Introduction
Les hydrogels sont des réseaux tridimensionnels formés par des polymères réticulés hydrophiles, qui sont naturelles ou synthétiques, et caractérisé par une structure tridimensionnelle particulière. Ces dispositifs sont de plus en plus attrayante dans les domaines biomédical de délivrance de médicaments, l' ingénierie tissulaire, les porteurs du gène et des capteurs intelligents 1,2. En effet, leur teneur élevée en eau, ainsi que leurs propriétés rhéologiques et mécaniques rendent les candidats aptes à imiter microenvironnement des tissus mous et les rendre des outils efficaces pour la cytokine soluble dans l'eau ou la livraison de facteur de croissance. Un de l'utilisation la plus prometteuse est comme un biomatériau injectable portant des cellules et des composés bioactifs. Les hydrogels peuvent améliorer la survie des cellules et de la tige de commande le destin des cellules en maintenant et délivrer précisément des signaux de régulation de cellules souches d'une manière pertinente physiologique, comme observé in vitro et dans des expériences in vivo 3,4. Le principal avantage est la possibilitéà maintenir les cellules injectées dans la zone d'inoculation (in situ), ce qui réduit la quantité de cellules qui quitte la zone extravasates et dans le torrent circulatoire, la migration de tout le corps et la perte de l'objectif visé 5. La stabilité des réseaux tridimensionnels d' hydrogel est due à ses sites de reticulation, formées par des liaisons covalentes ou des forces de cohésion entre les chaînes de polymère 6.
Dans ce cadre, la chimie sélective orthogonale appliquée aux chaînes de polymère est un outil polyvalent capable d'améliorer les performances d' hydrogel 7. En effet, la modification de polymères avec des groupes chimiques appropriés peut aider à fournir des propriétés mécaniques et chimiques appropriées, physiques et d'améliorer la viabilité des cellules et leur utilisation dans la formation des tissus. De la même façon, parmi les techniques de charger des cellules ou des facteurs de croissance dans la matrice de gel, l'utilisation du peptide RGD permet l'amélioration de l'adhérence cellulaire et la survie. RGD est un tripeptide composéde l' arginine, la glycine et l' acide aspartique, qui est de loin le plus efficace et souvent employé tripeptide en raison de sa capacité à traiter plus d'un récepteur d'adhésion cellulaire et son effet biologique sur l' ancrage des cellules, le comportement et la survie de 8,9. Dans ce travail, la synthèse des hydrogels RGD-fonctionnalisé est étudiée dans le but de concevoir des réseaux caractérisés par des propriétés biochimiques suffisantes pour un microenvironnement cellulaire hospitalier.
L'utilisation d' un rayonnement micro - ondes dans la synthèse de l' hydrogel propose une procédure simple pour minimiser les réactions secondaires et d' obtenir des taux et des rendements de réaction plus élevés dans une période de temps plus courte par rapport aux procédés thermiques classiques 10. Cette méthode ne nécessite pas d' étapes de purification et des rendements des hydrogels stériles en raison des interactions entre les polymères et l'absence de solvant organique dans le système réactionnel 11. Par conséquent, il garantit un pourcentage élevé de RGD liés au réseau polymère, car aucun modificateurfications sont nécessaires pour les groupes chimiques de polymères impliqués dans la formation de gel. Les groupes carboxyles, de l'AAP et le carbomère, et les groupes hydroxyle, de PEG et d'agarose, donnent lieu à l'hydrogel structure tridimensionnelle par une réaction de polycondensation. Les polymères mentionnés sont utilisés pour la synthèse d'hydrogels dans la moelle lésion de la moelle 12 réparation des traitements. Ces dispositifs, tel que rapporté dans les précédents travaux 13,14, montrent une biocompatibilité élevée ainsi que des propriétés mécaniques et physico - chimiques qui ressemblent à celles de nombreux tissus vivants et dans la nature thixotrope. De plus, ils restent localisés in situ, dans la zone d'injection.
Dans ce travail, des groupes carboxyle PAA sont modifiés avec un alcyne (figure 1), et un composé RGD azoture est synthétisé en exploitant la réactivité du groupe terminal tripeptidique -NH 2 avec un composé chimique préparée avec la structure (CH 2) n - N 3 (<strong> Figure 2). Par la suite, l'AAP modifiée réagit avec le dérivé RGD-azoture par CuAAC clic réaction 15-17 (Figure 3). L'utilisation d'un cuivre (I) catalyseur conduit à d'importantes améliorations tant dans la vitesse de réaction et la régiosélectivité. La réaction CuAAC est largement utilisé dans la synthèse organique et en science polymère. Elle combine une efficacité élevée et une grande tolérance aux groupes fonctionnels, et il est affecté par l'utilisation de solvants organiques. Une sélectivité élevée, un temps de réaction rapide et une procédure de purification simple , permettent l'obtention de polymères en étoile, des copolymères séquencés ou des chaînes de greffage des fragments souhaités 18. Cette stratégie de clic permet de modifier des polymères après polymérisation pour personnaliser les propriétés physicochimiques selon l'application biochimique final. Les conditions expérimentales sont facilement reproductibles CuAAC (la réaction est insensible à l'eau, tandis que l'oxydation du cuivre peut se produire très peu), et la nature detriazole formé assure la stabilité du produit. L'utilisation du métal de cuivre peut être considéré comme un point critique en raison de ses effets toxiques potentiels sur les cellules et dans le micro-environnement biologique, mais la dialyse est utilisée comme méthode de purification pour permettre l'élimination complète des résidus catalytiques. Enfin, PAA modifié RGD est utilisé dans la synthèse de l' hydrogel (figure 4) et les propriétés physicochimiques des réseaux résultants sont étudiés, afin de vérifier la fonctionnalité potentielle de ces systèmes comme des cellules ou des médicaments porteurs.
Figure 1: PAA modifié la synthèse des alcyne Un schéma de PAA fonctionnalisation avec le groupe alcyne;. "n" indique les monomères avec un groupe carboxyle réagissant avec propargylamine. S'il vous plaît cliquer ici pour voirune version plus grande de cette figure.
Figure 2:.. RGD-azoture synthèse La synthèse du dérivé RGD-azoture S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Cliquez sur le schéma de réaction de clic réaction entre un dérivé RGD-azoture et alcyne-PAA.. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Hydrogel synthesis. RGD fonctionnalisé procédure de synthèse d'hydrogel. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Protocol
Remarque: Les produits chimiques sont utilisés tels que reçus. RGD linéaire est acheté, mais il peut être préparé par synthèse peptidique en phase solide Fmoc - type 16,19. Les solvants sont de qualité analytique. La dialyse nécessite l'utilisation d' une membrane avec une Mp de coupure égal à 3500 Da. Les composés synthétisés sont caractérisés par les spectres 1 H - RMN enregistré sur un spectromètre à 400 MHz en utilisant du chloroforme (CDCl 3) ou d' oxyde de deutérium (D 2 O) en tant que solvants, et les déplacements chimiques sont rapportés en valeurs S en parties par million. En outre, les hydrogels sont soumis à une analyse FT-IR en utilisant une technique KBr de granulés et de leur caractérisation physique implique des études de gélification évalués en utilisant le tube à essai inversé à 37 ° C.
1. Synthèse du chlorure de 4-1 Azidobutanoyl
- Dissoudre 500 mg d'acide 4-azidobutanoic (3,90 mmol) dans 10 ml de dichlorométhane et 0,5 ml de diméthylformamide.
- On refroidit la solution à 0 ° C,, En utilisant un bain de glace.
- Ajouter 505 pl de chlorure d'oxalyle (5,85 mmol) dans 5 ml de dichlorométhane et on ajoute lentement goutte à goutte au système réactionnel, tout en agitant.
- Au bout de 1 h à 0 ° C en utilisant un bain de glace, le retour à la température ambiante.
- On élimine le solvant sous pression réduite en utilisant un évaporateur rotatif.
- Caractériser le produit obtenu par spectroscopie 1 H-RMN, la dissolution de l'échantillon dans CDCl 3 16.
2. Synthèse de RGD-azoture Derivative 2
- Dissoudre 50 mg de RGD (0,145 mmol) dans 1 ml de 1 M de NaOH.
- Dissoudre 24 mg de 1 (0,16 mmol) dans 2 ml de tétrahydrofuranne.
- Ajouter toute la solution RGD à la solution 1 , goutte à goutte , à 0 ° C en utilisant un bain de glace.
- Retour à la température ambiante et agitation pendant une nuit.
- Ajouter 1 ml de 1 M HCl.
- On élimine le solvant sous pression réduite en utilisant un évaporateur rotatif.
- Caractériser l'obtained produit par spectroscopie 1 H-RMN, la dissolution de l'échantillon dans D 2 O 16.
3. PAA Acétylène Modification 3
- Dissoudre 200 mg de 35% p / p de la solution de PAA (2,8 mmol) dans 15 ml d'eau distillée.
- Ajouter 15,4 mg de chlorhydrate de propargylamine (0,20 mmol).
- Dissoudre 42,8 mg d'hydrate de 1-hydroxybenzotriazole (HOBt, 0,28 mmol) dans 14 ml d'un mélange 1: 1 v / v d'acétonitrile: solution d'eau distillée en chauffant à 50 ° C.
- Ajouter la totalité de la solution de HOBt à la solution de PAA à la température ambiante.
- Ajouter 53,6 mg de ethyldimethylaminopropylcarbodiimide (EDC, 0,28 mmol) au mélange réactionnel.
- En utilisant du HCl 1 M pour ajuster le pH à 5,5 et on agite le système réactionnel pendant une nuit à température ambiante.
- Dialyser la solution. Dissoudre 11,2 g de chlorure de sodium dans 2 litres d'eau distillée, puis ajouter 0,2 ml de 37% p / p de HCl. Dialyser la solution en utilisant une membrane avec un M w coupure de 3,5 kDa.
- Perform dialyse pendant trois jours. Changer la solution de dialyse par jour avec 2 litres d'eau distillée fraîchement préparée contenant 0,2 ml de 37% p / p de HCl.
- Conserver la solution finale à -80 ° C. Lyophiliser dans un lyophilisateur selon les protocoles du fabricant.
- Caractériser le polymère fonctionnalisé par spectroscopie 1 H-RMN, la dissolution de l'échantillon dans D 2 O 16.
4. Synthèse du PAA-RGD Polymer 4
- Dissoudre 78 mg de PAA modifié alcyne 3 (1,083 mmol) dans 10 ml d'eau distillée.
- Dissoudre 25 mg du dérivé azoture 2 RGD (0,0722 mmol) dans 5 ml de tétrahydrofuranne.
- Ajouter toute la solution RGD à la solution polymère.
- Ajouter 2,2 mg d'iodure de cuivre (0,0116 mmol) et 2,2 mg d'ascorbate de sodium (0,0111 mmol).
- Reflux le mélange résultant pendant une nuit à 60 ° C, sous agitation.
- On refroidit le mélange à 25 ° C.
- Dialyze la solution. Dissoudre 11,2 g de chlorure de sodium dans 2 litres d'eau distillée, puis ajouter 0,2 ml de 37% p / p de HCl. Dialyser la solution en utilisant une membrane avec un M w coupure de 3,5 kDa.
- Effectuer une dialyse pendant trois jours. Changer la solution de dialyse par jour avec 2 litres d'eau distillée fraîchement préparée contenant 0,2 ml de 37% p / p de HCl.
- Conserver la solution finale à -80 ° C. Lyophiliser dans un lyophilisateur selon les protocoles du fabricant.
- Caractériser le produit obtenu par spectroscopie 1 H-RMN, la dissolution de l'échantillon dans D 2 O 16.
5. RGD fonctionnalisés Hydrogel Synthèse
- Préparer le PBS. Dissoudre 645 mg de sel de PBS dans 50 ml d'eau distillée.
- Mélanger 40 mg de carbomère et de 10 mg de PAA fonctionnalisés 4 dans 9 ml de PBS (étape 5.1), à la température ambiante, jusqu'à dissolution complète (30 minutes).
- Ajouter 400 mg de PEG à la solution et maintenir l'agitation pendant 45 min.
- Arrêtez l'agitation et permettre au système de se contenter de 30 min.
- Utiliser NaOH 1 N pour ajuster le pH à 7,4.
- 5 ml du mélange obtenu, on ajoute 25 mg de poudre d'agarose.
- Irradier le système avec un rayonnement micro-onde à 500 W jusqu'à ce que l'ébullition, pendant une durée généralement comprise entre 30 s et 1 min, et chauffer électromagnétiquement jusqu'à 80 ° C.
- Laisser le mélange est exposé à la température ambiante jusqu'à ce que sa température tombe à 50 ° C et on ajoute 5 ml de PBS (étape 5.1), afin d'obtenir une solution à un rapport 1: 1 volumétrique.
- Préparer multipuits 12 cylindres en acier de la plaque contenant un diamètre de 1,1 cm.
- Prendre des aliquotes de 500 ul de la solution et placez-les dans chacun des cylindres en acier.
- Laisser au repos pendant 45 min jusqu'à ce que la gélification complète du système.
- Retirez les cylindres utilisant une pince en acier inoxydable pour obtenir les hydrogels.
6. Chargement des outils thérapeutiques (médicaments ou cellules)
- Répétez steps 5.1-5.7.
- Lorsque le mélange (déjà à l'état sol) atteint 37 ° C, ajouter 5 ml de la solution contenant la solution de médicament ou de la culture cellulaire désirée, afin d'obtenir un système final à un rapport 1: 1 volumétrique.
- Répétez les étapes 05.09 à 05.12 pour obtenir des réseaux polymères avec biocomposés physiquement piégées dans le gel.
7. Hydrogel Caractérisation
- Analyse FT-IR
- Après la formation de gel, faire tremper un des hydrogels synthétisées dans 2,5 ml d'eau distillée pendant 24 heures.
- Retirez les milieux aqueux où hydrogel est immergée et congelez-sec avec N2 liquide.
- Laminé l'échantillon d'hydrogel selon la technique de pastille de KBr.
- Ajouter une spatule pleine de KBr dans un mortier en agate. Prenez une petite quantité d'échantillon d'hydrogel (environ 0,1-2% du montant KBr, ou juste assez pour couvrir la pointe de la spatule) et mélanger avec la poudre KBr.
- Broyer le mélange jusqu'à ce que la poudre est fine et homogène. </ Li>
- Utilisez le kit de pastille de KBr pour former le culot IR. Appuyez sur la poudre à l'aide d'une presse manuelle de laboratoire: pendant 3 min à la capacité de pression égale à 5 tonnes, puis pendant 3 min à la capacité de pression de 10 tonnes.
- Relâchez la pression pour obtenir le culot final comme homogène et transparente en apparence. Insérez la pastille dans le porte-échantillon d'IR et d' exécuter le spectre 16.
- Des études de gélification
- Remplir 2 ml microtube avec 900 pi de PBS et équilibrer à 37 ° C.
- Ajouter 100 ul de la solution de polymère préparée pour former l'hydrogel et incuber à 37 ° C.
- Inversez le tube et observer si le gel coule à 1, 2, 5, 10 et 20 min. Enregistrer l'heure à laquelle le gel ne coule pas comme le temps de gélification.
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Representative Results
Le dérivé PAA alcyne est efficacement synthétisé à partir de l' acide polyacrylique et propargylamine, comme le montre la figure 1 , où n étiquettes les monomères dont les groupes carboxyle réagir avec l'amine. L'identité du produit est confirmée par spectroscopie de 1H-RMN. La figure 5 montre le spectre de 1H-RMN de PAA modifiés par triple liaison.
Figure 5: 1 spectre H-RMN de l'AAP alcyne modifiée Le signal lié à la fraction alcyne est en surbrillance.. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Les signaux de la chaîne de polymère peut être observée dans l'intervalle de 2,75 à 1,50 ppm; alors un pic à 2,8 0 ppm, représentant de l'alcyne de H et un pic à 4,20 ppm, par rapport au 2 H du CH 2 caractérisent le groupement propargyle. Cela confirme que l'AAP a été correctement modifié. L'évaluation du degré de fonctionnalisation alcyne a été réalisée en intégrant l'aire sous les pics de l' AAP (fixés à 3,00, en fonction du nombre d'atomes d'hydrogène par monomère) et de groupement propargyle, comme cela est illustré sur la figure 5. Le degré de fonctionnalisation f est calculé comme suit:
représente la surface intégrale du résidu de propargyle, la somme de la zone H de l'alcyne (étiqueté 
) Et la zone -CH 2 (indiquée par 
), tandis queion "src =" / files / ftp_upload / 54445 / 54445eq5.jpg "/> se réfère à la zone intégrale des signaux de polymère. Le degré de fonctionnalisation est calculé à 10% et il est considérer satisfaisante selon la synthèse d'hydrogel, où AAP doit réagir par l' intermédiaire de ses groupes carboxyle résiduels pour former le réseau 3D. Un rendement quantitatif est obtenu pour le 16 polymère modifié.
D'une manière similaire, la figure 6 représente le spectre RMN-1H du produit après la réaction entre le clic CuAAC l'AAP modifiée alcyne et azoture RGD. Le pic du triazole formé à 8,15 ppm confirme que la réaction se produit dans un rendement quantitatif et RGD est fortement liée aux chaînes de l' AAP. La figure 6 illustre l' ensemble des signaux caractéristiques de la chaîne de PAA et de la RGD.
Figure 6:1 spectre RMN ' H du RGD lié à l' AAP. Le signal de triazole est indiquée (marquée «A»). Fonctionnalisation polymère RGD via CuAAC clic réaction est effectuée. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Les hydrogels RGD fonctionnalisés sont préparés par reticulation chimique des quatre polymères (PAA, carbomer, de l'agarose et PEG) par polymérisation radicalaire assistée par micro-ondes. Chauffage à 80 ° C conduit à une mobilité plus élevée macromère, et améliore ainsi les connexions à courte distance entre les groupes carboxyle et hydroxyle des polymères. La réaction d'estérification a lieu entre ces groupes fonctionnels et produit des réseaux locaux appelés "microgels".
Comme le produit de polycondensation, la viscosité du système augmente continuellement, wien que la probabilité d'interaction entre les sites réactifs macromères diminue. Néanmoins, les groupes plus proches fonctionnels interagissent toujours efficacement en raison d'une mobilité plus lente. L'état physico-chimique résultante est caractérisée par une "soudure" entre les surfaces de microgel qui produit la dernière macrostructure 3D de l'hydrogel. L'estérification, la liaison hydrogène et carboxylation amener les chaînes polymères statistiquement plus étroite, ce qui crée une structure hétérogène stable. Le système résultant présente un sol / gel, et le comportement de sa transition vers un état de gel à moins de 5 min. Cet intervalle de temps est rapporté que le temps de gélification.
La nature chimique des hydrogels RGD-fonctionnalisés est étudiée en utilisant l' analyse FT-IR. La figure 7 montre la comparaison entre les spectres FT-IR du composé RGD-azoture (ligne verte), l'hydrogel synthétisé sans fonctionnalisation RGD (ligne noire), et l'hydrogel avec une modification de peptide (ligne bleue). La spécification d'hydrogeltra sont tous deux caractérisés par un signal large dans les 3,600-3,200 cm -1 gamme, représentatif de la vibration d' élongation des liaisons résiduelles OH et par un pic autour de 2940 cm -1 du tronçon de CH. La validation que l' estérification se produit entre les groupes carboxyle et hydroxyle polymère est donnée par les pics d' environ 1600 cm -1 et 1400 cm -1, ce qui correspond respectivement à l'étirement symétrique et asymétrique du groupement CO 2. Ces pics sont plus visibles dans le spectre de l'hydrogel non fonctionnalisés, tandis que dans le spectre RGD hydrogel, ils sont partiellement recouvertes par les signaux indiqués sous forme de bandes d'amide I et II.
Figure 7:. Comparaison des spectres FT-IR spectres FT-IR de RGD (ligne verte), hydrogel sans fonctionnalisation RGD (ligne noire) et hydrogel RGD fonctionnalisé (ligne bleue). lesignal lié à l'amide RGD est indiqué. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
L'étirement de C = O, appelée bande amide I ( "Amide I» dans la figure 7), présente un pic à 1650 cm -1 dans le spectre de tripeptide et elle est décalée à environ 1,670 cm - 1 dans l'échantillon de l' hydrogel RGD . La flexion de NH, par rapport à l' amide bande II ( "Amide II" sur la figure 7) peut être enregistré avec le signal d' environ 1,550 cm -1 dans le spectre RGD et il est également reconnaissable dans l'échantillon d'hydrogel, à environ 1600 cm - 1. Parce qu'il n'y a pas de composants amide dans la formulation d'hydrogel classique, la présence de pics de nature amidique suggère que l'AAP est vraiment fonctionnalisée par RGD et il est capable de former un hydrogel avec des sites peptidiques au sein du réseau polymère.
Le spectre FT-IR hydrogel montre également des pics liés à la vibration d' élongation du COC glycosidique (900-1,000 cm -1 PO) entre les unités de monosaccharide de l'agarose et les groupes ester.
Pour obtenir un aperçu de la structure 3D et des propriétés physiques et mécaniques de ces hydrogels, analyse SEM, gélification, cinétique de gonflement et des études rhéologiques sont effectuées, comme indiqué dans les travaux précédents 13,20. Résultats MEB (figure 8) montrent que les hydrogels sont caractérisés par une structure microscopique complexe avec des pores plus gros contenant de petits pores et certains réseaux fibrillaires sur les parois des pores. En outre, la plupart des pores sont interconnectés. La structure enchevêtrée est similaire au réseau 3D d'hydrogels préparés de la même manière, mais sans fonctionnalisation RGD. Ceci démontre que le RGD ne modifie pas le réseau polymère. En utilisant le test de tube à essai inversé, l'hydrogel ssolidifie amplement à moins de 5 min, comme observé dans l'échantillon d'hydrogel sans RGD fonctionnalisation 21. Ce temps de gélification court souligne sa pertinence pour des applications biomédicales.
Figure 8:.. Images analyse SEM MEB montrent la morphologie d'un échantillon de RGD-fonctionnalisé d'hydrogel (A) et un hydrogel sans fonctionnalisation (B) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Le rapport de gonflement à l' équilibre indique la capacité d'absorber et de retenir une grande quantité d'eau et il est l' une des principales caractéristiques des systèmes d'hydrogel 20,22. Les échantillons analysés présentent une enflure rapide cinétique et ils atteignent un gonflement d'équilibre dans la première heure. Leur houleing valeur d'équilibre Q est rapporté dans nos travaux antérieurs 16 et il est comparable à la valeur obtenue par l' analyse des hydrogels sans RGD, ce qui confirme que le tripeptide est intégré au réseau polymère et ne crée pas une grande gêne au processus de gélification.
Avec les études rhéologiques, et le module de stockage de gel (type G) se trouve être d' environ un ordre de grandeur supérieur au module de perte (G''), ce qui indique un matériau 23 élastique , plutôt que visqueuses et les deux sont sensiblement indépendantes de la fréquence. Des valeurs similaires de G'et G'' sont enregistrées avec l'échantillon de gel sans une modification de peptide 16. Ceci démontre que la présence de RGD au sein du réseau polymère ne modifie pas les propriétés rhéologiques du matériau, en conservant les caractéristiques propres concurrents à un système injectable pour une application biomédicale.
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Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier le professeur Maurizio Masi à une discussion fructueuse et Miss Chiara Allegretti pour l'édition de langue. La recherche des auteurs est soutenu par Bando Giovani Ricercatori 2010 (Ministero della Salute GR-2010- 2312573).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(acrylic acid) solution average Mw ~100,000, 35 wt% in H2O | Sigma Aldrich | 523925 | CAS 9003-01-4 |
| Poly(ethylene glycol) 2,000 | Sigma Aldrich | 84797 | CAS 25322-68-3 |
| Carbomeer 974P | Fagron | 1387083 | |
| Agarose | Invitrogen Corp. | 16500-500 | UltraPure Agarose |
| RGD peptide | abcam | ab142698 | |
| 4-azidobutanoic acid | Aurum Pharmatech | Z-2421 | CAS 54447-68-6 |
| Oxalyl chloride | Sigma Aldrich | O8801 | CAS 79-37-8 |
| Propargylamine hydrochloride 95% | Sigma Aldrich | P50919 | CAS 15430-52-1 |
| Copper(I) iodide | Sigma Aldrich | 3140 | CAS 7681-65-4 |
| Sodium ascorbate | Sigma Aldrich | Y0000039 | CAS 134-03-2 |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | |
| Dialysis Membrane | Spectrum Laboratories, Inc. | 132725 | Spectra/Por 3 Dialysis Membrane Standard RC Tubing MWCO: 3.5 kD |
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