Summary
यहाँ, हम chemostat संस्कृति का उपयोग की शर्तों के तहत सूक्ष्मजीवों के अनुकूली प्रयोगशाला विकास प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। इसके अलावा, विकसित तनाव के जीनोमिक विश्लेषण चर्चा की है।
Introduction
सूक्ष्मजीवों को जीवित और विविध वातावरण के लिए अनुकूलित कर सकते हैं। गंभीर तनाव के तहत, अनुकूलन यादृच्छिक जीनोमिक म्यूटेशन और बाद में सकारात्मक चयन 1-3 से फायदेमंद phenotypes के अधिग्रहण के माध्यम से हो सकता है। इसलिए, माइक्रोबियल कोशिकाओं इष्टतम विकास है, जो कहा जाता है "अनुकूली विकास के लिए" चयापचय या नियामक नेटवर्क बदलकर अनुकूलन कर सकते हैं। ऐसे सुपेर्बुग्स के फैलने और मजबूत माइक्रोबियल उपभेदों की घटना के रूप में हाल ही में महत्वपूर्ण माइक्रोबियल प्रवृत्तियों, बहुत बारीकी से तनावपूर्ण परिस्थितियों में विकास अनुकूली से संबंधित हैं। परिभाषित प्रयोगशाला परिस्थितियों के तहत हम आणविक विकास के तंत्र का अध्ययन करने के लिए और यहां तक कि विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए माइक्रोबियल विकास की दिशा को नियंत्रित कर सकते हैं। बहुकोशिकीय जीव के विपरीत, एक कोशिकीय जीवों में अच्छी तरह से निम्नलिखित कारणों के लिए अनुकूली प्रयोगशाला विकास (शराब) के लिए अनुकूल हैं: वे जल्दी से पुनर्जीवित, वे बड़ी आबादी को बनाए रखने, और इसे बनाने और hom बनाए रखने के लिए आसान हैogeneous वातावरण। डीएनए अनुक्रमण तकनीक और उच्च throughput प्रौद्योगिकियों में हाल के अग्रिमों के साथ संयुक्त, शराब जीनोमिक परिवर्तन है कि प्रणालीगत विनियामक परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व के प्रत्यक्ष अवलोकन के लिए अनुमति देता है। Mutational गतिशीलता और जनसंख्या की विविधता भी प्रत्यक्ष कर रहे हैं। जेनेटिक इंजीनियरिंग रणनीतियों शराब उपभेदों 4,5 के विश्लेषण से निर्धारित किया जा सकता है।
Chemostat संस्कृति स्थिर राज्य कोशिकाओं को प्राप्त और किण्वन प्रक्रिया 6 में उत्पादकता बढ़ाने के लिए इस्तेमाल एक विधि है। ताजा माध्यम से जोड़ा जाता है और संस्कृति शोरबा प्रक्रिया (उत्तरार्द्ध मध्यम और बायोमास भी शामिल है) के दौरान काटा जाता है। लंबे समय तक chemostat संस्कृति, तथापि, संस्कृति के स्थिर राज्य उत्पादकता में परिवर्तन और संस्कृति (चित्रा 1 ए) के दौरान सहज म्यूटेशन और चयन के संचय के बारे में लाता है। विभिन्न चयन दबावों (तनाव) के तहत परिवर्तन के संचय बढ़ाया है। एक लंबी अवधि में तनाव का एक क्रमिक वृद्धि chemostat म्यूटेशन, जैसे तापमान, पीएच, आसमाटिक दबाव, पोषक तत्व भुखमरी, ऑक्सीकरण, विषाक्त अंत उत्पादों, आदि कॉलोनी हस्तांतरण एक तरल माध्यम से एक ठोस मध्यम और धारावाहिक हस्तांतरण (दोहराया से उस के रूप में दी तनाव के खिलाफ काम की एक सतत चयन के लिए प्रदान करता है बैच संस्कृति) भी शोधकर्ताओं ने विकसित सूक्ष्मजीवों (चित्रा 1 बी और 1 सी) प्राप्त करने के लिए अनुमति देते हैं। हालांकि chemostat संस्कृति जटिल तरीकों की आवश्यकता है, विविधता के पूल (अनुकरण और जनसंख्या के आकार की संख्या) कॉलोनी हस्तांतरण और सीरियल हस्तांतरण तकनीक के द्वारा प्राप्त की तुलना में अधिक है। व्यक्ति की कोशिकाओं को स्थिर तनाव जोखिम और chemostat संस्कृति (स्थिर राज्य) बैच संस्कृति आधारित तकनीकों की तुलना में शराब के अन्य लाभ कर रहे हैं के दौरान सेलुलर राज्य में बदलाव की कमी हुई। कोलाई उच्च succinate शर्तों के अधीन की तनाव प्रेरित शराब इस लेख में पेश किया है।
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चित्रा 1: अनुकूली प्रयोगशाला विकास के तरीके (ए) Chemostat;। (बी) के सीरियल अंतरण; (सी) कॉलोनी हस्तांतरण। शीर्ष आंकड़े शराब के लिए तरीकों की अवधारणा को वर्णन है, और नीचे आंकड़े कोशिकाओं है कि शराब के दौरान हुई की संख्या को दर्शाते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Protocol
1. उपकरण तैयारी
- एक chemostat जार (150-250 मिलीलीटर) या एक Erlenmeyer कुप्पी (250 मिलीलीटर) एक इनलेट बंदरगाह से युक्त और एक दुकान के बंदरगाह प्राप्त करते हैं। सिलिकॉन टयूबिंग 10-100 मिलीग्राम / घंटा के प्रवाह दरों के लिए अनुमति के साथ बंदरगाहों को जोड़ने। वैकल्पिक रूप से, एक एयर वेंट, एक हवा आउटलेट बंदरगाह, और तापमान नियंत्रित पानी इनलेट और आउटलेट बंदरगाहों का उपयोग करें।
- chemostat जार है कि आंदोलन और तापमान नियंत्रण के लिए प्रदान के लिए उपयुक्त एक डिवाइस प्राप्त (या एक रोटरी मिलाते इनक्यूबेटर का उपयोग करें)।
- आदेश ताजा मध्यम देने और संस्कृति को इकट्ठा करने में दो क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप प्राप्त करते हैं।
- एक जलाशय जार (10-20 एल) एक मध्यम आउटलेट बंदरगाह और एक हवा प्रवेश बंदरगाह से युक्त प्राप्त करते हैं।
- (; एल / एस 13 ट्यूबिंग यानी, आईडी 0.8 मिमी, प्रवाह रेंज 0.06-36 मिलीग्राम / मिनट) कमजोर पड़ने की दर के लिए उपयुक्त सिलिकॉन टयूबिंग प्राप्त करते हैं।
2. मध्यम तैयारी और नसबंदी
- प्रारंभिक मझौले
- 0.3 ग्राम ग्लूकोज, 0.08 छ एनएच 4 भंगसीएल, 0.05 ग्राम सोडियम क्लोराइड, 0.75 ग्राम ना 2 HPO 4 · 2H 2 हे, और 0.3 ग्राम के.एच. 2 4 पीओ 90 में एमएल आसुत जल एक chemostat जार में (DW)।
- ट्यूबिंग clamps का उपयोग कर के साथ साथ chemostat जार सील। हवा वेंट मुहर नहीं है।
- 15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर एक आटोक्लेव में chemostat जार जीवाणुरहित। नसबंदी के बाद, कमरे के तापमान पर chemostat जार की दुकान।
- भंग 0.02 ग्राम MgSO 4 · 7H 2 हे, 0.01 छ CaCl 2, और 10 मिलीलीटर DW (समाधान ए) में 0.1 मिलीग्राम thiamine।
- फिल्टर समाधान एक एक सिरिंज और एक पूर्व निष्फल सिरिंज फिल्टर (0.45 माइक्रोन ताकना फिल्टर) का उपयोग।
- समाधान एक chemostat जार करने के लिए filtrates जोड़ें।
- तनाव मझौले
- 30 ग्राम ग्लूकोज, 8 ग्राम एनएच 4 सीएल, 5 ग्राम सोडियम क्लोराइड, 75 ग्राम ना 2 HPO 4 · भंग 2H 2 हे, 30 ग्राम के.एच. 2 4 पीओ, और 300 ग्राम Disodium succinate hexahydrate (ना 2 · succinate · 6H <उप> 2 हे; एक जलाशय जार में 9.9 एल DW में तनाव इस प्रयोग में इस्तेमाल किया)।
- ट्यूबिंग clamps का उपयोग के साथ-साथ जलाशय जार सील। हवा वेंट मुहर नहीं है।
- 15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर एक आटोक्लेव में जलाशय जार जीवाणुरहित। नसबंदी के बाद, कमरे के तापमान पर जार की दुकान।
- 2 जी MgSO 4 · 7H 2 हे, 1 ग्राम 2 CaCl, और 100 मिलीलीटर DW (समाधान ए) में 10 मिलीग्राम thiamine भंग।
- एक सिरिंज और एक पूर्व निष्फल सिरिंज फिल्टर (0.45 माइक्रोन ताकना फिल्टर) के साथ फिल्टर समाधान ए।
- समाधान एक जलाशय जार करने के लिए filtrates जोड़ें।
- Aseptically जलाशय जार को निष्फल सिलिकॉन टयूबिंग कनेक्ट और क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप देते हैं।
- उच्च तनाव मझौले
- धारा 2.2 में के रूप में के माध्यम से तैयार है, लेकिन तनाव का एक बड़ा एकाग्रता के साथ (यानी, 3-5 जी / एल succinate रूपांतर में उच्च)।
नोट: इस प्रोटोकॉल एक तनाव वीं के अनुकूलन के लिए हैपर मध्यम के माध्यम से दिया जा सकता है। जैसे तापमान, आंदोलन, या रोशनी के रूप में शारीरिक तनाव के मामले में, खेती के हिसाब से तैयार किया जाना चाहिए।
- धारा 2.2 में के रूप में के माध्यम से तैयार है, लेकिन तनाव का एक बड़ा एकाग्रता के साथ (यानी, 3-5 जी / एल succinate रूपांतर में उच्च)।
3. प्रारंभिक खेती
- जंगली प्रकार ई की एक भी कॉलोनी टीका लगाना एक 15 मिलीलीटर परीक्षण प्रारंभिक मध्यम के 4 मिलीलीटर युक्त ट्यूब में कोलाई।
- 37 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटा और 220 आरपीएम के लिए एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में टेस्ट ट्यूब सेते हैं।
- Aseptically हस्तांतरण chemostat जार करने के लिए preculture के 1 मिलीलीटर।
- chemostat जार सेते हैं, 6 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर, वेंटिलेशन (हवा में 50 मिलीग्राम / मिनट) और आंदोलन (200 आरपीएम) के लिए प्रदान करते हैं।
4. तनाव अनुकूलन
- Aseptically chemostat जार करने के लिए पंप से सिलिकॉन टयूबिंग की छोर से कनेक्ट।
- आउटलेट पंप (10 एमएल / घंटा या अधिक) शुरू करें और संस्कृति इकट्ठा।
नोट: संस्कृति, घातीय चरण में होना चाहिए आम तौर पर प्रारंभिक खेती के बाद 4-8 घंटा। - चौधरीआउटलेट ट्यूबिंग से संस्कृति के ऑप्टिकल घनत्व (600 एनएम) Eck।
- इनलेट पंप (10 मिलीग्राम / मानव संसाधन, मानव संसाधन 0.1 -1 के कमजोर पड़ने की दर के लिए इसी) की शुरुआत करें।
- आउटलेट हर 24 घंटा ट्यूबिंग से 600 एनएम पर संस्कृति के ऑप्टिकल घनत्व की जाँच करें।
- 96 घंटा (9.6 गुना कारोबार) या अधिक के लिए chemostat कार्य करते हैं। अगर ऑप्टिकल घनत्व स्थिर है, उच्च तनाव युक्त मध्यम जलाशय का आदान-प्रदान। ऑप्टिकल घनत्व 0.2 से कम है, 6 घंटे के लिए रोक खिला इनलेट पंप। इनलेट पंप पुन: प्रारंभ करें और जाँच करें कि ऑप्टिकल घनत्व 0.2 से अधिक है।
- धीरे-धीरे एक जलाशय में एक उच्च तनाव एकाग्रता से युक्त करने के लिए बदलने के द्वारा तनाव की एकाग्रता में वृद्धि।
- अनुकूलित संस्कृति के नमूने ले जब भी यह एक मील का पत्थर तक पहुँच जाता है (उदाहरण के लिए, एक दबाव 100 ग्राम / एल succinate तनाव के लिए अनुकूलित), और आगे जीनोमिक विश्लेषण के लिए दुकान।
- नमूना भंडारण के लिए, एक निष्फल 80% ग्लिसरॉल soluti के साथ संस्कृति नमूना (0.5 एमएल) के मिश्रणपर (0.5 मिलीलीटर) और इसे -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
नोट: सूक्ष्मजीव शराब की प्रक्रिया के दौरान तनाव नीचा करने की क्षमता प्राप्त कर लेता है, तो किण्वन जार में तनाव एकाग्रता है कि ताजा जलाशय के रूप में ही नहीं है।
तनाव से अनुकूलित तनाव के 5. एकल कॉलोनी अलगाव
- अगर प्लेट मध्यम (1.6% अगर) एक ही तनाव युक्त और मध्यम का एक ही एकाग्रता में तैयार करें।
- chemostat से आउटलेट संस्कृति (0.1 एमएल) की थाली, और 16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
- एक बाँझ दन्तखुदनी का उपयोग कर थाली से एकल कालोनियों उठाओ और उन्हें 15 मिलीलीटर की परीक्षा एक ही तनाव युक्त ट्यूबों में और chemostat के रूप में ही मध्यम एकाग्रता पर टीका लगाना, और 6 घंटे के लिए सेते हैं।
- हस्तांतरण माध्यम के 50 मिलीग्राम से युक्त एक 250 मिलीलीटर Erlenmeyer फ्लास्क में संस्कृति शोरबा के 1 मिलीलीटर। हार्वेस्ट संस्कृति शोरबा के 0.5 मिलीलीटर हर 1 घंटा, और 600 एनएम पर आयुध डिपो को मापने। अनुकूलित strai की विकास दर की तुलना करेंजंगली प्रकार के तनाव को देखते हुए तनाव की है कि एन।
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Representative Results
उच्च succinate तनाव अनुकूलन के लिए, जंगली प्रकार के ई कोलाई W3110 तनाव डी में एक chemostat में सुसंस्कृत था = 0.1 मानव संसाधन -1 270 दिनों के लिए (चित्रा 2)।
चित्रा 2: ई की उच्च succinate तनाव अनुकूलन कोलाई W3110 chemostat संस्कृति का उपयोग कर। पतला तीर बार जिस पर तनाव की एकाग्रता बढ़ गया था संकेत मिलता है, और बोल्ड तीर बार जिस पर संस्कृतियों संरक्षित किया गया संकेत मिलता है। तीर के साथ नंबर तनाव, Disodium succinate hexahydrate की सांद्रता संकेत मिलता है। शराब के दौरान बायोमास में परिवर्तन और तनाव की सांद्रता प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। चित्रा जे से संशोधित किया गया था Biosci। Bioeng 7। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
30 ग्राम / एल (Disodium succinate hexahydrate) की एक प्रारंभिक तनाव एकाग्रता धीरे-धीरे वृद्धि की गई थी, जब भी chemostat संस्कृति एक स्थिर अवस्था तक पहुँच है, जब तक तनाव की एकाग्रता 160 छ / एल था। अनुकूलित ई कोलाई DST160 तनाव (Disodium succinate तनाव की 160 ग्राम / एल के लिए सहिष्णु) 270 दिनों के बाद अधिग्रहण कर लिया था। DST160 तनाव, उच्च succinate तनाव (160 छ / एल तनाव) के तहत बेहिचक विकास का प्रदर्शन करते हुए पूर्वज तनाव (W3110) लगभग कोई विकास (चित्रा 3) से पता चला।
चित्रा 3: जंगली प्रकार (W3110, सफेद वृत्त) के विकास घटता और उच्च succinate तनाव में तनाव (DST160, काले वृत्त) अनुकूलित आंकड़ा बताता है कि अनुकूलित तनाव, जबकि जंगली जोर दिया की स्थिति उच्च succinate के तहत बिना किसी देरी से बढ़ी है। प्रकार से नहीं किया। त्रुटिसलाखों के तीन स्वतंत्र प्रयोगों के मानक विचलन का संकेत मिलता है। चित्रा जे से संशोधित किया गया था Biosci। Bioeng 7। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
सूक्ष्मजीवों उनके तेजी से विकास दर और आनुवंशिक विविधता की वजह से लगभग सभी प्रकार के वातावरण के अनुकूल ढालने में सक्षम हैं। अनुकूली प्रयोगशाला विकास के लिए बनाया गया परिस्थितियों, जो व्यक्ति सहज म्यूटेशन कि शर्तों के तहत दी फायदेमंद होते हैं शरण जीवों के चयन का एक तरीका प्रदान करता है के तहत विकसित करने के लिए सूक्ष्मजीवों सक्षम बनाता है।
chemostat तकनीक निम्नलिखित कारणों के लिए हस्तांतरण तकनीक की तुलना में कृत्रिम रूप से संचालित विकास को प्राप्त करने के लिए और अधिक मजबूत है: (क) एक स्थिर वातावरण - क्योंकि हस्तांतरण तकनीक या तो ठोस पर या तरल माध्यम में बैच संस्कृतियों पर आधारित हैं, कोशिकाओं के माहौल बैच के दौरान बदलता संस्कृति, जबकि स्थिर है chemostat के पर्यावरणीय तनाव; (ख) एक बड़ी आबादी और एक सतत चयन - chemostat की बड़ी आबादी के हस्तांतरण तकनीक की छोटी आबादी से भी अधिक आनुवंशिक विविधता प्रदान करता है। चर्चा की सतत चयनemostat तकनीक के लिए एक तेजी से रास्ता हस्तांतरण तकनीक का रुक-रुक कर चयन से विकास को प्राप्त है। यह महत्वपूर्ण है कि chemostat संस्कृति शराब की प्रक्रिया के दौरान अन्य सूक्ष्मजीवों द्वारा दूषित नहीं किया, और सड़न रोकनेवाला शर्तों chemostat संस्कृति भर में आवश्यक हैं। शराब प्रक्रिया ऐसी ऑक्सीडेटिव तनाव, आसमाटिक तनाव, और विषाक्त उत्पाद तनाव के रूप में तनाव में परिवर्तन के द्वारा संशोधित किया जा सकता है। वहाँ chemostat संस्कृति से शराब के लिए कुछ तकनीकी सीमाएं हैं। विकास संयोग से जगह लेता है; इसलिए, विभिन्न शोधकर्ताओं ने एक ही विकासवादी परिणाम प्राप्त करने में सक्षम नहीं हो सकता है, हालांकि परिवर्तन के परिणामों से संबंधित हो सकता है। एक और सीमा chemostat संस्कृति के बाहर धोने जब तनाव की एकाग्रता बहुत जल्दी बढ़ जाती है। बायोमास एक निश्चित राशि (यानी, आयुध डिपो = इस प्रक्रिया में 0.2) में कमी आई है तो बाद तनाव की एकाग्रता बढ़ जाती है, तनाव के प्रशासन के लिए कम से कम कुछ पीढ़ियों के लिए रुका किया जाना चाहिएतनाव समय अनुकूल करने के लिए दे।
जीनोम अनुक्रमण प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में हाल के घटनाक्रम म्यूटेशन कि कुछ तनावपूर्ण स्थितियों के जवाब में विकसित की समझ में मदद मिली है। उदाहरण के लिए, एक डीएनए उत्परिवर्तन एक विशेष प्रणालीगत प्रभाव यह देखते हुए कि पर्यावरण (यानी, एक जहरीले तनाव को सहिष्णुता) के लिए फायदेमंद है बदल। इस प्रकार, शराब जीन समारोह या नेटवर्क विनियमन, या 'त्वरित विकास' के लिए कच्चे माल के रूप में अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। शराब पढ़ाई भी, एंटीबायोटिक प्रतिरोधी बैक्टीरिया के विकास का अनुकरण तंत्र है जिसके द्वारा खतरनाक दवा प्रतिरोधी जीवाणु उपभेदों उठता का संकेत में उपयोगी होते हैं। के रूप में विकास की गति को जीनोम पर उत्कीर्ण है, आनुवंशिक परिवर्तन (जैसे कि तनाव सहिष्णुता के रूप में) वांछित phenotypes के लिए नेतृत्व को उजागर करने के लिए अगले बाधा एक बार विकसित उपभेदों 8 प्राप्त कर रहे है। वर्तमान में उपलब्ध अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों के बीच, Illumina और आयन धार बेनीरूपों न्यूक्लियोटाइड प्रतिस्थापन या छोटे indels कि विकसित उपभेदों में होने का पता लगाने के लिए उपयुक्त हैं, और दोनों सस्ती हैं। क्योंकि संस्करण का पता लगाने आम तौर पर संदर्भ दृश्यों की छोटी-पढ़ मानचित्रण शामिल है, पैतृक तनाव के जीनोम अनुक्रम की उपलब्धता के लिए महत्वपूर्ण है। यहां तक कि अगर संस्थापक तनाव के जीनोम अनुक्रम सार्वजनिक डेटाबेस से उपलब्ध है, यह अक्सर विकसित एक के साथ एक साथ यह क्रम के लिए वांछनीय है, क्योंकि वहाँ वास्तविक शुरुआती तनाव में कुछ अतिरिक्त मतभेद हो सकता है। उत्परिवर्तन की पहचान के लिए प्रोटोकॉल वेब या एक साहित्य खोज 9,10 के माध्यम से आसानी से उपलब्ध हैं। उदाहरण के लिए, BRESEQ प्रयोगशाला विकसित अगली पीढ़ी के अनुक्रमण डेटा का उपयोग कर 11 रोगाणुओं के जीनोमिक विश्लेषण के लिए एक विशेष रूप से डिजाइन पाइप लाइन है। कुछ मील के पत्थर पर विकसित उपभेदों की तुलना (उदाहरण के लिए, इस प्रतिनिधि डेटा, जंगली प्रकार, DST50, DST100, और DST160 में) विकसित तनाव के अनुक्रम प्रदान कर सकते हैंऔर एक दिया तनाव के परिणाम के बारे में विस्तृत जानकारी दे। इसलिए, ज्ञान और शराब प्रयोगों, सिस्टम जीव विज्ञान और प्रणालीगत गड़बड़ी चर की पहचान के साथ मिलकर की अनुप्रयोगों, निकट भविष्य में होने की उम्मीद कर रहे हैं।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mini-chemostat fermentor | Biotron Inc. | - | manufactured by special order |
| silicon tubing | Cole-Parmer | Masterflex L/S 13 | tubing size can be varied depending on the dilution rate and the size of fermentor jar. |
| reservoir jar | Bellco | Media storage bottle | 20 L |
| chemicals | Sigma-Aldrich | - | reagent grade |
| glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | ACS reagent |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5% |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | ACS reagent, ≥99% |
| Na2HPO4·2H2O | Sigma-Aldrich | 4272 | 98.5-101% |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 | ACS reagent, ≥99% |
| MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | ACS reagent, ≥98% |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 793639 | ACS reagent, ≥96% |
| thiamine·HCl | Sigma-Aldrich | T4625 | reagent grade, ≥99% |
| Na2·succinate·6H2O | Sigma-Aldrich | S2378 | ReagentPlus, ≥99% |
References
- Rando, O. J., Verstrepen, K. J. Timescales of genetic and epigenetic inheritance. Cell. 128, 655-668 (2007).
- Kim, H. J., et al. Short-term differential adaptation to anaerobic stress via genomic mutations by Escherichia coli strains K-12 and B lacking alcohol dehydrogenase. Front Microbiol. 5, 476 (2014).
- Mendizabal, I., Keller, T. E., Zeng, J., Yi, S. V. Epigenetics and evolution. Integr Comp Biol. 54, 31-42 (2014).
- Lee, J. Y., Seo, J., Kim, E. S., Lee, H. S., Kim, P. Adaptive evolution of Corynebacterium glutamicum resistant to oxidative stress and its global gene expression profiling. Biotechnol Lett. 35, 709-717 (2013).
- Lee, J. Y., et al. Artificial oxidative stress-tolerant Corynebacterium glutamicum. AMB Express. 4, 15 (2014).
- Narang, A. The steady states of microbial growth on mixtures of substitutable substrates in a chemostat. J Theor Biol. 190, 241-261 (1998).
- Kwon, Y. D., Kim, S., Lee, S. Y., Kim, P. Long-term continuous adaptation of Escherichia coli to high succinate stress and transcriptome analysis of the tolerant strain. J Biosci Bioeng. 111, 26-30 (2011).
- Barrick, J. E., Lenski, R. E. Genome dynamics during experimental evolution. Nat Rev Genet. 14, 827-839 (2013).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
- McKenna, A., et al. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).
- Deatherage, D. E., Barrick, J. E. Identification of mutations in laboratory-evolved microbes from next-generation sequencing data using breseq. Methods Mol Biol. 1151, 165-188 (2014).
