらの細胞のリリースに伴い、全血から実行可能な循環腫瘍細胞(CTC)のサイズベースの捕獲のための方法を示しています。戦略は、CTCと撮影しCTCの熱応答性実行可能なリリースのためのポリコーティング(N -ISO-プロピル)(PIPAAm)を取得するための新規なパリレンC膜のスロット孔のマイクロフィルターの使用を採用します。生きた細胞の捕獲は、典型的には、濾過プロセスに関連付けられたせん断応力を低減するために、特定の寸法を有するスロット細孔形状の設計を活用することで有効になっています。マイクロフィルターは、高い捕集効率を示すが、これらの細胞の放出は非自明です。そのような逆流または細胞掻爬などの技術が使用される場合、典型的には、細胞のわずかな割合が放出されます。パリレンC膜へのこれらの上皮癌細胞の強力な接着は、非特異的静電相互作用に起因します。目に対抗します効果がある、我々はPIPAAmのコーティングの使用を採用し、フィルターから細胞を解放するためにその熱応答性の界面特性を利用しました。血液は、最初に室温で濾過します。 32°C以下、PIPAAmは親水性です。その後、フィルターを培地またはPIPAAm旋回疎水性になる37℃に維持バッファのいずれかに配置され、続いて静電的に結合した細胞を放出します。

Introduction

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転移性疾患は、ほとんどの癌死亡の原因です。転移するための予後とコンパニオン診断バイオマーカーを開発することは、がんの管理と治療に重要です。循環腫瘍細胞(CTC)は、腫瘍の播種および転移において中心的な役割を果たしています。また、「液体生検」のバイオマーカーとして簡単にアクセス可能で、CTCは、癌患者における癌バイオマーカー研究のための温床 ''末梢血のように上昇しています」。 3 - CTCはよく乳癌、前立腺癌および結腸直腸癌1を含む様々な癌の設定、で予後バイオマーカーとして検証されています。しかし、CTCの分野における最近の進歩は、介入臨床試験4に示すように、これらの希少細胞の単なる列挙は、臨床的有用性を制限していることが示されました。このように、CTCの分子および機能的特徴付けを可能にする技術の新興必要性があります。現在、わずか数技術がfoを可能にする存在しますrの非抗原バイアスされ、実行可能な捕捉およびCTCのリリース、堅牢な下流の分子と機能解析の5,6を可能します。これらの微細加工装置の大半は、マイクロ流体プラットフォームに結合され、したがって、2〜4ミリリットル7の範囲であることを処理することができる血液の量、の制限要因持っている- 10。 CTCが大幅捕捉および目的のこれらの細胞を単離する可能性を妨げ、従って、さらに処理することができる血液の量を減少させる、採血(7.5 ml)を単一チューブで珍しい事象です。

我々は、より大きな腫瘍細胞およびより小さい正常な血液細胞11,12の間のサイズの違いを利用するCTCの捕獲のためのパリレンC膜マイクロデバイスの2種類を開発しました。我々は以前のラウンド細孔列挙フィルタに報告し、マイクロフィルタは、CTCの捕獲効率が優れていることが示されたFDA承認プラットフォームとそれを比較しました癌の患者の血液サンプル13,14。しかし、円形フィルタの制限は、濾過前に、ホルムアルデヒドベースの固定剤を使用する必要があります。このプロセスは、それらが濾過プロセスの間にせん断応力と圧力に耐えることができるようにしながら、細胞の形態を保持します。列挙及び分子的研究は、オンチップ13を行うことができるが、固定は、機能的特徴付けを実行する能力を損ないます。この制限に対処するために、我々は、濾過前( 図1)に細胞を固定するための必要性を否定するスロット孔のフィルターを開発ました。スロット孔形状(6ミクロン幅×40μmの長スロット孔)部分的にしか細孔を閉塞するので、さらに他の血液細胞のための自由な通過を可能にし、細胞の損傷につながる圧力の上昇を緩和しながら、腫瘍細胞が捕捉することを可能にしますそして最終的に破裂15,16は、スロット孔のカートリッジはサンドイッチ2アクリル片で構成されています漏れ防止シール14,15( 図1)を提供するために、ガスケットとしてポリジメチルシロキサン(PDMS)の演技でトップとボトムピース間のスロット孔フィルター。

スロット孔フィルタの捕捉効率が高いが、( 表1)、捕捉CTC代わりに接着15を媒介 、細胞外マトリックス(ECM)の強い非特異的静電相互作用によって、パリレンC膜に結合されています。そのような逆流または細胞スクレーパーを使用するなどの方法が効果的にフィルターから細胞を放出し、または細胞損傷および細胞死をもたらすことができません。私たちは、リリース戦略15を策定するPIPAAmの型破りな使用を検討しました。 PIPAAmは可逆下限臨界溶液温度(LCST)32°C 17の溶液温度で相転移を受けるポリマーです。伝統的に、PIPAAmのこの特性は、広く組織工学アプリケーションのために検討されています。典型的には、細胞でありますPIPAAmが疎水性である場合、37°C​​でPIPAAm被覆された表面上で培養しました。培養温度は、PIPAAm被覆された表面が水和17,18なる32°C以下に移行するときに、細胞は、次にシートとして取り外すことができます。我々は、(32℃未満)を室温で濾過処理を行い、その後37℃で維持培地にフィルタを配置することによって、細胞の放出を可能にすることによって、この熱的性質を利用しました。この温度で、PIPAAmのポリマー層は、それによって静電結合した細胞15( 図1)を解放し、疎水性になります。

温度応答方法だけでなく、他の方法が成功し19キャプチャおよびリリースの実行可能なCTCを達成するために実装されているが- 21を 、報告されたこれらの技術によって共有される1つのキーの潜在的な欠点は、それらすべては、CTCの捕獲のための抗原依存性の原則を採用することです。抗原ベースのCTC捕獲、示すように、previously、バイアスされたCTC分析11,14につながる可能性があります。例えば、多くの親和性に基づく技術は、CTCの捕獲のためのEpCAMに特異的に結合する抗体を使用します。ただし、CTCは、これらの技術によってEpCAMの低EpCAMの負CTCの漏れにつながるのEpCAMの様々なレベルを発現することが示されています。非上皮起源からCTCは黒色腫および肉腫の設定で、このようなCTCとして、関心がある場合にも、制限が発生することがあります。したがって、抗原ベースのキャプチャーによって導入された潜在的なバイアスなしで実行可能なCTCの捕獲および放出を可能にする技術が非常に望ましいです。

重要なことは、マイクロキャプチャ装置は、純粋に基づく大きさと解放戦略は、特定の表面マーカーの存在に依存しないです。私たちは、PIPAAm被覆したマイクロフィルターの雇用が効果的かつ効率的に捕捉し、下流の分析のためにCTCを放出する能力を提供することを通じて、転移過程の理解を広げるのに役立つと確信しています。これは強力かもしれませんially小説は全身療法が向けだけでなく、容易に監視することができるバイオマーカーを提供し、がん患者管理に役立つ可能性があります対象とするための新たな分子を公開します。

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Protocol

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倫理文:ヒト被験者の権利を保護するために、血液試料をIRB 20150020下のマイアミ大学の治験審査委員会によって承認されたプロトコルの下にインフォームドコンセント後に得られました。
注:CTCの捕獲のためにフィルタリングされる血液が凝固を防ぐために、EDTAチューブに収集することができる必要があります。

1.ポリ(N-イソ - プロピル)(PIPAAm)を持つマイクロフィルタをコーティング

  1. ブタノール中10%重量/体積溶液を調製しPIPAAmを量ります。溶液が透明になるまでボルテックスを用いて混合します。
  2. カットプラスチック顕微鏡は、ハサミや鋭利な刃のペアでおよそ12ミリメートル×12ミリメートルの正方形のいずれかにスライド。代わりにギロチンを使用します。
    注:これらの正方形は、スピンコーティングプロセス中にフィルタのホルダーとして機能します。
  3. ストレートエッジのはさみの鋭いペアを使用して、8ミリメートル×8ミリの正方形にスロット孔のマイクロフィルターのウェハをカット。
  4. プラスチックsquaにカットフィルタを固定したポリイミドフィルムテープを使用して解像度以前にステップ1.3でカット。フィルタ領域の少なくとも7ミリメートルX 7ミリメートルをテープで未覆われるようにエッジのみとフィルタのコーナーにフィルムを適用します。

図2
図2:PIPAAmコーティング 8ミリメートル×8ミリメートルのマイクロフィルターのためのマイクロフィルターセットアップの代表的なイラストは、プラスチック顕微鏡スライドから12ミリメートル×12ミリメートルのプラスチック正方形のカットの上に配置されています。ポリイミドテープは、基準15からの許可を得てコートにPIPAAm.Reproducedをスピンさせる代わりに、マイクロフィルターを固定するために使用されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

  1. スピンコーターの真空チャック上に、プラスチック製の正方形の上に固定されたマイクロフィルタを配置します。
  2. プログラムの次のレシピへのスピンコーター:スタート、10秒間500rpmで、6000 R60秒、10秒間500 rpmで、停止のための午後。
  3. 完全に標準的なプラスチック製のトランスファーピペットを用いて、マイクロフィルターの表面を覆い、スピンコーターを開始する(1.1に調製した)ワット/ vのPIPAAm溶液を十分に10%を分配します。
  4. コーティングプロセスが完了した後、スピンコーターからPIPAAm被覆されたマイクロフィルタを削除します。保管中にプラスチック製の正方形に取り付けられたフィルターを残します。
    注:コーティングされたフィルタは、最大3ヶ月間室温で保存することができます。

PIPAAmコーティングされたマイクロフィルターで濾過カセットの2組立

  1. まだペトリ皿にプラスチック製の正方形の上に固定マイクロフィルタを配置することによって、室温でPIPAAm被覆されたマイクロフィルターを再水和。マイクロフィルターが完全に水没するまで、1×PBSを加え、5分間放置しました。
  2. 水和工程の後、はさみのペアを使用してポリイミドフィルムテープを切断することにより、プラスチックの正方形からフィルタを解除します。
    注:フィルタの側が持っているのをメモしておいてくださいPIPAAm被覆。
  3. 2ポリジメチルシロキサン(PDMS)の部分がガスケット/シールとして機能するとともに、上部と下部のアクリルピースとの間のマイクロフィルターを挟んで、ろ過カセットにマイクロフィルターを組み立てます。フィルタを確保し、気密シールを提供するために、クリップでアクリルカセットをクランプします。
    注:サンプルはを通じて濾過されるようにPIPAAmコーティングは、上向きにする必要があり、細胞はフィルターのPIPAAm被覆された表面に捕捉されます( 図1)。

マイクロフィルターからのキャプチャとCTCのリリースと血液サンプルの3ろ過

  1. 各シリンジポンプのブランドが独自のユーザーインタフェースを持っているように、75ミリリットル/時の速度で流れ、20ミリリットルにボリュームを設定するためにシリンジポンプポンプ、プログラムのマニュアルを参照してください。
  2. 37°Cまで(10%ウシ胎児血清および1%ペニシリン及びストレプトマイシンで添加することにより調製した)マッコイ(市販の)細胞培養培地3mlの暖かいです。
  3. 7.5ミリリットルの血液試料に市販のハンクス平衡塩溶液(HBSS)の7.5ミリリットルを追加し、25ミリリットルの注射器にこの希釈血液を吸引します。
    1希釈:10mlの血液を使用する場合は、1を達成を10 mlのHBSSの等量混合HBSS 例えば 1:注:血液サンプルが1等量の希釈されるように、HBSSの音量を調整します。
  4. 注射器でろ過カセットをエンゲージし、シリンジポンプの上に置きます。フロースルーを収集し、ポンプを起動するために下部に50ミリリットルチューブを置きます。
    注:濾過はおよそ10〜12分を取る必要があります。すべての濾過工程を実施することになっていますステップ3.8を含む通常の室温(20〜25℃)で実施
  5. ろ過が完了した後、側はPIPAAm被覆表面に引っ掛かっセルを有するトップでろ過カセット撮影ノートを外します。吸引し、新しい注射器への暖かい培養培地の1ミリリットル。
  6. メディアを含む注射器でろ過カセットを再従事するが、フィルターのPIPAAm被覆された面が離れて注射器から直面しているように、この時点で、カセットの底端部に係合します。
    注:これは、穏やかな逆流を適用することにより、スロット孔の中に埋め込むことができる任意の細胞を放出するであろう。
  7. バックシリンジポンプへシリンジを置き、右ろ過カセットの下に小さなペトリ皿または6ウェルプレートを保持します。 100ミリリットル/時の流量を設定し、ポンプを起動します。
  8. フィルタを介してすべてのメディアをパスし、フロースルーシャーレ内を集めます。すべてのメディアが通過するのを待ってから、ポンプを停止し、シリンジaを削除しますポンプからの濾過カセットをND。
  9. 注射器からの濾過カセットを外し、カセットからフィルタを取得するために、それを開きます。 PIPAAm表面が毛穴から細胞を解放するときに逆流を収集するために使用したのと同じシャーレに下に向けてフィルタを配置します。暖かいメディアの残りの部分を追加し、37℃に設定した培養インキュベーターにペトリ皿を置きます。
  10. 30分後、すべての細胞がフィルターから解放されます。しかし、すべての細胞がデタッチ確保するために24時間までペトリ皿にフィルタを残します。
    注:また、放出された細胞は、いくつか例を挙げると、このようなPCR、ELISA、ウェスタンブロットなどのさらに下流の分析を実行するためにマイクロチューブに回収することができます。
  11. 文化の中で24時間後、慎重にピンセットを用いてマイクロフィルターを削除します。
    注:細胞はそれから解放されているように、フィルタは、この時点で廃棄することができます。
  12. 優しく千&#を使用して、上下の培地をピペット181; Lピペット、フィルター上に捕捉され、CTCでプレートに放出される再懸濁赤血球および末梢血単核細胞(PBMC)です。ゆるく付着した癌細胞を剥離避けるために、慎重に、ゆっくりと、このアクションを実行します。慎重に37℃に予熱した新鮮な培地で取り付けられ、癌細胞および代替を残しながら再懸濁した赤血球およびPBMCを含む媒体全体を削除します。
    注:過剰な赤血球が1回の洗浄後に存在している場合、この手順は一回繰り返すことができます。

4. CTC生存率評価

  1. ライブ/デッドアッセイ8を用いて培養CTCの生存率を評価します。
    注:多くのライブ/デッドアッセイが市販されています。製造元のプロトコルを、次のことを強くお勧めします。この実験のために使用される市販のアッセイキットのための材料/試薬のリストを参照してください。

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Representative Results

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(インフォームドコンセント次マイアミIRB 20150020の大学によって承認されたプロトコルで得られた)の健康なドナーの血液を培養癌細胞でスパイク使用して、実行可能な循環腫瘍細胞(CTC)を放出するための熱応答性技術は、キャプチャ、リリースと検索効率を達成しましたそれぞれ、94%±9%、82%±5%及び77%±5%( 1)15。比較すると、リリースおよびコーティングされていないフィルタの検索効率が有意に低かった(7%±1%放出効率と6%±1%の検索効率)( 1)15。フィルターから放出されたCTCの生存率を評価するために、〜千SK-BR-3細胞は、PIPAAm被覆されたスロットのフィルターを通して濾過し、上記の方法を使用して解放、健康なドナーの血液7.5mlの中にスパイクしました。生/死アッセイは、血液中にスパイクする前に、細胞生存率を評価しましたそしてリリース後。前スパイクの生存率は98%であった(カウント602細胞のうち592)および血液から捕獲され、放出された細胞の生存率は15( 図3A)(540 567出て細胞をカウント)95%でした。並行して、血液サンプルから捕捉およびポスト濾過放出された細胞は、マッコイ5A培地で培養しました。 図3(b)に示すように、画像は3日目と10日目に採取した、フィルターから放出された細胞は、生存残っていないだけではなく、従って、それらの生存能力の濾過後の確立、培養液中で急速に拡大しました。

図1
。図1:PIPAAm被覆されたスロットフィルタのPIPAAmをキャプチャするスロットフィルタをコーティングし、リリースが血液から循環腫瘍細胞を (トップパネル)(A)明視野像。 (B)CTCの捕獲のための全血のろ過。 Tの(C)概略彼は、PIPAAm被覆されたスロットフィルタは、上部と下部のカセットとの間に挟まれているカセットをマイクロフィルター。プロセスの(底板)(D)回路図PIPAAmからキャプチャCTCを解放するスロットフィルタをコーティングしました。参照15からの許可を得て複製。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
図3:キャプチャ、生存腫瘍細胞のリリースと文化乳癌細胞(SKBR-3)は、PIPAAm被覆されたミクロフィルターを用いて捕捉し、リリースされた正常ドナーの血液中にスパイクしました。細胞が生存可能なポストのリリースのまま、急速に培養で増殖します。 (A)ライブデッドアッセイは、フィルターから放出された細胞上で実施しました。細胞の95%は(567細胞のうち540がカウント)実行可能なことが示されましたリリース後(緑)。死細胞は赤色で標識されています。 (B)PIPAAm被覆されたスロットフィルターから放出された細胞の10日目培養による3日目。細胞が生存可能なままであり、培養で増殖します。スケールバー= 100参照15からの許可を得てμm.Reproduced。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
図4:毛穴パラメータ前後のPIPAAmコーティングの測定スロットフィルタ(A)の明視野像前および(B)後PIPAAmコーティング。 PIPAAmコーティングおよび細孔幅はPIPAAmの被覆後5.6%±15.3%減少した後(C)細孔の長さは2.1%±7.3%減少しました。参照15からの許可を得て複製。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5
図5:赤血球や白血球を混入はジェントルウォッシュにより除去され 、約千SKBR-3細胞は、PIPAAm被覆されたスロットフィルタによって血液から取り出され、48ウェルプレートに播種しました (A)培養液中の16時間で、アポトーシス赤血球や白血球のに対し、培養プレート(緑の矢印)に付着したSKBR-3腫瘍細胞はまた、プレート(赤矢印)の底部に沈降しました。 (B)洗浄後、非接着細胞(緑の矢印)プレートに付着腫瘍細胞を残して、除去しました。参照15からの許可を得て複製。 してくださいこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

表1
表1:キャプチャ、リリースおよびPIPAAm被覆されたスロットフィルタの検索効率効率をキャプチャ=リリース/細胞数の前にフィルター上に捕捉された細胞数は、血液中にスパイクしました。リリース前にフィルター上に捕捉フィルター/細胞数から放出効率=細胞数をリリース。検索効率=フィルター/細胞数から放出された細胞数は、基準15から許可を得てblood.Reproducedにスパイク。

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Discussion

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全血から生存CTCを捕捉し、マイクロフィルターからそれらを解放するプロセスは比較的簡単です。しかし、いくつかの重要なポイントは、言及する価値があります。これは、滅菌状態がプロセス全体を通じて維持されているすべての細胞培養と同様に、必須です。フィルタから細胞を放出させる技術の基礎は、PIPAAmの温度応答性界面特性を利用することに基づいているようPIPAAmでフィルタをコーティングする最初のステップは、非常に重要です。 、フィルタが効果的にコーティングされていることを確認コーティングする前に、顕微鏡下でフィルター上の孔(スロット孔の幅と長さ)のサイズを測定し、再度細孔サイズポストコーティングを測定しました。細孔サイズは、幅および長さ( 図4)の両方で1μM減少されるべきです。述べたように、スロットフィルタ効率CTCを捕捉しながら、また、いくつかの大規模なPBMC細胞を捕捉するが、これらの細胞は、非接着性細胞であり、従ってドゥリNGステップ3.13付着癌細胞を残す培養( 図5)から除去されます。

粘度が非常に高い場合、血液の異なるボリュームがインスタンス又はフィルタリングされる場合、プロトコルに若干の変更を必要とすることができます。 HBSSで1:プロトコルで述べたように、血液1を希釈することが重要です。血液の粘度は、しかし、ほとんどの部分は、これはろ過には影響しません、患者から患者へ変化します。粘度が非常に高いか、大きな凝血塊が存在しているときに、シリンジポンプはフィルターを通して血液を強制することはできません、その場合には、特定の場合があります。シリンジポンプを停止し、シリンジからカセットを外し、カセットの上部を開き、それでも底部に取り付けられたフィルターを残すために、これらのインスタンスにお勧めします。大きな血の塊は、フィルター上で簡単に見ることができます。わずかなANGでカセットを保持しながらゆっくりフィルター上にHBSSの1ミリリットルをピペットルは、血餅がオフに洗浄することができるようにします。凝血塊を除去した後、シリンジにそれを再従事し、ろ過を続け、カセットを閉じます。

PIPAAm被覆されたフィルタはバッチで行われ、後の使用のために保存することができるが、我々はこれらのプレコートフィルターの貯蔵寿命は、約3ヶ月であることを見出しました。細胞の効果的な取り込みと放出は、時間の経過によるPIPAAm分解に部分的に減少させることができます。

患者CTCからの培養を確立するための制限要因の一つは、血液試料中に存在するCTCの数であるだろう。低数字はおそらく不可能ではないとしても極めて困難細胞を拡大する能力を行います。しかし、より小さな文化の領域に低い細胞数でサンプルを隔離することは、代わりに6ウェルプレートの96ウェルプレートの1ウェルのように、役立つことがあります。 foの最適な環境を提供する培地の同定、または商業的に利用可能なメディアの変更、これらの細胞が成長するには、rは、克服しなければならないもう一つの課題です。

CTCの分子や細胞の分析は、癌の予後のための貴重な情報を提供し、駆動精度の薬15を助けることができます。キャプチャフィルタから放出された細胞の生存率は、薬剤感受性およびスクリーニング検査のための培養患者CTCへの能力に向けた重要な開発です。長いCTCが原発腫瘍とは異なる傾向があるので、必要に応じて両方を治療することが知られています。例として、Schneeweissら。転移性乳癌(MBC)は、転移性組織および原発腫瘍の抗原プロファイルは患者の20%までで異なることを報告しました。ヒト上皮増殖因子受容体2(HER2)の発現を含む予測マーカーの再評価は、MBCの治療を最適化するために役立つかもしれません。組織のサンプリングは侵襲的でしばしば繰り返すことが困難であるが、CTCの分析は、血液サンプルを必要とし、簡単に繰り返し、リアルタイム&#を提供するかもしれません34;液体生検」アプローチ22。

技術の主要な意義は、固定サンプルを処理するために必要であるように、一般的に、CTCの捕獲及び分析に使用される一方、いくつかのプラットフォームは、分子および細胞の分析に限られているという事実にある、またはCTCプラットフォーム上に固定されています。また、実行可能なCTCの捕獲および放出を可能にする親和性ベースのシステムは、潜在的標的抗原15の選択によってバイアスすることができます。また、PIPAAm被覆を有するスロットフィルタは、全血からのキャプチャ、生存CTCのリリースでは、効果的かつ効率的であるラベル無料のプラットフォームを提供します。この方法は、単一細胞の表現型とゲノム解析だけでなく、ex vivoでの CTCの文化など、生存CTCのさらなる特徴付けのための機能を提供します。

仕事は臨床応用のためにこの技術を採用することが現在進行中です。能力patienから効果的に文化CTCへトンのサンプルは、患者ごとに効果的な治療連隊の策定につながる新たな薬物標的を明らかにし、効果的な化学療法剤の開発につながります。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Slot Filter Circulogix Inc. MSF-01 Different size filters available based for filtration for CTC from blood or urine (www.circulogixinc.com)
poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm)  Ploysciences Inc. 21458 Non-Hazardous. Store at room temp.
1-Butanol Sigma Aldrich B7906 Use in well ventilated area
Plastic Microscope Slides Cole-Parmer 48510-30 Any plastic slides or alternatively any sort of square (Metal, Acrylic etc.) can be used if it will be bale to hold the 8mmx8mm filter square
Spin Coater Specialty Coating Systems SCS G3 Spin Coater Instrument
Polyimide Tape Uline S-7595 Polyimide is the generic name for Kapton Tape which can be purchased form multiple vendors (Amazon, Kaptontape.com)
HBSS- Hank's Balanced Salt Solution Gibco 14025-092
1x PBS Gibco 10010-023
Falcon Petri dishes 35 x 10 mm VWR 25373-041
Microfilter Cassette Circulogix Inc. FC-01 Custom catridges are avilable based on filtration for CTC from blood or urine 
Syringe 20 ml BD Scientific 302830
Syringe Pump KD scientific  78-0100V Any syringe pump capable of holding a 25 ml syringe may be used
Cellstar 50 ml Centrifuge tube VWR 82050-322
Greiner Bio One 6 well plate VWR 89131-688 Any brand can be used, as long as the surface is compatiable for cell adesion and not repellant
SKBR3 Cells ATCC HTB-30
Live Dead Assay Life Technologies L3224 Any assay that can provide a reasonable analysis to evaluate live cells will work
Cell Culture Incubator VWR 98000-368 Any incubator that can be used for cell culture will suffice

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References

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キャプチャと血液から生存循環腫瘍細胞のリリース
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Rawal, S., Ao, Z., Agarwal, A. Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood. J. Vis. Exp. (116), e54435, doi:10.3791/54435 (2016).More

Rawal, S., Ao, Z., Agarwal, A. Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood. J. Vis. Exp. (116), e54435, doi:10.3791/54435 (2016).

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