Procedure voor Adaptive Laboratorium Evolutie van micro-organismen met behulp van een Chemostat

Summary

Hier presenteren we een protocol laboratorium adaptieve evolutie van micro-organismen onder omstandigheden met behulp chemostaat cultuur te verkrijgen. Ook is genomische analyse van het vrijkomende stam besproken.

Introduction

Micro-organismen kunnen overleven en zich aan te passen aan verschillende omgevingen. Onder zware stress, kan de aanpassing gebeuren via de overname van heilzame fenotypes door willekeurige genomische mutaties en de daaropvolgende positieve selectie ^1-3. Daarom kan microbiële cellen aangepast door het veranderen van metabole of regulerende netwerken voor een optimale groei, die wordt aangeduid als "adaptieve evolutie". Recente belangrijke microbiële tendensen, zoals het uitbreken van superbugs en het optreden van sterke microbiële stammen, zijn nauw verwant aan adaptieve evolutie onder stressvolle omstandigheden. Onder laboratoriumomstandigheden gedefinieerd, kunnen wij de mechanismen van moleculaire evolutie bestuderen en zelfs de richting van microbiële evolutie verschillende toepassingen te beheersen. In tegenstelling tot meercellige organismen, eencellige organismen zijn zeer geschikt voor adaptieve laboratorium evolutie (ALE) om de volgende redenen: ze snel herstellen, onderhouden ze grote populaties, en het is eenvoudig te maken en te onderhouden homogeneous omgevingen. Gecombineerd met recente ontwikkelingen in DNA sequencing technieken en high-throughput technologieën ALE maakt de directe waarneming van genomische veranderingen die leiden tot structurele veranderingen in regelgeving. Mutatie dynamiek en diversiteit van de bevolking zijn ook waarneembaar. Genetische manipulatie strategieën kunnen worden bepaald uit de analyse van ALE stammen ^4,5.

Chemostaat cultuur is een methode die wordt gebruikt om steady-state cellen te verkrijgen en de productiviteit in fermentatieprocessen ⁶ te verhogen. Vers medium wordt toegevoegd en kweekbouillon wordt tijdens het proces (de laatste omvat medium en biomassa) geoogst. Langdurige kweek chemostaat echter verandert de steady-state productiviteit van de kweek en brengt de accumulatie van spontane mutaties en selectie in kweek (Figuur 1a). Onder verschillende selectiedruk (stressoren), zal de accumulatie van mutaties verbeterd. Een geleidelijke toename van stress op lange termijn chemostaat voorziet in een continue selectie van mutaties die werken tegen de gegeven stressoren, zoals temperatuur, pH, osmotische druk, voedingsmiddel verhongering, oxidatie, toxische eindproducten, enz Colony transfer van een vast medium en seriële overdracht van een vloeibaar medium (herhaalde batch cultuur) ook kunnen onderzoekers ontwikkelde micro-organismen (figuur 1b en 1c) ​​te verkrijgen. Hoewel chemostaat cultuur ingewikkelde methodes vereist, het zwembad van de diversiteit (het aantal herhalingen en de grootte van de populatie) is hoger dan die verkregen door kolonie overdracht en serial transfer technieken. De stabiele spanning blootstelling aan individuele cellen en verminderde variatie in de cellulaire toestand tijdens chemostaat cultuur (steady state) zijn andere voordelen van ALE in vergelijking met batch-cultuur gebaseerde technieken. Stress geïnduceerde ALE van Escherichia coli onderworpen aan hoge succinate omstandigheden die in dit artikel.

iles / ftp_upload / 54446 / 54446fig1.jpg "/>
Figuur 1: Methoden van adaptieve laboratorium evolutie (A) Chemostat;. (B) seriële overdracht; (C) kolonie overdracht. De bovenste cijfers illustreren het concept van de methoden voor het ALE en de onderste cijfers illustreren het aantal cellen die groeide tijdens ALE. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

1. apparatuur Voorbereiding

1. Verkrijgen van een chemostat pot (150-250 ml) of een erlenmeyer (250 ml) die een inlaatpoort en een uitlaatpoort. Sluit de poorten met siliconenslang waardoor stroomsnelheden van 10-100 ml / uur. Optioneel gebruik van een ontluchter, een luchtuitlaat poort, en temperatuurgecontroleerde water inlaat en uitlaat poorten.
2. Verkrijgen van een apparaat om de chemostaat pot die voorziet roeren en temperatuurregeling (of een roterende schudincubator).
3. Verkrijgen twee peristaltische pompen om vers medium te leveren en het verzamelen van de cultuur.
4. Zorg voor een reservoir jar (10-20 L) met een medium uitlaatpoort en een luchtinlaat poort.
5. Verkrijgen van silicium slangen die geschikt zijn voor de verdunning (dat wil zeggen, ID 0,8 mm, stroom range 0,06-36 ml / min; L / S 13 buizen).

2. Medium Voorbereiding en Sterilisatie

1. Initial Medium
   1. Los op 0,3 g glucose, 0,08 g _NH4Cl, 0,05 g NaCl, 0,75 g Na ₂ HPO ₄ · 2H ₂ O, en 0,3 g KH ₂ PO ₄ in 90 ml gedestilleerd water (DW) in een chemostaat pot.
   2. Sluit de chemostat pot samen met de slang met behulp van klemmen. Niet sluit de ontluchter.
   3. Steriliseer het chemostaat pot in een autoclaaf bij 121 ° C gedurende 15 minuten. Na sterilisatie, slaan de chemostaat pot bij kamertemperatuur.
   4. Ontbinden 0,02 g _MgSO4 · 7H ₂ O, 0,01 g CaCl ₂ en 0,1 mg thiamine in 10 ml DW (oplossing A).
   5. Filteroplossing Een behulp van een injectiespuit en een voorgevulde injectiespuit filter gesteriliseerd (0,45 urn poriën een filter).
   6. Voeg de oplossing A filtraten de chemostaat pot.
2. Stress Medium
   1. Los op 30 g glucose, 8 g NH ₄ Cl, 5 g NaCl, 75 g Na ₂ HPO ₄ · 2H ₂ O, 30 g KH ₂ PO _4, en 300 g dinatriumsuccinaat hexahydraat (Na ₂ · succinaat · 6H <sub> 2 O; de stressor gebruikt in dit experiment) in 9,9 L DW in een reservoir pot.
   2. Sluit de reservoir pot samen met de slang met behulp van klemmen. Niet sluit de ontluchter.
   3. Steriliseer het reservoir pot in een autoclaaf bij 121 ° C gedurende 15 minuten. Na sterilisatie Bewaar de kruik bij kamertemperatuur.
   4. Los 2 g _MgSO4 · 7H ₂ O, 1 g CaCl ₂ en 10 mg thiamine in 100 ml DW (oplossing A).
   5. Filteroplossing A met een injectiespuit en een voorgevulde injectiespuit filter gesteriliseerd (0,45 urn poriën een filter).
   6. Voeg de oplossing A filtraten het reservoir pot.
   7. Aseptisch sluit de gesteriliseerde silicium slang aan het reservoir pot en bevestig de peristaltische pompen.
3. High-stress-Medium
   1. Bereid het medium volgens punt 2.2, maar met een grotere concentratie van stressor (dwz 3-5 g / l hoger succinaat adaptatie).
      Let op: Dit protocol is voor de aanpassing aan een stress-thop kan worden geleverd via het medium. Bij fysische stressfactoren zoals temperatuur, roeren of verlichting moet de teelt dienovereenkomstig worden ontworpen.

3. Eerste Teelt

1. Inoculeer een enkele kolonie van wild-type E. coli in een 15 ml reageerbuis met 4 ml oorspronkelijke medium.
2. Incubeer de reageerbuis in een schudincubator gedurende 12 uur bij 37 ° C en 220 rpm.
3. Aseptisch overdracht 1 ml voorkweek de chemostaat pot.
4. Incubeer de chemostaat pot, voorziet beluchting (lucht 50 ml / min) en roeren (200 rpm) bij 37 ° C gedurende 6 uur.

4. Stress Adaptation

1. Aseptisch sluit het einde van het silicium slang van de pompen naar de chemostaat pot.
2. Start de pomp uitlaat (10 ml / u of hoger) en verzamel cultuur.
   Opmerking: De cultuur moet in de exponentiële fase typisch 4-8 uur na initiële kweek.
3. check de optische dichtheid (600 nm) van de kweek van de uitlaat slang.
4. Start de inlaatpomp (10 ml / uur, overeenkomend met een snelheid van verdunning van 0,1 ^h-1).
5. Controleer de optische dichtheid van de kweek bij 600 nm van de uitvoerslang elke 24 uur.
6. Bedien de chemostaat voor 96 uur (omzet 9,6-voudig) of meer. Als de optische dichtheid stabiel, wisselen het reservoir met de zwaar belaste medium. Als de optische dichtheid lager dan 0,2, stopt de toevoertransporteur inlaatpomp voor 6 uur. Herstart de inlaat pomp en controleer of de optische dichtheid is voorbij 0.2.
7. Geleidelijk verhogen van de concentratie van de stressor door het veranderen van een reservoir met een hogere concentratie stressor.
8. Monsters van de kweek aangepast wanneer het een mijlpaal bereikt (bijvoorbeeld een stam aangepast om 100 g / l succinaat stress), en opslag voor verdere genomische analyse.
9. Voor monster opslag, meng de cultuur monster (0,5 ml) met een gesteriliseerde 80% glycerol solution (0,5 ml) en het op -80 ° C.
   Opmerking: Als het micro-organisme verwerft het vermogen om de stressor afgebroken tijdens de ALE proces de stressor concentratie in de fermentatie pot is niet dezelfde als die in de verse reservoir.

5. Single-kolonie Isolatie van de stress-aangepaste stam

1. Bereid agarplaat-medium (1,6% agar) die dezelfde stressor en bij dezelfde concentratie drager.
2. Plaat de uitlaat kweek (0,1 ml) van de chemostaat en incubeer bij 37 ° C gedurende 16 uur.
3. Pick enkele kolonies van de plaat met een steriele tandenstoker en beënt ze in 15 ml reageerbuizen die dezelfde stressor en in hetzelfde medium concentratie in de chemostaat en incubeer gedurende 6 uur.
4. Breng 1 ml van de cultuur bouillon in een 250 ml Erlenmeyer die 50 ml medium. Oogst 0,5 ml van de kweekbouillon elke 1 uur, en meet de OD bij 600 nm. Vergelijk de groei van de aangepaste Strain met die van de wildtype gezien de stressor.

Representative Results

Voor high-succinaat stress-adaptatie, de wild-type E. coli W3110 stam werd gekweekt in een chemostat bij D = 0,1 ^h-1 gedurende 270 dagen (figuur 2).

Figuur 2: High-succinaat spanning aanpassing van E. coli W3110 gebruik chemostaat cultuur. Dunne pijlen geven de tijdstippen waarop de concentratie stressor werd verhoogd en vetgedrukte pijlen geven de tijdstippen kweken werden bewaard. Getallen met pijlen geven de concentraties van de stressor, dinatrium- succinaat hexahydraat. De verandering van de biomassa gedurende ALE en de concentraties van stressor vertegenwoordigd. Het cijfer werd aangepast van J. Biosci. Bioeng ^7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Een eerste stressor concentratie van 30 g / L (disodium succinaat hexahydraat) geleidelijk verhoogd wanneer de chemostaat kweek een stationaire toestand bereikt, wanneer de concentratie stressor was 160 g / l. De aangepaste E. coli DST160 stam (tolerant tot 160 g / l dinatriumsuccinaat stress) verkregen is na 270 dagen. De stam vertoonde DST160 ongeremde groei onder hoge spanning succinaat (160 g / l stressor), terwijl de voorouder-stam (W3110) vertoonde vrijwel geen groei (figuur 3).

Figuur 3: Groei bochten van de wild-type (W3110, witte cirkel) en aangepast stam (DST160, zwarte cirkel) onder hoge-succinaat spanning de figuur blijkt dat de aangepaste stam groeide onverwijld onder high-succinaat benadrukte omstandigheden, terwijl de wild. het type niet. De foutbalken geven de standaardafwijking van drie onafhankelijke experimenten. Het cijfer werd aangepast van J. Biosci. Bioeng ^7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Micro-organismen zijn in staat aan te passen aan bijna alle omgevingen vanwege hun snelle groei en de genetische diversiteit. Adaptive laboratorium evolutie stelt micro-organismen om te evolueren onder omstandigheden ontworpen, die een manier van het selecteren van de individuele organismen harboring spontane mutaties die gunstig onder de gegeven omstandigheden biedt.

De chemostaat techniek robuuster te bereiken kunstmatig aangedreven evolutie dan transfertechniek om de volgende redenen: (a) een stabiele omgeving - omdat overdracht technieken zijn gebaseerd op batchculturen hetzij vast of in een vloeibaar medium, de omgeving van de cellen varieert gedurende batch cultuur, terwijl de milieubelasting van de chemostaat is stabiel; (B) een grotere populatie en een continue selectiedruk - de grotere populatie van de chemostaat geeft meer genetische diversiteit dan de kleinere populatie overdrachttechnieken. Continue selectie van de chemostat techniek is een snellere manier om de evolutie dan intermitterende selectie van de overdracht technieken te bereiken. Het is cruciaal dat de chemostaat cultuur die niet door andere micro-organismen besmet zijn tijdens de ALE-procedure, en aseptische voorwaarden gedurende chemostaat cultuur vereist. De ALE procedure kan worden gemodificeerd door veranderingen in stressoren, zoals oxidatieve stress, osmotische stress, en toxisch product stress. Er zijn een paar technische beperkingen aan ALE door chemostaat cultuur. Evolutie vindt plaats bij toeval; Derhalve kunnen verschillende onderzoekers niet in staat zijn om hetzelfde resultaat te verkrijgen evolutionaire, hoewel de gevolgen van mutaties mogelijk verwant. Een andere beperking is het uitwassen van chemostaat kweken wanneer de concentratie van stressor te snel wordt verhoogd. Indien de biomassa vermindert tot een bepaald bedrag (dwz OD = 0,2 in deze procedure) na de concentratie stressor wordt verhoogd, toediening van de stressor moet worden stopgezet minstens een paar generatiesgeef de stam tijd aan te passen.

Recente ontwikkelingen in het genoom sequencing technologie hebben het begrip van mutaties die zich ontwikkelen in reactie op bepaalde stressvolle omstandigheden geholpen. Bijvoorbeeld, een DNA-mutatie verandert een specifiek systemisch effect dat gunstig is voor de gegeven omgeving (dat wil zeggen tolerantie voor een toxische stressor). Aldus kan ALE worden gebruikt om genfunctie of netregelgeving of als grondstof voor "versnelde ontwikkeling te bestuderen. ALE studies zijn ook bruikbaar bij het simuleren van de ontwikkeling van antibioticaresistente bacteriën, waarin de mechanismen die gevaarlijke resistente bacteriestammen ontstaan. Als de baan van evolutie gegraveerd op het genoom, het blootleggen van de genetische veranderingen die leiden tot de gewenste fenotypen (zoals stress tolerantie) het volgende obstakel eenmaal ontwikkelde stammen worden verkregen ^8. Onder de momenteel beschikbare next-generation sequencing technologie, de Illumina en Ion Torrent platvormen zijn geschikt voor de detectie van nucleotidesubstituties of kleine indels die voorkomen in de ontwikkelde stammen, en beide zijn betaalbaar. Omdat variant detectie omvat gewoonlijk korte lees mapping van de referentiesequenties, de beschikbaarheid van de genoomsequentie van het voorouderlijke stam cruciaal. Zelfs als de genoomsequentie van de grondlegger stam verkrijgbaar van publieke gegevensbanken, is het vaak wenselijk om het gelijktijdig sequentie met het ontstane één, omdat er mogelijk zou enige verschillen in de feitelijke aanvang stam. Protocollen voor mutatie identificatie gemakkelijk beschikbaar zijn via het web of een literatuuronderzoek ^9,10. Bijvoorbeeld BRESEQ is een speciaal ontworpen pijpleiding genomische analyse van laboratorium ontwikkelde microben gebruikt next-generation sequentiedata ^11. Vergelijkingen van de ontwikkelde stammen op bepaalde mijlpalen (bijvoorbeeld in deze representatieve gegevens wildtype, DST50, DST100 en DST160) kan de sequentie van de ontwikkelde spanning leverens en geven inzicht in de gevolgen van een bepaalde stressor. Daarom, kennis en toepassingen van ALE-experimenten, in combinatie met het systeem biologie en de identificatie van systemische storing variabelen, worden verwacht in de nabije toekomst.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mini-chemostat fermentor	Biotron Inc.	-	manufactured by special order
silicon tubing	Cole-Parmer	Masterflex L/S 13	tubing size can be varied depending on the dilution rate and the size of fermentor jar.
reservoir jar	Bellco	Media storage bottle	20 L
chemicals	Sigma-Aldrich	-	reagent grade
glucose	Sigma-Aldrich	G5767	ACS reagent
NH4Cl	Sigma-Aldrich	A9434	for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5%
NaCl	Sigma-Aldrich	746398	ACS reagent, ≥99%
Na2HPO4·2H2O	Sigma-Aldrich	4272	98.5-101%
KH2PO4	Sigma-Aldrich	795488	ACS reagent, ≥99%
MgSO4·7H2O	Sigma-Aldrich	230391	ACS reagent, ≥98%
CaCl2	Sigma-Aldrich	793639	ACS reagent, ≥96%
thiamine·HCl	Sigma-Aldrich	T4625	reagent grade, ≥99%
Na2·succinate·6H2O	Sigma-Aldrich	S2378	ReagentPlus, ≥99%