Introduction
Tuberkulose (TB) er en av de ledende smittsomme sykdommer som forårsaker mer assosiert dødsfall enn HIV i verden, og kombinert med økende økning av multiresistente stammer gjør TB en alarmerende global helseproblem en. Nye diagnostiske verktøy, mer effektive og mindre giftige stoffer, og nye trygge og effektive TB vaksiner er et presserende behov, spesielt i utviklingsland.
Levende svekkede Bacille Calmette-Guerin (BCG) er i dag den eneste lisensierte vaksine mot tuberkulose, som har blitt administrert intradermalt ved fødselen siden 1970-tallet på verdensbasis. BCG er ansett som effektiv for å hindre alvorlige former av sykdommen (meningitt og miliærtuberkulose TB) hos barn, men har vist inkonsekvent effekt mot lungetuberkulose ansvarlig for sykdomsoverføring 2.
Lunge vaksinasjon, som etterligner naturlig rute fra TB-infeksjon, representerer en attraktiv metode for grunning lokale vertens immunresponss. I denne forbindelse har forskjellige prekliniske arbeider på forskjellige relevante TB dyremodeller vist større vaksineeffektivitet følgende pulmonal immunisering, sammenlignet med subkutan eller intradermal rute 3-6. Likevel er de beskyttende mekanismer som utløses av lunge vaksinasjon ikke godt forstått. I de siste årene har flere verk peker mot IL17-mediert reaksjon som en viktig faktor for TB-spesifikke mucosal immunrespons, som i musemodeller mangelfull for IL17 slimhinne vaksineindusert beskyttende effekt er svekket 7,8.
Nylig viste vi for første gang at intranasal BCG administrasjon beskyttet DBA / 2 mus, en musestamme preget av mangel på beskyttelse etter subkutan BCG immunisering 9. Disse resultatene antydet at luft TB vaksinasjon kan være mer effektiv i å redusere frekvensen av TB i endemiske land, der intradermal BCG anses ineffektive mot pulmonær TB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle musene ble holdt under kontrollerte forhold og observert for eventuelle tegn på sykdom. Eksperimentelt arbeid ble utført i samsvar med europeiske og nasjonale direktiver for vern av forsøksdyr og med godkjenning fra vedkommende lokale etiske komiteer.
1. Utarbeidelse av kvantifiserte glyserol aksjer av BCG dansk og Mycobacterium tuberculosis H37Rv
MERK: Alle protokollen beskrevet ble utført under BSL3 forhold.
- Tine frossen glyserol aksjer av BCG dansk eller H37Rv stammer og inokulere 100 pl i 10 ml Brook 7H9 medium 10 supplementert med Tween-80 0,05% (v / v) og ADC (Albumin, dekstrose, Katalase) 10% (v / v).
- Inkuber under statiske betingelser i en uke ved 37 ° C inntil kulturen er i log-fase vekst.
- Skalere opp bakteriekultur ved å overføre den 10 ml kultur til 200 ml friskt medium. Inkuber i 20 ekstradager under statiske betingelser.
- Overfør til 50 ml sentrifugerør og sentrifuger i 15 min ved 2500 x g.
- Kast supernatanten og resuspender bakteriell pellet i det gjenværende volum. Legg til hvert rør sterile 3 mm diameter glassperler (10 - 15 per rør).
- Vortex kraftig i løpet av 1 min for å distansere bakterielle klumper. Resuspender hver pellet i 10 ml PBS med Tween-80 0,05% (v / v).
- La rørene i 10 minutter slik at de største bakterie aggregater og glassperler å slå seg ned.
- Gjenvinne 9,5 ml supernatant fra hver av de 4 rør inneholdende små klumper og enkle bakterier og overføre volumer til en enkelt frisk 50 ml sentrifugerør (slutt utvunnet volum 38 ml). Sentrifuger i 10 minutter ved 400 x g.
- Gjenopprette 35 ml supernatant (inneholdende hovedsaklig enkle bakterier) i en enkelt frisk 50 ml sentrifugerør og tilsett 15 ml PBS med glycerol 50% (v / v), oppnåelse av en endelig glyserol-konsentrasjon på 15% (v / v).
- bland forsiktigog distribuere i ett-ml porsjoner i passende rør for frysing. Oppbevares ved -80 ° C (en mye gir ca 50 porsjoner glyserol lager).
- For å kvantifisere glyserol aksjer, tine en glyserol dagen etter frysing og utføre syv ti-fold serielle fortynninger i separate 1,5 ml rør som inneholder 900 mL PBS.
- Plate 100 ul av hver fortynning i 7H10 faststoff-agar-medium 10 supplert med ADC 10% (volum / volum) fremstilt i 55 mm diameter Petri-skåler.
- Nøye legge til 3 mm diameter glassperler (ca. 10 per plate) og rist plate for å like distribuere volum over agar plate. Kast perler og forsegle agar plate med Parafilm.
- Inkuber i 21 dager ved 37 ° C og bestemme bakteriekonsentrasjon ved telling av kolonidannende enheter (CFU) i fortynningene hvor enkle kolonier kan være nøyaktig skilles.
2. Mouse Vaksinasjon
- Tine en pre-kvantifisert BCG glyserol og fortynne det i PBS til preper to suspensjoner. Beregn endelig volum vurderer dose per dyr er 100 fil for subkutan administrasjon (10 7 CFU per ml til subkutan vaksinering) og 40 ul for intranasal administrasjon (2,5 x 10 7 CFU for intranasal vaksinering).
- Bruk en spesialisert anestesi arbeidsstasjon for gnagere å bedøve mus med en blanding av isofluran og oksygen. Bruk isofluran 5% for å indusere anestesi og 2% for å opprettholde musene i anestesikammer. (Andre aksepterte anestesi metoden kan brukes).
- For subkutan administrering av vaksinen fylle en 1 ml sprøyte med en 26 G nål med 1 ml av bakteriesuspensjonen (10 7 CFU / ml). Fjern luftbobler.
- Plasser en bedøvet mus på et flatt underlag i liggende stilling inne i en laminær hette og vaksinere subkutant 100 mL (10 6 CFU / dose) av vaksine i en flanke av musen tilbake. Returner musen til buret og overvåke det å sikre at det properly gjenoppretter fra anestesi.
- Endre sprøytespissen mellom hver mus administrasjon. Fjernet luftbobler som beskrevet ovenfor.
- For intranasal administrasjon, plassere en bedøvet mus i liggende posisjon inne i hetten.
- Med en mikropipette ta 20 mL av suspensjonen med 2,5 x 10 7 CFU / ml. Plasser pode drop-by-slipp mellom de to neseborene til hele volumet har blitt avsatt, slik at tid mellom dråper å la muse puste volumet i. Merk: mus kan lider av åndenød i løpet av denne prosedyren så de bør overlates til assimilere hver dråpe før administrasjon av det neste for å hindre at det så mye som mulig.
- Re-fill mikropipette med en annen 20 ul og gjenta operasjonen. Hvis musen begynner å våkne opp fra bedøvelsen etter første vaksinasjon, plasser den i anestesi kammeret før den andre. Returner musen til buret og sørge for at det riktig gjenfra anestesi.
3. Mouse intranasal Challenge med H37Rv Strain
- Tine en pre-kvantifisert H37Rv glycerol og fortynne den i PBS for å fremstille en bakteriesuspensjon av 2500 CFU per ml. Beregn endelig volum vurderer dose per dyr er 40 ul.
- H37Rv ble inokulert intranasalt som beskrevet i 2.5 til 2.7. Siste utfordringen dose per mus er 10 2 CFU / 40 ul.
4. Analyse av indusert immunrespons i lungene
- Lung cellulær suspensjon
MERK: Vurdering av vaksineindusert adaptiv immunrespons i lungene krever generasjon av enkelt celle suspensjon. For dette formålet bruker vi en vev dissociator som GentleMACS.- Offer musen ved halshugging (eller andre aksepterte human metode) og sikre mus er død berøre øyeeplet for å bekrefte fraværende av blunkerefleksen.
- Inne i en laminær hette, pakke ut lungs bruker steril saks og pinsett og legg dem på en ren overflate. Clean lungene fjerne luftrøret og bindevev, og overføre lungene til en 1,5 ml tube med PBS (opprett på is inntil behandling).
- For å generere en cellesuspensjon, plasserer lungene i et passende rør for organ dissosiasjon (C-dissociator rør) inneholdende 5 ml 10 mM HEPES-NaOH pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM KCI, 1 mM MgCl2 og 1,8 mM CaCl2 buffer.
- Tilsett 100 Kollagenase D 100 mg / ml (2 mg / ml sluttkonsentrasjon), og 40 ul av DNase I 20.000 IU / ml (160 IU / ml sluttkonsentrasjon.
MERK: Stamløsninger av Kollagenase D eller DNaseI fremstilles oppløse lyofiliserte enzymer i PBS eller glycerol 50% (v / v), 20 mM Tris-HCl pH 7,5 y MgCl2 1 mM, respektivt. - Plasser røret i vevet dissociator og bruke forhåndsdefinerte program m_lung_01 for lunge fragmentering. Inkuber røret ved 37 ° C i et vannbad i 30 min.
- Plasser the tube i dissociator og bruke forhåndsdefinerte program m_lung_02 for fullstendig lunge homogenisering til én cellesuspensjonen.
- Passere cellesuspensjonen gjennom et 70 mikrometer nylon celle sil montert på en 50-ml sentrifugerør. Vask filteret med 10 ml RPMI 1640 medium.
- Sentrifuger cellene i 5 minutter ved 400 xg og kast supernatanten.
- Tilsett 1 ml av erytrocytter lyserende buffer, bland ved virvling og inkuberes i 1 min ved romtemperatur.
- Tilsett 10 ml RPMI 1640 medium og sentrifuger cellene i 5 minutter ved 400 x g.
- Resuspender celler i 0,5 ml komplett RPMI 1640 medium supplert med 10% varme-inaktivert føtalt kalveserum (FCS), 2 mM L-Glutamin, 100 ug / ml streptomycin, 100 IU / ml penicillin og 50 uM 2-merkaptoetanol.
MERK: FCS inaktiveres ved inkubasjon ved 56 ° C i 30 minutter. - Cellene telles og legge til fullstendig RPMI 1640 medium for å nå endelig celletetthet på 10 7 celler / ml.
MERK: For celletall, bruker vi automatisert celleteller. - Distribuere 100 mL av cellesuspensjonen i U-bunn 96-brønns plate (10 sterile 6 celler / brønn).
- Tilsett 50 ul / brønn komplett RPMI 1640 medium med 15 pg / ml av kommersiell H37Rv renset protein-derivat (PPD) (5 ug / ml sluttkonsentrasjon).
- Overstående samling for cytokin bestemmelse ved ELISA
- Inkuber platen fra 4.1.14 i 48 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
- Sentrifuger plate i 5 min ved 400 x g og gjenoppretter 100 ul supernatant.
- Oppbevar ved -80 ° C.
- Spe supernatanter 1/10 og 1/2 i analysebuffer for IFNy og IL17A besluttsomhet, henholdsvis. Bestem cytokin konsentrasjoner med kommersielle ELISA kits, i henhold til produsentens instruksjoner (ELISA Development Kits).
- Intracellulær farging for bestemmelse av cytokinproduserende CD4 + celler ved flow cytometri
- Inkuber platen fra 4.1.14 i 18 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
- Tilsett 1,5 mL av Brefeldin A 1 mg / ml (lager oppløst i DMSO) til hver brønn (10 pg / ml endelig konsentrasjon) og inkuberes i ytterligere seks timer.
- Sentrifuger plate fra 4.3.2 for en min ved 3200 xg og kast supernatanten.
- Resuspender celler i 50 ul av anti-mus-CD4-FITC fortynnet i RPMI 1640 med 10% FCS (1/500) og inkuber i 10 min ved 4 ° C.
- Sentrifuger plate fra 4.3.4 i 1 min ved 3200 x g, supernatanten kastes og tilsett 100 ul / brønn av fikseringsløsning. Inkuber ved 4 ° C i 20 min.
- Vask cellene to ganger med 150 ul / vask av permeabilization løsning.
MERK: 10x konsentrert lager blir fortynnet i avionisert vann for å fremstille 1x arbeid løsning. - Resuspender celler i 50 ul antimus IFNy-APC og anti-mus IL17A-APC.Cy7 fortynnet i permeabilvisualisering løsning (1/250 begge antistoffer).
- Inkuber i 1 time ved RT.
- Vask cellene to ganger med 150 ul / vask av permeabilization løsning.
- Resuspender celler i 200 mL PBS for flowcytometri oppkjøpet.
5. Analyse av immunglobuliner i Bronchoalveolar Lavage (BAL)
- Obtainment av BAL prøver
- Offer musen ved halshugging (eller andre aksepterte human metode) og sikre mus er død berøre øyeeplet for å bekrefte fraværende av blunkerefleksen.
- Expose luftrøret ved hjelp av riktig presisjon sterile tenger og sakser og utføre et lite snitt i luftrøret, og pass på ikke å skjære den helt. Pass på å ikke forårsake blødninger som kan forurense BAL prøven.
- Introdusere inn i luftrøret en kanyle koblet til en steril 1 ml sprøyte med 800 ul iskald PBS.
- Vaksinere sakte PBS inn i lungene og deretter recover BAL volum holdt igjen i sprøyten stempel meget langsomt for å unngå lungekollaps.
MERK: Gjenoppretting av 500 til 600 mikroliter er tilfredsstillende. - Overfør BAL volum inn i et 1,5 ml rør og bekrefte BAL forblir ufarget, noe som indikerer at det ikke er forurenset med blod (vedlikeholde på is inntil behandling).
- Sentrifuger BAL prøvene i 5 min ved 400 x g, og overføring av supernatanten til et nytt rør.
- Oppbevar supernatanter ved -80 ° C.
- Fastsettelse av IgA i BAL supernatantene
MERK: Alle reagenser som brukes er på RT.- Coat høy-proteinbinding polystyren flatbunnede 96-brønners plater med 100 ul av PPD fortynnet i PBS (10 ug / ml) for M. tuberkulose-spesifikke IgA besluttsomhet, eller med 100 ul BAL supernatanten fortynnet 10 ganger i PBS for total IgA besluttsomhet.
- Inkuber over natten ved 4 ° C.
- Kast supernatant og trykk platen på papirhåndkle å dry. Vask med 200 ul / brønn PBS.
- Blokk med 200 ul / brønn av et bovint serumalbumin (BSA) 1% (w / v) i PBS-Tween-80 0,05% (v / v) (blokkeringsbuffer).
- Inkuber 1 time ved RT.
- Vask en gang med 200 ul / brønn av PBS-Tween-80 0,05% (v / v) (vaskebuffer).
- Tilsett 100 ufortynnet BAL supernatant i PPD-belagte brønner. Inkuber i to timer ved romtemperatur.
MERK: Hvis den totale IgA-bestemmelse utføres i parallell med PPD-spesifikke IgA, gitt total IgA brønnene med 100 ul vaskebuffer i løpet av denne inkubasjonen. - Vask tre ganger med 200 ul / brønn av vaske buffer.0170004
- Tilsett 100 ul pepperrotperoksidase (HRP) -konjugert anti-muse-IgA fortynnet i blokkeringsbuffer (1 / 10.000).
- Inkuber 1 time RT.
- Vask fem ganger med 200 ul / brønn vaskebuffer.
- Tilsett 100 ul / brønn av 3,3 ', 5,5'-tetrametylbenzidin (TMB). Inkuber 20 minutter ved romtemperatur i than mørke.
- Tilsett 100 ul / brønn av H 2 SO 4 0,5N. Avles platen i et spektrofotometer ved en bølgelengde på 450 nm.
6. Bakteriell belastning besluttsomhet i lungene
- Lung homogenisering og plating
- Fire uker etter utfordring, ofre musen ved halshugging (eller andre aksepterte human metode) og sikre mus er død berøre øyeeplet for å bekrefte fraværende av blunkerefleksen.
- Plasser musen i liggende stilling fast på et flatt og desinfisert overflaten inne i en laminær hette.
- Lag et snitt og fjern skinnet fra brystet regionen til å forlate synlig thorax området.
- Skjær ut ribbe og høste lungene og hjertet ved hjelp av steril saks og pinsett. Plasser organer på en ren overflate.
- Rense ut lungene ved å fjerne hjerte, luftrøret og bindevev og overføre lungene til et 1,5 ml rør med 1 ml avionisert vann(Opprett på is inntil behandling).
- Bruk steril tang til å overføre lungene hos hver mus i et passende rør for homogenisering organ (M - dissociator rør), som inneholdt 1 ml avionisert vann.
- Plasser røret i vevet dissociator og bruke forhåndsdefinerte program RNA_1 å homogen lungene.
- Lag fem ti-fold serielle fortynninger i 1,5 ml rør, og starter med 100 ul lungehomogenat fortynnet i 900 fil.
- Plate fortynninger som beskrevet i 1.11 til 1.14.
- Differensiering mellom BCG og H37Rv av PCR
MERK: I platene fra 6.1.6 tilsvarende gruppen vaksinert med BCG ved intranasal rute, analyserte vi et representativt antall kolonier av en kresne PCR mellom BCG og H37Rv å sikre at CFU anses å vurdere vaksine-konferert beskyttende effekt samsvarer unikt å H37Rv. Dette PCR mål forsterkning av RD9, en genomisk region annerledes i BCG og M. tuberculosis, noe som gir et fragment av 2618 bp for H37Rv, og 465 bp for BCG 11.- Forbered en mester mix lager for alle prøver med volum pr prøve som angitt, og deretter distribuere i PCR-rør (9 pl / prøve).
MERK: Buffer 5x: 2 pl. Forward primer 25 um (GTGTAGGTCAGCCCCATCC): 0,32 mL, Omvendt primer 25 um (GCCCAACAGCTCGACATC): 0,32 mL, Taq polymerase 5 enheter / ul: 0,04 gl, ionisert H 2 O: 6,32 mL. - Trykk på en koloni med en steril tannpirker og dypp tannpirker med prøven i en PCR-rør som inneholder master mix.
- Kjør PCR med følgende program: 10 min 95 ° C (dette trinnet er å utløse bakteriell forstyrrelse), 10 min 95 ° C (dette trinnet er å utløse bakteriell forstyrrelse), 35 sykluser (30 sekunder ved 95 ° C, 1 min ved 58 ° C og 4 min ved 72 ° C).
- Laster PCR-prøvene i en 1% agarosegel med etidiumbromid og kjøre prøvene for å visualisere fragmentene.
- Forbered en mester mix lager for alle prøver med volum pr prøve som angitt, og deretter distribuere i PCR-rør (9 pl / prøve).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dette arbeidet beskriver sammenligning av to ruter av administrasjonen av BCG: subkutan og intranasal. Subkutant, er sammenlignbart med intradermal, som er den nåværende kliniske rute for BCG over hele verden. Intranasal rute for vaksinering tar sikte på å etterligne den naturlige infeksjonsrute av M. tuberkulose, med det formål å indusere immunrespons direkte i lungene, det primære målorgan for denne patogen.
Figur 1 beskriver arbeidsflyten fulgt. Åtte til ti uker gamle hunn DBA / 2 mus vaksinert med 10 6 CFU av BCG dansk ved subkutan eller intranasal administreringsmåte. Åtte uker senere, er en gruppe av mus ofret for å analysere lunge immunresponsen indusert ved vaksinering. BAL prøvene er først innhentet og deretter vi høste lungene. For å studere vaksinedratt beskyttende effekt, vaksinere vi en different gruppe av mus med en lav dose intranasal utfordring med M. tuberkulose H37Rv belastning. En måned senere, ofrer vi dyr og slakte lungene. I dette tilfelle, for hvert dyr bruker vi den venstre lungen for å bestemme bakteriemengde og høyre lunge til å vurdere vaksine-induserte immunrespons post-utfordring. Målet er å generere bakteriemengde og immunresponsdata i lungene for hvert dyr for å studere mulige korrelater for beskyttelse.
Som vist i figur 2, ble lungene dissosiert for å oppnå enten et organ homogenat eller en cellesuspensjon. Homogeniserte lunger ble sådd ut på fast agarmedium for å bestemme bakteriemengde fire uker post-utfordring. Cellular suspensjon for å studere vaksine-induserte immunrespons ble oppnådd etter lunge enzymatisk spaltning med kollagenase D og DNaseI.
Våre resultater viser tydelig at, sammenlignet to subkutant, intranasal ruten for vaksinering ensidige mye større beskyttende effekt i lungene fire uker etter smitte (figur 3A). I tillegg har vi bekreftet at bakteriemengden i lungene fra intranasal BCG-vaksine gruppe tilsvarer H37Rv og ikke til BCG-vaksine. For å oppnå dette, analyserte vi et representativt antall kolonier fra denne gruppen ved spesifikk PCR for den RD9 genomet region, som forsterker forskjellig lengde fragmenter i BCG og M. tuberculosis (figur 3B). Figur viste klart at alle kolonier analysert ga et fragment på 0,4 kbp, noe som tilsvarte H37Rv.
Våre data indikerer sammenheng mellom beskyttende effekt gitt av intranasal BCG vaksinering og vaksineinduserte immunrespons i lungene før utfordring. Intranasal BCG klart utløst høyere IL17 og IFNy-produksjonen i lungene, målt ved ELISA (figur4A). Disse data ble bekreftet ved intracellulær farging (ICS) og flow-cytometri (data ikke vist). I tillegg har vi også funnet en høyere konsentrasjon av både total og PPD-spesifikk IgA-konsentrasjonen i BAL prøver (figur 4B), noe som indikerer at lunge BCG-vaksinasjon induserer produksjon av IgA og translokasjon til luftveiene.
Til slutt har vi studert BCG induserte immunrespons i lungene etter utfordring (figur 5). Våre data indikerer forskjeller mellom IL17 og IFNy; IL17A-produserende CD4 + -celler ble bare detektert i intranasal BCG gruppen, mens IFNy-produserende celler ble funnet i alle grupper infisert med H37Rv uavhengig av vaksinering. Representasjon av data fra hvert dyr svarende til IL17-produserende celler og bakteriemengden viste en signifikant korrelasjon mellom nærværet av IL17 og lunge bakterielastreduksjon, som ikke ble observert i tilfellet med IFNy.
Figur 1. Arbeidsflyt til sammenligning intranasal og subkutant av BCG-vaksinasjon. Åtte uker etter BCG immunisering, et sett med mus (6 per eksperimentell gruppe) brukes til å høste lungene og utføre en BAL, og analysere lungeimmunrespons indusert av vaksinasjon. Et annet sett med mus (6 / gruppe), ble inokulert med en lav dose intranasal utfordring med M. tuberkulose H37Rv stamme (100 CFU). En måned senere, blir dyrene avlivet og bakteriemengden er analysert i venstre lunge og PPD-spesifikk immunrespons i høyre lunge. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. beskyttende effekten gitt av BCG Immunisering. Grupper på 6 DBA / 2 mus ble vaksinert ved subkutan (BCG sc), intranasal (BCG i) rute, eller ikke-vaksinerte (Unvacc) med BCG dansk vaksine 10 6 CFU. På to måneder etter vaksinering ble mus inokulert intranasalt med en lav dose (100CFU) H37Rv utfordring, og en måned senere bakteriemengden i lungene ble bestemt. En representant eksperiment av to uavhengige vises. (A) Dataene i grafene er representert som gjennomsnitt + SD. Enveis ANOVA test med Bonferroni stolpe analyse ble utført for å beregne statistisk signifikans. (B) Et representativt antall av enkeltkolonier fra BCG intranasale gruppen ble analysert ved hjelp av PCR spesifikk for RD9 region (forskjellig i BCG og H37Rv genomer) for å skjelne BCG og H37Rv kolonier. (Tidligere publisert 9). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Vaksine spesifikke Lungeimmunrespons analyseres før utfordring med H37Rv. Grupper på 6 DBA / 2 mus varvaksinert ved subkutan (BCG sc) eller intranasal (BCG i) rute, eller ikke-vaksinerte (Unvacc) med BCG Dansk vaksine 10 6 CFU. (A) Etter to måneder etter vaksinering, ble en cellesuspensjon fra høstet lungene erholdt. Celler ble stimulert med PPD som beskrevet i metodedelen og IL17A (venstre panel) og IFNy (høyre panel) produksjon ble analysert ved hjelp av ELISA. (B) Total IgA, og M. tuberkulose (MTB) -spesifikk IgA ble analysert fra BAL prøver ved ELISA. Sammenslåtte data fra to uavhengige eksperimenter er vist. Dataene i grafene er representert som gjennomsnitt + SD. (Tidligere publisert 9). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Vaksine spesifikkeLungeimmunrespons analyseres før utfordring med H37Rv. Grupper på 6 DBA / 2 mus ble vaksinert ved subkutan (BCG sc) eller intranasal (BCG i) rute, eller ikke-vaksinerte (NV) med BCG dansk vaksine 10 6 CFU. En kontrollgruppe av ikke-vaksinerte, ikke-infiserte mus ble også inkludert (NV / NI). På to måneder etter vaksinering, ble mus utfordret intranasalt med en lav H37Rv dose (100 CFU), og en måned senere ble dyrene avlivet. Venstre og høyre lungene fra det samme dyr ble anvendt for å bestemme bakteriemengde og IL17A- (A) eller IFNγ- (B) fremstilling av CD4 + -celler, respektivt. Dataene i venstre paneler tilsvarer prosentandelen av cytokin-produserende celler, målt ved flow-cytometri, og er representert som gjennomsnitt + SD. Høyre panel representerer data fra bakteriemengde og cytokine- produsere CD4 + celler hentet for hver mus. Lineær regresjon ble beregnet og p-verdien oppnådd i hvert tilfelle er vist i tilfellet med IL17A. Fellesdata fra to uavhengige eksperimenter er vist i figuren. (Tidligere publisert 9). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Middlebrook 7H9 broth | BD | 271310 | |
| Middlebrook ADC Enrichment | BD | 211887 | |
| Tween 80 | Scharlau | TW00800250 | |
| 3-mm diameter Glass Beads | Scharlau | 038-138003 | |
| Middlebrook 7H10 Agar | BD | 262710 | |
| 1-ml syringe 26GA 0.45 x 10 mm | BD | 301358 | |
| GentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| M tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | |
| Collagenase D | Roche | 11088882001 | |
| DNaseI | Applichem | A3778,0100 | |
| Falcon 70 µm Cell Strainer | Corning | 352350 | |
| RPMI 1640 | Sigma | R0883 | |
| Red Blood Cell Lysing Buffer | Sigma | R7757 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-061 | 100x concentrated |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sigma | P4333 | 100x concentrated |
| Fetal Calf Serum | Biological Industries | 04-001-1A | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148-25ML | |
| Scepter 2.0 Handheld Automated Cell Counter | Millipore | PHCC20040 | |
| Scepter Cell Counter Sensors, 40 µm | Millipore | PHCC40050 | |
| Mycobacterium Tuberculosis - Tuberculin PPD | Statens Serum Institut (SSI) | 2390 | |
| Mouse IFN-γ ELISA development kit | Mabtech | 3321-1H | |
| Mouse IL17A ELISA development kit | Mabtech | 3521-1H | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD4 | BD | 553047 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Kit | BD | 555028 | |
| APC-Cy7 Rat Anti-mouse IL-17A | BD | 560821 | |
| APC Mouse Anti-mouse IFNg | BD | 554413 | |
| LACHRYMAL OLIVE LUER LOCK 0.60 x 30 mm. 23G x 1 1/4” | UNIMED | 27.134 | Used as trachea cannula for BAL |
| high-protein binding polystyrene flat-bottom 96-well plates MAXISORP | NUNC | 430341 | |
| Albumin, from bovine serum | Sigma | A4503 | |
| Goat Anti-Mouse IgA (α-chain specific)−Peroxidase antibody | Sigma | A4789 | |
| 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) | Sigma | T0440 | |
| MyTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21107 | The kit Includes Buffer 5x |
References
- Zumla, A., et al. The WHO 2014 global tuberculosis report--further to go. Lancet Glob Health. 3 (1), e10-e12 (2015).
- Mangtani, P., et al. Protection by BCG vaccine against tuberculosis: a systematic review of randomized controlled trials. Clin Infect Dis. 58 (4), 470-480 (2014).
- Aguilo, N., et al. Pulmonary Mycobacterium bovis BCG vaccination confers dose-dependent superior protection compared to that of subcutaneous vaccination. Clin Vaccine Immunol. 21 (4), 594-597 (2014).
- Chen, L., Wang, J., Zganiacz, A., Xing, Z. Single intranasal mucosal Mycobacterium bovis BCG vaccination confers improved protection compared to subcutaneous vaccination against pulmonary tuberculosis. Infect Immun. 72 (1), 238-246 (2004).
- Giri, P. K., Verma, I., Khuller, G. K. Protective efficacy of intranasal vaccination with Mycobacterium bovis BCG against airway Mycobacterium tuberculosis challenge in mice. J Infect. 53 (5), 350-356 (2006).
- Lagranderie, M., et al. BCG-induced protection in guinea pigs vaccinated and challenged via the respiratory route. Tuber Lung Dis. 74 (1), 38-46 (1993).
- Gopal, R., et al. Interleukin-17-dependent CXCL13 mediates mucosal vaccine-induced immunity against tuberculosis. Mucosal Immunol. 6 (5), 972-984 (2013).
- Khader, S. A., et al. IL-23 and IL-17 in the establishment of protective pulmonary CD4+ T cell responses after vaccination and during Mycobacterium tuberculosis challenge. Nat Immunol. 8 (4), 369-377 (2007).
- Aguilo, N., et al. Pulmonary but Not Subcutaneous Delivery of BCG Vaccine Confers Protection to Tuberculosis-Susceptible Mice by an Interleukin 17-Dependent Mechanism. J Infect Dis. , (2015).
- Middlebrook, G., Cohn, M. L. Bacteriology of tuberculosis: laboratory methods. Am J Public Health Nations Health. 48 (7), 844-853 (1958).
- Brosch, R., et al. A new evolutionary scenario for the Mycobacterium tuberculosis complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (6), 3684-3689 (2002).
- Kaushal, D., et al. Mucosal vaccination with attenuated Mycobacterium tuberculosis induces strong central memory responses and protects against tuberculosis. Nat Commun. 6, 8533 (2015).
- Lochhead, J. J., Thorne, R. G. Intranasal delivery of biologics to the central nervous system. Adv Drug Deliv Rev. 64 (7), 614-628 (2012).
- Lochhead, J. J., Wolak, D. J., Pizzo, M. E., Thorne, R. G. Rapid transport within cerebral perivascular spaces underlies widespread tracer distribution in the brain after intranasal administration. J Cereb Blood Flow Metab. 35 (3), 371-381 (2015).
- Griffiths, K. L., et al. Cholera toxin enhances vaccine-induced protection against Mycobacterium tuberculosis challenge in mice. PLoS One. 8 (10), e78312 (2013).
- Hirota, K., et al. Plasticity of Th17 cells in Peyer's patches is responsible for the induction of T cell-dependent IgA responses. Nat Immunol. 14 (4), 372-379 (2013).
- Jaffar, Z., Ferrini, M. E., Herritt, L. A., Roberts, K. Cutting edge: lung mucosal Th17-mediated responses induce polymeric Ig receptor expression by the airway epithelium and elevate secretory IgA levels. J Immunol. 182 (8), 4507-4511 (2009).
