Summary
Vi beskriver en eggstokkkjepphest pad transplantasjon analysen egnet for studier av normale og forvandlet epitel av den kvinnelige skjede. Musen fettpute gjør transplantasjon av store vev fragmenter, er lett tilgjengelig for kirurgi og bildebehandling, og gir den mest gunstige opprinnelige miljø for vev av Mullerian opprinnelse.
Introduction
Transplantasjons analyser, som innebærer innføring av celler og vev i spesifikke kroppssteder i mus, representere et viktig metode for studier av vev regenerering og karsinogenese. Ortotopiske transplantasjoner av celler, det vil si, deres plassering i en innfødt miljø, er spesielt viktig for karakterisering av voksne stamceller. Eksistensen av melke stamceller ble først foreslått av transplantasjon av epitelceller brystkjerteltumorer fragmenter inn kjertel frie melkefettputer av mus 1. Engraftment analyser til humanisert musefettpute 2 ble brukt til å rekapitulere den regenerative potensial og normal utvikling av menneskelige primære bryst epitelceller. Videre serie og begrensende fortynning transplantasjoner av fenotypisk forskjellige celletyper i det ryddet melkefettpute var avgjørende for å teste selvfornyelse kapasitet og multilineage differensiering av melke stamceller 3-5. Transplantasjonsforsøk i combination med genetisk avstamning tracing gitt bevis av cellen opprinnelses i brystkreft 5. Nyre kapsel transplantasjoner blir ofte brukt for å teste egenskapene til antatt prostata stamceller 6. Orthotopic transplantasjon av normal og neoplastiske mus og menneskelige bukspyttkjertelen organoids avslørt gener og stier endret i kreft progresjon 7. Betydningen av de innfødte miljøet har også vært støttet av demonstrasjon av diverse regenerering etter engraftments av svettekjertler i ulike steder, for eksempel melkefettputer, skulder fett pads, og tilbake hud åtte.
Bukhulen og eggstokkreft bursa er vanligvis brukt som steder for orthotopic transplantasjon av epitelceller kvinnelige skjede 9-12. Begge disse metoder har en rekke begrensninger. Intraperitoneal injeksjon av celler som fører til deres implantasjoner i ulike områder av bukhulen, hvorved complicating overvåking cellevekst. Videre variasjoner i mikromiljøet, for eksempel graden av vaskularisering, innervasjon og immuncelle representasjon, kan være ganske betydelig i forskjellige områder av bukhulen. Ovarial bursa har et svært begrenset volum, slik at injeksjon av ikke mer enn 10 ul væske. Dette begrenser mengden av celler som kan administreres i betydelig grad. Videre kan injeksjoner i eggstokk bursa være ganske teknisk utfordrende og framgangsmåten krever en betydelig mengde av tid.
For å møte disse begrensningene, har vi tatt nytte av eggstokkene fett puten egenskaper. Musen eggstokkreft fett puten har en stor størrelse, ligger ved siden av eggstokk og livmor rør, og er lett tilgjengelig med kirurgi. Det har blitt rapportert at equine trophoblast kan transplanteres inn i museeggstokkfettputen 13. Men detaljene i denne metoden ble beskrevet. Det ble heller ikke rapportert om dette er megthod kan brukes på voksne celler og vev. Her beskriver vi en pålitelig metode for transplantering av mus og humane celler i det kvinnelige reproduksjonssystemet og viser at denne fremgangsmåte er også anvendelig for langsiktig organtransplantasjon.
Protocol
All in vivo arbeidet som er beskrevet er godkjent av Cornell University Institutional Animal Care og bruk komité.
1. Eksempel Forberedelser til Eggstokkfettpute Analyser
- Isolasjon og Culture of Primary Tubal epitel (TE) Cells
- Avlive donor 6- til 8 uker gammel jomfru β-actin-Enhanced grønt fluorescerende protein (EFGP) eller β-actin-Discosoma Red Fluorescent Protein (DsRed) mus med CO 2 administrasjon fulgt ved halshugging. Bekreft vellykket dødshjelp av en tå klype.
- Plasser en individuell mus på et sugende drapere, ventral siden opp, og tørk av magen med 70% etanol. Åpne huden ved å gjøre et innsnitt ved lateral legemet midtlinjen og med fingertuppene dra huden over og under snittet mot hodet og halen av musen.
- Hold peritoneum med butte pinsett og gjøre et kutt med fine saks for å åpne kroppens hulrom. Skyv spolen av intestine til side og finne den reproduktive organer.
- Med fin pinsett plukke opp en livmor horn og kutte 0,5 cm over det punktet hvor livmor horn skille. Mens du holder livmorhorn, dissekere bort bindevev festet til livmorhorn, livmor tube, eggstokk og eggstokkreft fett pad. Plasser dissekert skjede i en skål med 6 ml sterilt fosfatbufret saltvann (PBS). Fortsett med andre skjede.
- Overfør parabolen til en biosikkerhet skap og vask vevet 3 ganger i 6 ml steril PBS. Videreføre arbeidet under et disseksjon mikroskop ligger i biosikkerhet kabinettet. Ta tak i livmor horn med fine pinsett og koble livmor horn fra livmor rør av kuttet i utero-tubal kryss. Skjær ut eggstokkreft bursa rundt eggstokken ved hjelp av en 25 G nål.
Merk: Etter at eggstokkene bursa er fjernet, er disseksjon komplett og den enkelte livmor røret forblir i PBS-løsning. - Overfør en single livmor rør i en 50 mL dråpe PBS til en 3,5 cm parabol og hakke i 0,1 mm brikker bruker 28 måle nåler. Overføring til 200 ul fordøyelse buffer 1 (Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) F12 (Hams) medium supplementert med 300 enheter ml -1 kollagenase og 100 enheter ml -1 Hyaluronidase) og inkuberes i 1 time ved 37 ° C i en 5% CO 2 inkubator.
- Etter inkuberingen, tilsett 1 ml 0,25% Trypsin-Etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) og suspendere oppløsningen ved hjelp av en 1 ml pipette (aka blå tip) 20 ganger i 3 minutter. Tilsett 5 ml + 4 ° C DMEM / F12 (Hams) medium inneholdende 2% føtalt bovint serum.
- Samle vev ved sentrifugering (600 RCF, 5 min, romtemperatur (RT)), og tilsett 1 ml fordøyelsen buffer 2 (DMEM F12 (Hams) medium supplert med 7 mg ml -1 Dispase II og 10 mikrogram ml -1 deoxyribonuclease I ( DNase I)). Suspendere vev pellet 20 ganger med hjelp av en 1 ml pipette tis.
- Tilsett 5 ml serumfritt komplett museeggleder epitel vekstmedium (M-TE-GM, tabell 1).
- Samle cellene ved sentrifugering (600 RCF, 5 min, RT). Tilsett 1 ml M-TE-GM, suspendere og telle celler ved hemocytometer. Seed 1 x 10 5 celler i 1 ml per brønn i en 24-brønns lav festeplate og inkuberes i M-TE-GM ved 37 ° C i en 5% CO 2 inkubator for 4 dager.
- Endre medium hver dag.
- Forbered enkelt celle suspensjoner av dyrkede primære opphengs TE celler fra p-aktin-EGFP eller β-actin-DsRed mus.
- Samle TE suspensjonskulturer fra 24-vel lave festeplater. Sentrifuger (600 RCF, 5 min, RT), og suspendere celle-pellets med en ml 0,25% Trypsin-EDTA. Inkuber i 10 minutter ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator.
- Stoppe trypsin-aktivitet ved tilsetning av 5 ml DMEM / F12 (Hams) medium inneholdende 5% føtalt bovint serum. Samle cellepelleter ved sentrifugering (600 RCF, 5 min, RT).
- Vask celle pellets to ganger med 4 ml kald PBS (4 ° C), tilsett 1 ml PBS per celle pellet, og suspendere. Cellene telles ved hemocytometer og overføres til 1,7 ml sentrifugeringsrør. Arbeid på is, tilsett 1 x 10 5 celler til 10 mL PBS, legg deretter til 10 mL basalmembran matrix. Suspendere og transportere på is til dyrerom.
Merk: Utfør alle disseksjon og vev kulturarbeid i et biosikkerhet skap under sterile forhold.
- Fremstilling av Udødeliggjort human cellelinje
- Separat vokse lentivirus-EGFP og -mCherry merket humant udødelig eggstokkreft overflaten epitel celle lineHIO118 inntil 80-90% konfluens på 10 cm retter ved 37 ° C i en 5% CO 2 inkubator.
- Vaske to ganger med 10 ml PBS, tilsett 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA per parabol og inkuberes i 10 min ved 37 ° C i en 5% CO 2 inkubator. Stopp reaksjonen ved tilsetning av 10 ml DMEM / F12 (Hams) medium inneholdende 5% føtalt bovint serum. Samle inncellepelleter ved sentrifugering (600 RCF, 5 min, RT).
- Vask celle pellets to ganger med 10 ml kald PBS (4 ° C), tilsett 1 ml PBS per celle pellet, og suspendere. Cellene telles ved hemocytometer og overføres til 1,7 ml sentrifugeringsrør.
- Arbeid på is, tilsett 1,0 x 10 6 Lenti-mCherry merkede celler + 1,0 x 10 6 Lenti-EGFP merket celler til 10 mL PBS. Tilsett 10 mL basalmembran matrix. Suspendere og transportere på is til dyrerom.
- Utarbeidelse av Livmor Tube
- Dissekere individuelle eggledere fra 6- til 8-uker gamle jomfrue β-actin-DsRed mus i PBS som beskrevet i trinn 1.1.1-1.1.5. Overfør enkelt livmor rør inn en 200 mL dråpe PBS under et disseksjon mikroskop. Forsiktig vikle eggledere ved hjelp av pinsetter og 28 spor nåler ved å fjerne mesosalpinx, et parti av den brede ligament som understøtter segmentene i livmor røret. Plasser enkelt uncoiled livmor rør i en dråpe 200 mL iskald PBS til mottakerens eggstokk fett puten er utsatt for og forberedt på å motta transplantasjon.
2. Ovarian Fat Pad Transplantasjon
Merk: Desinfiser instrumenter mellom hvert dyr operasjon. Forbered og ordne alt utstyr på forhånd. Rygg transplantasjoner til høyre eggstokk-fett puten er fortrinnsrett som dette unngår milten. Imidlertid kan mottakerne har transplantasjoner i begge eggstokkene fett pads.
- Bruk syngene mus eller alvorlig kombinert immunsvikt (SCID / NCR) mus som mottakere av primære celler. For menneskeceller, slik som HIO118 celler, bruk Nod / SCID / gamma (NSG) mus eller SCID mus.
- Bedøve mottaker mus med en enkelt intra-peritoneal injeksjon av 2,2,2-Tribromoethanol i en dose på 0,15 ml / 10 g kroppsvekt. Plasser dyret på en varmepute, i dyre hette og bekrefte riktig anesthetization ved tap av pedalrefleks (tå klype). Påfør veterinær salve på øynene for å hindre tørrhet mensdyret er under narkose. Injiser dyret subkutant med den analgetiske Ketoprofen i en dose på 4 mg / g kroppsvekt for behandling for post-operativ smerte.
Merk: Som et alternativ, bruker isofluran for anestesi. Plasserer dyret i induksjonskammeret og justere oksygenstrømningsmåleren til 0,8-1,5 l / min, og isofluran fordamper til 2-3%. Fjern bedøvet dyret fra kammeret, la den puste isofluran fra en maske og sette oksygen målere til 0,4-0,8 l / min og isofluran vaporizer til 1,5%, og deretter starte operasjonen. - Barbere den kirurgiske området med # 40 clippers; fjerne hår fra et område 2 ganger den kirurgiske området, forberede barbert hud med tre antiseptiske skrubb av povidon-jod, etterfulgt av 70% etanol, og dekk til med en steril drapere.
- Flytt dyr under et disseksjon mikroskop ligger i et biosikkerhet skap. Expose skjede ved et snitt i dorsomedial posisjon direkte over eggstokkene fett pad.
Merk: Critical trinn: Nøyaktig innsnitt letter sårheling, er bruk av en skalpell som anbefales i trinn 2,4. - Bruke sløv fin pinsett trekk eggstokkreft fett puten nøye gjennom snittet mot midtlinjen, minimere skader på nerver og store blodårer.
Kritisk trinn: Hvis blødningen oppstår, stopp kirurgi og vurdere transplantere en annen vert dyr. - Under kontroll av disseksjon mikroskop med hjelp av en 28 sporvidde avfaset nål lage en 2-4 mm dypt snitt i eggstokk fett puten, 3-4 mm over eggstokk.
Kritisk trinn: Kontroller at snittet går bare gjennom halvparten av fettet pad; punktering hele veien gjennom til undersiden forårsaker lekkasje. Vær rask og fortsette uten opphold etter dette trinnet. - For celletransplantasjoner, fylle en sprøyte (30 gauge nål) med 10-20 pl av celle-basalmembran matriks-blanding og injiserer inn i fettpute innsnitt. For livmor tube transplantasjon, plukke opp livmor tube viddh fin pinsett og legg i 10-20 mL basalmembran matrix holdt på is. Ved hjelp av en 0,1-10 / 20 ul XL graderingsfilter tips (forkortet med 3 mm) plukke opp vevet og basalmembran matrix suspensjon og slipper inn fettpute snittet.
- Vent 5 minutter for basalmembran matrix å stivne, og legg skjede tilbake i bukhinnen. Lukk musklene med 2 sting av kirurgisk sutur og huden med to små sår klipp eller kirurgisk sutur.
- Gjenta trinn 2,4-2,8 transplantere en PBS-basalmembran matrise-blandingen i den kontra-laterale fettpute av dyret som vil tjene som kontroll.
Kritiske trinn: Etter at operasjonen plasserer dyret på en varmepute, fordi varmetapet er hurtig i bedøvede mus. - La dyret komme på en varmepute på mors buret og observere dyret før helt våken fra anestesi. Ikke la et dyr uten tilsyn før det har gjenvunnet nok bevissthet til å opprettholde Sternal recumbence. Ikke returner et dyr som har gjennomgått kirurgi i selskap med andre dyr før fullt restituert.
- Legg en håndfull av pre-våt mat pellets inne i buret i tillegg til tørrfôr på buret etter operasjonen. Påfør post-kirurgiske analgetika ved behov for de neste dagene og undersøke såret daglig. Påfør antibiotika i henhold til godkjent dyr protokollen om sårinfeksjon oppstår. Fjern sår klipp 10 dager etter operasjonen når såret er helt lukket.
3. Histologi og Image Acquisition
- Graft Innsamling og bevaring
- Forbered 4% paraformaldehyde løsning ved å blande 26 ml DDH 2 O med 4 ml 10x PBS og 10 ml 16% paraformaldehyde løsning.
- Dissekere i en blokk, er innpodet ovarial fett puten, ovarie, livmor rør, 0,5 cm livmor som beskrevet i trinn 1.1.1-1.1.4. Umiddelbart plassere i 2 ml 4% paraformaldehyde og fikse for 2 timer, ved RT. Fra samme dyr, dissekere den ikke-innpodetkontralaterale eggstokkfettpute system transplantert med PBS-basalmembran matriks blanding som en kontroll (se trinn 2.9). Fiks og prosessen på samme måte.
- Etter fiksering vask vev tre ganger med PBS i 5 minutter og inkuberes over natten i PBS ved 4 ° C.
- For hele montering avbildning av eggstokkreft fett puten videre til trinn 3.2.1.
Merk: Etter bildeinnlastingen vev kan fryses (3.3.1) eller behandles for parafin innebygging (3.3.2). Inkubering over natten i 30% sukrose i PBS ved 4 ° C forbedrer kvaliteten av frosne vev.
- image Acquisition
- Plasser hel-mount eggstokkene fett puten systemer i PBS fylt retter og bilde ved hjelp av en invertert mikroskop utstyrt med epi-fluorescens vedlegg og HD-fargekamera, med 4, 10x mål, og et stereomikroskop utstyrt med en fluorescens vedlegg, fargekamera og Plan Apo 1xWD70, ED Plan 1.5xWD45 mål.
- histologi
- Følgendehel-mount image oppkjøpet (3.2.1) plassere en 200-500 mL dråpe innstøpningsmediet for frosne vevsprøver på en 2 x 1 cm stykke laboratorium film og bruk av tang, overføre vev til nedgangen. Plukk opp filmen på en kant og overføre vev-medium slippe til en 1,8 ml kryogenisk hetteglass. Lukk flasken og stupe inn i flytende nitrogen. Oppbevar frosne vev ved -80 ° C.
- Alternativt fortsette med standard parafin innebygging. Bruk 20-40 volumer av vev volum for hvert trinn.
- Dyppe vev gang i 65% etanol i 30 minutter, forsiktig risting ved RT.
- Dyppe vev gang i 70% etanol i 30 minutter, forsiktig risting ved RT. På dette stadiet prøver kan lagres i måneder ved romtemperatur.
- Dyppe vev gang i 90% etanol i 30 minutter, forsiktig risting ved RT.
- Dyppe vev gang i 95% etanol i 30 minutter, forsiktig risting ved RT.
- Dyppe vev to ganger i absolutt etanol (200 proof) i 30 minutter, forsiktig risting ved RT. <li> Fordyp vev to ganger i kloroform i 30 min, rister forsiktig på RT.
- Fordyp vev gang i parafin i 30 min, rister forsiktig ved 58 ° C.
- Fordyp vev gang i parafin i 12 timer, rister forsiktig ved 58 ° C.
- Dyppe vev gang i parafin i 3 timer, ved 58 ° C.
- Plasser vev i metall histologiske muggsopp og fyll formene med 58 ° C parafin. Legg til en plastisk histologi kassett på toppen av parafin og avkjøles parafin til 4 ° C. Pakk parafin-vevsblokk og oppbevar ved romtemperatur.
Merk: Parafin Temperaturen bør ikke overskride 58 ° C for optimal konservering av vev er egnet for immunhistokjemisk farging.
- Alternativt Forbered deg på Parafin Inkludering med Specimen Processing Gel.
- Aspirer PBS og overføre hele Monterte vev til 70% etanol. Inkuber ved romtemperatur i 2 timer. I et vannbad, forvarme prøve behandling av gel til 60 ° C.
- Pipette 200 mL av prøven behandling gel på et laboratorium film-lined petriskål. Bruke fin disseksjon pinsett overføre hel-mount vevsystem til prøven behandling gel dråpe.
- Tillat prøven behandling gelen plugg å stivne ved romtemperatur, eller stivne pluggen i 10 minutter ved 4 ° C.
- Plasser prøven behandling gel innebygd vev i histologi vev kassetter klemt mellom biopsi puter. Bygge inn i parafin som i trinn 3.3.2-3.3.2.10.
Merk: Prøve behandling gel embedding hindrer tap og lar bevaring av små skjøre vevsprøver.
Merk: Vev bevart ved å fryse eller parafin embedding er egnet for immunhistokjemisk farging 14,15.
Representative Results
Eksperimentelle celler og vev kan bli nøyaktig transplantert inn i eggstokkfettputen under et mikroskop disseksjon (figur 1). Eksemplene omfatter primær muse tubal epitel celler avledet fra mus overalt uttrykker EGFP (figur 2A) eller DsRed (figur 2B) og menneskeudødelig eggstokkreft overflate epitelceller HIO118 16,17 celler merket med mCherry og EGFP lentiviruses (Figur 2C - F). Fremgangsmåten er også anvendelig for langvarig transplantasjon av organer, slik som mus uterine røret (figur 3). Ifølge immunhistokjemisk farging, både Cilierte (FOXJ1 positiv 14) og sekretoriske (PAX8 positive 15) celler er bevart i tubal epitel av transplanterte vev (figur 3D og E).
Figur 2:. Påvisning av Transplanted Mouse Primære Tubal epitelceller og Menneskelig Udødelig Ovarian Overflate epitelceller (A, B) Out vekst av primær muse tubal epitel celler (piler) av β-actin-EGFP mus (A, grønn) og p-aktin-DsRed (B, rød) 8 dager etter transplantasjon i en syngene mus. (C, D) Engraftments blandede HIO118 celler (piler) merket med enten Lenti-EGFP (grønn) eller Lenti-mCherry (rød) 10 dager etter transplantasjon i NSG mus. (D) Forstørret område fra (C, pil). (E, F) Graft utviklet 43 dager etter transplantasjon av de samme celler som i C, D til SCID-mus (piler). AD, F, fluorescens; E, lyse feltet, FP, fett pad; Ov, eggstokk; UT, livmor tube. (A, B, DF) Skala bar = 500 um; (C) Scale bar = 1600 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
ad / 54444 / 54444fig3.jpg "/>
Figur 3: Karakterisering av Livmor Tube Transplant. (A) Complete livmor tube (pil) av β-aktin-DsRed mus 6 dager etter transplantasjon inn i eggstokkene fett puten (pil, lyse rødt). (B) Fluorescent frosne delen av fettpute med transplantasjon vist i (A). Rød, DsRed; Blå, 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) atomkontra. (C) Livmor rørprotese (pil) 40 dager etter transplantasjon i NSG mottaker mus (pil). Parafin delen. Legg merke til riktig bevaring av alle prinsippet livmor rør komponenter, og mangelen på transplantasjonsassosierte fibrose og inflammasjon. Hematoxylin og eosin farging. (D, E) Påvisning av tubal epitel markører parvise box genet 8 (PAX8) og gaffelhodeboks J1 (FOXJ1, brun atom farge, pilspisser) i cellene av pode (piler) som vises i (
| Komponent | 1x DMEM F12 (Ham) medium |
| L-glutamin | 2 mm |
| Sodium pruvate | 1 mm |
| Epidermal vekstfaktor | 10 ng ml -1 |
| Basisk fibroblast vekstfaktor-2- | 10 ng ml -1 |
| hydrokortison | 500 ng ml -1 |
| Insulin | 5 mikrogram ml -1 |
| Transferrin | 5 mikrogram ml -1 |
| Sodium selenite | 5 ng ml -1 |
| bovine albumin | 0,10% |
| Penicillin / streptomycin | 100 enheter ml -1/100 ug ml -1 |
| Minimum Essential Medium Eagle (MEM) ikke-essensielle aminosyrer | 0,1 mm |
| Beta-mercaptoethanol | 10 -4 M |
Tabell 1:. Mouse Tubal Epithelim vekstmedium (M-TE-GM) Komponenter oppført i venstre kolonne løses i 1x DMEM F12 (Hams) medium på angitte konsentrasjoner, høyre kolonne. Den endelige medium sammensetning er serum gratis.
Discussion
Vi har etablert en ovarian fettpute transplantasjon analysen som gir mulighet for presis levering og påvisning av epitelceller og vev. Ovarial fettpute analyse transplantasjon prosedyre er mindre teknisk krevende enn intrabursal injeksjon 10-12 og gir mulighet for mer ensartet og nøyaktig plassering av transplanterte celler sammenlignet med intraperitoneal injeksjon ni. Det er også godt egnet for langtids transplantasjon av en hel organ, slik som livmor røret.
Viktigere, gir eggstokk fett puten en kjent mikromiljøet for epithelia av den kvinnelige reproduktive system. Det skulle være spesielt egnet for studier av de molekylære og cellulære egenskapene for humant og mus ovarie og tubene epitel celler under regenerering og ondartet transformasjon. I motsetning til andre organer, er det få studier fokusert på identifisering og karakterisering av stamceller i epitel av hunn reproductive kanalen 18,19. Slike studier er av særlig betydning fordi mange kreftformer antas å stamme fra voksne stamceller 20. Likevel cellulære opprinnelse epiteliale eggstokkreft er fortsatt svært diskutabelt 18. Epitelial eggstokkreft står for størsteparten av eggstokkreft og er på 5. plass blant alle kreftrelaterte dødsfall av kvinner i USA 21. Dermed utviklingen av en orthotopic analysen med flere fordeler fremfor eksisterende transplantasjonsteknikker 9-12 skal i stor grad forenkle studier på dette området.
Gitt den overfladiske plasseringen av eggstokkreft fett puten, kan små dyr imaging-systemer brukes til å følge opp engraftments merket med sterk fluoriserende eller bioluminescent reportere. Det bør også være mulig å etablere minimalt invasive høyoppløselige levende bildeanalyser, slik som ikke-lineær mikroskopi 22. Den ovarian fett puten kan også holdes i organkulturer, for derved å tillateing tredimensjonal kultur av normale og neoplastiske epitel under betingelser tett rekapitulere organisering av celler og den ekstracellulære matriks. Fremtidige studier bør løse disse lovende muligheter.
Flere viktige skritt må tas i betraktning. Gir en varmepute og holde gnagere varm under operasjonen forbedrer overlevelsesraten. Sterilitet av instrumenter håndtering av fett puten sørger for at innpodet systemene holdes sterile. Vår erfaring er betydelige blødninger fører til veksthemming av transplantasjoner. Viktigere, bør fettpute innsnitt gjøres nettopp fordi rive fett puten eller punktering det gjennom forårsaker blødninger. Koagulanter skal brukes for å stoppe blødninger etter behov. Hvis engraftments utvikler ikke, bør en høyere konsentrasjon av injiserte celler vurderes. De første vellykkede utvekster kan observeres så tidlig som en uke etter transplantasjon og mest engraftments skal være synlig enmåned etter inngrepet. For transplantasjon, kan nåler med større diameter (23-25 g) anvendes for å forhindre skjæring av store celler (over 10 mikrometer i diameter). Imidlertid kan slike nåler er mer traumatisk for det fett puten og bruken av disse bør testes på forhånd. For våre forsøk har vi brukt 6-8 uker gamle giver- og mottaker mus. For begge formål yngre og eldre mus kan anvendes. Imidlertid kan trenge antall injiserte celler som skal justeres. Den mindre størrelsen på eggstokkene fettputer i yngre givere må også vurderes.
Som med alle metoder, er det noen begrensninger av muse ovarial fettputen transplantasjon assay. Selv om syngeniske immuno-kompetente mus kan brukes til murine primære celler / vev, krever vår teknikk NSG eller SCID-mus for transplantasjon av humant materiale. Det er sannsynlig mulig å humanfettpute for å understøtte veksten av humane epitelceller. Vi har imidlertid ikke testet denne tilnærmingen enda. Bruk av yngre femenn kan føre til lavere avl kostnader; Men modne jomfrue hunnmus (alder 8 til 10 uker) har en større fettpute, og dermed lar transplantasjon av større prøver. Til slutt bør laboratoriepersonell være opplært i dyr operasjon for å sikre tidsriktig og vellykket gjennomføring av prosedyren.
Acknowledgments
Vi ønsker å takke Dr. Andrew K. Godwin, University of Kansas Medical Center, for å gi de menneskelige celler HIO118. Disse studiene ble støttet av tilskudd fra New York Stem Cell Program (NYSTEM, T028095) og National Institutes of Health / National Institute of Child Health and Human Development (P50HD076210) til AFN, og ved tilskudd fra NYSTEM (C028125, C024174 og T028095), National Institutes of Health / National Cancer Institute (CA182413) og Ovarian Cancer Research Fund (327516) til Ayn.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 gauge needle | BD Becton Dickinson | 305122 | |
| 28 gauge needle (hypodermic syringe with attached needle) | Kendall | 30339 | Part Number: 8881500014 |
| basic fibroblast growth factor-2 | Sigma-Aldrich | F9786 | |
| basement membrane matrix (Geltrex) | Invitrogen | A1413202 | |
| β-actin-DsRed mice | The Jackson Laboratory | 6051 | B6.Cg-Tg(CAG-DsRed*MST)1Nagy/J |
| β-actin-EGFP mice | The Jackson Laboratory | 3291 | C57BL/6-Tg(CAG-eGFP)1Osb/J |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| bovine albumin | Sigma-Aldrich | A3311 | |
| chloroform | VWR | EM-CX1058-1 | |
| collagenase/hyaluronidase | Stem Cell Technologies | 7912 | |
| cryogenic vials | Thermo Scientific Nunc | 377267 | |
| dispase II | Worthington | NPRO2 | |
| DMEM F12 (HAM's) | Corning | 10-092-CV | |
| DNaseI (Deoxyribonuclease I) | Stem Cell Technologies | 7900 | |
| embedding medium for frozen tissue specimens (O. C. T.) | Sakura Finetek | 4583 | |
| epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E4127 | |
| ethanol 200 proof | Koptec | V1001 | to prepare 70% |
| fetal bovine serum | Sigma | F4135 | |
| filter tip 0.1-10/20 µl XL | USA Scientific | 1120-3810 | |
| FOXJ1 antibody | eBioscience | E10109-1632 | used at concentration 1:1,000 (no unmasking) |
| hydrocortisone | Sigma | H0135 | |
| Ketoprofen | Zoetis | 4396H | |
| laboratory film (Parafilm M) | American National Can | PM-999 | |
| L-Glutamine | Corning | 25-005-Cl | |
| insulin-transferin-sodium selenite | Sigma-Aldrich | I884 | |
| isoflurane, 250 ml | Santa Cruz Animal Health | sc-363629Rx | |
| low attachment plate 24-well | Costar | 3473 | |
| MEM non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | |
| metal histology molds | Electron Microscopy Sciences | 62527-22 | |
| microscope, inverted | Nikon | Eclipse TS 100 | |
| microscope, stereo | Nikon | SMZ800 | |
| Nod/SCID/gamma (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 05557 | NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ |
| paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| paraffin (Paraplast, X-TRA) | Fisher Thermo Scientific | 23-021-401 | |
| PAX8 antibody | Proteintech | 10336-1-AP | used at concentration 1:1,000 (no unmasking) |
| PBS (Phosphate-Buffered Saline) | Corning | 21-030-CV | |
| penicillin streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| severe combined immunodeficiency (SCID/NCr) mice, BALB/C background) | NCI-Frederick Animal Production Program | 01S11 | |
| sodium pyruvate | Corning | 25-000-Cl | |
| specimen processing gel (HISTOGEL) | Richard-Allan Scientific | HG-4000-012 | |
| sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Trypsin-EDTA, 25% | Corning | 25-053-Cl |
References
- Deome, K. B., Faulkin, L. J., Bern, H. A., Blair, P. B. Development of mammary tumors from hyperplastic alveolar nodules transplanted into gland-free mammary fat pads of female C3H mice. Cancer Res. 19, 515-520 (1959).
- Proia, D. A., Kuperwasser, C. Reconstruction of human mammary tissues in a mouse model. Nature protocols. 1, 206-214 (2006).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439, 84-88 (2006).
- Stingl, J., Caldas, C. Molecular heterogeneity of breast carcinomas and the cancer stem cell hypothesis. Nat Rev Cancer. 7, 791-799 (2007).
- Koren, S., et al. PIK3CA(H1047R) induces multipotency and multi-lineage mammary tumours. Nature. 525, 114-118 (2015).
- Nikitin, A. Y., Nafus, M. G., Zhou, Z., Liao, C. -P., Roy-Burman, P. Prostate stem cells and cancer in animals. Stem Cells and Cancer. Bagley, R. G., Teicher, B. A. , Humana Press. New York, NY. 199-216 (2009).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160, 324-338 (2015).
- Lu, C. P., et al. Identification of stem cell populations in sweat glands and ducts reveals roles in homeostasis and wound repair. Cell. 150, 136-150 (2012).
- Flesken-Nikitin, A., et al. Ovarian surface epithelium at the junction area contains a cancer-prone stem cell niche. Nature. 495, 241-245 (2013).
- Orsulic, S., et al. Induction of ovarian cancer by defined multiple genetic changes in a mouse model system. Cancer Cell. 1, 53-62 (2002).
- Dawes, J., Liu, B., Mars, W., Michalopoulos, G., Khillan, J. S. Multiple ovarian transplants to rescue a transgenic line of mice. Lab Anim (NY). 39, 191-193 (2010).
- Cordero, A. B., Kwon, Y., Hua, X., Godwin, A. K. In vivo imaging and therapeutic treatments in an orthotopic mouse model of ovarian cancer. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
- Albihn, A., et al. Production of capsular material by equine trophoblast transplanted into immunodeficient mice. Reproduction. 125, 855-863 (2003).
- Muthusamy, N., Vijayakumar, A., Cheng, G., Ghashghaei, H. T. A knock-in Foxj1(CreERT2::GFP) mouse for recombination in epithelial cells with motile cilia. Genesis. 52, 350-358 (2014).
- Perets, R., et al. Transformation of the fallopian tube secretory epithelium leads to high-grade serous ovarian cancer in Brca;Tp53;Pten models. Cancer Cell. 24, 751-765 (2013).
- Capo-Chichi, C. D., et al. Dynamic alterations of the extracellular environment of ovarian surface epithelial cells in premalignant transformation, tumorigenicity, and metastasis. Cancer. 95, 1802-1815 (2002).
- Roland, I. H., et al. Loss of surface and cyst epithelial basement membranes and preneoplastic morphologic changes in prophylactic oophorectomies. Cancer. 98, 2607-2623 (2003).
- Flesken-Nikitin, A., Odai-Afotey, A. A., Nikitin, A. Y. Role of the stem cell niche in the pathogenesis of epithelial ovarian cancers. Mol Cell Oncol. 1, 963435 (2014).
- Ng, A., Barker, N. Ovary and fimbrial stem cells: biology, niche and cancer origins. Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 625-638 (2015).
- Visvader, J. E. Cells of origin in cancer. Nature. 469, 314-322 (2011).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2015. CA Cancer J Clin. 65, 5-29 (2015).
- Williams, R. M., et al. Strategies for high-resolution imaging of epithelial ovarian cancer by laparoscopic nonlinear microscopy. Transl Oncol. 3, 181-194 (2010).
