Introduction
결핵 (TB)는 TB 놀라운 세계 보건 문제 일 수 있습니다 세계에서 HIV보다 더 많은 관련 사망의 원인이되는 주요 감염 질환 중 하나 다 약제 내성 균주의 증가 증가와 결합이다. 새로운 진단 도구,보다 효과적이고 독성이 적은 약물, 새로운 안전하고 효과적인 결핵 백신은 특히 개발 도상국에서, 긴급한 필요하다.
감쇠 Bacille 칼 메트 - GUERIN은 (BCG)은 현재 전 세계적으로 1970 년대 이후 출생시 피내 투여 된 TB, 대한 전용 허가 백신 살고있다. BCG는 아이들의 질환 (수막염 및 속 립성 결핵)의 심한 형태의 예방에 효과적인 것으로 간주되지만, 질병 전파 (2)의 책임 폐결핵에 대한 일관성 효과를 보여 주었다.
TB 감염의 자연 경로를 모방 폐 예방 접종은 로컬 호스트 면역 반응을 프라이밍위한 매력적인 접근 방식을 나타냅니다에스. 피하 또는 피내 경로 3-6에 비해 이와 관련하여, 다른 관련 TB의 동물 모델에서 다양한 전임상 작품 폐 면역화 다음 큰 백신 효능을 보여 주었다. 그럼에도 불구하고, 폐 예방 접종에 의해 유발 보호 메커니즘은 잘 이해되지 않습니다. 지난 몇 년 동안, 여러 작품 IL17 점막 백신에 의한 예방 효과에 대한 결핍 된 마우스 모델에서와 같이, TB-특정 점막 면역 반응의 중요한 요소로 IL17 중재 응답으로 지적은 7,8를 손상된다.
최근에 우리는 BCG 관리는 DBA / 2 마우스, 피하 BCG 예방 접종 9 후 보호의 부족을 특징으로하는 마우스 변형을 보호 비강 처음으로 보여 주었다. 이러한 결과는 호흡기 결핵 예방 접종은 피내 BCG가 pulmon에 대한 효과로 간주됩니다 발병 국가에서 TB의 비율을 감소 시키는데 더 효과적 일 수 있다고 제안진 TB.
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Protocol
모든 마우스는 통제 된 조건 하에서 유지와 질병의 징후가 관찰되었다. 실험 연구는 실험 동물의 보호와 관할 지역 윤리위원회의 승인과 유럽 국가 지침과 일치 하였다.
BCG 덴마크어의 정량화 글리세롤 주식 및 결핵균의 H37Rv 1. 준비
주 : 설명 된 모든 프로토콜은 BSL3 조건 하에서 수행 하였다.
- BCG 덴마크어 또는 H37Rv 균주의 해동 냉동 글리세롤 주식 및 트윈 80 0.05 % (v / v)로 및 ADC (알부민, 포도당, 카탈라제) 10 % (v / v)의 보충 7H9 매체 (10) 10ml에 100 μl를 접종.
- 배양 로그 상에 성장 될 때까지 37 ℃에서 일주일 동안 정적 조건에서 인큐베이션.
- 신선한 배지 200㎖에 10 ml의 문화를 전송하여 세균 배양을 확장 할 수 있습니다. 20 추가 품다정적 조건에서 일.
- g X 2500에서 15 분 동안 50 ml의 원심 분리기 튜브와 원심 분리기에 전송합니다.
- 상층 액을 버리고 잔류 볼륨에서 세균 펠렛을 재현 탁. (- 튜브 당 15 10) 각각의 튜브 멸균 3 mm 직경의 유리 구슬에 추가합니다.
- 소용돌이 적극적 위해 1 분 동안 세균 덩어리를 떼어 놓다합니다. 트윈 80 0.05 %와 PBS 10 ml의 각 펠렛을 재현 탁 (v / v)로.
- 가장 큰 세균 단위 및 유리 구슬이 정착 할 수 있도록 10 분 동안 튜브를 남겨주세요.
- 하나의 신선한 50 ml의 원심 분리기 튜브 (최종 복구 된 볼륨 38 ㎖)에 작은 덩어리와 하나의 박테리아 및 전송 볼륨을 포함하는 4 튜브의 각에서 상층 액 9.5 mL로 복구 할 수 있습니다. 400 × g으로 10 분 동안 원심 분리기.
- 15 %의 최종 글리세롤 농도를 수득 한 신선한 50 mL의 원심 분리 튜브 (주로 단일 박테리아를 함유 함) 상등액 35 mL를 복구 및 글리세롤로 50 % (V / V) PBS 15 mL로 추가 (V / V).
- 부드럽게 믹스냉동에 적합한 튜브에 1 ㎖의 분량 씩 배포 할 수 있습니다. -80 ° C에서 보관 (한 많은 약 50 분취 글리세롤 주식을 제공합니다).
- 글리세롤 주식을 정량화하기 위해, 동결 후 글리세롤에게 일을 해동하고 PBS 900 μl를 포함하는 별도의 1.5 ml의 튜브에 일곱 10 배 연속 희석을 수행합니다.
- 플레이트 55 mm 직경 배양 접시에서 제조 된 ADC 10 % (v / v)의 보충 7H10 고체 한천 배지 (10)의 각 희석액 100 ㎕.
- 조심스럽게 3mm 직경의 유리 구슬 (접시 당 약. 10)를 추가하고 부드럽게 동등하게 한천 접시 위에 볼륨을 배포 판을 흔들어. 구슬을 취소하고 파라 필름으로 한천 플레이트를 밀봉.
- 37 ° C 21 일 동안 품어 단일 콜로니를 정확하게 구별 할 수있는 희석에 집락 형성 단위를 (CFU)를 계산하여 세균 농도를 결정한다.
2. 마우스 예방 접종
- 사전 정량 BCG 글리세롤을 해동하고 사전에 PBS에 희석이 현탁액이다. 동물 당 투여 량을 고려하여 최종 부피를 계산하는 것은 피하 투여 100 μL (피하 접종 ml의 당 107 CFU) 및 비강 내 투여 (비강 예방 접종에 대해 2.5 × 10 7 CFU) 40 μL이다.
- 이소 플루 란과 산소의 혼합물로 쥐를 마취하는 설치류에 대한 전문 마취 워크 스테이션을 사용합니다. 마취 챔버 내에 마우스를 유지하는 마취 2 % 이소 플루 란을 유도하는 5 %를 사용한다. (기타 수락 마취 방법이 사용될 수있다).
- 피하 백신 투여에 세균 현탁액 (107 CFU / ㎖) 1 ㎖의 26 G 바늘을 1 mL를 주사기를 채운다. 공기 방울을 제거합니다.
- 층류 후드 내부에 발생하기 쉬운 위치에 평평한 표면에 마취 마우스를 놓고 마우스의 측면에 피하에게 백신 100 ㎕ (106 CFU / 복용량을) 다시 접종. 케이지에 마우스를 반환하고 prope 수 있도록 그것을 모니터RLY는 마취에서 회복.
- 각 마우스 행정부 사이의 주사기 바늘을 변경합니다. 상술 한 바와 같이 기포를 제거했다.
- 비강 내 투여의 경우, 후드 안쪽에 누운 자세에서 마취 마우스를 놓습니다.
- 마이크로 피펫으로 2.5 × 107 CFU / ㎖로 현탁액의 20 μl를 가져 가라. 마우스의 볼륨을 숨을 쉴 수 있도록 방울 사이의 시간을두고 접종 드롭하여 드롭 전체 볼륨이 입금 될 때까지 두 개의 콧 구멍 사이에 배치 참고 :. 마우스는이 절차를 수행하는 동안 호흡 곤란으로 고생 할 수 있습니다 그들이에 남아 있어야하므로 가급적으로 방지하기 위해 다음 중 하나를 관리하다 전에 각 드롭 동화.
- 또 다른 20 μL와 마이크로 피펫을 재 작성하고 작업을 반복합니다. 마우스가 첫 번째 접종 후 마취에서 깨어 시작되면, 이전에 두 번째로 마취 실에 넣습니다. 케이지에 마우스를 반환하고 올바르게 복구되었는지 확인마취에서.
H37Rv 스트레인 3. 마우스 비강 도전
- 미리 정량 H37Rv 글리세롤을 해동하고 ㎖의 당 2,500 CFU의 세균 현탁액을 준비하기 위해 PBS에 희석. 동물 당 투여 량을 고려하여 최종 부피를 계산하면 40 μL이다.
- 2.5에 설명 된대로 H37Rv는 비강 접종 - 2.7. 마우스 당 최종 도전 선량이 10 CFU / 40 μL이다.
폐에서 유도 된 면역 반응 4. 분석
- 폐 세포 현탁액
주 : 폐 백신 유발 적응성 면역 반응의 평가는 단일 세포 현탁액의 생성을 필요로한다. 이를 위해, 우리는 GentleMACS 티슈 dissociator를 사용한다.- 자궁 경부 전위 (또는 다른 승인 된 인도적인 방법)에 의해 마우스를 희생와 마우스가 점멸 반사의 존재를 확인하기 위해 안구에 접촉 죽은 확인합니다.
- 층류 후드 내부에서 L을 추출멸균 가위와 집게를 사용하여 깨끗한 표면에 배치 ungs. 면도 폐 기관지 및 결합 조직을 제거하고 (처리 될 때까지 얼음 상에 유지) PBS로 1.5 ㎖의 튜브에 폐를 옮긴다.
- pH가 7.4, 150 mM의 NaCl을, 5 밀리미터의 KCl, 1 mM의의 MgCl 2, 1.8 mM의 CaCl2를 10 mM의 HEPES-NaOH를 5 mL를 함유 기관 해리 (C-dissociator 튜브)에 대한 적절한 튜브에 폐를 배치, 휴대 정지를 생성하려면 완충기.
- 콜라게나 D 100 ㎎ / ㎖ 100 ㎕ (2 ㎎ / ㎖ 최종 농도)과의 DNase I 20,000 IU / ㎖의 40 μl를 (160 IU / ml의 최종 농도를 추가합니다.
주 : 콜라게나 D 또는 DNaseI의 스톡 솔루션은 각각이 1 ㎜ (V / V), 20 mM 트리스 - 염산 pH를 7.5의 Y의 MgCl 동결 PBS 효소 또는 글리세롤 50 % 용해 제조된다. - 조직 dissociator에 튜브를 놓고 폐 조각에 대해 사전 정의 된 프로그램 m_lung_01를 사용합니다. 30 분 동안 수욕에서 37 ℃에서 인큐베이션 튜브.
- 장소 일전자 상기 dissociator 튜브 및 단일 세포 현탁액에 완전한 폐 균질화에 대해 사전 정의 된 프로그램 m_lung_02를 사용합니다.
- 50 mL의 원심 분리 튜브에 장착 된 70 ㎛의 나일론 세포 여과기를 통하여 세포 현탁액을 통과한다. RPMI 1640 배지 10 ㎖로 스트레이너 씻으십시오.
- 원심 분리기 세포 400 XG에 5 분간 및 상층 액을 버린다.
- 버퍼를 용균 적혈구의 1 ML을 추가 텍싱하여 혼합하고 실온에서 1 분 동안 품어.
- 400 X g에서 5 분 동안 RPMI 1640 배지 및 원심 분리기 세포의 10 ML을 추가합니다.
- 완전 RPMI 1640 배지에 0.5 ㎖ 중의 재현 탁 된 세포를 10 % 열 - 불 활성화 된 태아 송아지 혈청 (FCS), 2 mM의 L 글루타민, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 100 IU / ㎖ 페니실린, 50 μM 2- 머 캅토 에탄올을 첨가.
주 : FCS 30 분 동안 56 ℃에서 배양하여 비활성화된다. - 세포를 카운트 10 7 세포 / ml의 최종 세포 밀도에 도달하는 전체 RPMI에게 1640 배지를 추가합니다.
주 : 세포 수를 들어, 우리는 자동 세포 계수기를 사용한다. - U-바닥 96 웰 멸균 접시에 세포 현탁액을 100 μl를 배포 (10 6 세포 / 웰).
- 상업 H37Rv 정제 된 단백질 유도체 15 ㎍ / ㎖ (PPD) (5 μg의 / ml의 최종 농도)로 전체 RPMI 1640 배지의 잘 50 μL /를 추가합니다.
- ELISA에 의해 사이토 카인 결정을위한 뜨는 수집
- 4.1.14에서 37 ° C에서 48 시간 5 % CO 2 판을 품어.
- 5 400 XG에 분, 상층 액 100 ㎕를 복구하기위한 원심 분리기 판.
- -80 ° C에서 보관하십시오.
- 각각 IFNγ에 대한 분석 버퍼와 IL17A 결정에 상층 액을 1/10 및 1/2 희석. 제조업체 지침 (ELISA 개발 키트)에 따라, 상업 ELISA 키트와 사이토 카인 농도를 결정합니다.
- 사이토 카인의 결정에 대한 세포 내 얼룩유동 세포 계측법에 의해 CD4 + 세포 -producing
- 4.1.14에서 37 ° C에서 18 시간 5 % CO 2 판을 품어.
- 각 웰 (10 μg의 / ml의 최종 농도)에 Brefeldin 1 ㎎ / ㎖ (DMSO에 용해 주)의 1.5 μl를 추가 여섯 추가 시간 동안 배양한다.
- 3200 XG에서 1 분 동안 4.3.2에서 접시를 원심 분리기 및 상층 액을 버린다.
- 10 % FCS (1/500)를 RPMI 1640에 희석 항 - 마우스 CD4-FITC의 50 μL와에 재현 탁 세포를 4 ℃에서 10 분 동안 품어.
- , 3,200 XG에서 1 분 동안 4.3.4에서 접시를 원심 분리기 뜨는을 버리고 100 μL / 웰의 고정 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 20 분 동안 4 ° C에서 품어.
- permeabilization 용액 150 μL / 워시로 두 번 세포를 씻으십시오.
참고 : 10 배 농축 재고 1X 작업 용액을 제조 탈 이온수로 희석한다. - 안티 마우스 IFNγ-APC 및 항 - 마우스 IL17A - APC.Cy7의 50 μL에 재현 탁 세포는 permeabil에 희석화 용액 (1/250 모두 항체).
- 실온에서 1 시간 동안 품어.
- permeabilization 용액 150 μL / 워시로 두 번 세포를 씻으십시오.
- 유동 세포 계측법 획득을위한 PBS 200 μL에 재현 탁 된 세포.
기관지 폐포 세척에서 면역 글로불린 5. 분석 (BAL)
- BAL 샘플 획득
- 자궁 경부 전위 (또는 다른 승인 된 인도적인 방법)에 의해 마우스를 희생와 마우스가 점멸 반사의 존재를 확인하기 위해 안구에 접촉 죽은 확인합니다.
- 확인 완전히 절제하지 않도록하고, 적절한 정밀 멸균 집게와 가위를 사용하여 기관을 노출하고기도에 작은 상처를 수행합니다. BAL 샘플을 오염시킬 수있는 출혈을 일으킬 않도록주의하십시오.
- 기관에 얼음처럼 차가운 PBS 800 μL와 멸균 1 ML의 주사기에 연결된 정맥을 소개합니다.
- PBS를 폐하고 연구에 천천히 접종폐 붕괴를 방지하기 위해 매우 느리게 주사기의 피스톤을 후퇴 Ecover 주방 BAL 볼륨.
참고 : (500) 600 μL의 복구 만족입니다. - 1.5 ML 튜브에 BAL 볼륨을 전송하고 그 혈액 (처리까지 얼음에 유지)에 오염되지 않은 나타내는, BAL은 채색 유지 확인합니다.
- 새로운 튜브에 5 400 XG에 분 및 전송 상등액을위한 원심 분리기 BAL 샘플.
- -80 ° C에서 보관 상층 액.
- BAL 상층 액에서의 IgA의 결정
참고 : 사용 된 모든 시약은 RT에 있습니다.- M. (10 μg의 / ㎖) PBS에 희석 PPD 100 ㎕와 코트 고 단백질 결합 폴리스티렌 평면 바닥 96 웰 플레이트 결핵 - 특정의 IgA 결정, 또는 전체의 IgA 결정을 위해 PBS에 10 배 희석 BAL의 상층 액 100 ㎕와.
- 4 ℃에서 밤새 품어.
- 뜨는을 취소하고 D에 종이 타월에 접시를 누릅니다공예. 200 μL / PBS 잘 씻으시오.
- 200 μL / 웰의 소 혈청 알부민 (BSA) PBS-트윈 80, 0.05 % (부피 / 부피) (블로킹 완충액) (V / w) 1 %로 차단.
- 실온에서 1 시간을 품어.
- 200 μL / PBS-트윈 80 0.05 % (v / v)의 (세척 버퍼) 잘 한 번 씻으십시오.
- PPD를 코팅 우물에 희석 BAL의 상층 액 100 μl를 추가합니다. 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션.
참고 : 전체의 IgA 결정은 PPD 별의 IgA와 병렬로 수행 할 경우,이 배양 동안 100 μL 세척 버퍼 전체의 IgA 우물을 둡니다. - 세척 buffer.0170004 200 μL / 웰로 3 회 세척
- 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP)의 100 μl를 추가 버퍼 (1 / 10,000) 차단에 희석 항 - 마우스의 IgA를 π 공역 계.
- 1 시간 RT를 품어.
- 세척 완충액 200 μL / 웰로 5 회를 씻으십시오.
- 3,3 100 ㎕ / 웰 추가 ', 5,5'- 테트라 메틸 벤지딘 (TMB). t 실온에서 20 분 인큐베이션그는 어두운.
- 100 μL / 웰의 H 2 SO 4 0.5N를 추가합니다. 파장 450 nm에서 분광 광도계 플레이트를 읽었다.
폐 6. 세균 부하 결정
- 폐 균질화 및 도금
- 네 주 공격 후, 자궁 경부 전위 (또는 다른 승인 된 인도적인 방법)에 의해 마우스를 희생와 마우스가 점멸 반사의 존재를 확인하기 위해 안구에 접촉 죽은 확인합니다.
- 층류 후드 내부의 평면 및 소독 표면에 고정 부정사 위치에 마우스를 놓습니다.
- 절개를 확인하고 흉부 영역을 볼 수 떠날 가슴 영역에서 피부를 제거합니다.
- 갈비뼈를 잘라 멸균 가위와 집게를 사용하여 폐와 심장을 수확. 깨끗한 표면에 장기를 놓습니다.
- 심장, 기관지 및 결합 조직을 제거하여 폐를 청소하고 1 ㎖ 탈 이온수에 1.5 ㎖의 튜브에 폐를 전송할(처리 될 때까지 얼음에 유지).
- 탈 이온수 1 ml를 포함, - (dissociator 튜브 M) 장기 균질화에 대한 적절한 튜브에 각 마우스의 폐를 전송하는 멸균 집게를 사용합니다.
- 조직 dissociator에 튜브를 놓고 폐를 균질화하는 미리 정의 된 프로그램 RNA_1를 사용합니다.
- 900 μL에 희석 폐 균질 100 ㎕를 시작으로 1.5 ml의 튜브에 5 ~ 10 배 연속 희석을 확인합니다.
- 플레이트 희석은 1.11-1.14에 설명 된대로.
- PCR에 의해 BCG와 H37Rv 사이의 차별화
참고 : 비강 내 경로에 의해 BCG 접종 그룹에 해당하는 6.1.6에서 판에서, 우리는 CFU가 백신 수여 예방 효과가 맞습니다 평가로 간주하도록 BCG와 H37Rv 사이의 안목 PCR에 의해 식민지의 대표 번호를 분석 고유 H37Rv합니다. RD9이 PCR 표적 증폭, BCG와 M. 너와 다른 게놈 영역berculosis, H37Rv에 대한 2618 bp의 및 BCG (11)에 대한 465 염기쌍의 단편을 제공.- PCR 튜브에 (9 μL / 샘플)을 배포 한 후 표시로 샘플 당 볼륨이있는 모든 샘플에 대한 마스터 믹스 재고를 준비합니다.
참고 : 버퍼 5 배 : 2 μL. 앞으로 프라이머 25 μM (GTGTAGGTCAGCCCCATCC) : Taq 중합 효소에게, μl의 5 단위 / 0.32 μL : 0.32 μL는 프라이머 25 μM (GCCCAACAGCTCGACATC)를 역 0.04 μL, 탈 H 2 O : 6.32 μl를. - 멸균 된 이쑤시개로 콜로니를 터치 마스터 믹스를 함유하는 PCR 튜브에 샘플 이쑤시개 젖어.
- 다음 프로그램으로 PCR을 실행 : 10 분 ~ 95 ° C (이 단계는 박테리아 중단을 유발하는 것입니다), 10 분, 95 ° C, 1 분, 95 ° C에서 35주기 (30 초 (이 단계는 박테리아 혼란을 유발하는 것입니다) 58 ° C와 4 분 72 ° C에서)에서.
- 단편을 시각화 티듐 브로마이드 실행 샘플을 1 % 아가 로스 겔에서 PCR 샘플을로드.
- PCR 튜브에 (9 μL / 샘플)을 배포 한 후 표시로 샘플 당 볼륨이있는 모든 샘플에 대한 마스터 믹스 재고를 준비합니다.
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Representative Results
피하 및 비강 :이 작품은 BCG의 관리의 두 경로의 비교에 대해 설명합니다. 피하 전세계 BCG 현재 임상 경로 인 피내, 비슷하다. 백신의 비내 경로 M.의 감염 천연 경로를 모방하는 것을 목표 목적으로 결핵은 폐에 직접 병원체의 주요 표적 장기를 면역 반응을 유도한다.
그림 1은 다음 워크 플로를 설명합니다. 십주 된 여성 DBA에 여덟은 / 2 마우스는 행정의 피하 또는 비강 경로로 106 CFU BCG의 덴마크어로 예방 접종을하고 있습니다. 여덟 주 후에 쥐의 그룹은 백신에 의한 폐의 면역 반응을 분석하기 위해 희생된다. BAL 샘플을 먼저 얻을 수있다, 그리고, 우리는 폐를 수확. 백신 수여 예방 효과를 연구하기 위해, 우리는 differe 접종M.의 저용량 비강 도전과 마우스의 NT 그룹 결핵 H37Rv 스트레인. 한 달 후, 우리는 동물과 수확 폐를 희생. 이 경우, 각각의 동물에 대해 우리는 세균 부하 백신 유발 된 면역 반응 후 도전을 평가 우측 폐를 결정 왼쪽 폐를 사용한다. 목적은 보호 전위 상관 관계를 연구하기 위하여 각 동물에 대한 폐의 박테리아 하중과 면역 반응 데이터를 생성하는 것이다.
도 2에 도시 된 바와 같이, 폐 기관 파쇄 또는 세포 현탁액를 얻기 위해 분해되었다. 균질 폐 세균 부하에게 사주 후 도전을 결정하기 위해 고체 한천 배지에 배양 하였다. 백신 유발 된 면역 반응을 연구 세포 현탁액을 콜라게나 제와 D DNaseI으로 폐 효소 소화 다음 얻었다.
우리의 결과는 명확하게 표시, 비교 t 그피하 경로 O를, 예방 접종의 비강 경로의 반칙으로 (그림 3A) 후 폐 사주에 훨씬 더 큰 예방 효과를 부여한다. 또, 비내 BCG 백신 그룹에서 폐의 박테리아 하중 H37Rv 및하지 BCG 백신 일치 함을 확인 하였다. 이를 위해, 우리는 BCG와 M.의 길이가 다른 단편을 증폭 RD9 게놈 영역에 대한 특정 PCR에 의해이 그룹에서 식민지의 대표 번호를 분석 결핵 (그림 3B). 그림은 명확하게 모든 식민지가 H37Rv에 맞습니다 0.4 KBP의 조각을 제공하여 분석 것으로 나타났다.
우리의 데이터는 비강 BCG 예방 접종 및 도전하기 전에 폐 백신에 의한 면역 반응에 의해 수여 예방 효과 사이의 상관 관계를 밝혔다. 비강 BCG 명확 ELISA에 의해 측정 된 높은 IL17과 폐에서 IFNγ 생산을 트리거 (도4A). 이러한 데이터는 세포 내 염색 (ICS)로 확인하고 유세포 하였다 (데이터는 보이지 않음). 또한, 우리는 또한 폐 BCG 예방 접종은 호흡기도에의 IgA의 생산과 전위를 유도하는 것을 나타내는, BAL 샘플 (그림 4B) 모두 총과 PPD 별의 IgA 농도의 높은 농도를 발견했다.
마지막으로, 우리는 도전 후 폐에 BCG에 의한 면역 반응 (그림 5)을 공부했다. 우리의 데이터는 IL17 및 IFNγ 사이의 차이를 밝혀; IFNγ 생성 세포에 관계없이 접종 H37Rv 감염된 모든 그룹에서 발견 된 반면 IL17A 생산 CD4 + 세포에만 비강 BCG 그룹에서 검출되었다. IL17 생산 세포와 세균 부하에 대응하는 각 동물의 데이터의 표현은 IFNγ의 경우에는 관찰되지 않았다 IL17의 존재 및 폐 박테리아 하중 감소 사이에 유의 한 상관 관계를 보였다.
그림 1. 워크 플로우는 BCG 예방 접종의 비강 및 피하 경로를 비교합니다. 여덟 주 BCG 예방 접종 (실험군 당 6) 마우스 세트를 게시 폐를 수확하고 BAL을 수행하고, 예방 접종에 의해 유도 된 폐 면역 반응을 분석하는 데 사용됩니다. 또 다른 세트의 마우스 (6 / 그룹), M.의 저용량 비강 챌린지 접종 결핵 H37Rv 스트레인 (100 CFU). 한 달 후, 동물이 희생되고 세균 부하가 왼쪽 폐와 오른쪽 폐에서 PPD 특정 면역 반응으로 분석된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 보호 효능이 BCG 예방 접종에 의해 수여. 6 DBA 그룹을 / 2 마우스는 BCG 덴마크어 백신 10 6 CFU와 피하 (BCG 사우스 캐롤라이나), 비강 (에서 BCG) 경로, 또는 비 백신 (Unvacc)에 의해 예방 접종을했다. 이개월 후 예방 접종에서 마우스를 저용량으로 비강 접종 하였다 ((100)폐 CFU) H37Rv 도전, 그리고 한 달 후에 세균 부담이 결정되었다. 독립적 인 두 가지의 대표적인 실험이 표시됩니다. (A) 데이터는 그래프에서 평균 + SD로 표시됩니다. 페로 니 포스트 분석 편도 ANOVA 테스트가 통계적 유의성을 계산 하였다. (B) (BCG 및 H37Rv 게놈에 다른) PCR의 RD9 영역에 대한 구체적인 분석 한 BCG의 비강 그룹에서 하나의 식민지의 대표 번호가 BCG를 식별하고, H37Rv 식민지. (이전 9 출판). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 백신 별 폐 면역 반응이 H37Rv에 도전하기 전에 분석. 6 DBA / 2 마우스의 그룹이었다이개월 접종 후에서 피하 (BCG의 SC) 또는 비강 내 (의 BCG) 경로 또는 비 접종 BCG 덴마크어 백신 106 CFU로 (Unvacc). (A)로 접종 수확 폐에서 세포 현탁액을 수득 하였다. 방법 섹션과 IL17A (왼쪽 패널) 및 IFNγ (오른쪽 패널) 생산은 ELISA로 분석 하였다에 설명 된대로 세포 PPD로 자극 하였다. (B) 전체의 IgA, 그리고 M.를 결핵 (MTB) - 특정 이가 ELISA에 의해 BAL 시료에서 분석 하였다. 두 개의 독립적 인 실험에서 풀링 된 데이터가 표시됩니다. 그래프의 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다. (이전 9 출판). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 백신 별폐 면역 반응이 H37Rv에 도전하기 전에 분석. 6 DBA 그룹을 / 2 마우스는 BCG 덴마크어 백신 10 6 CFU와 피하 (BCG 사우스 캐롤라이나) 또는 비강 (에 BCG) 경로, 또는 비 백신 (NV)에서 예방 접종을했다. 비 접종, 감염되지 않은 마우스의 대조군은 (NV / NI)을 포함 하였다. 이개월 후 접종에서, 마우스 낮은 H37Rv 도즈 (100 CFU)로 비내 감염시켰다, 한 달 후 동물을 안락사시켰다. 왼쪽과 같은 동물의 우측 폐 각각 CD4 + 세포를 생산하는 세균 부하 IL17A- (A) 또는 IFNγ- (B)를 결정하는데 사용되었다. 왼쪽 패널의 데이터는 유동 세포 계측법에 의해 측정 된 사이토 카인 생산 세포의 비율에 해당하고, 평균 + SD로 표시됩니다. 오른쪽 패널은 박테리아 하중에서 각 마우스 얻은 CD4 + 세포를 생산하는 사이토 카인의 데이터를 나타낸다. 선형 회귀를 계산하고, 각각의 경우에서 얻어진 p- 값은 IL17A의 경우에 도시된다. 풀링두 독립적 인 실험에서 데이터가 도시되어있다. (이전 9 출판). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Middlebrook 7H9 broth | BD | 271310 | |
| Middlebrook ADC Enrichment | BD | 211887 | |
| Tween 80 | Scharlau | TW00800250 | |
| 3-mm diameter Glass Beads | Scharlau | 038-138003 | |
| Middlebrook 7H10 Agar | BD | 262710 | |
| 1-ml syringe 26GA 0.45 x 10 mm | BD | 301358 | |
| GentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| M tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | |
| Collagenase D | Roche | 11088882001 | |
| DNaseI | Applichem | A3778,0100 | |
| Falcon 70 µm Cell Strainer | Corning | 352350 | |
| RPMI 1640 | Sigma | R0883 | |
| Red Blood Cell Lysing Buffer | Sigma | R7757 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-061 | 100x concentrated |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sigma | P4333 | 100x concentrated |
| Fetal Calf Serum | Biological Industries | 04-001-1A | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148-25ML | |
| Scepter 2.0 Handheld Automated Cell Counter | Millipore | PHCC20040 | |
| Scepter Cell Counter Sensors, 40 µm | Millipore | PHCC40050 | |
| Mycobacterium Tuberculosis - Tuberculin PPD | Statens Serum Institut (SSI) | 2390 | |
| Mouse IFN-γ ELISA development kit | Mabtech | 3321-1H | |
| Mouse IL17A ELISA development kit | Mabtech | 3521-1H | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD4 | BD | 553047 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Kit | BD | 555028 | |
| APC-Cy7 Rat Anti-mouse IL-17A | BD | 560821 | |
| APC Mouse Anti-mouse IFNg | BD | 554413 | |
| LACHRYMAL OLIVE LUER LOCK 0.60 x 30 mm. 23G x 1 1/4” | UNIMED | 27.134 | Used as trachea cannula for BAL |
| high-protein binding polystyrene flat-bottom 96-well plates MAXISORP | NUNC | 430341 | |
| Albumin, from bovine serum | Sigma | A4503 | |
| Goat Anti-Mouse IgA (α-chain specific)−Peroxidase antibody | Sigma | A4789 | |
| 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) | Sigma | T0440 | |
| MyTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21107 | The kit Includes Buffer 5x |
References
- Zumla, A., et al. The WHO 2014 global tuberculosis report--further to go. Lancet Glob Health. 3 (1), e10-e12 (2015).
- Mangtani, P., et al. Protection by BCG vaccine against tuberculosis: a systematic review of randomized controlled trials. Clin Infect Dis. 58 (4), 470-480 (2014).
- Aguilo, N., et al. Pulmonary Mycobacterium bovis BCG vaccination confers dose-dependent superior protection compared to that of subcutaneous vaccination. Clin Vaccine Immunol. 21 (4), 594-597 (2014).
- Chen, L., Wang, J., Zganiacz, A., Xing, Z. Single intranasal mucosal Mycobacterium bovis BCG vaccination confers improved protection compared to subcutaneous vaccination against pulmonary tuberculosis. Infect Immun. 72 (1), 238-246 (2004).
- Giri, P. K., Verma, I., Khuller, G. K. Protective efficacy of intranasal vaccination with Mycobacterium bovis BCG against airway Mycobacterium tuberculosis challenge in mice. J Infect. 53 (5), 350-356 (2006).
- Lagranderie, M., et al. BCG-induced protection in guinea pigs vaccinated and challenged via the respiratory route. Tuber Lung Dis. 74 (1), 38-46 (1993).
- Gopal, R., et al. Interleukin-17-dependent CXCL13 mediates mucosal vaccine-induced immunity against tuberculosis. Mucosal Immunol. 6 (5), 972-984 (2013).
- Khader, S. A., et al. IL-23 and IL-17 in the establishment of protective pulmonary CD4+ T cell responses after vaccination and during Mycobacterium tuberculosis challenge. Nat Immunol. 8 (4), 369-377 (2007).
- Aguilo, N., et al. Pulmonary but Not Subcutaneous Delivery of BCG Vaccine Confers Protection to Tuberculosis-Susceptible Mice by an Interleukin 17-Dependent Mechanism. J Infect Dis. , (2015).
- Middlebrook, G., Cohn, M. L. Bacteriology of tuberculosis: laboratory methods. Am J Public Health Nations Health. 48 (7), 844-853 (1958).
- Brosch, R., et al. A new evolutionary scenario for the Mycobacterium tuberculosis complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (6), 3684-3689 (2002).
- Kaushal, D., et al. Mucosal vaccination with attenuated Mycobacterium tuberculosis induces strong central memory responses and protects against tuberculosis. Nat Commun. 6, 8533 (2015).
- Lochhead, J. J., Thorne, R. G. Intranasal delivery of biologics to the central nervous system. Adv Drug Deliv Rev. 64 (7), 614-628 (2012).
- Lochhead, J. J., Wolak, D. J., Pizzo, M. E., Thorne, R. G. Rapid transport within cerebral perivascular spaces underlies widespread tracer distribution in the brain after intranasal administration. J Cereb Blood Flow Metab. 35 (3), 371-381 (2015).
- Griffiths, K. L., et al. Cholera toxin enhances vaccine-induced protection against Mycobacterium tuberculosis challenge in mice. PLoS One. 8 (10), e78312 (2013).
- Hirota, K., et al. Plasticity of Th17 cells in Peyer's patches is responsible for the induction of T cell-dependent IgA responses. Nat Immunol. 14 (4), 372-379 (2013).
- Jaffar, Z., Ferrini, M. E., Herritt, L. A., Roberts, K. Cutting edge: lung mucosal Th17-mediated responses induce polymeric Ig receptor expression by the airway epithelium and elevate secretory IgA levels. J Immunol. 182 (8), 4507-4511 (2009).
