Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשיג אבולוצית מעבדה אדפטיבית של מיקרואורגניזמים בתנאים באמצעות תרבות chemostat. כמו כן, ניתוח גנטי של הזן התפתח נדון.
Introduction
מיקרואורגניזמים יכול לשרוד ולהסתגל סביבות מגוונות. תחת לחץ חמור, הסתגלות יכולה להתרחש באמצעות רכישת פנוטיפים מועילים ידי מוטציות גנומי אקראיות סלקציה חיובית לאחר 1-3. לכן, תאים מיקרוביאליים יכול להתאים על ידי שינוי מטבולי או רשתות רגולטוריות לצמיחה אופטימלית, אשר נקרא "התפתחות מסתגלת". נטיות חיידקים חשובות אחרונות, כגון התפרצויות של חיידקים לבין ההתרחשות של זנים של חיידקים חזקים, הם קרובים מאוד אדפטיבית אבולוציה בתנאים מלחיצים. בתנאי מעבדה מוגדרים, אנו מסוגלים ללמוד את המכניזם של אבולוציה מולקולרית ואף לשלוט על הכיוון של אבולוצית חיידקים עבור יישומים שונים. בניגוד יצורים רב-תאיים, חד תאיים אורגניזמים מתאימים גם לאבולוציה מעבדה אדפטיבית (ALE) מהסיבות הבאות: הם להתחדש במהירות, הם שומרים על אוכלוסיות גדולות, וזה קל ליצור ולתחזק Homסביבות ogeneous. בשילוב עם התקדמות טכניקות רצפי DNA וטכנולוגיות תפוקה גבוהה, ALE מאפשר תצפית הישירה של שינויים גנומית להוביל שינויים רגולטוריים מערכתיים. דינמיקה מוטציוני ומגוון מהאוכלוסייה הם גם נצפה. אסטרטגיות הנדסה גנטית ניתן לקבוע מניתוח זני ALE 4,5.
תרבות Chemostat היא שיטה המשמשת כדי להשיג תאים יציבים ולהגדיל את הפרודוקטיביות תהליכי תסיסה 6. מדיום חדש מתווסף מרק התרבות שנקטף במהלך התהליך (האחרון כולל בינוניות ביומסה). לתרבות לטווח ארוך chemostat, לעומת זאת, משנה את הפרודוקטיביות היציב של התרבות ומביא על הצטברות של מוטציות ספונטניות ובחירת במהלך התרבות (איור 1 א). תחת לחץ ברירה שונה (לחצים), ההצטברות של מוטציות היא משופרת. עלייה הדרגתית של הלחץ לטווח ארוך chemostat מספק מבחר רציף של מוטציות שפועלות נגד גורמי הלחץ הנתונים, כגון טמפרטורה, pH, לחץ האוסמוטי, הרעבה מזינה, חמצון, מוצרי קצה רעילים, וכו 'העברת קולוני מתוך בינוני מוצק והעברה סידורית של מדיום נוזלי (חזר תרבות אצווה) גם לאפשר לחוקרים לקבל מיקרואורגניזמים התפתחו (איור 1b ו 1c). למרות שתרבות chemostat דורשת שיטות מסובכות, הברכה של גיוון (מספר חזרות וגודל אוכלוסייה) הוא גבוהה יותר מזה שהושג באמצעות עברת מושבה וטכניקות העברת סדרתי. חשיפת המתח היציבה תאים בודדים וירידת וריאציה במדינת הסלולר במהלך תרבות chemostat (מצב יציב) יתרונות אחרים של ALE לעומת טכניקות התרבות מבוססת יצווה. ALE-induced מתח של Escherichia coli נתון בתנאי succinate גבוהים הוא הציג במאמר זה.
Iles / ftp_upload / 54,446 / 54446fig1.jpg "/>
איור 1: שיטות של האבולוציה מעבדה אדפטיבית (א) Chemostat;. (ב) העברת סדרתי; (ג) העברת המושבה. הדמויות העליונות להמחיש את הרעיון של שיטות ALE, ואת הדמויות התחתונות להמחיש את מספר התאים גדלו במהלך ALE. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת ציוד
- השג צנצנת chemostat (150-250 מ"ל) או בקבוק Erlenmeyer (250 מ"ל) המכיל יציאת כניסת ויציאת לשקע. חברו את יציאות עם צינורות סיליקון המאפשר ספיקות של 10-100 מ"ל / שעה. לחלופין, להשתמש פורקן אוויר, יציאת האוויר, ויציאות לשקע כניסת מים בטמפרטורה מבוקרת.
- השג מכשיר מתאים את צנצנת chemostat המספקת שליטת תסיסה והטמפרטורה (או להשתמש חממה רועדת סיבובית).
- השג שתי משאבות פריסטלטיות כדי לספק בינוני טרי ולאסוף את התרבות.
- השג צנצנת מאגר (10-20 L) המכילה יציאת בינוניים יציאת כניסת אוויר.
- השג צינורות סיליקון מתאים שיעור הדילול (כלומר, מ"מ 0.8 מזהה, מגוון זרימת .06-36 מ"ל / דקה; L / צינורות S 13).
הכנה בינונית 2. ועיקור
- בינוני ראשוני
- ממיסים 0.3 גלוקוז גרם, 0.08 גרם NH 4Cl, 0.05 גרם NaCl, 0.75 גרם Na 2 4 HPO · 2H 2 O, ו -0.3 גרם KH 2 PO 4 ב 90 מ"ל מים מזוקקים (DW) בצנצנת chemostat.
- סוגרים את הצנצנת chemostat יחד עם צינורות באמצעות מלחציים. אין לאטום את פתח האוורור.
- לעקר את צנצנת chemostat ב חיטוי ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לאחר העיקור, לאחסן בצנצנת chemostat בטמפרטורת החדר.
- ממיסים 0.02 גרם MgSO 4 · 7H 2 O, 0.01 גרם CaCl 2, ו תיאמין 0.1 מ"ג ב 10 מ"ל DW (פתרון).
- פתרון סינון באמצעות מזרק מסנן מזרק מראש מעוקרים (מסנן נקבובי 0.45 מיקרומטר).
- מוסיפים את פתרון filtrates לצנצנת chemostat.
- בינוני מתח
- ממיסים 30 גרם גלוקוז, 8 גרם NH 4 Cl, 5 גרם NaCl, 75 גרם Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, 30 גרם KH 2 4 פו, hexahydrate succinate Disodium 300 גרם (Na 2 · succinate · 6H <sub> 2 O; הדחק השתמשו בניסוי זה) ב 9.9 L DW בצנצנת המאגר.
- סוגרים את הצנצנת המאגר יחד עם צינורות באמצעות מלחציים. אין לאטום את פתח האוורור.
- לעקר את צנצנת המאגר ב חיטוי ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לאחר העיקור, לאחסן בצנצנת בטמפרטורת החדר.
- ממיסים 2 גרם MgSO 4 · 7H 2 O, CaCl גרם 1 2, ו -10 מ"ג תיאמין 100 מ"ל DW (פתרון).
- פתרון מסנן עם מזרק מזרק מסנן מראש מעוקרים (מסנן 0.45 מיקרומטר נקבובית).
- מוסיפים את פתרון filtrates לצנצנת המאגר.
- בסביבה נקייה מחיידקים, לחבר את צינורות סיליקון מעוקר לצנצנת המאגר ולצרף המשאבות peristaltic.
- בינוני מתח גבוה
- הכן את המדיום כאמור בסעיף 2.2, אבל עם ריכוז גדול יותר של עקה (כלומר, 3-5 גר '/ ל גבוהה של הסתגלות succinate).
הערה: פרוטוקול זה הוא להסתגלות מתח הבבית יכול להיות מועבר דרך המדיום. במקרה של לחצים פיזיים כגון טמפרטורה, תסיסה, או תאורה, טיפוח צריך להיות מתוכנן בהתאם.
- הכן את המדיום כאמור בסעיף 2.2, אבל עם ריכוז גדול יותר של עקה (כלומר, 3-5 גר '/ ל גבוהה של הסתגלות succinate).
3. טיפוח ראשוני
- לחסן מושבה אחת של wild-type E. coli במבחנה 15 מ"ל המכיל 4 מ"ל של מדיום הראשונית.
- דגירת המבחנה בתוך חממת רעד במשך 12 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 220 סל"ד.
- בסביבה נקייה מחיידקים, העברת 1 מ"ל של preculture לצנצנת chemostat.
- דגירה צנצנת chemostat, מתן אוורור (50 מ"ל אוויר / min) תסיסה (200 סל"ד), ב 37 מעלות צלזיוס במשך 6 שעות.
הסתגלות מתח 4.
- בסביבה נקייה מחיידקים, חבר את הקצה של הצינור סיליקון מהמשאבות לצנצנת chemostat.
- הפעל את המשאבה לשקע (10 מ"ל / שעה ומעלה) ולאסוף תרבות.
הערה: התרבות צריכה להיות בשלב המעריכים, בדרך כלל 4-8 שעות לאחר טיפוח ראשוני. - ChEck הצפיפות האופטית (600 ננומטר) של התרבות מן הצינורות המוצאים.
- הפעל את משאבת כניסת (10 מ"ל / שעה, המתאים לשיעור של דילול של 0.1 hr -1).
- בדוק את הצפיפות האופטית של התרבות ב 600 ננומטר משקע צינורות כל 24 שעות.
- הפעילו את chemostat למשך 96 שעות (מחזור 9.6-פי) או יותר. אם הצפיפות האופטית היא יציבה, להחליף את המאגר המכיל את מדיום המתח הגבוה. אם הצפיפות האופטית נמוכה מ -0.2, להפסיק את משאבת כניסת האכלת 6 שעות. הפעל מחדש את משאבת הכניסה ולבדוק כי הצפיפות האופטית היא מעל 0.2.
- בהדרגה להגדיל את הריכוז של גורם הדחק ידי שינוי למאגר המכיל ריכוז גבוה מלחץ.
- קח דגימות של התרבות המותאמת בכל פעם שהוא מגיע ציון דרך (למשל, זן מותאם 100 גר '/ ל מתח succinate), ולאחסן לניתוח גנומי נוסף.
- עבור אחסון מדגם, לערבב המדגם תרבות (0.5 מ"ל) עם soluti גליצרול 80% מעוקריםעל (0.5 מ"ל) ולאחסן אותו ב -80 מעלות צלזיוס.
הערה: אם מיקרואורגניזם רוכש יכולת לבזות את הלחץ במהלך תהליך ALE, ריכוז הלחץ בתוך מכל התסיסה אינו זהה לזה במאגר הטרי.
5. בידוד חד מושבה של הזנים מותאם-מתח
- כן בינוני צלחת אגר (1.6% אגרו) המכיל את אותו לחץ ובאותו הריכוז בינוני.
- פלייט תרבות לשקע (0.1 מ"ל) מן chemostat, ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.
- פיק מושבות אחת מהצלחת באמצעות קיסם סטרילי ולחסן אותם 15 מ"ל מבחנות המכילות אותו הדחק ובאותו ריכוז בינוני כמו chemostat, דגירה במשך 6 שעות.
- העברת 1 מ"ל של מרק התרבות לתוך בקבוק 250 מ"ל Erlenmeyer המכיל 50 מ"ל של מדיום. קציר 0.5 מ"ל של מרק התרבות בכל שעה 1, ולמדוד את OD ב 600 ננומטר. השווה את שיעור הצמיחה של strai המותאםn לזה של זן פראי סוג נתון גורם הדחק.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
להסתגלות מתח גבוה-succinate, סוג-בר E. coli W3110 זן היה בתרבית chemostat בבית D = 0.1 hr -1 עבור 270 ימים (איור 2).
איור 2: הסתגלות מתח גבוה-succinate של E. coli W3110 באמצעות תרבות chemostat. חיצים Thin לציין את הזמנים שבהם ריכוז הדחק הוגדל, וחצים מודגש לציין את הזמנים שבהם תרבויות נשמרו. מספרים עם החצים מצביעים על ריכוזים של גורם הדחק, succinate Disodium hexahydrate. השינוי ביומסה במהלך ALE ועל ריכוזי הדחק מיוצגים. הנתון היה שונה מן J. Biosci. Bioeng 7. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
ריכוז לחץ ראשוני של 30 גר '/ ל (hexahydrate succinate disodium) היה בהדרגה גדל בכל פעם בתרבות chemostat הגיעה למצב יציב, עד הריכוז של לחץ היה 160 גר' / ל. מותאם E. coli DST160 זן (סובלני ל -160 גר '/ ל של מתח succinate disodium) נרכש לאחר 270 ימים. זן DST160 הציג צמיחת מעצורים תחת מתח הגבוה-succinate (דחק 160 גר '/ ל'), בעוד הזן הקדמון (W3110) הראה כמעט שום צמיחה (איור 3).
איור 3: עקומות גדילה של wild-type (W3110, עיגול לבן) ומותאמת זן (DST160, עיגול שחור) תחת מתח גבוה-succinate האיור מציג כי המתח מותאם גדל ללא דיחוי תת succinate גבוהה תנאים הדגיש בעוד בטבע. סוג לא. הטעותברים מצביעים סטיית התקן של שלושה ניסויים בלתי תלויים. הנתון היה שונה מן J. Biosci. Bioeng 7. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מיקרואורגניזמים הם יהיו מסוגלים להתאים כמעט לכל סביבות בגלל קצב הצמיחה המהיר שלהם המגוון הגנטי. אבולוצית מעבדה מסתגלת מאפשרת מיקרואורגניזמים להתפתח בתנאים תוכנן, אשר מספק דרך בחירת אורגניזמים בודדים מחסה מוטציות ספונטניות שאינן מועילים בתנאים הנתונים.
טכניקת chemostat היא חזקה יותר להשגת התפתחות מונעת באופן מלאכותי מאשר טכניקות העברה מהסיבות הבאות: (א) סביבה יציבה - כי טכניקות העברה מבוססות על תרבויות יצוו או על מוצק או במדיום נוזלי, הסביבה של התא משתנית במהלך יצווה תרבות בעוד הלחץ הסביבתי של chemostat הוא יציב; (ב) אוכלוסייה גדולה יותר ומבחר רציף - האוכלוסייה הגדולה יותר של chemostat מספקים מגוון גנטי יותר בהשוואה לאוכלוסייה הקטנה של טכניקות העברה. בחירה רציפה של chטכניקת emostat היא דרך מהירה יותר להשיג אבולוציה מאשר בחירה לסירוגין של טכניקות העברה. זה קריטי, כי התרבות chemostat לא להיות מזוהם על ידי מיקרואורגניזמים אחרים במהלך ההליך ALE, והתנאים ספטית נדרשים לאורך התרבות chemostat. הליך ALE ניתן לשנות על ידי שינויים מלחיצים, כגון עקה חמצונית, לחץ האוסמוטי, ומתח מוצר רעיל. ישנן כמה מגבלות טכניות כדי ALE ידי תרבות chemostat. אבולוציה מתרחשת במקרה; ולכן, חוקרים שונים ייתכן שלא יוכלו להשיג את אותה תוצאה אבולוציונית, למרות ההשלכות של מוטציות יכולות להיות קשורות. מגבלה נוספת היא לשטוף-אאוט של תרבות chemostat כאשר הריכוז של לחץ הוא גדל מהר מדי. אם ביומסה הוא ירד עד סכום מסוים (כלומר, OD = 0.2 בהליך זה) לאחר הריכוז של לחץ הוא גדל, ממשל של גורם הדחק יש להפסיק לפחות כמה דורותלתת זמן זן להסתגל.
ההתפתחויות האחרונות טכנולוגיית ריצוף הגנום סייעו בהבנת המוטציות לפתח בתגובה לתנאי מלחיץ מסוימים. לדוגמא, מוטצית ה- DNA משנים השפעה מערכתית מסוימת כי הוא מועיל לסביבה המסוימת (כלומר, סובלנות גורם לחץ רעיל). לפיכך, ALE יכול לשמש כדי לחקור את תפקוד גן או תקנת רשת, או כחומר גלם עבור 'אבולוציה מואצת ". מחקרים ALE גם שימושי המדמה התפתחות חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה, המציין את המנגנונים שבאמצעותם זני חיידקים מסוכנים עמידים לתרופות להתעורר. כמו מסלול אבולוציה חקוק על הגנום, לחשוף את השינויים הגנטיים שמובילים פנוטיפים הרצויים (כגון מתח סובלנות) הוא המכשול הבא פעם זנים התפתחו מתקבלים 8. בין הטכנולוגיות רצף הדור הבא כרגע זמין, Illumina יון plat Torrentצורות מתאימות לצורך זיהוי של החלפות נוקלאוטיד או indels הקטן המתרחשים הזנים התפתחו, ושניהם הם סבירים. מפני שזיהוי גרסה בדרך כלל מיפוי קצר לקריאה של רצפי ההתייחסות, הזמינות של רצף הגנום של הזן הקדמון היא קריטית. גם אם רצף הגנום של זן המייסד זמין ממאגרים ציבוריים, הוא לעתים קרובות רצוי רצף זה בד בבד עם התפתח אחד, כי ייתכן שיש כמה הבדלים נוספים בזן עכברי ההתחלה בפועל. פרוטוקולים לזיהוי מוטציה זמינים בקלות דרך האינטרנט או חיפוש בספרות 9,10. לדוגמא, BRESEQ הוא צינור שתוכנן במיוחד עבור ניתוח גנטי של חיידקים התפתחו במעבדה באמצעות נתוני רצף של הדור הבא 11. השוואות של הזנים התפתחו אבן דרך מסוימת (למשל, בנתוני נציג זה, סוג בר, DST50, DST100, ו DST160) יכולות לספק את הרצף של הזן התפתחs ולתת תובנה ההשלכות של גורם לחץ מסוים. לכן, ידע ויישומים של ניסויי ALE, יחד עם ביולוגיה מערכתית וזיהוי משתנה הפרעות מערכתיות, צפויים בעתיד הקרוב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mini-chemostat fermentor | Biotron Inc. | - | manufactured by special order |
| silicon tubing | Cole-Parmer | Masterflex L/S 13 | tubing size can be varied depending on the dilution rate and the size of fermentor jar. |
| reservoir jar | Bellco | Media storage bottle | 20 L |
| chemicals | Sigma-Aldrich | - | reagent grade |
| glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | ACS reagent |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5% |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | ACS reagent, ≥99% |
| Na2HPO4·2H2O | Sigma-Aldrich | 4272 | 98.5-101% |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 | ACS reagent, ≥99% |
| MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | ACS reagent, ≥98% |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 793639 | ACS reagent, ≥96% |
| thiamine·HCl | Sigma-Aldrich | T4625 | reagent grade, ≥99% |
| Na2·succinate·6H2O | Sigma-Aldrich | S2378 | ReagentPlus, ≥99% |
References
- Rando, O. J., Verstrepen, K. J. Timescales of genetic and epigenetic inheritance. Cell. 128, 655-668 (2007).
- Kim, H. J., et al. Short-term differential adaptation to anaerobic stress via genomic mutations by Escherichia coli strains K-12 and B lacking alcohol dehydrogenase. Front Microbiol. 5, 476 (2014).
- Mendizabal, I., Keller, T. E., Zeng, J., Yi, S. V. Epigenetics and evolution. Integr Comp Biol. 54, 31-42 (2014).
- Lee, J. Y., Seo, J., Kim, E. S., Lee, H. S., Kim, P. Adaptive evolution of Corynebacterium glutamicum resistant to oxidative stress and its global gene expression profiling. Biotechnol Lett. 35, 709-717 (2013).
- Lee, J. Y., et al. Artificial oxidative stress-tolerant Corynebacterium glutamicum. AMB Express. 4, 15 (2014).
- Narang, A. The steady states of microbial growth on mixtures of substitutable substrates in a chemostat. J Theor Biol. 190, 241-261 (1998).
- Kwon, Y. D., Kim, S., Lee, S. Y., Kim, P. Long-term continuous adaptation of Escherichia coli to high succinate stress and transcriptome analysis of the tolerant strain. J Biosci Bioeng. 111, 26-30 (2011).
- Barrick, J. E., Lenski, R. E. Genome dynamics during experimental evolution. Nat Rev Genet. 14, 827-839 (2013).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
- McKenna, A., et al. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).
- Deatherage, D. E., Barrick, J. E. Identification of mutations in laboratory-evolved microbes from next-generation sequencing data using breseq. Methods Mol Biol. 1151, 165-188 (2014).
