Summary
We beschrijven een ovariële rage pad transplantatie assay die geschikt zijn voor studies van normale en getransformeerde epitheel van het vrouwelijke voortplantingssysteem. De muis vetkussentje maakt transplantatie van grote weefsel fragmenten, is gemakkelijk te bereiken voor een operatie en beeldvorming, en biedt de meest gunstige natuurlijke omgeving voor weefsels van Müller oorsprong.
Introduction
Transplantatie assays, die de introductie van cellen en weefsels in specifieke plaatsen op het lichaam bij muizen te betrekken, vormen een essentiële benadering voor studies van weefselregeneratie en carcinogenese. Orthotope transplantaties van cellen, dat wil zeggen de plaatsing in een natieve milieu, bijzonder belangrijk voor het karakteriseren van volwassen stamcellen. Het bestaan van mamma-stamcellen werd voor het eerst voorgesteld door de transplantatie van epitheliale borstklier fragmenten in klier-vrije uiervet pads muizen 1. Innesteling assays gehumaniseerde muis vetkussentje 2 werden gebruikt voor het herhalen van de regeneratieve potentieel en de normale ontwikkeling van de menselijke primaire borst epitheelcellen. Bovendien, seriële en het beperken van verdunning transplantaties van fenotypisch verschillende celtypes in de ontruimde uiervet pad waren cruciaal voor de zelfvernieuwingscapaciteit en multilineage differentiatie van mamma-stamcellen 3-5 te testen. Transplantatie assays in combination met genetische afstamming tracing bewijs geleverd van de cel van oorsprong in borstklieren carcinogenese 5. Niercapsule transplantaties worden vaak gebruikt voor het testen van eigenschappen van vermoedelijke prostaatstamcellen 6. Orthotope transplantatie van normale en neoplastische muis en humane pancreatische organoids geopenbaard genen en routes gewijzigd kankervooruitgang 7. Het belang van de eigen omgeving werd ook ondersteund door de demonstratie van diverse regeneratie na engraftments van zweetklieren in verschillende locaties, zoals uiervet pads, schouder vetkussentjes en rug huid 8.
De peritoneale holte en de ovariële bursa worden meestal gebruikt als ondergrond orthotope transplantatie van epitheelcellen van het vrouwelijke voortplantingssysteem 9-12. Beide methoden hebben een aantal beperkingen. Intraperitoneale injectie van cellen leidt tot hun implantaties in verschillende gebieden van peritoneale holte, waarbij comkopiëren waarvoor het toezicht op cellulaire groei. Bovendien verschillen in de micro-omgeving, zoals de mate van vascularisatie, innervatie en immuuncel representatie kan aanzienlijk, verschillende gebieden van de peritoneale holte. De ovariële bursa heeft een zeer beperkt volume, waardoor de injectie van niet meer dan 10 pl vloeistof. Dit beperkt aanzienlijk de hoeveelheid cellen die kunnen worden toegediend. Bovendien kunnen injecties in de ovariële bursa vrij technisch uitdagend en de procedure vereist een aanzienlijke hoeveelheid tijd.
Om deze beperkingen aan te pakken, hebben we geprofiteerd van de ovariële vet pad eigenschappen. De muis ovariële vet pad heeft een grote omvang, grenst aan de eierstokken en de baarmoeder buis, en is gemakkelijk bereikbaar met de operatie. Vermeld is dat equine trofoblast kan worden getransplanteerd in de muis ovariële vetkussentje 13. Maar de details van deze methode werden niet beschreven. Evenmin werd gerapporteerd als dit meThOD kan worden toegepast op volwassen cellen en weefsels. We beschrijven hier een betrouwbare benadering voor de transplantatie van muis en humane cellen van de vrouwelijke voortplantingssysteem en laten zien dat deze werkwijze ook voor langdurige orgaantransplantatie.
Protocol
Al het in vivo werk beschreven, is goedgekeurd door de Cornell University Institutional Animal Care en gebruik Comite.
1. Steekproef De voorbereidingen voor ovariële Fat Pad Testen
- Isolatie en cultuur van de Primary Tubal epitheel (TE) Cellen
- Euthanize donor 6 tot 8 weken oude virgin β-actine-Enhanced Green Fluorescent Protein (EFGP) of β-actine-Discosoma rood fluorescent eiwit (DsRed) muizen door CO 2 toediening, gevolgd door cervicale dislocatie. Controleer succesvolle euthanasie door een teen knijpen.
- Plaats een individuele muis op een absorberend draperen, ventrale kant naar boven, en veeg de buik met 70% ethanol. Open de huid door een laterale snede in het lichaam middellijn en met de vingertoppen trek de huid boven en onder de incisie naar de kop en staart van de muis.
- Houd het buikvlies met behulp van stompe pincet en maak een snede met fijne schaar om de lichaamsholte te openen. Duw de spoel van de intestine opzij en zoek de voortplantingsorganen.
- Met fijne tang halen een baarmoeder hoorn en snijd 0,5 cm boven het punt waar de baarmoeder horens te scheiden. Terwijl de baarmoeder hoorn, ontleden weg bindweefsel bevestigd aan de baarmoeder hoorn, eileider, eierstok en ovariële vet pad. Plaats ontleed voortplantingsorganen in een schaal met 6 ml steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Ga verder met de tweede voortplantingsorganen.
- Breng de schotel naar een bioveiligheid kast en was de weefsels 3 keer in 6 ml steriele PBS. Voortzetting van de werkzaamheden in het kader van een dissectie microscoop in de bioveiligheid kast. Pak de baarmoeder hoorn met fijn pincet en trek de baarmoeder hoorn van de eileider door het doorsnijden van de utero-eileiders kruising. Knip de ovariële bursa rond de eierstok met behulp van een 25 G naald.
Let op: Na de ovariële bursa is verwijderd, de dissectie is voltooid en het individuele eileider blijft in de PBS-oplossing. - Transfer een single eileider in een 50 ul druppel PBS tot een 3,5 cm schotel en gehakt in 0,1 mm stukken met behulp van 28 gauge naalden. Overdracht aan 200 pi digestie buffer 1 (Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) F12 (Ham's) medium aangevuld met 300 eenheden ml -1 Collagenase en 100 eenheden ml -1 hyaluronidase) en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C in een 5% CO 2 incubator.
- Na de incubatie, voeg 1 ml 0,25% trypsine-Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) en suspendeer de oplossing met behulp van een 1 ml pipetpunt (aka blauwe tip) 20 keer gedurende 3 minuten. Voeg 5 ml + 4 ° C DMEM / F12 (Ham's) medium dat 2% foetaal runderserum.
- Verzamel weefsels door centrifugeren (600 RCF, 5 min, kamertemperatuur (RT)), en voeg 1 ml digestiebuffer 2 (DMEM F12 (Ham's) medium aangevuld met 7 mg ml -1 Dispase II en 10 ug ml-1 Deoxyribonuclease I ( DNase I)). Opschorten weefsel pellet 20 keer met behulp van een 1 ml pipet tip.
- Voeg 5 ml serum vrij compleet muis eileiders epitheel groeimedium (M-TE-GM, tabel 1).
- Verzamel cellen door centrifugeren (600 RCF, 5 min, kamertemperatuur). Voeg 1 ml M-TE-GM, te schorsen en te tellen cellen door hemocytometer. Seed 1 x 10 5 cellen in 1 ml per putje in een 24-well plaat lage hechting en incubeer in M-TE-GM bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator gedurende 4 dagen.
- Verander het medium elke dag.
- Bereid enkele cel suspensies van gekweekte primaire suspensie TE cellen van β-actine-EGFP of β-actine-DsRed muizen.
- Verzamel TE schorsing culturen uit 24-well laag platen attachment. Centrifuge (600 RCF, 5 min, kamertemperatuur) en schorten celpellets met 1 ml 0,25% trypsine-EDTA. Incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator.
- Stop trypsine activiteit door toevoeging van 5 ml DMEM / F12 (Ham's) medium dat 5% foetaal runderserum. Verzamel celpellets door centrifugatie (600 RCF, 5 min, kamertemperatuur).
- Wassen celpellets tweemaal met 4 ml koude PBS (4 ° C), voeg 1 ml PBS per celpellet en schorten. Aantal cellen door hemocytometer en transfer naar 1,7 ml buisjes centrifugeren. Werken op het ijs, voeg 1 x 10 5 cellen tot 10 pi PBS, voeg dan 10 ul basaal membraan matrix. Schorten en te vervoeren op het ijs om het dier kamer.
Opmerking: Voer alle dissectie en weefselkweek werken in een bioveiligheid kast onder steriele omstandigheden.
- Bereiding van geïmmortaliseerde humane cellijn
- Afzonderlijk groeien lentivirus-EGFP en -mCherry gemerkte menselijke geïmmortaliseerde ovariële oppervlak epitheelcel lineHIO118 tot 80-90% confluentie op 10 cm schalen bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator.
- Afwas tweemaal met 10 ml PBS, voeg 1 ml 0,25% trypsine-EDTA per schaal en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator. Stop de reactie door toevoeging van 10 ml DMEM / F12 (Ham's) medium dat 5% foetaal runderserum. Verzamelencelpellets door centrifugatie (600 RCF, 5 min, kamertemperatuur).
- Wassen celpellets tweemaal met 10 ml koude PBS (4 ° C), voeg 1 ml PBS per celpellet en schorten. Aantal cellen door hemocytometer en transfer naar 1,7 ml buisjes centrifugeren.
- Werken op het ijs, voeg 1,0 x 10 6 Lenti-mCherry gelabelde cellen + 1,0 x 10 6 Lenti-EGFP gelabelde cellen tot 10 pi PBS. Voeg 10 ul basaal membraan matrix. Schorten en te vervoeren op het ijs om het dier kamer.
- Voorbereiding van de eileider
- Ontleden individuele eileiders van 6 tot 8 weken oude virgin β-actine-DsRed muizen in PBS zoals beschreven in de stappen 1.1.1-1.1.5. Transfer één eileiders in een 200 ul druppel PBS onder een dissectie microscoop. Voorzichtig ontrollen eileiders met behulp van een pincet en 28 gauge naalden door het verwijderen van de mesosalpinx, een gedeelte van de brede ligament die de segmenten van de eileider ondersteunt. Plaats één afgewikkeld eileiders in een druppel 200 ul ijskoude PBS tot ovariële vet pad van de ontvanger wordt blootgesteld en bereid zijn om de transplantatie te ontvangen.
2. ovariële vet pad Transplantation
Opmerking: Ontsmet instrumenten tussen elk dier chirurgie. Voor te bereiden en te regelen alle apparatuur op voorhand. Dorsale transplantaties naar rechts ovariële vet pad zijn preferentiële als dit voorkomt de milt. Echter, ontvangers transplantaties in zowel ovariële vetkussentjes hebben.
- Gebruik syngene muizen of ernstige gecombineerde immunodeficiëntie (SCID / NCR) muizen als ontvangers van primaire cellen. Menselijke cellen, zoals HIO118 cellen, gebruik Nod / SCID / gamma (NSG) muizen of SCID-muizen.
- Verdoven ontvanger muis met een intraperitoneale injectie van 2,2,2-tribroomethanol in een dosering van 0,15 ml / 10 g lichaamsgewicht. Leg het dier op een verwarmingselement, in de dierenwereld kap en bevestig de juiste verdoving door het verlies van pedaal reflex (teen knijpen). Toepassen dierenarts zalf op de ogen tot droog terwijl voorkomendier onder narcose. Injecteer het dier subcutaan met pijnstillende Ketoprofen in een dosering van 4 mg / g lichaamsgewicht voor de behandeling van postoperatieve pijn.
Opmerking: Als alternatief gebruikt isofluraan anesthesie. Plaats het dier in de inductie kamer en pas de zuurstof flowmeter op 0,8-1,5 l / min en de isofluraan vaporizer 2-3%. Verwijder de verdoofde dier uit de kamer, laat het ademen isofluraan van een masker en zet de zuurstof flowmeter tot 0,4-0,8 l / min en de isofluraan vaporizer tot 1,5%, start de operatie. - Scheer de chirurgische gebied met # 40 tondeuse; Verwijder het haar van een gebied 2 maal de chirurgische gebied, de voorbereiding van de geschoren huid met drie antiseptische scrubs van povidonjood, gevolgd door 70% ethanol, en dek af met een steriel laken.
- Verplaats het dier onder een dissectie microscoop in een bioveiligheid kast. Maak de voortplantingsorganen door een incisie in de dorsomediale direct boven de ovariële vetkussentje.
Opmerking: Critical stap: Precieze incisie bevordert wondgenezing is het gebruik van een scalpel aanbevolen in stap 2,4. - Met behulp van stompe fijne tang trek de ovariële vet pad voorzichtig door de incisie in de richting van de middellijn, het minimaliseren van schade aan de zenuwen en grote bloedvaten.
Kritische stap: Als bloeden optreedt, stop de operatie en beschouwen transplanteren naar een andere gastheer dier. - Onder besturing van de dissectie microscoop met behulp van een 28 gauge naald afgeschuind maken 2-4 mm diepe snede in de ovariële vetkussentje, 3-4 mm boven de eierstok.
Kritische stap: Zorg dat de incisie gaat alleen door middel van de helft van het vet pad; doorboren helemaal door naar de onderzijde veroorzaakt lekkage. Wees snel en onverwijld na deze stap. - Voor cel transplantaties, vul een injectiespuit (30 gauge naald) met 10-20 ul van de cel-basaal membraan matrix-mengsel en te injecteren in het vet pad incisie. Voor eileider transplantatie, pick-up de eileider with fijn pincet en plaats in 10-20 pi basaal membraan matrix op ijs bewaard. Met behulp van een 0,1-10/20 ul XL afgestudeerd filter tip (ingekort 3 mm) halen het weefsel en basaal membraan matrix schorsing en de uitstoot in het vet pad incisie.
- Wacht 5 minuten voor het basaal membraan matrix te stollen en plaats de voortplantingsorganen terug in het buikvlies. Sluit de spieren met 2 hechtingen van chirurgisch hechtdraad en de huid met twee kleine wond clips of chirurgisch hechtdraad.
- Herhaal stap 2,4-2,8 naar een PBS-basaal membraan matrix-mengsel te transplanteren naar de contra-laterale vet pad van het dier dat als controle zal dienen.
Kritische stap: Na de operatie plaats het dier op een verwarmingselement, omdat warmteverlies is snel in verdoofde muizen. - Laat dier terug op een verwarmingselement in de moedertaal kooi en observeer het dier tot helemaal wakker uit de narcose. Heeft een dier niet onbeheerd achter te laten tot het voldoende bewustzijn sterna behouden heeft herwonnenl recumbence. Heeft een dier dat een operatie heeft ondergaan om het gezelschap van andere dieren tot volledig hersteld niet meer terug.
- Doe wat vooraf nat voer pellets in de kooi naast droogvoer op de kooi na de operatie. Solliciteer post-operatieve pijnstillers als dat nodig is voor de komende dagen en onderzoek dagelijks de wond. Solliciteer antibiotica volgens de goedgekeurde dier protocol als wondinfectie optreedt. Verwijderen wondklemmen 10 dagen na de operatie als de wond volledig gesloten.
3. histologie en Image Acquisition
- Graft verzamelen en bewaren
- Bereid 4% paraformaldehyde oplossing door het mengen van 26 ml DDH 2 O met 4 ml 10 x PBS en 10 ml 16% paraformaldehyde oplossing.
- Ontleden in een blok, de geënt ovariële vet pad, eierstokken, baarmoeder buis, 0,5 cm baarmoeder zoals beschreven in de stappen 1.1.1-1.1.4. Plaats onmiddellijk in 2 ml 4% paraformaldehyde en vaststellen voor 2 uur, bij kamertemperatuur. Van hetzelfde dier, ontleden de niet-geëntecontralaterale ovariële vet pad systeem getransplanteerd met PBS-basaalmembraan matrix mengsel als een controle (zie stap 2.9). Fix en werkwijze op dezelfde manier.
- Na fixatie wassen weefsels driemaal met PBS gedurende 5 minuten en incubeer overnacht in PBS bij 4 ° C.
- Voor het hele-mount beeldvorming van de ovariële vet pad ga dan naar stap 3.2.1.
Let op: Nadat het beeld overname weefsels kunnen worden ingevroren (3.3.1) of verwerkt voor het inbedden in paraffine (3.3.2). Overnacht incubatie in 30% sucrose in PBS bij 4 ° C verbetert de kwaliteit van bevroren weefsels.
- Afbeeldingen verwerving
- Place whole-mount ovariële vet pad systemen in PBS gevulde gerechten en beeld met behulp van een omgekeerde microscoop uitgerust met epi-fluorescentie gehechtheid en high-definition kleuren camera, met 4, 10x doelstellingen, en een stereomicroscoop voorzien van een fluorescentie gehechtheid, kleurencamera en Plan Apo 1xWD70, ED Plan 1.5xWD45 doelstellingen.
- histologie
- volgendwhole-mount beeldacquisitie (3.2.1) plaats een 200-500 pi druppel inbedding medium voor bevroren weefselmonsters op een 2 x 1 cm stuk van het laboratorium film en met behulp van een tang, overdracht van het weefsel aan de daling. Pak de film aan een rand en de overdracht van het weefsel-medium dalen tot een 1,8 ml cryogene flacon. Sluit het flesje en duik in vloeibare stikstof. Bewaar bevroren weefsels bij -80 ° C.
- Als alternatief, ga dan met de standaard paraffine inbedding. Gebruik 20-40 volumina weefsel volume voor elke stap.
- Dompelen weefsel eenmaal in 65% ethanol gedurende 30 min, zacht schudden bij kamertemperatuur.
- Dompelen weefsel eenmaal in 70% ethanol gedurende 30 min, zacht schudden bij kamertemperatuur. In deze fase monsters kunnen worden bewaard maanden bij kamertemperatuur.
- Dompelen weefsel eenmaal in 90% ethanol gedurende 30 min, zacht schudden bij kamertemperatuur.
- Dompelen weefsel eenmaal in 95% ethanol gedurende 30 min, zacht schudden bij kamertemperatuur.
- Dompel weefsels tweemaal in absolute ethanol (200 proof) gedurende 30 min, zacht schudden bij kamertemperatuur. <li> Dompel weefsels tweemaal in chloroform gedurende 30 min, zacht schudden bij kamertemperatuur.
- Dompelen eenmaal weefsels in paraffine voor 30 min, zacht schudden bij 58 ° C.
- Dompel weefsels eenmaal in paraffine gedurende 12 uur, schudden zachtjes op 58 ° C.
- Dompelen weefsels in paraffine eens 3 uur bij 58 ° C.
- Plaats weefsels in metalen mallen histologie en vul vormen met 58 ° C paraffine. Voeg een plastic histologie cassette bovenop de paraffine en paraffine afkoelen tot 4 ° C. Extract paraffine-tissue block en bewaar bij kamertemperatuur.
Opmerking: Paraffine temperatuur mag niet hoger zijn dan 58 ° C voor een optimale conservering van weefsel geschikt zijn voor immunohistochemische kleuring.
- Als alternatief, Bereid je voor op het inbedden in paraffine met Specimen Processing Gel.
- Zuig het PBS en de overdracht whole-mount weefsels tot 70% ethanol. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. In een waterbad, voorverwarmen specimen verwerking gel tot 60 ° C.
- Pipette 200 ul van het monster verwerking gel op een laboratorium film-beklede petrischaal. Met behulp van fijne dissectie tang overdracht van de hele-mount weefsel systeem om het monster verwerking gel druppel.
- Laat het monster verwerking gel plug stollen bij kamertemperatuur stollen of de stekker voor 10 min bij 4 ° C.
- Plaats het monster verwerking gel ingebed weefsel in histologie weefselcassettes ingeklemd tussen biopsie foamtape. Insluiten in paraffine zoals in stappen 3.3.2-3.3.2.10.
Opmerking: Specimen verwerken gel inbedding voorkomt en maakt het mogelijk het behoud van kleine breekbare weefselmonsters.
Opmerking: Tissues bevroren of paraffine inbedding geschikt zijn voor immunohistochemische kleuring 14,15.
Representative Results
Experimentele cellen en weefsels nauwkeurig worden getransplanteerd in de ovariële vetkussentje onder een dissectie microscoop (Figuur 1). De voorbeelden omvatten primaire muis eileiders epitheel cellen afkomstig van muizen die alomtegenwoordig uitdrukken EGFP (Figuur 2A) of DsRed (Figuur 2B) en eierstokkanker oppervlakte epitheelcellen mens onsterfelijk HIO118 16,17 cellen gelabeld met mCherry en EGFP lentivirussen (figuur 2C - F). De aanpak is ook toepasbaar voor langdurige transplantatie van organen, zoals de muis eileider (figuur 3). Volgens immunohistochemische kleuring zowel trilharen (FOXJ1 positieve 14) en uitscheiding (PAX8 chromosomale positieve 15) cellen worden bewaard in de tubaire epitheel van getransplanteerde weefsels (Figuur 3D en E).
Figuur 2:. Detectie van getransplanteerde muis Primaire Tubal epitheelcellen en Human Onsterfelijk ovariële oppervlakte-epitheel cellen (A, B) Out groei van primaire muizen eileiders epitheel cellen (pijlen) van β-actine-EGFP muizen (A, groen) en β-actine-DsRed (zwart, rood) 8 dagen na transplantatie in een syngene muis. (C, D) Engraftments gemengde HIO118 cellen (pijlen) gemerkt met hetzij Lenti-EGFP (groen) of Lenti-mCherry (rood) 10 dagen na transplantatie in muizen NSG. (D) Vergroot gebied van (C, pijl). (E, F) Graft ontwikkeld 43 dagen na transplantatie van dezelfde cellen als in C, D SCID muis (pijlen). AD, F, fluorescentie; E, helder veld, FP, vet pad; Ov, ovarium; UT, baarmoeder buis. (A, B, DF) Schaal bar = 500 micrometer; (C) Schaal bar = 1,600 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
ad / 54444 / 54444fig3.jpg "/>
Figuur 3: Karakterisering van eileider Transplant. (A) Complete eileider (pijl) van β-actine-DsRed muis 6 dagen na de transplantatie in de ovariële vet pad (pijl, helder rood). (B) Fluorescent vriescoupeonderzoek van het vetkussentje met transplantatie getoond in (A). Rood, DsRed; Blauw, 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) tegenkleuring kern. (C) Baarmoeder buis graft (pijl) 40 dagen na transplantatie in NSG ontvanger muis (pijl). Paraffine sectie. Opmerking correct bewaren van beginsel eileider componenten, en gebrek aan transplantatie geassocieerde fibrose en ontsteking. Hematoxyline en eosine kleuring. (D, E) Detectie van de eileiders epitheel markers Gekoppelde-box gen 8 (PAX8 chromosomale) en Forkhead doos J1 (FOXJ1; bruine nucleaire kleur, pijlpunten) in de cellen van het transplantaat (pijlen) getoond in (
| bestanddeel | 1x DMEM F12 (Ham's) medium |
| L-Glutamine | 2 mM |
| natrium pruvate | 1 mM |
| Epidermale groeifactor | 10 ng ml -1 |
| Basische fibroblast groeifactor-2 | 10 ng ml -1 |
| hydrocortison | 500 ng ml -1 |
| Insuline | 5 ug ml -1 |
| Transferrin | 5 ug ml -1 |
| natriumseleniet | 5 ng ml -1 |
| runderalbumine | 0,10% |
| Penicilline / streptomycine | 100 eenheden ml -1/100 ug ml -1 |
| Minimum Essential Medium Eagle (MEM) niet-essentiële aminozuren | 0,1 mM |
| Beta-mercaptoethanol | 10 -4 M |
Tabel 1:. Mouse Tubal Epithelim groeimedium (M-TE-GM) Onderdelen in de linker kolom worden opgelost in 1x DMEM F12 (Ham) medium bij de aangegeven concentraties rechterkant. De uiteindelijke samenstelling van het medium is serum vrij.
Discussion
We hebben een ovariële vet pad transplantatie assay die het mogelijk maakt voor de accurate levering en detectie van epitheliale cellen en weefsels vastgesteld. De ovariële vetkussentje assay transplantatieprocedure minder technisch uitdagend dan intrabursale injectie 10-12 en zorgt voor meer uniforme en precieze locatie van getransplanteerde cellen in vergelijking met intraperitoneale injectie 9. Het is ook goed geschikt voor langdurige transplantatie van een gehele orgaan, zoals de eileider.
Belangrijk is dat de ovariële vetkussentje verschaft een bekende micro voor epithelia van het vrouwelijk voortplantingssysteem. Het moet in het bijzonder geschikt voor onderzoek naar de moleculaire en cellulaire eigenschappen van humaan en muis eierstokken en eileiders epitheel cellen tijdens regeneratie en maligne transformatie. In tegenstelling tot andere organen, hebben enkele studies gericht op de identificatie en karakterisering van stamcellen in het epitheel van de vrouwelijke reproductive darmkanaal 18,19. Dergelijke studies zijn bijzonder belangrijk omdat veel kankers zijn vermoedelijk afkomstig zijn van volwassen stamcellen 20. Toch cellulaire oorsprong van epitheliale eierstokkanker blijven zeer discutabel 18. Epitheliale eierstokkanker verantwoordelijk voor het merendeel van eierstokkanker en is op de 5e plaats onder alle kanker gerelateerde sterfgevallen van vrouwen in de VS 21. Aldus ontwikkeling van een orthotope assay met verscheidene voordelen boven de bestaande transplantatietechnieken 9-12 moet grote studies op dit gebied vergemakkelijken.
Gezien de oppervlakkige ligging van de ovariële vet pad, kunnen kleine dieren beeldvormende systemen worden gebruikt om de follow-up van engraftments gelabeld met sterke fluorescerende of bioluminescente verslaggevers. Het moet ook mogelijk zijn minimaal invasieve hoge resolutie levende imaging assays, zoals niet-lineaire microscopie 22 vast. De ovariële vet pad kan ook in het orgel culturen worden gehouden, daardoor mogelijk te makening driedimensionale kweek van normale en neoplastische epitheel onder condities dicht indient het complex van cellen en de extracellulaire matrix. Toekomstige studies moeten deze veelbelovende mogelijkheden aan te pakken.
Aantal kritische stappen worden overwogen. Het verstrekken van een verwarmingselement en het houden van knaagdieren warm tijdens de operatie verbetert de overlevingskans. Steriliteit van de instrumenten hanteren vetkussentje zodat de geënte systemen steriel gehouden. In onze ervaring, aanzienlijke bloeden resultaten in groeivertraging van transplantaties. Belangrijk is, moet het vet pad incisie precies worden gemaakt, omdat scheuren het vet pad of doorprikken het door oorzaken bloeden. Coagulatiemiddelen worden gebruikt om te stoppen indien nodig bloeden. Als engraftments niet ontwikkelen, moet een hogere concentratie van de geïnjecteerde cellen worden overwogen. De eerste succesvolle uitwassen kan reeds na één week na transplantatie en meest engraftments moet zichtbare zijnmaand na de procedure. Voor transplantatie, kan naalden met grotere diameter (23-25 G) worden gebruikt om grote afschuiving van cellen te voorkomen (meer dan 10 pm in diameter). Echter, zoals naalden meer traumatisch om het vet pad zijn en het gebruik ervan moet worden getest op voorhand. Voor onze experimenten hebben we gebruik 6-8 weken oude donor en ontvangende muizen. Voor beide doeleinden jonger of ouder muizen kunnen worden gebruikt. Echter kan het aantal geïnjecteerde cellen moeten worden aangepast. De kleinere omvang van ovariële vetkussentjes bij jongere donoren moet ook worden overwogen.
Zoals bij alle werkwijzen, zijn er enkele beperkingen van de muis ovariële vetkussentje transplantatie assay. Hoewel syngene immuuncompetente muizen kunnen worden gebruikt voor murine primaire cellen / weefsels, onze techniek vereist NSG of SCID-muizen voor transplantatie van menselijk materiaal. Waarschijnlijk kan de vetkussentje vermenselijken de groei van humane epitheelcellen ondersteunen. Echter, we hebben niet deze aanpak nog getest. Het gebruik van de jongere femannetjes kan leiden tot lagere kosten voor de fokkerij; echter volwassen maagdelijke vrouwelijke muizen (leeftijd 8-10 weken) een grotere vetkussentje, waardoor transplantatie van grotere exemplaren. Ten slotte moet het laboratorium personeel worden opgeleid in dierlijke chirurgie om tijdige en succesvolle uitvoering van de procedure te waarborgen.
Acknowledgments
We willen graag bedanken Dr Andrew K. Godwin, Universiteit van Kansas Medical Center, voor het verstrekken van de menselijke cellen HIO118. Deze studies werden ondersteund door subsidies van de New York Stem Cell Program (NYSTEM, T028095) en de National Institutes of Health / National Institute of Child Health and Human Development (P50HD076210) naar AFN en door de subsidies van NYSTEM (C028125, C024174 en T028095), National Institutes of Health / National Cancer Institute (CA182413) en Ovarian Cancer Research Fund (327.516) naar AYN-.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 gauge needle | BD Becton Dickinson | 305122 | |
| 28 gauge needle (hypodermic syringe with attached needle) | Kendall | 30339 | Part Number: 8881500014 |
| basic fibroblast growth factor-2 | Sigma-Aldrich | F9786 | |
| basement membrane matrix (Geltrex) | Invitrogen | A1413202 | |
| β-actin-DsRed mice | The Jackson Laboratory | 6051 | B6.Cg-Tg(CAG-DsRed*MST)1Nagy/J |
| β-actin-EGFP mice | The Jackson Laboratory | 3291 | C57BL/6-Tg(CAG-eGFP)1Osb/J |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| bovine albumin | Sigma-Aldrich | A3311 | |
| chloroform | VWR | EM-CX1058-1 | |
| collagenase/hyaluronidase | Stem Cell Technologies | 7912 | |
| cryogenic vials | Thermo Scientific Nunc | 377267 | |
| dispase II | Worthington | NPRO2 | |
| DMEM F12 (HAM's) | Corning | 10-092-CV | |
| DNaseI (Deoxyribonuclease I) | Stem Cell Technologies | 7900 | |
| embedding medium for frozen tissue specimens (O. C. T.) | Sakura Finetek | 4583 | |
| epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E4127 | |
| ethanol 200 proof | Koptec | V1001 | to prepare 70% |
| fetal bovine serum | Sigma | F4135 | |
| filter tip 0.1-10/20 µl XL | USA Scientific | 1120-3810 | |
| FOXJ1 antibody | eBioscience | E10109-1632 | used at concentration 1:1,000 (no unmasking) |
| hydrocortisone | Sigma | H0135 | |
| Ketoprofen | Zoetis | 4396H | |
| laboratory film (Parafilm M) | American National Can | PM-999 | |
| L-Glutamine | Corning | 25-005-Cl | |
| insulin-transferin-sodium selenite | Sigma-Aldrich | I884 | |
| isoflurane, 250 ml | Santa Cruz Animal Health | sc-363629Rx | |
| low attachment plate 24-well | Costar | 3473 | |
| MEM non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | |
| metal histology molds | Electron Microscopy Sciences | 62527-22 | |
| microscope, inverted | Nikon | Eclipse TS 100 | |
| microscope, stereo | Nikon | SMZ800 | |
| Nod/SCID/gamma (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 05557 | NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ |
| paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| paraffin (Paraplast, X-TRA) | Fisher Thermo Scientific | 23-021-401 | |
| PAX8 antibody | Proteintech | 10336-1-AP | used at concentration 1:1,000 (no unmasking) |
| PBS (Phosphate-Buffered Saline) | Corning | 21-030-CV | |
| penicillin streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| severe combined immunodeficiency (SCID/NCr) mice, BALB/C background) | NCI-Frederick Animal Production Program | 01S11 | |
| sodium pyruvate | Corning | 25-000-Cl | |
| specimen processing gel (HISTOGEL) | Richard-Allan Scientific | HG-4000-012 | |
| sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Trypsin-EDTA, 25% | Corning | 25-053-Cl |
References
- Deome, K. B., Faulkin, L. J., Bern, H. A., Blair, P. B. Development of mammary tumors from hyperplastic alveolar nodules transplanted into gland-free mammary fat pads of female C3H mice. Cancer Res. 19, 515-520 (1959).
- Proia, D. A., Kuperwasser, C. Reconstruction of human mammary tissues in a mouse model. Nature protocols. 1, 206-214 (2006).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439, 84-88 (2006).
- Stingl, J., Caldas, C. Molecular heterogeneity of breast carcinomas and the cancer stem cell hypothesis. Nat Rev Cancer. 7, 791-799 (2007).
- Koren, S., et al. PIK3CA(H1047R) induces multipotency and multi-lineage mammary tumours. Nature. 525, 114-118 (2015).
- Nikitin, A. Y., Nafus, M. G., Zhou, Z., Liao, C. -P., Roy-Burman, P. Prostate stem cells and cancer in animals. Stem Cells and Cancer. Bagley, R. G., Teicher, B. A. , Humana Press. New York, NY. 199-216 (2009).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160, 324-338 (2015).
- Lu, C. P., et al. Identification of stem cell populations in sweat glands and ducts reveals roles in homeostasis and wound repair. Cell. 150, 136-150 (2012).
- Flesken-Nikitin, A., et al. Ovarian surface epithelium at the junction area contains a cancer-prone stem cell niche. Nature. 495, 241-245 (2013).
- Orsulic, S., et al. Induction of ovarian cancer by defined multiple genetic changes in a mouse model system. Cancer Cell. 1, 53-62 (2002).
- Dawes, J., Liu, B., Mars, W., Michalopoulos, G., Khillan, J. S. Multiple ovarian transplants to rescue a transgenic line of mice. Lab Anim (NY). 39, 191-193 (2010).
- Cordero, A. B., Kwon, Y., Hua, X., Godwin, A. K. In vivo imaging and therapeutic treatments in an orthotopic mouse model of ovarian cancer. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
- Albihn, A., et al. Production of capsular material by equine trophoblast transplanted into immunodeficient mice. Reproduction. 125, 855-863 (2003).
- Muthusamy, N., Vijayakumar, A., Cheng, G., Ghashghaei, H. T. A knock-in Foxj1(CreERT2::GFP) mouse for recombination in epithelial cells with motile cilia. Genesis. 52, 350-358 (2014).
- Perets, R., et al. Transformation of the fallopian tube secretory epithelium leads to high-grade serous ovarian cancer in Brca;Tp53;Pten models. Cancer Cell. 24, 751-765 (2013).
- Capo-Chichi, C. D., et al. Dynamic alterations of the extracellular environment of ovarian surface epithelial cells in premalignant transformation, tumorigenicity, and metastasis. Cancer. 95, 1802-1815 (2002).
- Roland, I. H., et al. Loss of surface and cyst epithelial basement membranes and preneoplastic morphologic changes in prophylactic oophorectomies. Cancer. 98, 2607-2623 (2003).
- Flesken-Nikitin, A., Odai-Afotey, A. A., Nikitin, A. Y. Role of the stem cell niche in the pathogenesis of epithelial ovarian cancers. Mol Cell Oncol. 1, 963435 (2014).
- Ng, A., Barker, N. Ovary and fimbrial stem cells: biology, niche and cancer origins. Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 625-638 (2015).
- Visvader, J. E. Cells of origin in cancer. Nature. 469, 314-322 (2011).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2015. CA Cancer J Clin. 65, 5-29 (2015).
- Williams, R. M., et al. Strategies for high-resolution imaging of epithelial ovarian cancer by laparoscopic nonlinear microscopy. Transl Oncol. 3, 181-194 (2010).
