Introduction
Retinsyre (RA) er en metabolitt derivat av retinol eller vitamin A og er produsert ved sekvensiell aktiviteten av flere cellulære dehydrogenaser 1. På grunn av sin kjemiske natur, amfipatisk, det passerer lett lipidmembraner og kan fungere som en oppløselig morfogenetiske faktor 1. Det er et viktig molekyl som regulerer en rekke utviklings- og voksne cellulære prosesser ved å opptre som en ligand for atom retinoid reseptorer og aktivere disse 2-10. Uten RA, disse RA reseptorer (Rars) bind Rares i DNA og fungere som repressors; RA binding til disse reseptorene gjør dem til transkripsjonsaktivatorer som resulterer i mål genuttrykk 1,5,6.
Selv om RA signalveien er godt karakterisert, den lille størrelse (~ 300 Da) og den amfipatiske natur av RA gjør direkte histologisk visualisering og måling av RA for tiden er teknisk gjennomfør 11. Den eneste metoden for direct måling av RA-nivåer er gjennom isolasjon av RA fra vevsprøver ved hjelp av væskekromatografi med høy yteevne (HPLC) 11. Denne metoden krever vanligvis store mengder vev, tilrettelagt av pooling forskjellige prøver 12. Således er denne teknikken dårlig egnet for måling av RA-nivåer i de enkelte embryoer eller små mengder av prøven / vev.
For å undersøke den cellulære funksjonen til RA, har flere metoder blitt utviklet for å indirekte antyde tilstedeværelse av RA. Disse fremgangsmåter gjør bruk av reporter-systemer inneholdende den sterkt responsive RAR-beta RARE å drive ekspresjon av beta-galaktosidase eller luciferase 11,13,14. Den transgene RARE-lacZ-rapportør mus som genereres av Rossant et al. 13 er et ideelt system for å visualisere tid og rom regioner av RA signalering in situ 11,13,15,16, men er uegnet for kvantitative målinger. Den F9 RARE-LacZ cellelinje 14, på than derimot, er nyttig for påvisning av RA og kvantitative målinger av RA-nivåer i vev eksplantater 11,12,14,17,18.
F9 teratokarsinomceller celler uttrykker endogent alfa-, beta-, og gamma-retinsyrereseptorer 19, og sette i gang differensiering i parietale endoderm etter eksponering for RA 19-21. F9 celler har lenge vært etablert som en modell for RA-indusert cellulær differensiering, noe som er grunnen til at det ble valgt som en ideell cellelinje for en RA reporter analysen. Den F9-avledede Sil-15 RA rapportørcellelinje som genereres av Wagner et al., 14 inneholder en E. coli'LacZ genet nedstrøms for en kopi av det 64 bp-retinoinsyre responselement (RARE) av det humane beta-retinsyrereseptor (RAR-beta) genet. For å velge og opprettholde stabile kloner, inneholder konstruksjonen også aminoglykosid fosfotransferase (NEO r) genet som en selekterbar markør i nærvær av G418. Denne konstruksjonen confers induserbar ekspresjon av B-galaktosidase i nærvær av RA, som kan visualiseres gjennom LacZ farging og denne reaksjon kan deretter kvantifiseres ved hjelp av kolorimetriske metoder 11,12,14,18.
Denne ekstremt allsidig rapportørcellelinje som har blitt mye brukt i påvisning av endogen RA produksjonen gjennom ko-kultur av vevsprøver med rapportør celler, så som cochlea 17 og embryonale gulvplate eksplantater 14. I tillegg har denne reporteren linjen vært anvendt for kvantifisering av RA-nivåer i utviklingen av ryggmargen ved dyrking sammenslåtte deler av embryoniske ryggmargen separat og tilsetning av kondisjonert medium fra disse kulturene til F9 RARE-lacZ-celler 18. Kvantifisering ble utført etter LacZ farging gjennom kolo lesing ved hjelp av en standard ELISA plateleser 11,12,18. Endelig har denne reporter-cellelinjen blitt anvendt i påvisning av tilstedeværelse av RA metabolske enzymer ved overvåkingsng endringer i RA nivåer 12,18.
Her rapporterer vi at sensitiviteten av denne reporter cellelinje gir også mulighet for måling av RA nivåer generert fra individuelle co-kultivert E8.5 embryoer. Dette gjør sammenligningen mellom de enkelte embryoer fra forskjellige genotyper. Som et konkret eksempel, er Gpr161 en foreldreløs GPCR som regulerer neurulation delvis gjennom RA signalveien 22, og vi rapporterer å bruke denne reporteren cellelinje for å undersøke effekten av en recessiv mutasjon i Gpr161 (Gpr161 vl) på gjennomsnittlige RA nivåer i embryo. I tillegg til dette, allsidighet og brukervennlighet-bruk av dette reporter systemet tillater frihet til å måle og sammenligne RA nivåer i ulike vevsprøver, selv i neurosfære kulturer hentet fra voksen ryggmargs stamceller. Her beskriver vi kvantitativ måling av relative RA nivåer i embryoer og neurosfære kulturer gjennom direkte co-kultur med F9 RARE-LacZ RA reporter cellelinje.
Protocol
Alle dyr arbeidet ble gjort i henhold til godkjente Rutgers-RWJMS IACUC metoder.
1. Løsning og Media Forberedelse
- Forbered lager og bufferløsninger som per tabell 1. Forbered arbeidsløsninger som per tabell 2.
2. Kultur og vedlikehold av F9 RARE-lacZ Cells
- Opptining av frosne celler
- Fremstille F9 RARE-LacZ cellekulturmedium som beskrevet i tabell 2.
- Coat 10 cm kulturskåler (cellekultur behandlet) med 10 ml 0,2% gelatin (se tabell 2) i 30 minutter ved RT. Vask av overflødig gelatin med to skyllinger med 10 ml destillert vann. Tilsett umiddelbart 9 ml F9 RARE-lacZ-cellekulturmedium i kolben for å hindre at gelatin fra tørking.
- Tine en ampulle med F9 RARE-lacZ-celler 14 i et 37 ° C vannbad i 2 - 3 min. Plate celler (rundt 1 x 10 6 celler / ml) inn i belagt fatet containing 9 ml kulturmedium. Kultur ved 37 ° C, 5% CO2. Endre medium neste dag.
- Vedlikehold av F9 RARE-lacZ Cells
- Opprettholde et vanlig passasje hver 2 - 3 dager i forholdet 1:10.
Merk: Ikke la cellene vokse inn konfluens da dette vil resultere i deres differensiering. - Dele kulturer på en confluency på 80-90%. Fjern mediet og vask av cellene med 10 ml 1 x fosfatbufret saltvann (PBS). Fjern PBS og tilsett 1 ml trypsin, inkuberes i 5 min. Legg 9 ml kulturmedium, pipette opp og ned og dele celler 01:10 for passasje.
- Opprettholde et vanlig passasje hver 2 - 3 dager i forholdet 1:10.
- Frysing F9 RARE-lacZ Cells
- Trypsineres en 10 cm tallerken inneholder F9 RARE-lacZ celler ved 80 - 90% samløpet som beskrevet i trinn 2.2.2. Overfør de dissosierte cellene inn i et 15 ml sentrifugerør og sentrifugering ved 200 xg i 5 minutter.
- Fjern supernatant og resuspender cellepelleten i 10 ml F9 RARE-LacZ freezing medium (se tabell 2). Delmengde 1 ml til merket cryovials og overføre ampuller i frysecontainere. Plasser fryseemballasje på -80 ° C fryser O / N og overføre ampuller til flytende nitrogen stridsvogner neste dag.
3. Disseksjon av E8.5 embryoer
- Parring Cage Oppsett og Plug Sjekk
- Sett opp en parring bur inneholder en parring par. Morgenen neste dag, se på tilstedeværelsen av en vaginal plugg og utpeke den dagen en plugg finnes som dag 0,5 23. I dag E8.5, slakte embryoer.
- Disseksjon av embryoer
- Offer demningen ved halshugging og spray mageområdet med 70% etanol (se tabell 2). Foreta en tverrgående kutt på huden over buken ved hjelp av kirurgiske sakser og trekke de to fliker fra hverandre (anterior og posterior) for å utsette mageområdet. Lag en lignende kuttpå peritoneum for å eksponere underlivet.
- Finn uteri og slipp uteri fra egglederne og mesometrium ved hjelp av en saks 23. Plasser uteri i en 6 cm plate (ikke-cellekulturer behandlet) med 10 ml 1 x PBS for å vaske av overskudd av fett og blod. Overføring til en annen 6 cm tallerken inneholder friske 10 ml 1x PBS.
- Separat en livmor som inneholder ett embryo ved å klippe den av ved hjelp av kirurgisk saks. Fjerne livmor og decidua og slipp plommesekken inneholder embryo ved hjelp av to par no. 5 tang 23.
- Separer plommesekken fra embryo, og overføre plommesekken til et 1,5 ml mikrosentrifuge-rør for genomisk DNA-ekstraksjon som skal brukes for genotyping. Bruk en P20 pipette med en vid boring spissen, overføre hele embryoet inn i en 1,5 ml mikro rør som inneholder 10 mL av trypsin. Plasser røret på is.
- Gjenta trinn 3.2.3 - 3.2.4 til alle embryoer har blitt dissekert.
- embryo Dissosiasjon
- Inkuber 1,5 ml rør inneholdende embryoer i trypsin ved 37 ° C i 5 min for å lette enzymatisk dissosiasjon.
- Triturate forsiktig ved hjelp av et P20 pipette for mekanisk dissosiasjon av embryoet, og plate hele 10 ul volum inneholdende en dissosiert embryo over en brønn av F9 RARE-lacZ-celler i en 96-brønns plate (se trinn 5.1 for plating F9 RARE-lacZ-celler i en 96-brønns plate). Kultur O / N ved 37 ° C og 5% CO2.
- Inkuber 1,5 ml rør inneholdende embryoer i trypsin ved 37 ° C i 5 min for å lette enzymatisk dissosiasjon.
4. laminectomy, Disseksjon av Adult Korsrygg Spinal Cord og neurosfære Kultur
- laminectomy
- Ofre en voksen (P60) mus gjennom halshugging.
- Spray dorsalsiden med 70% etanol og foreta en tverrgående snitt ved hjelp av kirurgiske sakser. Trekk begge flaps (fremre og bakre) fra hverandre for å eksponere ryggen og ryggraden.
- Ved hjelp av kirurgiske saks, klippe av musklene som dekker ryggraden.Finn korsryggen i ryggmargen, under ribbeina. Ved hjelp av saks, gjør et dypt kutt for å kutte ryggraden på dette punktet for å eksponere ryggmargen.
- Trekk opp korsryggen av ryggraden uten. 5 tang slik at den blottlagte tverrsnitt av ryggmargen er vendt mot experimenter. Ved hjelp av tips av gode saks, klipp vertebra og muskel på klokken 3 og 9 posisjoner av den eksponerte enden. Ta tak i rygg klaff av kuttet vertebra med pinsett. Fortsett disse kuttene caudally inntil lengden av den lumbale ryggmargen er eksponert.
- Slipp ryggmargen fra ryggvirvlene bruker no. 5 samt butt-endete tang. Overfør ryggmargen til en 15 ml tube inneholder 3 ml DMEM / F12 kulturmedium. Hold på is inntil alle lumbale ryggmargen har blitt isolert.
- Spinal Cord Dissection
- Hell kulturmediet med ryggmargen til en 6 cm tallerken (ikke-cellekultur behandlet).
- Under en stereomikroskop, fjerner ryggmargen og blodårene rundt ryggmargen segment ved å ta tak ganglia og blodårene ved hjelp av to par av no. 5 pinsett og forsiktig trekke dem vekk fra ryggmargen. Overfør ryggmargen segmentet til en 6 cm tallerken uten medium og hakke vevet fint å bruke en skalpell blad.
- Overføring hakket vev til 15 ml rør inneholdende 1 ml av neurosfære dissosiasjon media (se tabell 2). Sett røret på is og gjenta trinn 4.2.1 - 4.2.2 til alle ryggmargen har blitt behandlet.
- Inkuber rør inneholdende hakket vev i dissosiasjon medium ved 37 ° C i 10 minutter, bla røret på siden for å blande og deretter inkuberes ved 37 ° C i ytterligere 10 min. Etter enzymatisk fordøyelse, triturate med brann polert pipetter av avtagende diameter for mekanisk dissosiasjon.
Merk: Forbered brann polert pipetter av avtagende diameter før du utfører eksperimenter. Ta et glass Pasteurpipette og plugg den brede enden med ren bomull. Ved hjelp av en alkohol lampe, brann polsk tips av pipetter i flammen til å lage forskjellige diametre: "vanlig", "fine", og "ekstra fine". For "vanlige" polerte pipetter, tvinne enden av pipetten i flammen for å runde av kantene uten å redusere diameteren (~ 1 mm). Roter enden av pipetten i flammen for en litt lengre perioder for å skape "fine" (~> 1 mm og> 5 mm diameter) og "ekstra fine" (~ 0,5 mm) polerte pipetter. Ikke bruk pipetter med diameter mindre enn 0,5 mm.
- neurosfære Culture
- Spinne ned rør inneholdende dissosierte ryggmargsvevet ved 200 xg i 10 min. Fjern supernatant og resuspender cellepelleten i 1 ml neurosfære kulturmedium (se tabell 2). Triturer med en pipette P1,000 etterfulgt av en P200 pipette for å lette dissosiasjon.
Merk: Unngå å innføre bobler,noe som ville redusere celle levedyktighet. - Overføre 10 ul av dissosierte celler i et hemocytometer og oppnå et celletall. Plate-celler ved en tetthet på 1x10 5/10 ml i en T25-kolbe med 10 ml neurosfære kulturmedier. Inkuber ved 37 ° C og 5% CO2 i 7 dager inntil neurosfærer vises 24.
- Spinne ned rør inneholdende dissosierte ryggmargsvevet ved 200 xg i 10 min. Fjern supernatant og resuspender cellepelleten i 1 ml neurosfære kulturmedium (se tabell 2). Triturer med en pipette P1,000 etterfulgt av en P200 pipette for å lette dissosiasjon.
- neurosfære Dissosiasjon
- Samle neurosfære kultur og overføres til 15 ml rør. Spin 200 xg i 10 min. Fjerne det meste av supernatanten later 1 ml bak. Triturer med en P1,000 pipette til cellepelleten suspenderes og dissosierer neurosfærer inn i enkeltceller. Overfør 10 mL av dissosiert celler i et hemocytometer og få en celletall.
- Plate 1 x 10 5 dissosiert neurosfære celler over en brønn på F9 RARE-LacZ i en 96-brønns plate (se avsnitt 5.1 for plating F9 RARE-LacZ i 96-brønns plate). Plate 3 brønner som paralleller. Kultur O / N ved 37 ° C og 5% CO2.
5. RA analysen av E8.5 embryoer og Spinal Cord Neurosfærer
- Plating F9 RARE-LacZ i 96-brønners plate
- En dag før høsting E8.5 embryoer eller dissosiasjon av neurosfærer, belegge en 96-brønns plate med 100 ul 0,2% gelatin per brønn i 30 min ved RT. Aspirer ut gelatin og skylles to ganger med 200 pl destillert vann.
- Trypsineres F9 RARE-lacZ celler opprettholdt i 10 cm retter som beskrevet i trinn 2.2.2. Plate 1 x 10 5 celler / brønn av F9-RARE LacZ celler, men denne gangen ved hjelp av kulturmedium uten G418.
- Forbered nok brønner for ko-kultur av embryoer (~ 12-20, avhengig av kullstørrelse), neurosfærer (3 brønner / genotype) så vel som for en standardkurve i triplikat (27 brønner).
- Co-kulturen i F9 RARE-LacZ og E8.5 Embryoet eller Spinal Cord Neurosfærer
- Slakte embryoer som beskrevet i kapittel 3.2 og plate på toppen av F9RARE-LacZ i 96-brønns plate fra avsnitt 5.1. På lignende måte, dissosiere neurosfærer og plate på toppen av F9 RARE-LacZ i 96-brønns plate som beskrevet i trinn 4.4. Kultur O / N ved 37 ° C og 5% CO2.
- Generere en standardkurve
- For å generere en standardkurve, forberede all-trans RA (at-RA) løsninger med følgende konsentrasjoner: 100 nm, 10 nm, 1 NM, 100 pM, 22:00, 13:00, 100 FM, etter serie fortynning av at- RA lager (se tabell 1) med F9 RARE-LacZ dyrkingsmedium.
- Tilsett 100 av disse ulike at-RA konsentrasjoner til F9 RARE-lacZ celler fra avsnitt 5.1. Tildele brønner som inneholder ubehandlet F9 RARE-lacZ celler som negativ kontroll. Fremstille tre paralleller av hver RA konsentrasjon og negative kontrollbrønner. Kultur O / N ved 37 ° C og 5% CO2.
Merk: F9 RARE-lacZ-celler responderer på en doseavhengig lineær måte til varierende konsentrasjoner av all-trans-RA.
- RA-analyse
- Etter at O / N kultur av 96-brønners plate inneholdende standardkurver og ko-kulturer, fjern mediet og feste kulturene ved tilsetning av 100 ul 2,5% glutaraldehyd (se tabell 2) i 15 min, RT. Fjern fiksativ og vask to ganger med 200 mL 1x PBS, 10 min per vask.
- Fjern PBS og vask tre ganger med 200 ul av LacZ vaskeoppløsning (se tabell 2), 10 minutter per vask. Under den tredje vask, fremstille X-gal-farging oppløsning i et 15 ml rør innpakket i folie (se tabell 2). Beregne hvor mye fargeløsning som er nødvendig, og fremstille den passende mengde (200 ul / brønn).
Merk: X-gal-farging løsning er lysfølsom. Bruk fargeløsning i løpet av 15 minutter etter tilberedning. - Fremstille et fuktet kammer ved å plassere et papirhåndkle fuktet med destillert vann i en plastbeholder er stor nok til å holde en 96-brønns plate. Tilsett 200 ul av X-a-gal farging oppløsning per brønn av 96-brønns plate og plassere platen i et fuktet kammer.
- Inkuber fuktet kammer inneholdende 96-brønners plate ved 37 ° C for å tillate utvikling av blå-farget bunnfall. For E8.5 embryoer, inkuber platen O / N (12-16 timer). For neurosfære kulturer, inkuber platen 4 - 8 timer.
- Reading Absorbsjon ved OD 610 og bildebehandling
- Etter farge reaksjon, fjerne LacZ fargeløsning og erstatte med 200 mL 1x PBS. Mål absorbansen ved 610 nm ved anvendelse av en standard ELISA-plateleser for å kvantifisere responsen på reporteren RA. Bilde individuelle brønner ved hjelp av en standard stereomikroskop utstyrt med et kamera.
6. Subkloning av F9 RARE-lacZ Cells
- Kontroll F9 RARE-LacZ rResponse til RA
- Før du starter noen eksperimenter, teste responsen F9 RARE-lacZ celler til RA. Plate F9 RARE-LacZ calen i 96-brønners plate (se punkt 5.1), og tilsett 1 nM all-trans retinsyre (se trinn 5.3). Inkuber i et fuktet kammer ved 37 ° CO / N.
- Visual utvikling av blåfarget utfelling ved hjelp av et mikroskop. Hvis fargeutvikling er ikke ensartet over hele cellene i brønnen (se figur 1B, til venstre), utføre subkloning beskrevet nedenfor.
- Subkloning av F9 RARE-lacZ Cells
- Splitte F9 RARE-lacZ celler dyrket i 10 cm retter som beskrevet i trinn 2.2.2. I stedet for et 01:10 forhold, platen en lav såing tetthet på 1 x 10 5 celler / 10 ml i et 10 cm rett til å tillate vekst av isolerte kolonier slik at hver koloni oppstår fra en enkelt F9 RARE-LacZ celle.
- Etter to dager, belegge en 24-brønns plate med 500 mL av 0,2% gelatin per brønn i 30 min. Fjern gelatinoppløsning og rens brønnene to ganger med 500 pl destillert vann. Skift vann med 500 mL av F9 RARE-LacZ cellekulturmedium.
- Plukk en koloni med en steril P10 pipette og overfør til en brønn; gjøre dette 24 ganger for å oppnå 24 individuelle kolonier. Kultur ved 37 ° C, 5% CO 2 for 3 - 4 dager.
- Splitte de individuelle kolonier i to 24-brønns plater. Etter 2 dager i kultur, tilsett 1 nM RA til hver brønn i en 24-brønners plate og kulturen O / N. Utfør LacZ flekker som beskrevet i avsnitt 5.4 for å teste for høye respondere. Visualfargereaksjon av hver brønn under et mikroskop for å bestemme sterke og jevne respondere.
- Når en sterk subklon responder er bestemt ved å utvide den tilsvarende kulturen fra den andre 24-brønnsplate. Ytterligere utvide at kolonien i en 10 cm tallerken, fryse ned flere ampuller som beskrevet i kapittel 2.3, og forkaste alle andre kolonier.
Merk: Bare om lag en fjerdedel av de opprinnelige koloniene resultere i høye respondere. Vanligvis gjør den første runden av subkloning ikke resulterer i uniform LacZ-farging og en etterfølgende runde med subkloning som må gjøres for åoppnå ensartede sterke reaksjoner.
Representative Results
Den F9 RARE-LacZ reporteren er en adherent embryonal karsinom cellelinje dyrket på gelatin-belagte overflate. Reporteren konstruksjonen gjør at cellene til å reagere kvantitativt til RA med en proporsjonal induksjon av beta-galaktosidase. 11,12,14,18. Disse cellene vise en epitelial morfologi (figur 1A). På grunn av deres høye dobling hastighet, er det anbefalt at disse cellene deles hver 2 - 3 dager ved et forhold på 1:10. Under vårt arbeid med denne rapportørcellelinje, har vi observert at selv med tilsetning av G418 i kulturmediet, er responsen til disse cellene til RA svekker etter flere passasjer (figur 1B, til venstre), og dette kan påvirke reporteren kapasiteten denne cellelinjen. Dette tap av følsomhet kan skyldes delvis tap av transgenet ved senere passasjer. Som sådan, periodisk subkloning er nødvendig for å sikre sterke og enhetlige respondere til RA (Figur1B, til høyre).
Mens forskjellige anvendelser av denne cellelinje er tidligere blitt publisert 12,14-18, rapporteres her er bruken av denne cellelinje for å måle endogene RA nivåer fra individuelle E8.5 embryoer med forskjellige genotyper. De Gpr161 vl / vl mutasjon fører til nedsatt embryonale RA signale 22. Som vist ved ko-kultur av dissosierte embryoer med F9 RARE-lacZ-celler, har disse Gpr161 vl / vl embryoene redusert endogen RA sammenlignet med villtype-søsken (figur 2A). På grunn av allsidigheten til denne reporter cellelinje, også rapportert her er en ny anvendelse av disse cellene for å påvise RA nivåene produsert av neurosfære kulturer erholdt fra voksen Gpr161 vekt / vekt mus (figur 2B). Dette reporter cellelinjen var i stand til å vise at neurosfære kulturer fra voksne ryggmargen stamceller produsere endogent RA. Den store difference i fargeintensitet indikerer en større reporter celle respons på ryggmargs Neurosfærene forhold til E8.5 embryoer. Dette kan være på grunn av mye større RA nivåer som genereres av neurosfærene over tid i forhold til E8.5 embryoer, som kan være på grunn av det faktum at neurosfære kulturer er mer homogene enn E8.5 embryoer og således inneholde mer RA-produserende celler.
Tilsetning av forskjellige konsentrasjoner av at-RA resulterer i en doseavhengig lineær respons av reporter cellene. Dette svaret kan måles kolorimetrisk ved å lese absorbans ved 610 nm. Den genererte standardkurve kan deretter brukes til å kvantifisere RA nivåer i prøver, for eksempel i villtype neurosfære kulturer (figur 3a) eller E8.5 embryoer (figur 3B).
Figur 1. Maintenance og Subkloning av F9 RARE-lacZ Cells. (A) En krets med fasekontrastrikt bilde av F9 RARE-lacZ-celler er vist. Disse celler har en doblingstid på ~ 10 timer og må føres hver 3. dag. (Omtrent 70-80% konfluens) med en 01:10 forhold (B) periodisk testing av kulturer med tilsetning av 1 nM at-RA og påfølgende LacZ farging må gjøres for å sikre kulturer forbli sterke og enhetlige respondere til RA (til høyre). I tilfelle dårlig og ikke-uniforme respondere (til venstre), må subkloning utføres. Scale barer 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. LacZ Farging av Co-dyrkede Samples (Spaltet E8.5 embryo / Neurosfærer) og F9 RARE-lacZ celler. (A) E8.5 mus embryo s av ulike genotyper ble skilt og belagt på toppen av F9 RARE-lacZ celler. LacZ farging 24 timer senere tillater visualisering av responsen fra F9 RARE-lacZ celler til endogen RA produsert av co-kultivert prøver. Den Gpr161 vl mutasjon fører til nedsatt endogen RA som visualisert ved redusert respons av reporter celler. (B) Venstre. En fase-kontrast neurosfærer dyrkede fra voksne ryggmarg nevrale stamceller vises. Ikke sant. Neurosfærer avledet fra voksen Gpr161 vekt / vekt ryggmargen ble skilt og belagt på toppen av F9 RARE-lacZ celler. Tilstedeværelsen av blå bunnfall følgende LacZ farging indikerer tilstedeværelse av endogent RA i disse neurosfærer. Forskjellen i fargeintensitet mellom neurosfære og E8.5 embryo co-kulturer indikerer større grad av RA stede i Neurosfærene enn E8.5 embryoer. Scale barer 100 mikrometer.target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. standardkurve og kolorimetrisk Kvantifisering av RA nivåer. Responsen til F9 RARE-lacZ-rapportørcellelinje kan måles kolorimetrisk ved 610 nm ved anvendelse av en standard ELISA-plateleser. (A) Representative standardkurve som brukes for å kvantifisere relative nivåer av RA vill-type neurosfære kultur r. (B) Kvantifisering av relative RA nivåer fra co-kultivert E8.5 embryoer. N = 3; * P <0,05, student t-test. Feilfelt SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Stock buffere / Løsninger | komponenter | lagrings~~POS=TRUNC |
| 10% natriumdeoksycholat monohydrat (C 24 H 39 NaOC 4 · H 2 O) | 10 ml i 100 ml dH 2 O | 4 ºC |
| 1 M magnesiumklorid (MgCl2) | RT | |
| 100x kalium ferrocyanid (K 4 [Fe (CN) 6] · 3H 6 O) | 2,12 g i 10 ml dH 2 O | RT i mørket |
| 100x kaliumferricyanid (K 3 [Fe (CN) 6]) | 1,64 g i 10 ml dH 2 O | RT i mørket |
| 20 mg / ml X-gal (5-brom-4-klor-3-indolyl-β-D-galaktopyranosid) | tilsett 5 ml dimetylformamid for å gjøre 20 mg / ml stamløsning | -20 ºC |
| 10 mM (3 mg / ml) all-trans retinsyre | Løs opp 50 mg i 16,67 ml absolutt etanol. Forbered 1 ml prøver. | -80 ° C i mørket, i 1,5 ml rav mikrosentrifugerør |
| papain | oppløse en ampulle i 7 ml HBSS | 4 ºC |
Tabell 1. Buffere og Solution komposisjoner.
| Arbeide buffere / Løsninger | komponenter | lagrings~~POS=TRUNC |
| F9 RARE-LacZ cellekulturmedium | 50 ml føtalt bovint serum (FBS) (sluttkonsentrasjon 10%) | Filter-sterilisere. |
| 5 ml 100x Penicillin streptomycin (endelig kons 1X) | Oppbevar ved 4 ºC. | |
| 4ml 50 mg / ml G418 (sluttkonsentrasjon 0,4 mg / ml) | ||
| til 500 ml DMEM / F-12 (med L-glutamin og HEPES) | ||
| 0,2% gelatin | 25 ml 2,0% gelatin | Oppbevar ved 4 ºC. |
| 80 ml destillert vann | ||
| Bland godt | ||
| 70% etanol | 30 ml 95% etanol | Sett i sprayflaske. |
| 70 ml destillert vann | Oppbevares ved RT | |
| Neurosfære dissosiasjon medium | 1 ml 20U papain | forberede fersk hver gang |
| 100 ul 13 mg / ml trypsin | ||
| 100 ul 7 mg / ml hyaluronsyre | ||
| 28 ul 10 mg / ml DNaseI | ||
| 50 pl 4 mg / ml kynurensyre | ||
| Neurosfære dyrkingsmedium | DMEM / F-12 (med L-glutamin og HEPES) | forberede fersk hver gang |
| 2% B-27 supplement | ||
| 20 ng / ml fibroblast vekstfaktor (FGF) | ||
| 20 ng epidermal vekstfaktor (EGF) | ||
| 2,5% glutaraldehyd | 250 mL 50% glutaraldehyd | forberede fersk hver gang |
| 4750 mL 1x PBS | ||
| LacZ vaskeløsning | 0,5 ml 10% deoksycholat (sluttkonsentrasjon 0,1%) | Oppbevar ved 4 ºC. |
| 1,0 ml 100% NP-40 (sluttkonsentrasjon 0,2%) | ||
| 50 ml 10X PBS | ||
| destillert vann til 500 ml | ||
| X-gal-farging løsning | 1x kalium ferrocyanide | forberede fersk hver gang |
| 1x kaliumferricyanid | ||
| 1 mg / ml X-gal | ||
| til passende volumet ved hjelp LacZ vaskeløsning | ||
| F9 RARE-LacZ frysing medium | F9 RARE-LacZ dyrkingsmedium + 5% DMSO | forberede fersk hver gang |
Tabell 2. Arbeidstid Buffere og Solution komposisjoner.
Discussion
Den F9 RARE-LacZ-cellelinjen 14 er et kraftsystem som kan anvendes for påvisning av RA produsert av vev eksplantater 12,14,17,18. Det er følsom for RA konsentrasjoner så lave som 100 FM, med ingen ikke-spesifikk respons påvist i celler med ubehandlede RA 12,14,18. Videre rapportør celler reagerer på all-trans-RA på en lineær måte innenfor et bestemt konsentrasjonsområde, og dermed gir LacZ-reaksjonen som skal kvantifiseres, og brukes til å bestemme størrelsen av RA nivåer 12,14,18. Den raske og enkle RA reporter analysen presentert her utnytter F9 RARE-lacZ-rapportørcellelinje for visualisering (figur 2) og relativ kvantitativ måling (figur 3) av embryoer og voksne dyrket neurale stamceller. Dette reporter systemet tillater sammenligning av endogene RA-nivåer mellom de enkelte prøver, som vist i figur 2. Den er følsom nok til å være i stand til å detektere RAgenerert av enkelt E8.5 embryoer (figur 2A) samt RA produsert av dyrkede neurosfærer (figur 2B). Dose-avhengig respons fra denne cellelinje til varierende konsentrasjoner av RA muliggjør kvantifisering av RA-nivåer (figur 3a) i prøvene så vel som sammenligning av relative RA nivåer mellom prøvene (figur 3B). Det er viktig å merke seg at F9 RARE rapportørcellelinje som måler den totale mengde av RA genereres av vevsprøvene over inkubasjonstiden. Dette tilsvarer nettobalanse RA syntese og katabolisme.
Mens F9 RARE-LacZ celle reporter system er svært følsom og allsidig, er det flere viktige feilsøkingstrinn som vi har innlemmet for å sikre påliteligheten av systemet. Først, som vist i figur 1, er det viktig å opprettholde helsen til disse cellene ved vanlige passasjene uten å la dem graden til konfluens. For det andre har vi observert senere passasjer pleier å resultere i inkonsistente RA svar, selv om de kulturene er stadig opprettholdt under markeringen med G418. For å feilsøke dette, er det anbefalt å forkaste kulturer etter 20 passasjer og tine en ny beholder. I tillegg må regelmessige kontroller utføres for å sikre at rapportør cellene fremdeles er sterke respondere til tilstedeværelse av RA i media. Tredje, hvis de tidlige passasjer vise dårlig eller ikke-uniform respons til RA (figur 1B, til venstre), en eller flere runder med subkloning kan være nødvendig inntil sterke reaksjoner oppnås (figur 1B, hø t). Til slutt, før ko-kultur, er det anbefalt at vevsprøver som embryoer og neurosfærer blir dissosiert til enkeltceller. Vi har observert at dissosiasjon av prøvene gir mer konsistente kolorimetriske målinger. Dette kan skyldes en mer jevn fordeling av RA i kulturbrønnene, som de dissosierte cellene er i uniskjema kontakt med reporter celler.
Flere endringer ble også gjort til den opprinnelige protokollen 14. Først ble RA responsen fra F9 RARE-lacZ-celler kvantifiseres ved direkte å feste cellene og måling av absorbansen ved 610 nm i stedet for å samle celler og analyse av lysat for b-galaktosidase-aktivitet 14. En annen endring er den direkte co-kulturen i dissosiert prøver med F9 RARE-LacZ før kvantifisering av RA respons. Tidligere metoder rapportert dyrking prøvene separat og legger bare media fra disse kulturene til F9 RARE-LacZ 16,18.
Til tross for at det blir et kraftig system, har F9 RARE-LacZ reporter analysen flere begrensninger. En begrensning av denne reporter cellelinje er at selv om det reagerer sterkt av tilstedeværelsen av all-trans-RA, er det også reagerer på andre retinsyre isomerer, inkludert 9-cis-RA og 13-cis-RA; men de er 100 ganger mer følsom for all-trans RA selrød til de andre isomerer 18. En annen begrensning til dette systemet er at den lineære doseavhengig respons bare faller mellom 10 -13 M til 10 -7 M ved RA-14,18; således, hvis man sammenligner RA nivåer utenfor disse grenser, kan det være nødvendig å utføre en seriell fortynning av prøven til målingene som faller innenfor det lineære området. Til slutt, siden dette er først og fremst en kolorimetrisk assay, vil endepunktet av fargeutvikling variere mellom prøver og eksperimenter. Således er det viktig at en standardkurve alltid bli belagt i parallell for hver enkelt eksperiment for å kunne bruke det til kvantifisering av reportercelleresponsen.
Avslutningsvis har vi rapportert bruk av F9 RARE-LacZ RA reporter cellelinje for å måle RA nivåer kvantitativt i E8.5 embryoer og tidligere urapporterte i neurosfærer. Allsidigheten av denne reporter systemet kan muliggjøre kvantifisering av RA nivåer i praktisk talt en hvilken som helst celle eller vevstype, og may resultere i utvikling av varierte applikasjoner i fremtiden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C3H/HeSn-Gpr161vl/J mouse strain | Jackson Laboratory | 000316 | |
| F9 RARE-LacZ reporter cell line | from Dr. Michael Wagner (SUNY Downstate Medical Center) and Ben Thiede (Dr. Jeff Corwin lab, University of Virginia) | ||
| DMEM/F-12 (with L-glutamine and HEPES) | ThermoFisher Scientific | 11330-057 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified | ThermoFisher Scientific | 26140-079 | Store at -20 °C in 10-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; warm in 37 °C for media preparation |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | Store at -20 °C in 10-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; light-sensitive |
| G418 | ThermoFisher Scientific | 10131-027 | Store at 4 °C; light-sensitive |
| 2% Gelatin | Sigma Aldrich | G1393 | Store at 4 °C |
| B-27 supplement (2 % stock solution) | ThermoFisher Scientific | 17504-044 | Store at -20 °C in 1-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; warm at room temperature for media preparation |
| Murine Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 315-09 | Prepare 100 μg/ml stock solution in 0.1% bovine serum albumin (BSA) in 1xPBS; prepare working concentrations by diluting with 1x PBS; store at -20 °C |
| Murine Fibroblast Growth Factor (FGF)-basic | PeproTech | 450-33 | Prepare 100 μg/ml stock solution in 0.1% bovine serum albumin (BSA) in 1x PBS; prepare working concentrations by diluting with 1x PBS; store at -20 °C |
| 50% glutaraldehyde | Amresco | M155 | Store at 4 °C |
| Sodium deoxycholate monohydrate (C24H39NaO4 · H2O) | Sigma Aldrich | D5670 | Store at RT |
| X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-galactopyranoside) | Promega | V3941 | Store stock at -20 °C |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | 41639 | Store at RT |
| all-trans Retinoic Acid (at-RA) | Sigma Aldrich | R-2625 | Store 1 ml aliquots of stock in -80 °C; extremely sensitive to light |
| TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12605-010 | Store at RT |
| 0.25% trypsin-EDTA | ThermoFisher Scientific | 25200-056 | alternative to TrypLE Express; aliquot and store at -20 °C |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14170-112 | Store at 4 °C |
| 10x phosphate buffered solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010-023 | Store at 4 °C |
| Papain | Worthington | LK003176 | Store at 4 °C. |
| Trypsin | Worthington | LS003703 | Store in 1 ml aliquots at -20 °C. |
| Hyaluronic acid | Calbiochem | 385908 | Store 200 μl aliquots at -20 °C. |
| DNaseI | Worthington | LS002139 | Store in 200 μl aliquots at -20 °C |
| Kynurenic acid | Sigma Aldrich | K3375 | Store in 200 μl aliquots at -20 °C |
| 95% ethanol | |||
| Mr. Frosty Freezing container | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | |
| 10 cm culture dish (non-cell culture treated) | |||
| 10 cm culture dish (cell culture treated) | |||
| 6 cm culture dish (non-cell culture treated) | |||
| 96-well cell culture plates | |||
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | |||
| 1.5 ml amber microcentrifuge tubes | |||
| 1.5 ml cryovials | |||
| 37 °C water bath | |||
| surgical scissors | |||
| fine surgical scissors | |||
| no. 5 forceps | |||
| blunt-ended forceps | |||
| scalpel blade | |||
| glass pasteur pipettes | |||
| cotton | |||
| alcohol lamp | |||
| ELISA plate reader | |||
| stereomicroscope |
References
- Vilhais-Neto, G. C., Pourquie, O. Retinoic acid. Curr Biol. 18 (5), R191-R192 (2008).
- Drager, U. C. Retinoic acid signaling in the functioning brain. Science Signalling. 324, 1-3 (2006).
- Lane, M. A., Bailey, S. J. Role of retinoid signalling in the adult brain. Prog Neurobiol. 75 (4), 275-293 (2005).
- Maden, M. Retinoid signalling in the development of the central nervous system. Nat Rev Neurosci. 3 (11), 843-853 (2002).
- Maden, M. Retinoids and spinal cord development. J Neurobiol. 66 (7), 726-738 (2006).
- Rhinn, M., Dolle, P. Retinoic acid signalling during development. Development. 139 (5), 843-858 (2012).
- Ang, H. L., Deltour, L., Hayamizu, T. F., Zgombic-Knight, M., Duester, G. Retinoic acid synthesis in mouse embryos during gastrulation and craniofacial development linked to class IV alcohol dehydrogenase gene expression. J Biol Chem. 271 (16), 9526-9534 (1996).
- Ang, H. L., Duester, G. Stimulation of premature retinoic acid synthesis in Xenopus embryos following premature expression of aldehyde dehydrogenase ALDH1. Eur J Biochem. 260, 227-234 (1999).
- Bastien, J., Rochette-Egly, C. Nuclear retinoid receptors and the transcription of retinoid-target genes. Gene. 328, 1-16 (2004).
- Chatzi, C., Cunningham, T. J., Duester, G. Investigation of retinoic acid function during embryonic brain development using retinaldehyde-rescued Rdh10 knockout mice. Dev Dyn. 242 (9), 1056-1065 (2013).
- Sakai, Y., Drager, U. C. Detection of retinoic acid catabolism with reporter systems and by in situ hybridization for CYP26 enzymes. Methods Mol Biol. 652, 277-294 (2010).
- Yamamoto, M., Drager, U. C., McCaffery, P. A novel assay for retinoic acid catabolic enzymes shows high expression in the developing hindbrain. Dev Biol Res. 107, 103-111 (1998).
- Rossant, J., Zirngibl, R., Cado, D., Shago, M., Giguere, V. Expression of a retinoic acid response element-hsplacZ transgene defines specific domains of transcriptional activity during mouse embryogenesis. Genes & Dev. 5, 1333-1344 (1991).
- Wagner, M., Han, B., Jessel, T. M. Regional differences in retinoid release from embryonic neural tissue detected by an in vitro reporter assay. Development. 116, 55-66 (1992).
- Luo, T., Wagner, E., Crandall, J. E., Drager, U. C. A retinoic-acid critical period in the early postnatal mouse brain. Biol Psychiatry. 56 (12), 971-980 (2004).
- Luo, T., Wagner, E., Grun, F., Drager, U. C. Retinoic acid signaling in the brain marks formation of optic projections, maturation of the dorsal telencephalon, and function of limbic sites. J Comp Neurol. 470 (3), 297-316 (2004).
- Kelley, M. W., Xu, X. M., Wagner, M. A., Warchol, M. E., Corwin, J. T. The developing organ of Corti contains retinoic acid and forms supernumerary hair cells in response to exogenous retinoic acid in culture. Development. 119, 1041-1053 (1993).
- McCaffery, P., Drager, U. C. Hot spots of retinoic acid synthesis in the developing spinal cord. Proc Natl Acad Sci. 91, 7194-7197 (1994).
- Hu, L., Gudas, L. J. Cyclic AMP analogs and retinoic acid influence the expression of retinoic acid receptor alpha, beta, and gamma mRNAs in F9 teratocarcinoma cells. Mol Cell Biol. 10 (1), 391-396 (1990).
- Martin, G. R. Teratocarcinomas and mammalian embryogenesis. Science. 209 (4458), 768-776 (1980).
- Strickland, S., Mahdavi, V. The induction of differentiation in teratocarcinoma stem cells by retinoic acid. Cell. 15 (2), 393-403 (1978).
- Li, B. I., et al. The orphan GPCR, Gpr161, regulates the retinoic acid and canonical Wnt pathways during neurulation. Dev Biol. 402 (1), 17-31 (2015).
- Hogan, B., Constantini, F., Lacy, E. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , 1st, Cold Spring Harbor Laboratory. (1986).
- Deleyrolle, L. P., Reynolds, B. A. Isolation, expansion, and differentiation of adult Mammalian neural stem and progenitor cells using the neurosphere assay. Methods Mol Biol. 549, 91-101 (2009).
