Introduction
Hydrogeler är tredimensionella nätverk som bildats av hydrofila tvärbundna polymerer, som är naturliga eller syntetiska, och kännetecknas av en distinkt tredimensionell struktur. Dessa enheter är alltmer attraktiva i biomedicinska områdena drug delivery, vävnadsteknik, genbärare och smarta sensorer 1,2. Faktum är att deras höga vattenhalt, liksom deras reologiska och mekaniska egenskaper gör dem lämpliga kandidater att efterlikna mjukdelsmikromiljöer och göra dem effektiva verktyg för vattenlösligt cytokin eller tillväxtfaktor leverans. En av de mest lovande användning är som ett injicerbart biomaterial bärande celler och bioaktiva föreningar. Hydrogeler kan förbättra cellöverlevnad och kontroll stamcells öde genom att hålla och exakt leverera stamcellsregleringssignaler i ett fysiologiskt relevant sätt, såsom observerats i in vitro- och i in vivo-experiment 3,4. Den ledande Fördelen med detta är möjlighetenatt upprätthålla injicerade cellerna inom zonen av inokulering (in situ), vilket minimerar den mängd celler som lämnar området och extravasates i cirkulations flöde, migrerar över hela kroppen och förlora målet mål 5. Stabiliteten hos de tre-dimensionella hydrogelpartiklar nätverk beror på dess tvärbindningsställen, bildade genom kovalenta bindningar eller kohesiva krafter mellan polymerkedjorna 6.
I detta sammanhang tillämpas ortogonala selektiv kemi till polymerkedjor är ett mångsidigt verktyg kan förbättra hydrogel föreställningar 7. I själva verket modifiering av polymerer med lämpliga kemiska grupper kan bidra till att tillhandahålla lämplig kemiska, fysikaliska och mekaniska egenskaper för att förbättra cellviabilitet och deras användning i vävnadsbildning. På samma sätt, bland de tekniker för att ladda celler eller tillväxtfaktorer inom gelmatrisen, användningen av RGD-peptiden medger förbättringar i celladhesion och överlevnad. RGD är en tripeptid sammansattarginin, glycin och asparaginsyra, som är den i särklass mest effektiva och ofta anställda tripeptid på grund av dess förmåga att adressera mer än en cell adhesion receptor och dess biologiska effekter på cell förankring, beteende och överlevnad 8,9. I detta arbete studeras syntesen av RGD-funktion hydrogeler i syfte att utforma nätverk som kännetecknas av tillräckliga biokemiska egenskaper för en gäst cell mikromiljö.
Användningen av mikrovågsstrålning i hydrogel syntes ger ett enkelt förfarande för att minimera bireaktioner och få högre reaktionshastigheter och utbyten på kortare tid jämfört med konventionella termiska processer 10. Denna metod kräver inte reningssteg och ger sterila hydrogeler på grund av de interaktioner mellan polymererna och frånvaron av organiska lösningsmedel i reaktionssystemet 11. Därför ser det höga procentandelar av RGD kopplade till polymera nätverket eftersom ingen modfikationerna är skyldiga att polymer kemiska grupper som är inblandade i gelbildning. Karboxylgrupper, från PAA och karbomer, och hydroxylgrupper, från PEG och agaros, ge upphov till hydrogelen tredimensionella strukturen genom en polykondensationsreaktion. De nämnda polymerer användes för syntes av hydrogeler i ryggmärgsskada reparation behandlingar 12. Dessa enheter, som rapporterats i tidigare verk 13,14, visar hög biokompatibilitet samt mekaniska och fysikalisk-kemiska egenskaper som liknar de hos många levande vävnader och tixotrop natur. Dessutom förblir de lokaliserad in situ, vid zonen för injektionen.
I detta arbete är PAA karboxylgrupper modifierad med en alkyn molekyldel (figur 1), och en RGD-azid förening syntetiseras utnyttjar reaktiviteten hos tripeptid terminala gruppen -NH2 med en förberedd kemisk förening med strukturen (CH2) n - N 3 (<strong> Figur 2). Därefter reagerar den modifierade PAA med RGD-azidderivat genom CuAAC klick reaktion 15-17 (Figur 3). Användningen av en koppar (I) katalysator leder till stora förbättringar i både reaktionshastigheten och regioselektivitet. Den CuAAC reaktion används ofta i organisk syntes och polymervetenskap. Den kombinerar hög effektivitet och hög tolerans mot de funktionella grupperna, och det är opåverkad av användningen av organiska lösningsmedel. En hög selektivitet, en snabb reaktionstid och en enkel procedur renings tillåter erhållandet av stjärnpolymerer, segmentsampolymerer eller kedjor ympning önskade delar 18. Denna klick strategi gör det möjligt att modifiera polymerer efter polymerisation att anpassa fysikalisk-kemiska egenskaper enligt den slutliga biokemiska ansökan. De CuAAC experimentella betingelser är lätt reproducerbar (reaktionen är okänslig för vatten, medan koppar oxidation kan förekomma minimalt), och naturen avbildade triazol säkerställer produktens stabilitet. Användningen av kopparmetall kan anses vara en kritisk punkt, på grund av dess potentiella toxiska effekt mot celler och i den biologiska mikromiljö, men dialys används som en reningsmetod för att tillåta fullständigt avlägsnande av katalysatorrester. Slutligen PAA modifierad RGD används i hydrogel-syntes (Figur 4) och de fysikalisk-kemiska egenskaperna hos de erhållna näten undersöks, i syfte att kontrollera den potentiella funktionaliteten hos dessa system som celler eller droger bärare.
Figur 1: PAA modifierad alkyn syntes Ett system av PAA funktionalisering med alkyn grupp;. "n" anger monomerer med karboxylgrupp reagera med propargylamin. Klicka här för att seen större version av denna siffra.
Figur 2:.. RGD-azid syntes Syntesen av RGD-azidderivat Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Klicka på reaktionsschema klick reaktion mellan RGD-azidderivat och alkyn-PAA.. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: hydrogel Synthesis. RGD funktion hydrogel syntesförfarandet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: Kemikalierna används som mottagna. Linjär RGD köps, men det kan framställas genom standard Fmoc fast fas peptidsyntes 16,19. Lösningsmedel är av analytisk kvalitet. Dialysen kräver användning av membran med en Mw cut-off lika med 3500 Da. De syntetiserade föreningarna kännetecknas av ett H-NMR-spektra registrerades på en 400 MHz-spektrometer med användning av kloroform (CDCI3) eller deuteriumoxid (D2O) som lösningsmedel, och kemiska skift rapporteras som ö-värden i delar per miljon. Dessutom är hydrogeler utsattes för FT-IR-analys med hjälp KBr pellet teknik och deras fysikaliska egenskaper medför gelbildning studier bedöms med hjälp av den inverterade provrör vid 37 ° C.
1. Syntes av 4-Azidobutanoyl Chloride 1
- Lös upp 500 mg av 4-azidobutanoic syra (3,90 mmol) i 10 ml diklormetan och 0,5 ml dimetylformamid.
- Kyl lösningen vid 0 ° C, Med användning av ett isbad.
- Lägg 505 pl av oxalylklorid (5,85 mmol) till 5 ml diklormetan och tillsätt långsamt droppvis till reaktionssystemet, under omrörning.
- Efter 1 h vid 0 ° C med användning av ett isbad, återgå till rumstemperatur.
- Avlägsna lösningsmedlet under reducerat tryck med användning av en rotationsindunstare.
- Karakterisera den erhållna produkten genom att en H-NMR-spektroskopi, upplösning av provet i CDCI3 16.
2. Syntes av RGD-azidderivat 2
- Lös upp 50 mg av RGD (0,145 mmol) i 1 ml 1 M NaOH.
- Lös upp 24 mg av en (0,16 mmol) i 2 ml tetrahydrofuran.
- Lägg all RGD lösning till lösning 1 droppvis vid 0 ° C med hjälp av ett isbad.
- Återgå till rumstemperatur och omrördes över natten.
- Tillsätt 1 ml 1 M HCl.
- Avlägsna lösningsmedlet under reducerat tryck med användning av en rotationsindunstare.
- Karakterisera OBTained produkt genom ett H-NMR-spektroskopi, upplösning av provet i D2O 16.
3. PAA alkyn Modifiering 3
- Lös upp 200 mg av 35% vikt / vikt PAA-lösning (2,8 mmol) i 15 ml destillerat vatten.
- Lägg 15,4 mg propargylamin hydroklorid (0,20 mmol).
- Lös upp 42,8 mg 1-hydroxibensotriazolhydrat (HOBt, 0,28 mmol) i 14 ml av en 1: 1 volym / volym acetonitril: destillerat vatten-lösning genom uppvärmning till 50 ° C.
- Lägg alla HOBt lösning till PAA-lösning vid rumstemperatur.
- Lägg 53,6 mg ethyldimethylaminopropylcarbodiimide (EDC, 0,28 mmol) till reaktionsblandningen.
- Använda en M HCl för att justera pH till 5,5 och rör om reaktionssystemet över natten vid rumstemperatur.
- Dialysera lösningen. Lös upp 11,2 g natriumklorid i 2 L destillerat vatten och tillsätt sedan 0,2 ml av 37% vikt / vikt HCl. Dialysera lösningen med användning av ett membran med en Mw cut-off på 3,5 kDa.
- perform dialys i tre dagar. Ändra dialyslösningen dagligen med 2 L av nyberedd destillerat vatten innehållande 0,2 ml av 37% vikt / vikt HCl.
- Lagra den slutliga lösningen vid -80 ° C. Lyofilisera den i en lyofilisator i enlighet med tillverkarens protokoll.
- Karakterisera den funktionaliserade polymeren genom en H-NMR-spektroskopi, upplösning av provet i D2O 16.
4. Syntes av PAA-RGD Polymer 4
- Lös 78 mg PAA modifierad alkyn 3 (1,083 mmol) i 10 ml destillerat vatten.
- Lös upp 25 mg av den RGD azid 2-derivat (0,0722 mmol) i 5 ml tetrahydrofuran.
- Lägg all RGD lösning till polymerlösningen.
- Lägg 2,2 mg kopparjodid (0,0116 mmol) och 2,2 mg natriumaskorbat (0,0111 mmol).
- Återflöde den resulterande blandningen över natten vid 60 ° C, under omröring.
- Kyl blandningen till 25 ° C.
- Dialyze lösningen. Lös upp 11,2 g natriumklorid i 2 L destillerat vatten och tillsätt sedan 0,2 ml av 37% vikt / vikt HCl. Dialysera lösningen med användning av ett membran med en Mw cut-off på 3,5 kDa.
- Utför dialys i tre dagar. Ändra dialyslösningen dagligen med 2 L av nyberedd destillerat vatten innehållande 0,2 ml av 37% vikt / vikt HCl.
- Lagra den slutliga lösningen vid -80 ° C. Lyofilisera den i en lyofilisator i enlighet med tillverkarens protokoll.
- Karakterisera den erhållna produkten genom att en H-NMR-spektroskopi, upplösning av provet i D2O 16.
5. RGD-funktion Hydrogel Synthesis
- Förbered PBS. Lös 645 mg PBS salt i 50 ml destillerat vatten.
- Blanda 40 mg av karbomer och 10 mg av funktionaliserad PAA 4 i 9 ml PBS (steg 5,1), vid rumstemperatur, till fullständig upplösning (30 min).
- Tillsätt 400 mg av PEG till lösningen och hålla omrörning under 45 min.
- Stoppa omrörning och tillåta systemet att nöja sig med 30 min.
- Använd en N NaOH för att justera pH till 7,4.
- Till 5 ml av den erhållna blandningen, tillsätt 25 mg agaros pulver.
- Bestråla systemet med mikrovågsstrålning vid 500 W tills kokning, under en tid som vanligtvis mellan 30 sekunder och 1 minut, och elektromagnetiskt värme upp till 80 ° C.
- Låt blandningen utsätts för rumstemperatur tills dess temperatur sjunker till 50 ° C och tillsätt 5 ml PBS (steg 5,1), för att erhålla en lösning vid ett 1: 1 volymförhållande.
- Förbered 12 flerkällsplatta som innehåller stålcylindrar med en diameter på 1,1 cm.
- Ta 500 l alikvoter från lösningen och placera dem till varje stålcylindrar.
- Låt vila i 45 minuter tills fullständig gelning av systemet.
- Ta cylindrarna med hjälp av en tång i rostfritt stål för att erhålla hydrogeler.
6. Laddning av terapeutiskt verktyg (Drug eller celler)
- upprepa steps 5,1-5,7.
- När blandningen (redan vid soltillstånd) når 37 ° C, tillsätt 5 ml av lösningen innehållande den önskade läkemedelslösning eller cellkultur, för att erhålla en slutlig system vid en 1: 1 volymförhållande.
- Upprepa steg från 5,9 till 5,12 för att erhålla polymera nätverk med biocompounds fysiskt infångade i gelén.
7. Hydrogel Karakterisering
- FT-IR-analys
- Efter gelbildning, blöt en av de syntetiserade hydrogeler i 2,5 ml destillerat vatten under 24 timmar.
- Ta bort vatten media där hydrogel är nedsänkt och frystorka med flytande N2.
- Laminera hydrogelen provet enligt KBr-pellet teknik.
- Lägg en spatel full av KBr till en agat mortel. Ta en liten mängd av hydrogel provet (ca 0,1-2% av det KBr beloppet, eller bara tillräckligt för att täcka spetsen på spateln) och blanda med KBr pulver.
- Mala blandningen tills pulvret är fint och homogent. </ Li>
- Använda KBr-pellet-kit för att bilda IR-pelleten. Tryck på pulvret med hjälp av en manuell laboratoriepress: 3 min vid tryckkapacitet lika med 5 ton och sedan under 3 min vid tryckkapacitet på 10 ton.
- Frigöra tryck för att erhålla den slutliga pelleten så homogen och transparent i utseende. Sätt pelleten i IR provhållaren och kör spektrumet 16.
- Gelning Studier
- Fyll 2 ml mikrocentrifugrör med 900 ^ il PBS och jämvikta till 37 ° C.
- Tillsätt 100 pl av den framställda polymerlösningen för att bilda hydrogelen och inkubera vid 37 ° C.
- Invertera röret och observera om gelén strömmar med en, två, fem, 10 och 20 min. Registrera den tid, vid vilken gelén inte strömmar som gelningstiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PAA alkyn derivatet effektivt syntetiseras från polyakrylsyra och propargylamin, som visade i figur 1, där n etiketter monomerer vars karboxylgrupper reagerar med amin. Identiteten hos produkten bekräftades genom ett H-NMR-spektroskopi. Figur 5 visar ett H-NMR-spektrum av PAA modifierad med trippelbindning.
Figur 5: 1 H-NMR-spektrumet för PAA modifierade alkynen Signalen relaterad till alkynen delen är markerad.. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
De signaler av polymerkedjan kan observeras i intervallet 2,75 till 1,50 ppm; medan en topp vid 2,8 0 ppm, representant för alkyn är H, och en topp vid 4,20 ppm, i samband med två H i -CH2-, karakterisera propargyl delen. Detta bekräftar att PAA har rätt ändrats. Utvärderingen av graden av alkynen funktionalisering har utförts genom att integrera arean under PAA topparna (satta till 3,00, beroende på antalet av väteatomer per monomer) och propargyl-del, såsom visas i fig 5. Graden av funktionalisering f är beräknas som:
representerar den integrerade delen av propargyl rest, summan av alkynen s H område (märkt som 
) Och -CH 2-området (anges som 
), Medanjon "src =" / filer / ftp_upload / 54.445 / 54445eq5.jpg "/> hänvisar till den integrerade området polymer signaler. Graden av funktionalisering beräknas vara 10% och det är överväga tillfredsställande enligt hydrogel syntes, där PAA måste reagera genom sina kvarvarande karboxylgrupper för att bilda den 3D-nätet. ett kvantitativt utbyte erhålles för den modifierade polymeren 16.
På ett liknande sätt, fig 6 visar ett H-NMR-spektrumet för produkten efter CuAAC klick reaktionen mellan alkynen modifierade PAA och RGD-azid. Toppen av den bildade triazolen vid 8,15 ppm bekräftar att reaktionen sker i ett kvantitativt utbyte och RGD är starkt kopplad till PAA kedjorna. Figur 6 illustrerar alla de karakteristiska signalerna för PAA kedjan och RGD.
Figur 6:1 H-NMR-spektrum av RGD kopplad till PAA. Signalen från triazol indikeras (märkt som "A"). RGD polymer funktionalisering via CuAAC klick Reaktionen utförs. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
RGD-funktionaliserade hydrogeler framställes genom kemisk tvärbindning av de fyra polymererna (PAA, karbomer, agaros och PEG) genom mikrovågsassisterad friradikalpolymerisation. Upphettning till 80 ° C leder till en högre makromer rörlighet, och således förbättrar kortdistanssammankopplingar bland karboxyl- och hydroxylgrupperna i polymererna. Förestringsreaktionen sker mellan dessa funktionella grupper och producerar lokala nätverk som kallas "mikrogeler".
Som polykondensationen fortskrider system viskositet ökar kontinuerligt, wedan sannolikheten för interaktion mellan makromer reaktiva platser minskar. Ändå närmare funktionella grupperna fortfarande samverka effektivt på grund av en långsammare mobilitet. Den resulterande fysikalisk-kemiska tillstånd kännetecknas av en "svetsning" mellan mikrogelpartiklar ytor som ger den slutliga 3D makrostruktur av hydrogelen. Förestringen, vätebindning och karboxylering föra polymerkedjorna statist närmare, vilket skapar en stabil heterogen struktur. Den resulterande systemet uppvisar sol / gel beteende och det övergår till en gel tillstånd inom fem minuter. Detta tidsintervall redovisas som gelningstiden.
Den kemiska naturen av de RGD-funktionaliserade hydrogeler, studerades i FT-IR-analys. Figur 7 visar jämförelsen mellan FT-IR-spektra för den RGD-azidföreningen (grön linje), hydrogelen syntetiseras utan RGD funktionalisering (svart linje), och hydrogelen med peptid modifiering (blå linje). Hydrogelen spectra är båda kännetecknas av en bred signal i 3,600-3,200 cm -1 intervall, representativ för sträckningsvibration av kvarvarande OH-bindningar och genom en topp i närheten av 2940 cm -1 i CH stretch. Valideringen att förestring sker bland karboxyl och hydroxyl polymergrupper ges av topparna runt 1600 cm -1 och 1400 cm -1, motsvarande, respektive till den symmetriska och asymmetriska sträckning av CO2-delen. Dessa toppar är mer synliga i spektrumet för den icke-funktionaliserade hydrogel, medan det i RGD-hydrogel spektrum de delvis täcks av de signaler som anges som amid band I och II.
Figur 7:. Jämförelse av FT-IR-spektra FT-IR-spektra av RGD (grön linje), hydrogel utan RGD funktionalisering (svart linje) och RGD funktion hydrogel (blå linje). Designal relaterad till amiden RGD anges. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Sträckningen av C = O, märkt som amidband I ( "Amid I" i figur 7), presenterar en topp vid 1.650 cm -1 i tripeptiden spektrum och det skiftas till ca 1670 cm -1 i RGD-hydrogel prov . Böjningen av NH, i samband med amidband II ( "Amid II" i fig 7), kan spelas in med signalen runt 1550 cm -1 i RGD spektrum och det är också att känna igen i hydrogel provet vid cirka 1600 cm - 1. Eftersom det inte finns några amid komponenter i standard hydrogelformuleringen, antyder närvaron av toppar i en amidisk karaktär att PAA verkligen är funktionaliserad med RGD och det är i stånd att bilda en hydrogel med peptidställen inom det polymera nätverket.
Hydrogelen FT-IR-spektrum visar också toppar i samband med sträckningsvibration av COC av glykosidbindning (900-1,000 cm -1 range) mellan monosackaridenheterna i agarosen och estergrupperna.
För att få insikt i 3D-strukturen och fysikaliska och mekaniska egenskaperna hos dessa hydrogeler, SEM analys, gelning, svullnad kinetik och reologiska studier utförs, som diskuterats i tidigare verk 13,20. SEM resultat (figur 8) visar att hydrogeler kännetecknas av en komplex mikroskopiska strukturen med några större porer som innehåller små porer och några fibrillära nätverk på porväggarna. Dessutom har de flesta av porerna är sammankopplade. Intrasslad struktur liknar 3D nätverk av hydrogeler som framställts på samma sätt men utan RGD funktionalise. Detta visar att RGD inte förändrar polymernätverket. Använda den inverterade provrör test, hydrogel sriklig stelnar inom fem minuter, som observerats i hydrogel prov utan RGD funktionalisering 21. Denna korta gelningstid stryker dess lämplighet för biomedicinska tillämpningar.
Figur 8:.. SEM-analys SEM-bilder visar morfologin av en RGD-funktion hydrogel prov (A) och en hydrogel utan funktionalisering (B) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Svullnaden jämviktsförhållande indikerar förmågan att absorbera och kvarhålla en stor mängd vatten och det är en av de ledande funktionerna i hydrogel system 20,22. De analyserade proverna uppvisar snabbt svällande kinetik och de når svullnad jämvikt inom den första timmen. deras swelling jämviktsvärde Q redovisas i vårt tidigare arbete 16 och det liknar det värde som erhålls genom analys av hydrogeler utan RGD, bekräftar att tripeptid är integrerad med det polymera nätverket och skapar inte en hög hinder för gelatineringsprocessen.
Med de reologiska studier gelén lagringsmodul (G') befanns vara approximativt en storleksordning högre än förlustmodulen (G''), vilket indikerar en elastisk i stället för visköst material 23 och båda är i huvudsak oberoende av frekvens. Liknande värden av G'och G'' registreras med gelén provet utan en peptid ändring 16. Detta visar att närvaron av RGD inom det polymera nätverket inte påverkar de reologiska egenskaperna hos materialet, bevara de speciella funktioner som konkurrerar med injicerbara system för biomedicinsk tillämpning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Författarna vill tacka professor Maurizio Masi för givande diskussion och Miss Chiara Allegretti för språkgranskning. Författarnas forskning stöds av Bando Giovani Ricercatori 2010 (Minis della Salute GR-2010- 2.312.573).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(acrylic acid) solution average Mw ~100,000, 35 wt% in H2O | Sigma Aldrich | 523925 | CAS 9003-01-4 |
| Poly(ethylene glycol) 2,000 | Sigma Aldrich | 84797 | CAS 25322-68-3 |
| Carbomeer 974P | Fagron | 1387083 | |
| Agarose | Invitrogen Corp. | 16500-500 | UltraPure Agarose |
| RGD peptide | abcam | ab142698 | |
| 4-azidobutanoic acid | Aurum Pharmatech | Z-2421 | CAS 54447-68-6 |
| Oxalyl chloride | Sigma Aldrich | O8801 | CAS 79-37-8 |
| Propargylamine hydrochloride 95% | Sigma Aldrich | P50919 | CAS 15430-52-1 |
| Copper(I) iodide | Sigma Aldrich | 3140 | CAS 7681-65-4 |
| Sodium ascorbate | Sigma Aldrich | Y0000039 | CAS 134-03-2 |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | |
| Dialysis Membrane | Spectrum Laboratories, Inc. | 132725 | Spectra/Por 3 Dialysis Membrane Standard RC Tubing MWCO: 3.5 kD |
References
- Slaughter, B. V., Khurshid, S. S., Fisher, O. Z., Khademhosseini, A., Peppas, N. A. Hydrogels in Regenerative Medicine. Adv. Mater. 21 (32-33), 3307-3329 (2009).
- Rossi, F., Perale, G., Papa, S., Forloni, G., Veglianese, P. Current options for drug delivery to the spinal cord. Expert Opin. Drug Deliv. 10 (3), 385-396 (2013).
- Huebsch, N., et al. Harnessing traction-mediated manipulation of the cell/matrix interface to control stem-cell fate. Nat. Mater. 9 (6), 518-526 (2010).
- Mothe, A. J., Tam, R. Y., Zahir, T., Tator, C. H., Shoichet, M. S. Repair of the injured spinal cord by transplantation of neural stem cells in a hyaluronan-based hydrogel. Biomaterials. 34 (15), 3775-3783 (2013).
- Khetan, S., et al. Degradation-mediated cellular traction directs stem cell fate in covalently crosslinked three-dimensional hydrogels. Nat. Mater. 12 (5), 458-465 (2013).
- Ashley, G. W., Henise, J., Reid, R., Santi, D. V. Hydrogel drug delivery system with predictable and tunable drug release and degradation rates. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110 (6), 2318-2323 (2013).
- Rossi, F., van Griensven, M. Polymer Functionalization as a Powerful Tool to Improve Scaffold Performances. Tissue Eng. Part A. 20 (15-16), 2043-2051 (2014).
- Gould, S. T., Darling, N. J., Anseth, K. S. Small peptide functionalized thiol-ene hydrogels as culture substrates for understanding valvular interstitial cell activation and de novo tissue deposition. Acta Biomater. 8 (9), 3201-3209 (2012).
- Azagarsamy, M. A., Anseth, K. S. Wavelength-Controlled Photocleavage for the Orthogonal and Sequential Release of Multiple Proteins. Angew. Chem. Int. Edit. 52 (51), 13803-13807 (2013).
- Larrañeta, E., et al. Microwave-Assisted Preparation of Hydrogel-Forming Microneedle Arrays for Transdermal Drug Delivery Applications. Macromol. Mater. Eng. 300 (6), 586-595 (2015).
- Cook, J. P., Goodall, G. W., Khutoryanskaya, O. V., Khutoryanskiy, V. V. Microwave-Assisted Hydrogel Synthesis: A New Method for Crosslinking Polymers in Aqueous Solutions. Macromol. Rapid Comm. 33 (4), 332-336 (2012).
- Perale, G., et al. Multiple drug delivery hydrogel system for spinal cord injury repair strategies. J. Control. Release. 159 (2), 271-280 (2012).
- Rossi, F., Perale, G., Storti, G., Masi, M. A Library of Tunable Agarose Carbomer-Based Hydrogels for Tissue Engineering Applications: The Role of Cross-Linkers. J. Appl. Polym. Sci. 123 (4), 2211-2221 (2012).
- Frith, J. E., et al. An injectable hydrogel incorporating mesenchymal precursor cells and pentosan polysulphate for intervertebral disc regeneration. Biomaterials. 34 (37), 9430-9440 (2013).
- Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. Click chemistry: Diverse chemical function from a few good reactions. Angew. Chem. Int. Edit. 40 (11), (2001).
- Sacchetti, A., Mauri, E., Sani, M., Masi, M., Rossi, F. Microwave-assisted synthesis and click chemistry as simple and efficient strategy for RGD functionalized hydrogels. Tetrahedron Lett. 55 (50), 6817-6820 (2014).
- Ossipov, D. A., Hilborn, J. Poly(vinyl alcohol)-based hydrogels formed by "click chemistry". Macromolecules. 39 (5), 1709-1718 (2006).
- Truong, V., Blakey, I., Whittaker, A. K. Hydrophilic and Amphiphilic Polyethylene Glycol-Based Hydrogels with Tunable Degradability Prepared by "Click" Chemistry. Biomacromolecules. 13 (12), 4012-4021 (2012).
- Hou, R. Z., et al. New synthetic route for RGD tripeptide. Prep. Biochem. Biotechnol. 36 (3), 243-252 (2006).
- Rossi, F., Chatzistavrou, X., Perale, G., Boccaccini, A. R. Synthesis and Degradation of Agar-Carbomer Based Hydrogels for Tissue Engineering Applications. J. Appl. Polym. Sci. 123 (1), 398-408 (2012).
- Mauri, E., Rossi, F., Sacchetti, A. Tunable drug delivery using chemoselective functionalization of hydrogels. Mater. Sci. Eng. C. 61, 851-857 (2016).
- Joaquin, A., Peppas, N. A., Zoldan, J. Hydrogel Polymer Library for Developing Induced Pluripotent Stem Cell Derived Cardiac Patches. Tissue Eng. Part A. 20, S55-S55 (2014).
- Rossi, F., et al. Tunable hydrogel-Nanoparticles release system for sustained combination therapies in the spinal cord. Colloids Surf. B Biointerfaces. 108, 169-177 (2013).
- Kolb, H. C., Sharpless, K. B. The growing impact of click chemistry on drug discovery. Drug Discov. Today. 8 (24), 1128-1137 (2003).
- Ossipov, D. A., Yang, X., Varghese, O., Kootala, S., Hilborn, J. Modular approach to functional hyaluronic acid hydrogels using orthogonal chemical reactions. Chem. Commun. 46 (44), 8368-8370 (2010).
- Anderson, S. B., Lin, C. C., Kuntzler, D. V., Anseth, K. S. The performance of human mesenchymal stem cells encapsulated in cell-degradable polymer-peptide hydrogels. Biomaterials. 32 (14), 3564-3574 (2011).
- Caron, I., et al. A new three dimensional biomimetic hydrogel to deliver factors secreted by human mesenchymal stem cells in spinal cord injury. Biomaterials. 75, 135-147 (2016).
- Lee, J. W., Kim, H., Lee, K. Y. Effect of spacer arm length between adhesion ligand and alginate hydrogel on stem cell differentiation. Carbohyd. Polym. 139, 82-89 (2016).
- Liu, Y., Fan, Z., Wang, Y., Yu, L. Controlled Release of Low Molecular Protein Insulin-like Growth Factor-1 through Self-Assembling Peptide Hydrogel with Biotin Sandwich Approach. J.Biomed. Eng. 32 (2), 387-392 (2015).
