Summary
여기서는 chemostat 문화 사용 조건 하에서 미생물 적응 진화 실험을 얻을 프로토콜을 제시한다. 또한, 진화 된 균주의 게놈 분석은 설명한다.
Introduction
미생물이 생존하고 다양한 환경에 적응할 수 있습니다. 심한 스트레스, 적응은 임의의 게놈 변이 이후 긍정적 인 선택 1-3으로 도움이 표현형의 인수를 통해 발생할 수 있습니다. 따라서, 균체는 "적응 진화"이라한다 최적 성장을 위해 대사 또는 규제 네트워크를 변경하여 적용 할 수있다. 이러한 슈퍼 박테리아의 발생 및 강력한 미생물 균주의 발생으로 최근 중요한 미생물 경향은 매우 밀접하게 스트레스 조건에서 진화를 적응 적 관련이 있습니다. 정의 실험실 조건에서, 우리는 분자 진화의 메커니즘을 연구에도 다양한 용도 미생물 진화의 방향을 제어 할 수있다. 그들은 큰 개체군을 유지 빠르게 재생하고, 생성 및 혼을 유지하기 쉽다 : 다세포 유기체 달리 단세포 유기체 이유는 다음 실험실 적응 진화 (ALE)에 적합ogeneous 환경. DNA 시퀀싱 기술과 높은 처리량 기술의 최근 발전과 결합, ALE는 전신 규제 변화로 이어질 게놈의 변화를 직접 관찰 할 수 있습니다. 돌연변이 역학 및 인구의 다양성도 관찰 할 수 있습니다. 유전 공학 전략 ALE 균주 4,5의 분석으로부터 결정될 수있다.
Chemostat 배양 정상 세포를 얻는 발효 공정 6의 생산성을 향상하기 위해 사용하는 방법이다. 신선한 배지를 첨가하고, 배양액의 처리 (후자는 중간 및 바이오 매스를 포함한다) 중에 수확된다. 장기 배양 chemostat 그러나 배양 정상 생산성을 변경하여 배양 (도 1a) 중 자발적인 돌연변이 및 선택의 축적을 초래한다. 다양한 선택 압력 (스트레스)에서 돌연변이의 축적이 향상된다. 장기 응력 점진적 증가 chemostat는 반복 액체 매질에서 고체 배지 및 시리얼 전송 (에서 온도, pH, 삼투압, 영양 결핍, 산화, 독성 최종 제품 등 식민지 전송으로 지정된 스트레스에 반대 돌연변이의 연속 선택을 제공합니다 배치 배양)도 연구 진화 미생물 (도 1B 및 1C)을 수득 할 수있다. chemostat 배양 복잡한 방법이 필요하지만, 다이버 시티 풀 (복제 인구 크기의 수) 콜로니 전송과 시리얼 전송 기술에 의해 얻어진 것보다 높다. 각각의 세포에 안정 스트레스 노출과는 chemostat 문화 (정상 상태) 일괄 문화 기반 기술에 비해 ALE의 다른 혜택입니다 동안 세포 상태의 변화를 감소. 높은 숙시 네이트 조건에 적용 대장균의 스트레스 유발 ALE는이 문서에서 소개된다.
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그림 1 : 적응 형 실험실 진화의 방법 (A) Chemostat;. (B) 시리얼 전송하는 단계; (C) 식민지 전송. 상단 그림은 ALE에 대한 방법의 개념을 설명하고, 아래 그림은 ALE 동안 성장 세포의 수를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Protocol
1. 장비 준비
- chemostat 항아리 (150-250 ml)로 또는 유입구를 함유하는 삼각 플라스크 (250 mL) 및 출구 포트를 얻었다. 실리콘 튜브는 10 ~ 100 ㎖ / hr의 유량을 허용하여 포트를 연결합니다. 선택적으로 통기, 공기 출구, 및 온도 조절 물 입구 및 출구 포트를 사용한다.
- 교반 및 온도 제어를 제공하는 chemostat 항아리에 적합한 장치를 취득 (또는 회전 진탕 배양기를 사용).
- 문화를 새로운 배지를 전달하고 수집하기 위해 두 개의 연동 펌프를 얻습니다.
- 매체 출구 포트 및 공기 입구 포트를 포함하는 저장 용기 (10 ~ 20 L)을 얻었다.
- (; L / S (13) 튜브 즉, ID 0.8 mm, 유량 범위 0.06-36 ml / 분) 희석 비율에 적합한 실리콘 튜브를 얻습니다.
2. 중간 준비 및 살균
- 초기 중간
- 0.3 g 포도당, 0.08 g NH 4를 녹여CL, 0.05 g의 NaCl, 0.75 g 나 2 HPO 4 · 2H 2 O, 0.3 g의 KH 2 PO 4 90 ml의 증류수 chemostat 항아리 (DW).
- 클램프를 사용하여 튜브와 함께 chemostat 항아리를 밀봉합니다. 통풍구를 밀봉하지 마십시오.
- 15 분 동안 121 ℃에서 오토 클레이브에서 chemostat 항아리 소독. 살균 한 후, 실온에서 chemostat 항아리를 저장합니다.
- 녹인 0.02 g 황산 · 7H 2 O, 0.01 g의 CaCl2를, 10 ml의 DW (용액 A) 0.1 mg의 티아민.
- 주사기 및 미리 멸균 주사기 필터 (0.45 ㎛의 세공 필터)를 사용하여 용액 A 필터.
- A는 chemostat 항아리에 여과하는 솔루션을 추가합니다.
- 스트레스 중간
- 30g 글루코스 8g NH 4 CL, 5g의 NaCl, 75g이 나 HPO 4 · 용해 2H 2 O, 30g의 KH 2 PO 4, 300g 나트륨 숙시 네이트 수화물 (NA 2 · 숙신산 · 6H <서브> 2 O; 저수지 항아리에 9.9 L DW에서이 실험에 사용 된 스트레스).
- 클램프를 사용하여 튜브와 함께 저장 항아리를 밀봉합니다. 통풍구를 밀봉하지 마십시오.
- 15 분 동안 121 ℃에서 오토 클레이브 저류 용기 살균. 멸균 후, 실온에서 보관 용기.
- 2g 황산 4 · 7H 2 O, 1g의 염화칼슘 2, 100 ㎖ DW (용액 A) 10 mg을 티아민을 녹인다.
- 주사기 및 미리 멸균 주사기 필터 (0.45 ㎛의 세공 필터)와 필터 A 액.
- A는 저장 항아리에 여과하는 솔루션을 추가합니다.
- 무균는 저장 항아리에 살균 실리콘 튜브를 연결하고 연동 펌프를 연결합니다.
- 스트레스가 높은 중간
- 2.2 절에서와 같이 매체를 준비하지만, 스트레스의 큰 농도 (즉, 숙시 네이트 적응에 3~5g / L 이상).
참고 :이 프로토콜은 스트레스 일에 적응입니다AT는 매체를 통해 전달 될 수있다. 온도, 교반이나 조명과 같은 물리적 스트레스의 경우, 배양이 적절하게 설계되어야한다.
- 2.2 절에서와 같이 매체를 준비하지만, 스트레스의 큰 농도 (즉, 숙시 네이트 적응에 3~5g / L 이상).
3. 초기 재배
- 야생형 E.의 단일 식민지의 예방 초기 배지 4 mL를 함유하는 15 ㎖의 시험관에 대장균.
- 37 ° C에서 12 시간, 220 rpm으로의 진탕 배양기에서 테스트 튜브를 품어.
- 무균 전송 chemostat 항아리에 예비 배양 1 ㎖.
- 6 시간 동안 37 ° C에서, 폭기 (공기 50 ml / 분)와 교반 (200 rpm으로)에 대해 제공하는 chemostat 항아리를 품어.
4. 스트레스 적응
- 무균는 chemostat 항아리에 펌프 실리콘 튜브의 끝을 연결합니다.
- 배출 펌프 (10 ㎖ / 시간 이상)을 시작하고 문화를 수집합니다.
참고 : 문화는 일반적으로 4-8 시간 초기 배양 한 후, 지수 상에 있어야합니다. - 장출구 관에서 문화의 광학 밀도 (600 nm의) 에크.
- 입구 펌프 (0.1 시간-1의 희석 비율에 해당하는 10 ㎖ / 시간 등)를 시작합니다.
- 매 24 시간을 튜브 콘센트에서 600 nm에서 문화의 광학 밀도를 확인합니다.
- 96 시간 (9.6 배 매출) 이상에 대한 chemostat을 운영하고 있습니다. 광학 농도가 안정되면, 높은 스트레스 매체를 함유하는 저장 용기를 교환한다. 광학 밀도가 0.2보다 낮 으면, 6 시간에 대한 공급 흡입 펌프를 멈춘다. 입구 펌프를 다시 시작하고 광학 밀도가 0.2 이상인지 확인합니다.
- 점차 높은 스트레스 농도를 함유하는 저장조로 변경하여 스트레스의 농도를 증가시킨다.
- 이 이정표에 도달 할 때마다 적응 문화의 샘플을 채취 (예를 들어, 100g / L 숙시 네이트 스트레스에 적응 주) 더 게놈 분석 및 저장.
- 샘플 수납하는 멸균 80 % 글리세롤 soluti 함께 배양 시료 (0.5 ml)에 혼합상 (0.5 ml)에 용해시키고 -80 ℃에서 보관.
주 : 상기 미생물은 ALE 과정에서 스트레스를 저하시키는 능력을 취득하는 경우, 발효 용기에서 스트레스 농도는 신선한 저장조와 동일하지 않다.
스트레스 적응 변형 5. 단일 콜로니 분리
- 한천 평판 배지 (1.6 % 한천) 같은 스트레스를 함유 매체의 동일한 농도를 준비합니다.
- chemostat에서 출구 배양 (0.1 ㎖) 플레이트, 16 시간 동안 37 ℃에서 배양한다.
- 멸균 된 이쑤시개를 이용하여 플레이트로부터 단일 콜로니를 선택하고, 동일한 스트레스를 함유하는 15 ㎖의 시험관에 상기 chemostat와 동일한 중간 농도 그들을 접종하고, 6 시간 동안 배양한다.
- 전사 배지 50 ㎖를 포함하는 250 ㎖의 삼각 플라스크에 배양액 1 ㎖. 수확 배양액 0.5ml를 각 1 시간, 600 nm에서의 OD를 측정한다. 적응 strai의 성장 속도를 비교하여스트레스 요인 특정 야생형 균주의 것과 N.
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Representative Results
높은 숙시 응력 적응 야생형 E. 대장균 W3110 균주는 D에서 chemostat에서 배양 = 0.1 시간 -1 270일에 대한 (그림 2).
그림 2 : E.의 높은 숙시 네이트 스트레스 적응 대장균을 이용하여 배양 chemostat W3110. 얇은 화살표는 스트레스의 농도가 증가하는 시간을 나타내고, 굵은 화살표는 배양 하였다 보존하는 시간을 나타낸다. 화살표 번호는 스트레스, 나트륨 숙시 네이트 육수화물의 농도를 나타낸다. ALE 동안 바이오 매스의 변화와 스트레스의 농도가 표시됩니다. 그림은 J.에서 수정 된 Biosci. Bioeng 7. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
chemostat 문화가 정상 상태에 도달 할 때마다 스트레스의 농도가 160g / L가 될 때까지의 30g / L의 (나트륨 숙시 네이트 수화물)의 초기 스트레스 농도는 점차적으로 증가 하였다. 적응 E. (나트륨 숙시 응력 160 그램 / L의 내성) DST160 콜라이 균주 270 일 후에 수집 하였다. 조상 균주 (W3110)이 거의없는 성장 (그림 3)을 보여 주었다 동안 DST160 균주는 높은 숙시 네이트 스트레스 (160g / L의 스트레스 요인)에 따라 자유로운 성장을 보였다.
그림 3 : 야생형 (W3110, 흰색 원)의 성장 곡선과 높은 숙시 네이트 스트레스 변형 (DST160, 검은 색 원)을 적용 그림은 적응 변형 야생 동안 높은 숙시 네이트에서 지체없이 스트레스 조건 성장을 보여준다. 유형은하지 않았다. 오류바는 3 개의 독립적 인 실험의 표준 편차를 나타냅니다. 그림은 J.에서 수정 된 Biosci. Bioeng 7. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
미생물 때문에 빠른 성장 속도와 유전 적 다양성의 거의 모든 환경에 적응시킬 수있다. 적응 진화 실험은 주어진 조건 하에서 유용 자연 돌연변이를 보유하는 개개의 유기체를 선택하는 방법을 제공하는 설계 조건 하에서 미생물 발전을 가능하게한다.
chemostat 기술은 다음과 같은 이유로 이전 기법보다 인위적 구동 발전을 달성하기위한 더 강력 : (a) 정상 환경 - 전송 기술들은 고체 또는 액체 매질 중 회분식 배양 기반으로하기 때문에, 세포의 환경을 배치하는 동안 변화 문화 chemostat의 환경 스트레스가 정상 상태에서; (b) 더 큰 모집단과 연속 선택 - chemostat의 큰 모집단은 전사 기술의 작은 집단 이상의 유전 적 다양성을 제공한다. 은 ch 연속 선정emostat 기술은 전사 기술 간헐적 선택보다 발전을 달성하기위한 빠른 방법이다. chemostat 문화가 ALE 과정에서 다른 미생물에 의해 오염되지 않는 것이 중요하며, 무균 조건은 chemostat 문화 전반에 걸쳐 필요합니다. 에일 맥주 절차는 이러한 산화 스트레스, 삼투압 스트레스, 독성 제품 스트레스로 스트레스를 변경, 수정할 수 있습니다. chemostat 문화에 의해 ALE에 대한 몇 가지 기술적 인 제한이 있습니다. 진화는 우연히 일어난다; 돌연변이의 결과가 관련 될 수도 있지만 따라서, 다른 연구자들은 동일한 진화 결과를 얻을 수없는 경우가 있습니다. 스트레스의 농도가 너무 빨리 증가 할 때 다른 제한 chemostat 문화에 워시 아웃이다. 바이오 매스는 일정 금액 (예 : OD =이 절차 0.2)로 감소되면 스트레스의 농도가 증가 후 스트레스의 관리는 적어도 몇 세대를 중단해야한다적응 변형 시간을 제공합니다.
게놈 시퀀싱 기술의 최근 발전은 특정 스트레스 조건에 따라 돌연변이 발전의 이해를 도왔다. 예를 들어, DNA 돌연변이는 주어진 환경 (독성 스트레스에, 즉 허용 오차)에 유익한 특정 전신 효과를 변화시킨다. 따라서, ALE는 유전자 기능이나 네트워크 조절 또는 '가속 진화'원료 등을 연구하는데 이용 될 수있다. ALE 연구는 항생제 내성균의 개발을 시뮬레이션 위험한 약제 내성 균주가 발생하는 메커니즘을 표시하는데 유용하다. 진화의 궤적이 (예 : 스트레스 내성 등) 원하는 표현형으로 이어질 유전 변경을 발굴, 게놈에 새겨 져으로 한 번 진화 균주 8 얻어 다음 장애물이다. 현재 이용 가능한 차세대 시퀀싱 기술 중, Illumina 사 이온 런트 말하형태는 염기 치환 또는 진화 계통에서 발생하는 작은 삽입과 삭제의 검출에 적합하고, 모두가 적당하다. 변형 검출 보통 레퍼런스 시퀀스의 짧은 판독 매핑을 포함하므로, 선조 균주의 게놈 서열의 이용은 매우 중요하다. 설립자 균주의 게놈 서열이 공개 데이터베이스에서 사용할 경우에도 실제 시작 변형에 몇 가지 추가 차이가있을 수 있기 때문에, 진화 한 동시에 그것을 순서에 종종 바람직하다. 돌연변이 식별을위한 프로토콜은 웹 또는 문헌 검색 9,10 통해 쉽게 사용할 수 있습니다. 예를 들어, BRESEQ 차세대 시퀀싱 데이터 (11)를 사용하여 실험실 진화 미생물의 게놈 분석을 위해 특별히 디자인 된 파이프 라인이다. (예를 들어,이 대표 데이터, 야생형, DST50, DST100 및 DST160에서) 특정 이정표에서 진화 계통의 비교는 진화 변형의 순서를 제공 할 수 있습니다s와 주어진 스트레스의 결과에 대한 통찰력을 제공합니다. 따라서, 기술 및 시스템 생물학 전신 교란 변수들의 식별과 결합 ALE 실험의 애플리케이션은 가까운 장래에 기대된다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mini-chemostat fermentor | Biotron Inc. | - | manufactured by special order |
| silicon tubing | Cole-Parmer | Masterflex L/S 13 | tubing size can be varied depending on the dilution rate and the size of fermentor jar. |
| reservoir jar | Bellco | Media storage bottle | 20 L |
| chemicals | Sigma-Aldrich | - | reagent grade |
| glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | ACS reagent |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5% |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | ACS reagent, ≥99% |
| Na2HPO4·2H2O | Sigma-Aldrich | 4272 | 98.5-101% |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 | ACS reagent, ≥99% |
| MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | ACS reagent, ≥98% |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 793639 | ACS reagent, ≥96% |
| thiamine·HCl | Sigma-Aldrich | T4625 | reagent grade, ≥99% |
| Na2·succinate·6H2O | Sigma-Aldrich | S2378 | ReagentPlus, ≥99% |
References
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- Kim, H. J., et al. Short-term differential adaptation to anaerobic stress via genomic mutations by Escherichia coli strains K-12 and B lacking alcohol dehydrogenase. Front Microbiol. 5, 476 (2014).
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