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Bioengineering

Die Synthese von RGD-funktionalisierten Hydrogele als Werkzeug für therapeutische Anwendungen

Published: October 7, 2016 doi: 10.3791/54445
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemistry, Materials and Chemical Engineering "Giulio Natta", Politecnico di Milano

Introduction

Hydrogele sind dreidimensionale Netzwerke durch hydrophile vernetzte Polymere gebildet werden, die natürlich oder synthetisch sind, und die durch eine ausgeprägte dreidimensionale Struktur aus. Diese Geräte sind zunehmend attraktiv in den biomedizinischen Bereichen Medikamentenabgabe, Tissue Engineering, Genträger und intelligente Sensoren 1,2. Tatsächlich ihres hohen Wassergehaltes sowie ihre rheologischen und mechanischen Eigenschaften machen sie geeignete Kandidaten Weichgewebe Mikroumgebungen zu imitieren und sie wirksame Werkzeuge für wasserlösliche Zytokin oder Wachstumsfaktor-Lieferung. Einer der vielversprechendsten ist die Verwendung als injizierbare Biomaterial Zellen und bioaktiven Verbindungen trägt. Hydrogele können das Überleben von Zellen und Kontrollstammzell Schicksal durch Halten und präzise Abgabe Stammzellregulationssignale in einer physiologisch relevanten Art und Weise verbessern, wie 3,4 in in vitro und in in vivo Experimenten beobachtet. Der führende Vorteil hierbei ist die Möglichkeit,injizierten Zellen innerhalb der Zone der Impfung (in situ), Minimierung der Menge an Zellen zu erhalten, die das Gebiet und Extravasate in den Kreis Strom verlässt, über den ganzen Körper der Migration und dem angestrebten Ziel 5 zu verlieren. Die Stabilität der dreidimensionalen Netzwerke Hydrogels ist aufgrund seiner Vernetzungsstellen, gebildet durch kovalente Bindungen oder Kohäsionskräfte zwischen den Polymerketten 6.

In diesem Rahmen angewendet orthogonal selektive Chemie an Polymerketten ist ein vielseitiges Werkzeug in der Lage 7 Hydrogel Leistungen zu verbessern. Tatsächlich könnte die Modifikation von Polymeren mit geeigneten chemischen Gruppen helfen, geeignete chemische, physikalische und mechanische Eigenschaften bereitzustellen Lebensfähigkeit der Zellen und deren Verwendung in der Gewebebildung zu verbessern. In gleicher Weise zu den Techniken Zellen oder Wachstumsfaktoren innerhalb der Gelmatrix, die Verwendung des RGD-Peptid ermöglicht Verbesserungen in der Zelladhäsion und das Überleben zu laden. RGD ist ein Tripeptid zusammengesetztvon Arginin, Glycin und Asparaginsäure, die bei weitem das wirksamste und oft eingesetzt Tripeptid aufgrund seiner Fähigkeit , mehr als eine Zelladhäsion - Rezeptor und seine biologische Wirkung auf die Zellverankerung, Verhalten und Überleben 8,9 zu adressieren ist. In dieser Arbeit wird die Synthese von RGD-funktionalisierten Hydrogele mit dem Ziel der Netzwerke durch ausreichende biochemische Eigenschaften für eine gastliche Zelle Mikro gekennzeichnet Gestaltung studiert.

Die Verwendung von Mikrowellenstrahlung in Hydrogel - Synthese bietet ein einfaches Verfahren , um Nebenreaktionen zu minimieren und höhere Reaktionsgeschwindigkeiten und Ausbeuten in kürzerer Zeit im Vergleich zu den herkömmlichen thermischen Verfahren 10 erhalten. Dieses Verfahren erfordert keine Reinigungsstufen und Ausbeuten sterile Hydrogele aufgrund der Wechselwirkungen der Polymere und der Abwesenheit eines organischen Lösungsmittels in dem Reaktionssystem 11. Daher gewährleistet es einen hohen Prozentsatz von RGD gebunden an das polymere Netzwerk, da kein modkationen werden den Polymer chemischen Gruppen erforderlich Gelbildung beteiligt. Carboxygruppen, von PAA und Carbomer, und Hydroxylgruppen von PEG und Agarose, führen zu dem Hydrogel dreidimensionale Struktur durch eine Polykondensationsreaktion. Die genannten Polymere werden für die Synthese von Hydrogelen in die Rückenmarksverletzung Reparaturbehandlungen 12 verwendet. Diese Geräte, wie in den vorangegangenen berichtet arbeitet 13,14, zeigen eine hohe Biokompatibilität sowie mechanischen und physikalisch - chemische Eigenschaften, die denen von vielen lebenden Geweben und in thixotropen Natur ähneln. Außerdem bleiben sie in situ lokalisiert in der Zone der Injektion.

In dieser Arbeit PAA Carboxylgruppen mit einem Alkin - Einheit (1) modifiziert und eine RGD-Azid - Verbindung synthetisiert wird , die Reaktivität des Tripeptids Endgruppe NH 2 mit einer vorbereiteten chemische Verbindung mit der Struktur zu nutzen (CH 2) n - N 3 (<strong> Abbildung 2). Anschließend reagiert das modifizierte PAA mit dem RGD-Azid - Derivat durch CuAAC Klick - Reaktion 15-17 (Abbildung 3). Die Verwendung eines Kupfer (I) -Katalysator führt zu wesentlichen Verbesserungen in sowohl die Reaktionsgeschwindigkeit und die Regioselektivität. Die CuAAC Reaktion wird in der organischen Synthese und in der Polymerwissenschaft weit verbreitet. Es verbindet einen hohen Wirkungsgrad und eine hohe Toleranz gegenüber den funktionellen Gruppen, und es ist unabhängig von der Verwendung von organischen Lösungsmitteln. Eine hohe Selektivität, eine schnelle Reaktionszeit und eine einfache Reinigungsverfahren ermöglichen die Gewinnung von Sternpolymeren, Blockcopolymere oder Ketten gewünschten Einheiten 18 Pfropfen. Dieser Klick-Strategie ermöglicht es, Polymere nach der Polymerisation zu modifizieren, um die physikalisch-chemischen Eigenschaften nach der endgültigen biochemischen Anwendung anpassen. Die CuAAC experimentellen Bedingungen sind leicht reproduzierbar (die Reaktion ist unempfindlich gegen Wasser, während Kupfer Oxidation minimal auftreten kann), und die Art dergebildet Triazol sorgt für Stabilität des Produkts. Die Verwendung von Kupfermetall kann ein kritischer Punkt, aufgrund seiner potentiellen toxischen Wirkung gegenüber Zellen und in der biologischen Mikroumgebung in Betracht gezogen werden, aber der Dialyse wird als Reinigungsverfahren verwendet, um die vollständige Entfernung von katalytischen Rückständen ermöglichen. Schließlich PAA modifizierte RGD in Hydrogel - Synthese (4) und die physikalisch - chemischen Eigenschaften der resultierenden Netzwerken verwendet wird untersucht, um die potentielle Funktionalität dieser Systeme als Zellen oder Drogen Träger zu überprüfen.

Abbildung 1
Abbildung 1: PAA modifizierte Alkin Synthese ein Schema PAA Funktionalisierung mit Alkin - Gruppe;. "n" gibt die Monomere mit Carboxylgruppe mit Propargylamin reagieren. Bitte klicken Sie hier um zu seheneine größere Version dieser Figur.

Figur 2
Abbildung 2:.. RGD-Azid - Synthese Die Synthese von RGD-Azid - Derivat Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3: Klicken Sie auf Reaktionsschema der Klick - Reaktion zwischen RGD-Azid - Derivat und Alkin-PAA.. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4: Hydrogele synthesis. RGD funktionalisierten Hydrogel - Syntheseverfahren. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Protocol

Anmerkung: Die verwendeten Chemikalien sind wie empfangen. Linear RGD gekauft wird , aber es kann durch Standard - Fmoc - Festphasen - Peptidsynthese 16,19 hergestellt werden. Lösungsmittel sind von analytischer Qualität. Die Dialyse erfordert die Verwendung von Membran mit einem M w cut-off gleich 3.500 Da. Die synthetisierten Verbindungen werden durch 1 H - NMR - Spektren wurden auf einem 400 MHz - Spektrometer unter Verwendung von Chloroform (CDCl 3) oder Deuteriumoxid (D 2 O) als Lösungsmittel, und die chemischen Verschiebungen sind angegeben als δ - Werte in ppm aufgezeichnet gekennzeichnet. Weiterhin sind Hydrogele unterworfen FT-IR-Analyse KBr Pellet-Technik und ihrer physikalischen Charakterisierung beinhaltet die Gelierung Studien untersucht unter Verwendung der invertierten Teströhrchen bei 37 ° C verwendet wird.

1. Synthese von 4-Azidobutanoyl Chloride 1

  1. Man löst 500 mg 4-azidobutanoic Säure (3,90 mmol) in 10 ml Dichlormethan und 0,5 ml Dimethylformamid gegeben.
  2. Die Lösung wird bei 0 ° C, Mit einem Eisbad.
  3. Hinzufügen 505 ul Oxalylchlorid (5,85 mmol) zu 5 ml Dichlormethan gelöst und langsam tropfenweise zu dem Reaktionssystem hinzuzufügen, während gerührt wurde.
  4. Nach 1 Stunde bei 0 ° C mit einem Eisbad, Rückkehr zur Raumtemperatur.
  5. Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck am Rotationsverdampfer.
  6. Charakterisieren des erhaltenen Produkts durch 1 H-NMR - Spektroskopie, um die Probe in CDCl 3 16 aufzulösen.

2. Synthese von RGD-Azid-Derivat 2

  1. Man löst 50 mg RGD (0,145 mmol) in 1 ml 1 M NaOH.
  2. Man löst 24 mg 1 (0,16 mmol) in 2 ml Tetrahydrofuran gegeben.
  3. Fügen Sie alle der RGD - Lösung zu Lösung 1 tropfenweise bei 0 ° C mit einem Eisbad.
  4. Rückkehr auf Raumtemperatur und rühre über Nacht.
  5. 1 ml 1 M HCl.
  6. Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck am Rotationsverdampfer.
  7. Charakterisieren Sie die obtained Produkts durch 1 H-NMR - Spektroskopie, Lösen der Probe in D 2 O 16.

3. PAA Alkin Modifikation 3

  1. Man löst 200 mg von 35% w / w PAA-Lösung (2,8 mmol) in 15 ml destilliertem Wasser.
  2. Hinzufügen 15,4 mg Propargylamin-hydrochlorid (0,20 mmol).
  3. Man löst 42,8 mg von 1-Hydroxybenzotriazol-hydrat (HOBt, 0,28 mmol) in 14 ml eines 1: 1 v / v Acetonitril: destilliertes Wasser-Lösung durch Erhitzen auf 50 ° C.
  4. Fügen alle der HOBt-Lösung PAA-Lösung bei Raumtemperatur.
  5. Hinzufügen, 53,6 mg Ethyldimethylaminopropylcarbodiimid (EDC, 0,28 mmol) zu dem Reaktionsgemisch.
  6. Verwenden Sie 1 M HCl, um den pH-Wert auf 5,5 und rührt das Reaktionssystem über Nacht bei Raumtemperatur einzustellen.
  7. Dialysieren der Lösung. Man löst 11,2 g Natriumchlorid in 2 l destilliertem Wasser und füge dann 0,2 ml 37% w / w HCl. Dialysieren der Lösung mit einer Membran mit einem M w cut-off von 3,5 kDa verwendet wird .
  8. Perform Dialyse für drei Tage. Ändern, um die Dialyselösung täglich mit 2 l frisch destilliertem Wasser hergestellt, das 0,2 ml 37% w / w HCl.
  9. Bewahren Sie die endgültige Lösung bei -80 ° C. Lyophilisieren es in einem Lyophilisator nach Herstellerprotokollen.
  10. Charakterisierung des funktionalisierten Polymers durch 1 H-NMR - Spektroskopie, Lösen der Probe in D 2 O 16.

4. Synthese von PAA-RGD Polymer 4

  1. Man löst 78 mg des modifizierten PAA Alkin 3 (1,083 mmol) in 10 ml destilliertem Wasser.
  2. Man löst 25 mg des RGD Azid 2 Derivat (0,0722 mmol) in 5 ml Tetrahydrofuran gegeben.
  3. Fügen alle der RGD Lösung der Polymerlösung.
  4. Hinzufügen 2,2 mg Kupferiodid (0,0116 mmol) und 2,2 mg Natriumascorbat (0,0111 mmol).
  5. Rückfluß der resultierenden Mischung über Nacht bei 60 ° C unter Rühren.
  6. Das Gemisch wird auf 25 ° C.
  7. Dialyze die Lösung. Man löst 11,2 g Natriumchlorid in 2 l destilliertem Wasser und füge dann 0,2 ml 37% w / w HCl. Dialysieren der Lösung mit einer Membran mit einem M w cut-off von 3,5 kDa verwendet wird .
  8. Führen Sie die Dialyse für drei Tage. Ändern, um die Dialyselösung täglich mit 2 l frisch destilliertem Wasser hergestellt, das 0,2 ml 37% w / w HCl.
  9. Bewahren Sie die endgültige Lösung bei -80 ° C. Lyophilisieren es in einem Lyophilisator nach Herstellerprotokollen.
  10. Charakterisieren des erhaltenen Produkts durch 1 H-NMR - Spektroskopie, Lösen der Probe in D 2 O 16.

5. RGD-funktionalisierten Hydrogel-Synthese

  1. Bereiten Sie die PBS. Man löst 645 mg PBS Salz in 50 ml destilliertem Wasser.
  2. Mischung 40 mg Carbomer und 10 mg funktionalisiertes PAA 4 in 9 ml PBS (Schritt 5.1), bei Raumtemperatur bis zur vollständigen Auflösung (30 min).
  3. In 400 mg PEG zur Lösung und halten für 45 min gerührt wurde.
  4. Halten Sie das Rühren und lassen Sie das System für 30 Minuten absetzen.
  5. Verwenden 1 N NaOH pH auf 7,4 einzustellen.
  6. Zu 5 ml der erhaltenen Mischung werden 25 mg Agarose-Pulver.
  7. Bestrahlen, das System mit Mikrowellenstrahlung bei 500 W bis zum Kochen, für eine Zeit, in der Regel zwischen 30 sec und 1 min, und elektromagnetisch erhitzen auf 80 ° C.
  8. Lassen Sie die Mischung auf Raumtemperatur ausgesetzt, bis die Temperatur auf 50 ° C ab, und mit 5 ml PBS (Schritt 5.1), um eine Lösung mit einer 1: 1 zu erhalten Volumenverhältnis.
  9. Bereiten Sie 12 Multi-Well-Platte mit Stahlzylinder mit einem Durchmesser von 1,1 cm.
  10. Nehmen Sie 500 ul Aliquots aus der Lösung und legen Sie sie auf jede Stahlzylinder.
  11. Lassen Sie für 45 Minuten bis zur vollständigen Gelieren des Systems in Ruhe.
  12. Entfernen Sie die Zylinder ein Edelstahl-Pinzette, um die Hydrogele erhalten.

6. Laden von Therapeutic Tool (Drug oder Zellen)

  1. Wiederholen Sie steps 5,1-5,7.
  2. Wenn die Mischung (die bereits im Sol-Zustand) 37 ° C erreicht, werden 5 ml der Lösung die gewünschte Arzneimittellösung oder Zellkultur enthält, um ein Endsystem zu einem 1: 1 zu erhalten Volumenverhältnis.
  3. Wiederholen Sie die Schritte 5,9-5,12 polymere Netzwerke mit Bioverbindungen physikalisch innerhalb des Gels eingeschlossen zu erhalten.

7. Hydrogels Charakterisierung

  1. FT-IR-Analyse
    1. Nach der Gelbildung, während 24 Stunden in 2,5 ml destilliertem Wasser eine der synthetisierte Hydrogele einweichen.
    2. Entfernen Sie die wässrigen Medien , wo Hydrogel untergetaucht ist und gefrier trocken mit flüssigem N 2.
    3. Laminat mit der Hydrogel-Probe gemäß KBr Pellet-Technik.
      1. Fügen Sie einen Spachtel voller KBr in einem Achatmörser. Nehmen Sie eine kleine Menge an Hydrogel-Probe (etwa 0,1 bis 2% des KBr Menge oder gerade genug, um die Spitze der Spachtel zu bedecken) und vermischen sich mit dem KBr-Pulver.
      2. Schleifen Sie die Mischung, bis das Pulver fein und homogen. </ Li>
      3. Verwenden Sie das KBr-Pellet-Kit das IR-Pellet zu bilden. Drücken Sie die Pulver eine manuelle Laborpresse: 3 min bei Druckkapazität in Höhe von 5 Tonnen und dann 3 min bei Druckkapazität von 10 Tonnen.
      4. Lassen Sie den Druck der endgültige Pellet als homogen und transparent im Aussehen zu erhalten. Legen Sie die Pellets in den IR - Probenhalter und führen Sie das Spektrum 16.
  2. Gelieren Studies
    1. Füllen 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 900 & mgr; l PBS und auf 37 ° C äquilibrieren.
    2. Füge 100 & mgr; l der hergestellten Polymerlösung, um das Hydrogel bilden, und Inkubieren bei 37 ° C.
    3. Drehen Sie das Röhrchen und beobachten, ob das Gel bei 1 fließt, 2, 5, 10 und 20 min. Aufzeichnen der Zeit, zu der das Gel fließt nicht als die Gelierzeit.

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Representative Results

Die PAA Alkin - Derivat effizient aus Polyacrylsäure und Propargylamin synthetisiert, wie in Abbildung 1 gezeigt , wobei n die Monomere , deren Carboxyl - Gruppen reagieren mit dem Amin - Etiketten. Die Identität des Produkts wird durch 1 H-NMR - Spektroskopie bestätigt. Abbildung 5 Die 1 H-NMR - Spektrum von PAA zeigt mit Dreifachbindung modifiziert.

Abbildung 5
Abbildung 5: 1 H-NMR - Spektrum des PAA modifizierten Alkin Das Signal an die Alkineinheit Zusammenhang wird hervorgehoben.. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Die Signale der Polymerkette kann im Bereich von 2,75 bis 1,50 ppm beobachtet werden; während ein Peak bei 2,8 0 ppm, repräsentativ für Alkin der H, und ein Peak bei 4,20 ppm, bezogen auf die 2 H des -CH 2 kennzeichnen die Propargyl - Rest. Dies bestätigt, dass PAA korrekt modifiziert wurde. Die Auswertung des Grades der Alkin Funktionalisierung wurde durch Integrieren der Fläche unter den PAA Peaks (eingestellt auf 3,00, entsprechend der Anzahl der Wasserstoffatome pro Monomer) und Propargyl - Einheit durchgeführt, wie in 5 dargestellt. Der Grad der Funktionalisierung f ist berechnet als:

Gleichung

Gleichung den Integralbereich des Propargyl-Rest darstellt, wobei die Summe der H-Fläche des Alkins (gekennzeichnet als Gleichung ) Und die CH 2 Bereich (angegeben als Gleichung ), wohingegenion "src =" / files / ftp_upload / 54445 / 54445eq5.jpg "/> der Polymer Signale. Der Grad der Funktionalisierung auf die Integralfläche bezieht, berechnet 10% sein, und es ist nach dem Hydrogel Synthese zufriedenstellend betrachten, wo PAA hat durch seine restliche Carboxylgruppen zu reagieren , um das 3D - Netzwerk zu bilden. Eine quantitative Ausbeute für das modifizierte Polymer 16 erhalten.

In ähnlicher Weise zeigt 6 das 1 H-NMR - Spektrum des Produkts nach der CuAAC Klickreaktion zwischen dem Alkin modifizierten PAA und RGD-Azid. Der Peak des gebildeten Triazol bei 8,15 ppm bestätigt , dass die Reaktion in einer quantitativen Ausbeute und RGD ist stark an die PAA Ketten verbunden. Figur 6 alle charakteristischen Signale der PAA - Kette und der RGD veranschaulicht.

Figur 6
Abbildung 6:1 H-NMR - Spektrum des RGD an PAA verbunden. Das Signal von Triazol angegeben ist (gekennzeichnet als "A"). RGD Polymerfunktionalisierung über CuAAC Klick - Reaktion wird durchgeführt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

RGD-funktionalisierten Hydrogele werden durch chemische Vernetzung der vier Polymere (PAA, Carbomer, Agarose und PEG) durch Mikrowellen-unterstützte freie radikalische Polymerisation hergestellt. Erhitzen auf 80 ° C führt zu einer höheren Makromer Mobilität und damit verstärkt die kurzreichweitige Verbindungen zwischen den Carboxyl- und Hydroxylgruppen der Polymeren. Die Veresterung erfolgt zwischen diesen funktionellen Gruppen und produziert lokale Netzwerke als "Mikrogele".

Da die Polykondensation fortschreitet, kontinuierlich die Viskosität des Systems steigt, während die Wahrscheinlichkeit der Wechselwirkung zwischen Makromer reaktiven Stellen abnimmt. Dennoch wirken die engere funktionelle Gruppen noch effizienter aufgrund einer geringeren Mobilität. Die resultierende physikalisch-chemischen Zustand wird durch ein "Schweißen" zwischen Mikrogel Flächen gekennzeichnet, die die endgültige 3D-Makrostruktur des Hydrogels erzeugt. Die Veresterung, Wasserstoffbindung und Carboxylierung bringen die Polymerketten statistisch näher, wodurch eine stabile heterogene Struktur zu schaffen. Das resultierende System zeigt Sol / Gel-Verhalten und es geht in einen Gel-Zustand innerhalb von 5 min. Dieses Zeitintervall wird als Gelzeit angegeben.

Die chemische Natur der RGD-funktionalisierten Hydrogelen untersucht unter Verwendung von FT-IR - Analyse dar. 7 zeigt den Vergleich zwischen den FT-IR - Spektren der RGD-Azidverbindung (grüne Linie), das Hydrogel ohne RGD Funktionalisierung (schwarze Linie) synthetisiert, und das Hydrogel mit Peptid-Modifikation (blaue Linie). Das Hydrogel spectra werden beide durch ein breites Signal in den 3,600-3,200 cm gekennzeichnet -1 Bereich, Vertreter der Streckschwingung der Rest - OH - Bindungen und durch einen Peak bei etwa 2940 cm -1 der CH Strecke. Die Validierung , dass die Veresterung unter den Carboxyl- und Hydroxyl - Polymergruppen auftritt , wird durch die Peaks etwa 1.600 cm -1 angegeben und 1400 cm -1, entsprechend jeweils der symmetrischen und asymmetrischen Streck von CO 2 -Einheit. Diese Peaks sind besser sichtbar in dem Spektrum des nicht-funktionalisierten Hydrogel, wohingegen in dem RGD-Hydrogel-Spektrum sie teilweise abgedeckt werden durch die angegebenen Signale als Amidbanden I und II.

7
Abbildung 7:. Vergleich von FT-IR - Spektren FT-IR - Spektren von RGD (grüne Linie), Hydrogel ohne RGD Funktionalisierung (schwarze Linie) und RGD funktionalisierten Hydrogel (blaue Linie). DasSignal an das Amid im Zusammenhang mit RGD angezeigt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Die Dehnung der C = O, bezeichnet als Amidbande I ( "Amid I" in 7), zeigt einen Peak bei 1.650 cm -1 in dem Tripeptid - Spektrum und wird verschoben bis etwa 1.670 cm -1 in der RGD-Hydrogelprobe . Das Biegen von NH, bezogen auf Amid Band II ( "Amid II" in 7), kann mit dem Signal rund 1.550 cm -1 aufgezeichnet werden in dem RGD - Spektrum und es ist auch erkennbar , in dem Hydrogel Probe bei etwa 1.600 cm - 1. Da es keine Amidkomponenten in der Standard Hydrogelformulierung sind, schlägt das Vorhandensein von Spitzen eines amidische Natur, dass die PAA wirklich mit dem RGD funktionalisiert ist, und es in der Lage ist, ein Hydrogel mit Peptid Stellen innerhalb des Polymernetzwerk zu bilden.

Das Hydrogel FT-IR - Spektrum zeigt auch die auf der Streckschwingung der COC von glykosidischen Bindung im Zusammenhang mit Spitzen (900-1.000 cm -1 Bereich) zwischen den Monosaccharideinheiten der Agarose und den Estergruppen.

Zu erhalten Einblick in die 3D - Struktur und die physikalischen und mechanischen Eigenschaften dieser Hydrogele, SEM - Analyse, Gelierung, Quellkinetik und rheologischen Untersuchungen durchgeführt werden, beschrieben , wie in früheren Arbeiten 13,20. SEM Ergebnisse (8) zeigen , dass Hydrogele durch eine komplexe mikroskopische Struktur mit einigen größeren Poren gekennzeichnet sind , die kleine Poren und einige fibrillar Netzwerke auf den Porenwänden. Darüber hinaus sind die meisten der Poren miteinander verbunden sind. Die verschlungene Struktur ist ähnlich der 3D-Netzwerk von Hydrogelen in der gleichen Weise hergestellt, jedoch ohne RGD Funktionalisierung. Dies zeigt, dass das RGD nicht das Polymernetzwerk zu verändern. Unter Verwendung des invertierten Reagenzglas-Test, das Hydrogel sausreichend verfestigt sich innerhalb von 5 Minuten, als ohne RGD Funktionalisierung 21 in der Hydrogel - Probe beobachtet. Diese kurze Gelierzeit unterstreicht seine Eignung für biomedizinische Anwendungen.

Abbildung 8
Abbildung 8:.. Die SEM - Analyse REM - Aufnahmen zeigen die Morphologie eines RGD-funktionalisierten Hydrogel - Probe (A) und einem Hydrogel ohne Funktionalisierung (B) Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Das Quellgleichgewichtsverhältnis gibt die Fähigkeit , eine große Menge Wasser zu absorbieren und zu halten , und es ist eine der führenden Eigenschaften Hydrogelsysteme 20,22. Die analysierten Proben aufweisen Schwellung schnelle Kinetik und erreichen sie innerhalb der ersten Stunde Quellungsgleichgewicht. ihre Dünunging Gleichgewichtswert Q wird in unserer früheren Arbeit 16 gemeldet und es ist ähnlich dem Wert , der durch Analyse der Hydrogele ohne RGD erhalten, was bestätigt , dass das Tripeptid mit dem polymeren Netzwerk integriert ist und kein hohes Hindernis für den Gelierungsprozess erstellen.

Mit den rheologischen Untersuchungen wird das Gel Speichermodul (G ') in etwa eine Größenordnung erwiesen höher als der Verlustmodul (G''), eine elastische und nicht viskoses Material angibt 23 und beide sind im Wesentlichen unabhängig von der Frequenz. Ähnliche Werte von G 'und G'' werden ohne Peptid Modifikation 16 mit dem Gel Probe aufgezeichnet. Dies zeigt, dass die Anwesenheit von RGD in dem polymeren Netzwerk nicht die rheologischen Eigenschaften des Materials nicht beeinträchtigt, die Aufrechterhaltung der besonderen Merkmale zu injizierbaren System für biomedizinische Anwendung konkurrieren.

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Acknowledgments

Autoren möchte Prof. Maurizio Masi für eine fruchtbare Diskussion und Fräulein Chiara Allegretti für Lektur danken. Autoren Forschung wird von Bando Giovani Ricercatori 2010 (Ministero della Salute GR-2010- 2312573) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly(acrylic acid) solution average Mw ~100,000, 35 wt% in H2O Sigma Aldrich 523925 CAS 9003-01-4
Poly(ethylene glycol) 2,000 Sigma Aldrich 84797 CAS 25322-68-3
Carbomeer 974P Fagron 1387083
Agarose  Invitrogen Corp. 16500-500 UltraPure Agarose
RGD peptide abcam ab142698
4-azidobutanoic acid Aurum Pharmatech Z-2421  CAS 54447-68-6
Oxalyl chloride Sigma Aldrich O8801 CAS 79-37-8
Propargylamine hydrochloride 95% Sigma Aldrich P50919 CAS 15430-52-1
Copper(I) iodide Sigma Aldrich 3140 CAS 7681-65-4
Sodium ascorbate Sigma Aldrich Y0000039 CAS 134-03-2
Phosphate buffered saline Sigma Aldrich P4417
Dialysis Membrane Spectrum Laboratories, Inc. 132725 Spectra/Por 3 Dialysis Membrane  Standard RC Tubing
MWCO: 3.5 kD

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Bioengineering Heft 116 Hydrogele Polyacrylsäure RGD klicken Sie auf Chemie Mikrowellen-unterstützte Synthese Funktionalisierung Tissue Engineering
Die Synthese von RGD-funktionalisierten Hydrogele als Werkzeug für therapeutische Anwendungen
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Mauri, E., Sacchetti, A., Rossi, F.… More

Mauri, E., Sacchetti, A., Rossi, F. The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications. J. Vis. Exp. (116), e54445, doi:10.3791/54445 (2016).

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