Förfarande för adaptiv Laboratory Evolution av mikroorganismer med hjälp av en kemostat

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att erhålla adaptiv laboratorium utvecklingen av mikroorganismer under betingelser med användning kemostat kultur. Dessutom är genom-analys av den utvecklade stammen diskuteras.

Introduction

Mikroorganismer kan överleva och anpassa sig till olika miljöer. Under svår stress, kan anpassning ske via förvärv av nyttiga fenotyper av slumpmässiga genomiska mutationer och efterföljande positiv selektion ^1-3. Därför kan mikrobiella celler anpassa genom att ändra metaboliska eller regulatoriska nätverk för optimal tillväxt, som kallas "adaptiv evolution". Senaste viktiga mikrobiella tendenser, såsom utbrott av superbugs och förekomsten av robusta mikrobiella stammar, är mycket nära släkt med adaptiv evolution under stressiga förhållanden. Under definierade laboratoriemiljö, har vi möjlighet att studera mekanismerna för molekylär evolution och även styra riktningen på mikrobiell utveckling för olika tillämpningar. Till skillnad från flercelliga organismer, encelliga organismer är väl lämpade för adaptiv laboratorie evolution (ALE) av följande skäl: de regenerera snabbt, de behåller stora populationer, och det är lätt att skapa och underhålla homogeneous miljöer. Kombinerat med de senaste framstegen inom DNA-sekvenseringstekniker och teknik med hög kapacitet, gör ALE för direkt observation av genomiska förändringar som leder till systemregelförändringar. Mutations dynamik och en mångfald av befolkningen är också observeras. Gentekniska strategier kan bestämmas genom analys av alestammar ^4,5.

Kemostat kultur är en metod som används för att erhålla steady-state-celler och öka produktiviteten i jäsningsprocesser ^6. Färskt medium tillsätts och odlingsbuljong skördas under processen (den senare innefattar mediet och biomassa). Långsiktig kemostat kultur, men ändrar steady-state produktivitet kultur och medför ackumulering av spontana mutationer och urval under odling (Figur 1a). Under olika selektionstryck (stressorer), är en ansamling av mutationer förbättras. En gradvis ökning av stress i ett långsiktigt kemostat föreskrivs en kontinuerlig urval av mutationer som arbetar mot de givna stressfaktorer, såsom temperatur, pH, osmotiskt tryck, näringsämnen svält, oxidation, giftiga slutprodukter, etc. Colony överföring från ett fast medium och seriell överföring från ett vätskemedium (upprepad satsvis odling) tillåter också forskare att erhålla utvecklats mikroorganismer (Figur 1b och 1c). Även kemostat kultur kräver komplicerade metoder, är poolen av mångfald (antal upprepningar och populationsstorlek) högre än den som erhålls genom koloniöverförings och serieöverföringsteknik. Den stabila spännings exponering för enskilda celler och minskad variation i den cellulära tillstånd under kemostat kultur (steady state) är andra fördelar med ALE jämfört med satskulturbaserade tekniker. Stressinducerad ALE av Escherichia coli utsätts för höga succinat villkor införs i den här artikeln.

iles / ftp_upload / 54446 / 54446fig1.jpg "/>
Figur 1: Metoder för adaptiv laboratorie evolution (A) kemostat;. (B) seriell överföring; (C) koloniöverförings. Den översta figurer illustrerar begreppet metoder för ALE, och botten siffror visar antalet celler som växte under ALE. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Protocol

1. Förberedelse av utrustning

1. Erhålla en kemostat burk (150-250 ml) eller en Erlenmeyer-kolv (250 ml) innehållande en inloppsport och en utloppsport. Anslut portarna med kisel slang möjliggör för flödeshastigheter av 10-100 ml / h. Du kan också använda en luftventil, en luftutloppsöppning, och temperaturreglerade in- vatten och utloppsportar.
2. Skaffa en anordning som är lämplig för kemostaten burken som ger agitation och temperaturkontroll (eller använd en roterande skakinkubator).
3. Erhålla två peristaltiska pumpar för att leverera färskt medium och samla kulturen.
4. Erhålla en reservoar burk (20/10 L) innehållande ett medium utloppsport och en luftinloppsport.
5. Erhålla kisel slang lämplig för utspädningshastighet (dvs., ID 0,8 mm, flödesområde 0,06-36 ml / min; L / S 13 slangar).

2. Medium Förberedelser och sterilisering

1. initial Medium
   1. Lös upp 0,3 g glukos, 0,08 g NH ₄Cl, 0,05 g NaCl, 0,75 g Na ₂ HPO ₄ • ₂ H2O, och 0,3 g KH ₂ PO ₄ i 90 ml destillerat vatten (DW) i en kemostat burk.
   2. Täta kemostaten burk tillsammans med slangen med klämmor. Inte täta luftgallret.
   3. Sterilisera kemostat burken i en autoklav vid 121 ° C under 15 min. Efter sterilisering, förvara kemostat burk vid rumstemperatur.
   4. Lös upp 0,02 g MgSO ₄ · 7 _H2O, 0,01 g _CaCl2 och 0,1 mg tiamin i 10 ml DW (lösning A).
   5. Filter lösning A med användning av en spruta och en i förväg steriliserad sprutfilter (ett 0,45 | j, m por-filter).
   6. Tillsätta lösningen A-filtraten till kemostat burken.
2. Stress Medium
   1. Lös upp 30 g glukos, 8 g _NH4CI, 5 g NaCl, 75 g Na ₂ HPO ₄ • ₂ H2O, 30 g KH ₂ PO _4, och 300 g dinatrium-succinat hexahydrat (Na ₂ · succinat · 6H <sub> 2 O; den stressor som används i detta experiment) i 9,9 L DW i en reservoar burk.
   2. Täta behållaren burk tillsammans med slangen med klämmor. Inte täta luftgallret.
   3. Sterilisera behållaren burk i en autoklav vid 121 ° C under 15 min. Efter sterilisering, lagra burken vid rumstemperatur.
   4. Lös upp 2 g MgSO ₄ · 7 _H2O, 1 g _CaCl2 och 10 mg tiamin i 100 ml DW (lösning A).
   5. Filter lösning A med en spruta och en i förväg steriliserad sprutfilter (ett 0,45 | j, m por-filter).
   6. Tillsätta lösningen A-filtraten till reservoaren burken.
   7. Aseptiskt ansluter steriliserade kisel slangen till reservoaren burken och fäster de peristaltiska pumparna.
3. Hög stress Medium
   1. Förbered mediet som i avsnitt 2.2, men med en större koncentration av stress (dvs 3-5 g / L högre i succinat anpassning).
      Obs: Detta protokoll är för anpassning till en spänning thvid kan levereras via mediet. I fallet med fysiska stressorer, såsom temperatur, agitation, eller belysning, bör odlingen utformas i enlighet därmed.

3. Initial Odling

1. Ympa en enda koloni av vildtyp E. coli i ett 15 ml provrör innehållande 4 ml av initial medium.
2. Inkubera provröret i ett skakande inkubator under 12 h vid 37 ° C och 220 rpm.
3. Överför aseptiskt 1 ml förodling till kemostaten burken.
4. Inkubera kemostat burk, som innehåller luftning (luft 50 ml / min) och omrörning (200 rpm), vid 37 ° C under 6 h.

4. Stress Anpassning

1. Aseptiskt anslut änden av kisel slangen från pumparna till kemostat burken.
2. Starta utloppspumpen (10 ml / h eller högre) och samla kultur.
   Notera: Kulturen bör vara i den exponentiella fasen, typiskt 4-8 h efter initial odling.
3. Check den optiska densiteten (600 nm) av kulturen från utloppsslangen.
4. Starta pumpinloppet (10 ml / h, vilket motsvarar en hastighet av utspädning av 0,1 tim ^-1).
5. Kontrollera den optiska densiteten av kulturen vid 600 nm från utloppsslangen varje 24 h.
6. Manövrera kemostaten för 96 h (9,6-faldig omsättning) eller mer. Om den optiska densiteten är stabil, byta ut behållare innehållande den höga-stress-medium. Om den optiska densiteten är lägre än 0,2, stoppa intaget till pumpen utfodring under 6 timmar. Starta pumpinloppet och kontrollera att den optiska densiteten är över 0,2.
7. Gradvis öka koncentrationen av den stressfaktor genom att ändra till en reservoar som innehåller ett högre stressor koncentration.
8. Ta prover av den anpassade kultur när den når en milstolpe (t.ex. en stam anpassad till 100 g / L succinat stress), och lagra för ytterligare genomisk analys.
9. För provförvaring, blanda provet kultur (0,5 ml) med en steriliserad 80% glycerol solutipå (0,5 ml) och förvara den vid -80 ° C.
   Obs: Om mikroorganismen förvärvar en förmåga att bryta ned stressfaktor under ALE processen, inte är densamma som i den friska behållaren stressor koncentrationen i fermentations burken.

5. Single-koloni Isolering av stress anpassade Strain

1. Förbereda agarplatta-medium (1,6% agar) innehållande samma stressfaktor och vid samma koncentration av medium.
2. Plate utlopps kultur (0,1 ml) från kemostat, och inkubera vid 37 ° C under 16 h.
3. Plocka enskilda kolonier från plattan med användning av en steril tandpetare och inokulera dem i 15 ml provrör innehållande samma stressfaktor och på samma medium koncentration som i kemostat, och inkubera i 6 timmar.
4. Över 1 ml av odlingsbuljongen i en 250 ml Erlenmeyer-kolv innehållande 50 ml medium. Harvest 0,5 ml av odlingsbuljongen varje en timme, och mäta OD vid 600 nm. Jämföra tillväxthastigheten för den anpassade strain med den för vildtyp stam med tanke på stress.

Representative Results

För hög succinat spänningsanpassning, vildtyp E. coli W3110 stam odlades i en kemostat vid D = 0,1 h ^-1 för 270 dagar (figur 2).

Figur 2: Hög-succinat stressen anpassning av E. coli W3110 med användning kemostat odling. Tunna pilar anger de tider vid vilka koncentrationen av stressfaktor ökades, och fet pilar anger de tider vid vilka kulturer bevarades. Tal med pilar anger koncentrationerna av stressfaktor, dinatriumsuccinat hexahydrat. Förändringen av biomassan under ALE och koncentrationerna av stressfaktor är representerade. Siffran ändrades från J. Biosci. Bioeng ^7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

En initial stresskoncentration av 30 g / L (dinatriumsuccinat hexahydrat) ökades gradvis närhelst kemostat kulturen nådde ett stationärt tillstånd, tills koncentrationen av stressfaktor var 160 g / L. Den anpassade E. coli DST160 stam (tolerant till 160 g / L av dinatriumsuccinat stress) förvärvades efter 270 dagar. Den DST160 stammen uppvisade ohämmad tillväxt under hög-succinat stress (160 g / L stress), medan förfader stam (W3110) visade nästan ingen tillväxt (Figur 3).

Figur 3: Tillväxtkurvor för vildtypen (W3110, vit cirkel) och anpassad stam (DST160, svart cirkel) under hög succinat stressen Figuren visar att den anpassade stammen växte utan dröjsmål under hög succinat stressade förhållanden medan det vilda. typ inte. Feletstaplar indikerar standardavvikelsen för tre oberoende försök. Siffran ändrades från J. Biosci. Bioeng ^7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Mikroorganismer är kapabla att anpassa sig till nästan alla miljöer på grund av deras snabba tillväxt och den genetiska mångfalden. Adaptiv laboratorium evolution gör mikroorganismer att utvecklas enligt utformade villkor, vilket ger ett sätt att välja individuella organismer som härbärgerar spontana mutationer som är fördelaktiga under givna förutsättningar.

Den kemostat teknik är mer robust för att uppnå konstgjord väg driven evolution än överföringsteknik av följande skäl: (a) en stadig miljö - eftersom överföringstekniker är baserade på satskulturer, antingen på fast eller i flytande medium, miljön av cellerna varierar under batch kultur medan miljöstressen i kemostaten är stabil; (B) en större befolkning och en kontinuerlig val - den större befolkningen i kemostaten ger mer genetisk mångfald än den mindre populationen av överföringsteknik. Kontinuerlig val av lmemostat teknik är ett snabbare sätt att uppnå utveckling än intermittent urval av överföringsteknik. Det är kritiskt att kemostaten kulturen inte vara förorenat av andra mikroorganismer under ALE förfarandet och aseptiska förhållanden krävs hela kemostat kultur. Den ALE förfarande kan modifieras genom ändringar i stressfaktorer, såsom oxidativ stress, osmotisk stress och toxisk produkt stress. Det finns några tekniska begränsningar för ALE av kemostat kultur. Evolution sker av en slump; därför kan olika forskare inte att kunna erhålla samma evolutionära resultat, även om följderna av mutationerna kan vara relaterat. En annan begränsning är den wash-out av kemostat kulturen när koncentrationen av stressfaktor ökas för snabbt. Om biomassan minskas till ett visst belopp (dvs., OD = 0,2 i den här proceduren) efter koncentrationen av stressfaktor ökas, administrering av stressfaktor bör stoppas för åtminstone några generationer tillge stammen tid att anpassa sig.

Den senaste utvecklingen inom genomet sekvenseringsteknologi har hjälpt förståelsen av mutationer som utvecklas som svar på vissa påfrestande förhållanden. Till exempel, en DNA-mutation förändrar en viss systemisk effekt som är gynnsam för den givna miljön (dvs tolerans mot ett toxiskt stressor). Således kan ALE användas för att studera geners funktion eller nätregleringen eller som råmaterial för "accelererad evolution". ALE studier är också användbara i att simulera utvecklingen av antibiotikaresistenta bakterier, som anger de mekanismer genom vilka farliga läkemedelsresistenta bakteriestammar uppkommer. Eftersom banan evolutions är ingraverat på genomet, avslöja de genetiska förändringar som leder till de önskade fenotyper (t.ex. stresstolerans) är nästa hinder gång utvecklats stammar erhålls ^8. Bland de för närvarande tillgängliga nästa generations sekvensering teknik, Illumina och Ion Torrent platformer är lämpliga för detektion av nukleotidsubstitutioner eller små InDels som förekommer i de utvecklade stammar, och båda är överkomliga. Eftersom variant upptäckt innebär oftast kort läsa kartläggning av referenssekvenserna, är av avgörande betydelse att det finns genomsekvensen av förfädernas stammen. Även om den genomsekvens av grundaren stammen är tillgänglig från offentliga databaser, är det ofta önskvärt att sekvensera den samtidigt med den utvecklade en, eftersom det kan finnas några ytterligare skillnader i den verkliga utgångsstammen. Protokoll för mutation identifiering är lätt tillgängliga via webben eller en litteratursökning ^9,10. Till exempel är BRESEQ en specialdesignade rörledning för genomisk analys av laboratorie utvecklats mikrober som använder nästa generations sekvenseringsdata ^11. Jämförelser av de utvecklade stammar på vissa milstolpar (t ex i detta representativa uppgifter, vildtyp, DST50, DST100 och DST160) kan ge sekvensen av den utvecklade stammens och ge insikt i konsekvenserna av en viss stress. Därför, kunskap och tillämpningar av ALE experiment, tillsammans med systembiologi och identifiering av systemstörningsvariabler, väntas inom en snar framtid.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mini-chemostat fermentor	Biotron Inc.	-	manufactured by special order
silicon tubing	Cole-Parmer	Masterflex L/S 13	tubing size can be varied depending on the dilution rate and the size of fermentor jar.
reservoir jar	Bellco	Media storage bottle	20 L
chemicals	Sigma-Aldrich	-	reagent grade
glucose	Sigma-Aldrich	G5767	ACS reagent
NH4Cl	Sigma-Aldrich	A9434	for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5%
NaCl	Sigma-Aldrich	746398	ACS reagent, ≥99%
Na2HPO4·2H2O	Sigma-Aldrich	4272	98.5-101%
KH2PO4	Sigma-Aldrich	795488	ACS reagent, ≥99%
MgSO4·7H2O	Sigma-Aldrich	230391	ACS reagent, ≥98%
CaCl2	Sigma-Aldrich	793639	ACS reagent, ≥96%
thiamine·HCl	Sigma-Aldrich	T4625	reagent grade, ≥99%
Na2·succinate·6H2O	Sigma-Aldrich	S2378	ReagentPlus, ≥99%