Summary
Burada, biz kemostat kültür kullanarak koşullar altında mikroorganizmaların adaptif laboratuvar evrimini elde etmek için bir protokol mevcut. Ayrıca, gelişmiş soyunun genomik analiz tartışılmıştır.
Introduction
Mikroorganizmalar hayatta ve çeşitli ortamlara uyum sağlayabilir. Ağır stres altında, adaptasyon rastgele genomik mutasyonların ve sonraki pozitif seleksiyon 1-3 yararlı fenotip kazanması ile ortaya çıkabilir. Bu nedenle, mikrobiyal hücreler "adaptif evrim" olarak adlandırılır optimum büyüme için metabolik veya düzenleyici ağları değiştirerek uyum sağlayabilir. Bu tür süpermikroplar salgınları ve sağlam mikrobiyal suşların ortaya çıkması gibi yeni önemli mikrobiyal eğilimler, çok yakından stresli koşullar altında evrimi uyarlamalı ilişkilidir. tanımlanan laboratuvar koşullarında, moleküler evrim mekanizmaları incelemek ve hatta çeşitli uygulamalar için mikrobik evrimin yönünü kontrol edebiliyoruz. onlar büyük nüfusları korumak, hızlı bir şekilde yeniden ve oluşturmak ve Hom bakımı kolaydır: Çok hücreli organizmalardan farklı, tek hücreli canlılar aşağıdaki nedenlerden ötürü adaptif laboratuvar evrim (ALE) için uygundurogeneous ortamlar. DNA dizileme teknikleri ve yüksek verimli teknolojilerindeki son gelişmeler ile birlikte, ALE sistemik düzenleyici değişikliklere yol genomik değişikliklerin doğrudan gözlem sağlar. Mutasyon dinamikleri ve nüfus çeşitliliği de gözlemlenebilir. Genetik mühendisliği yöntemi ALE suşlarının 4,5 analizinden belirlenebilir.
Kemostat kültür kararlı durum hücreleri elde etmek ve fermantasyon süreçleri 6 verimliliği artırmak için kullanılan bir yöntemdir. Taze ortam ilave edilir ve kültür sıvısı işlemi (ikinci orta ve biyokütle içerir) içinde toplanır. Uzun vadeli kemostat kültürü Bununla birlikte, kültürün kararlı durum verimliliği değiştirir ve kültür (Şekil 1a) sırasında spontan mutasyon ve seleksiyon birikimi getiriyor. Çeşitli seçim basınçlarında (stres) altında, mutasyonların birikimi artar. Uzun vadede stres kademeli bir artış kemostat tekrarlanan sıvı bir ortamda bir katı ortam ve seri transferi (arasında, sıcaklık, pH, ozmotik basıncı, besin açlık, oksidasyon, toksik son ürün, vb Koloni transferi verilen stres karşı çalışma mutasyonlar, sürekli bir seçim sağlar küme kültür), araştırmacılara gelişti mikroorganizmaları (Şekil 1B ve 1C) elde edilmesine olanak sağlamaktadır. kemostat kültür karmaşık yöntemler gerektirmesine rağmen, çeşitlilik havuzu (tekrarlamalı ve nüfus büyüklüğü sayısı) koloni transfer ve seri transfer teknikleri ile elde edilenden daha yüksektir. tek tek hücrelerin kararlı stres maruziyeti ve kemostat kültürü (sabit durum) toplu kültür temelli tekniklerle karşılaştırıldığında ALE diğer faydaları şunlardır sırasında hücresel devlet varyasyon azalmıştır. Yüksek süksinat koşullara tabi Escherichia coli strese bağlı ALE Bu makalede tanıtıldı.
iles / ftp_upload / 54446 / 54446fig1.jpg "/>
Şekil 1: adaptif laboratuvar evrim Yöntemleri (A) Kemostat;. (B) Seri transferi; (C) koloni transferi. Üst rakamlar ALE yöntemleri kavramını göstermek ve alt rakamlar ALE sırasında büyüyen hücrelerin sayısını göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ekipman Hazırlığı
- Bir kemostat küp (150-250 mi) ya da bir giriş noktası ihtiva eden bir bir Erlenmeyer şişesi (250 mi) ve bir çıkış portuna elde edin. silikon boru 10-100 ml / saat akış hızları için izin ile bağlantı noktalarını bağlayın. İsteğe bağlı olarak, bir hava deliği, bir hava çıkış ağzı, ve sıcaklık kontrollü su giriş ve çıkış bağlantı noktaları kullanımı.
- ajitasyon ve ısı kontrolü sağlayan kemostat kavanoz için uygun olan bir cihaz elde edilir (veya bir döner çalkalama inkübatöründe kullanın).
- kültür taze orta teslim ve toplamak için iki peristaltik pompa edinin.
- orta çıkış deliği ve bir hava giriş ağzı ihtiva eden bir hazne kavanoz (10-20 L) elde edilir.
- (L / S 13 boru Yani, ID, 0.8 mm, akış aralığı 0,06-36 ml / dak) seyrelme oranı için uygun silikon boru elde edilir.
2. Orta Hazırlama ve Sterilizasyon
- ilk Orta
- 0.3 gr glikoz, 0.08 g NH4 çözülürCI, 0.05 g NaCl, 0.75 g Na 2 HPO 4 · 2H 2, O, ve 0.3 g KH 2 PO 4 90 ml damıtılmış su, kemostat kavanoza (DW).
- kelepçeler kullanılarak boru ile birlikte kemostat kavanoz mühür. havalandırma deliğini mühür yok.
- 15 dakika boyunca 121 ° C'de bir otoklav içinde kemostat kavanoz sterilize edin. Sterilizasyon sonrasında, oda sıcaklığında kemostat kavanoz saklayın.
- Çözülür 0.02 gr MgSO 4 · 7H 2, O, 0.01 g CaCl2 ve 10 mi DW (A çözeltisi) içinde 0.1 mg tiamin.
- bir şırınga ve bir önceden sterilize edilmiş şırınga filtresi (0.45 mikron gözenek filtresi) ile filtre solüsyonu için uygun değildir.
- Bir kemostat kavanoza süzüntüler çözüm ekleyin.
- stres Orta
- 30 g glukoz, 8 g NH4CI, 5 g NaCl, 75 g 2 Na HPO 4 · çözülür 2H 2, O, 30 g KH 2 PO 4 ve 300 g disodyum süksinat heksahidrat (Na2 · süksinat · 6H <sub> 2 O; Bir rezervuar kavanoza 9.9 L DW bu deneyde kullanılan stres).
- kelepçeler kullanılarak boru ile birlikte rezervuar kavanoz mühür. havalandırma deliğini mühür yok.
- 15 dakika boyunca 121 ° C'de bir otoklav içinde, rezervuar kavanoz sterilize edin. Sterilizasyon sonrasında, oda sıcaklığında kavanoz saklayın.
- 2 g MgSO 4 · 7H 2, O, 1 g CaCl2, ve 100 ml DW (A çözeltisi) içinde 10 mg tiamin çözülür.
- bir şırınga ve bir ön-sterilize edilmiş şırınga filtresinden (0.45 mikron gözenek filtresi) ile filtre solüsyonu için uygun değildir.
- Bir rezervuar kavanoza süzüntüler solüsyonu ekleyin.
- Aseptik rezervuar kavanoza sterilize silikon tüp bağlamak ve peristaltik pompalar takın.
- Yüksek stres Orta
- Bölüm 2.2 gibi orta hazırlayın, ama stresörün büyük bir konsantrasyon ile (yani, süksinat adaptasyon 3-5 g / L daha yüksek).
Not: Bu protokol bir stres inci adaptasyon içinde orta yoluyla teslim edilebilir. sıcaklık, ajitasyon ya da aydınlatma gibi fiziksel stres durumunda, kültür buna göre tasarlanmış olmalıdır.
- Bölüm 2.2 gibi orta hazırlayın, ama stresörün büyük bir konsantrasyon ile (yani, süksinat adaptasyon 3-5 g / L daha yüksek).
3. İlk Yetiştirme
- Yabani tip E. tek bir koloni İnokülasyon Başlangıç ortamı 4 ml içeren 15 ml'lik deney tüpünde coli.
- 37 ° C'de 12 saat ve 220 rpm'de sallanan bir kuluçka makinesinde test tüpünü inkübe edin.
- Aseptik olarak transferi kemostat kavanoza ön kültür 1 ml.
- 6 saat boyunca 37 ° C 'de, havalandırma (hava 50 ml / dakika) ve karıştırılarak (200 rpm) sağlayan, kemostat kavanoz inkübe edin.
4. Stres Adaptasyon
- Aseptik kemostat kavanoza pompalardan silikon hortumun ucunu.
- çıkış pompası (10 ml / saat veya daha yüksek) başlatın ve kültür toplamak.
Not: Kültür tipik olarak 4-8 saat, ilk yetiştirme sonrasında, üslü fazda olması gerekir. - Chçıkış borusundan kültürün optik yoğunluğu (600 nm) eck.
- Giriş pompası (0.1 saat -1 sulandırma bir orana karşı gelen 10 ml / sa,) başlatın.
- her 24 saatte tüp çıkışından 600 nm'de kültür optik yoğunluk kontrol edin.
- 96 saat (9.6 kat ciro) ya da daha fazla kemostat çalıştırın. optik yoğunluk stabil ise, yüksek stres ortamı içeren rezervuar alışverişi. Optik yoğunluk 0.2 düşükse, 6 saat boyunca besleme giriş pompayı durdurun. giriş pompasını yeniden başlatın ve optik yoğunluk 0.2 üzerinde olup olmadığını kontrol edin.
- Yavaş yavaş daha yüksek stres konsantrasyonunu ihtiva eden bir rezervuara değiştirerek stres konsantrasyonunu artırır.
- O bir dönüm noktası ulaştığında adapte kültür örnekleri almak (örneğin, 100 g / L süksinat strese adapte suş) ileri genomik analiz için, ve mağaza.
- Örnek depolama için, steril bir% 80 gliserol soluti kültür numunesi (0.5 mL) karışımıilgili (0.5 mi) ve -80 ° C'de saklayın.
Not: Mikroorganizma ALE sürecinde stres aşağılamak için bir yeteneği edinirse, fermantasyon kavanoz stres konsantrasyonu taze haznesinde aynı değildir.
Stres adapte Uzama 5. Tek koloni izolasyonu
- Agar plaka orta (% 1.6 ağar) aynı stres içeren ve ortamın aynı konsantrasyonda hazırlayın.
- kemostat gelen çıkış kültür (0.1 mi) plaka ve 16 saat 37 ° C'de inkübe edin.
- Steril kürdan ile plaka, tek koloniler aynı stres ihtiva eden 15 ml'lik deney tüpleri ve kemostat aynı ortam konsantrasyonunda bunları inoküle ve 6 saat inkübe edilir.
- Transfer ortamı 50 ml içeren 250 ml'lik bir Erlenmeyer şişesi içinde bulundukları kültür çorbasından 1 mi. Hasat kültür sıvısının 0.5 ml her 1 saat ve 600 nm'de OD'yi ölçün. adapte strai büyüme hızını karşılaştırmakstres verilen yabani tip suşu edilene n.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yüksek süksinat stres adaptasyonu için, vahşi tip E. coli W3110 suşu D bir kemostat kültürlenmiştir = 0.1 saat -1 270 gün (Şekil 2).
Şekil 2: E. Yüksek süksinat stres adaptasyonu E. coli kemostat kültür kullanarak W3110. İnce oklar stresörün konsantrasyonu artmış edildiği kez gösterir ve kalın oklar kültürleri muhafaza edildiği zamanları gösterir. oklarla Sayılar stres, disodyum süksinat hekzahidrat konsantrasyonlarını göstermektedir. ALE sırasında biyokütle değişim ve stressor konsantrasyonları temsil edilmektedir. Şekil J. modifiye edilmiş Biosci. Bioeng 7. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
kemostat kültürü kararlı bir duruma ulaşıldığında her stres konsantrasyonu 160 g / l olana kadar 30 g / L (disodyum süksinat hekzahidrat) olan stres konsantrasyonu, artan aşamalı olarak. Adapte E. (disodyum süksinat stres 160 g / L hoşgörülü) E. coli DST160 suşu 270 gün sonra elde edildi. Ata suşu (W3110) neredeyse hiçbir büyüme (Şekil 3) gösterirken DST160 suşu, yüksek süksinat stres (160 g / L stres) altında sınır tanımayan bir büyüme sergiledi.
Şekil 3: yabani tip (W3110, beyaz daire) Büyüme eğrileri ve yüksek süksinat stres altında zorlanma (DST160, siyah daire) uyarlanmış rakam adapte suş vahşi iken yüksek süksinat altında gecikmeden vurguladı koşulları büyüdüğünü göstermektedir. tip değildi. Hataçubuk, üç bağımsız deneyin standart sapmalarını gösterir. Şekil J. modifiye edilmiş Biosci. Bioeng 7. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikroorganizmalar nedeniyle hızlı büyüme oranı ve genetik çeşitliliğin hemen hemen tüm ortamlarda uyum yeteneğine sahiptirler. Adaptif laboratuvar evrim verilen koşullar altında yararlıdır spontan mutasyon barındıran bireysel organizmaların seçerek bir yol sağlar tasarlanmış koşullar altında gelişmeye mikroorganizmaları sağlar.
kemostat tekniği aşağıdaki nedenlerle transfer teknikleri daha yapay tahrik evrimi elde etmek için daha sağlamdır, (a) sürekli bir ortam - transfer teknikleri, katı ya da sıvı bir ortam içinde, ya parti kültürlerine göre, çünkü hücrelerin ortamı toplu işlem sırasında değişir kültür kemostat çevresel stres sabit iken; (B) daha büyük bir nüfus ve sürekli bir seçim - kemostat büyük nüfus transferi teknikleri küçük nüfusundan daha fazla genetik çeşitlilik sağlar. ch Sürekli seçimemostat teknik transfer teknikleri aralıklı seçimi daha evrimini elde etmek için hızlı bir yoldur. Kemostat kültür ALE işlemi sırasında diğer mikroorganizmalar tarafından kontamine edilmemesi önemlidir ve aseptik koşullar kemostat kültür boyunca gereklidir. ALE prosedür, oksidatif stres, ozmotik stres, ve toksik ürün stres gibi stres değişiklikler ile değiştirilebilir. kemostat kültürü ile ALE birkaç teknik sınırlamalar vardır. Evrim tesadüfen gerçekleşir; mutasyonlar sonuçları ilişkili olabileceği, ancak bu nedenle, farklı araştırmacılar, aynı evrimsel sonucu elde etmek mümkün olmayabilir. stresör konsantrasyonu çok hızlı arttığı zaman başka sınırlama kemostat kültürünün yıkama-out. Biyokütle belli bir miktar (yani, OD = Bu prosedürde 0.2) düşmüştür ise stresörün konsantrasyonu artar sonra, stresör idaresi için en az birkaç nesiller için kesilmelidiruyarlamak için gerilme zaman verin.
genom dizileme teknolojisindeki son gelişmeler bazı stresli koşullar karşısında geliştirmek mutasyonların anlayış yardımcı olmuştur. Örneğin, bir DNA mutasyonu belirli bir ortamda (toksik stres, yani, tolerans) için faydalı olan belirli bir sistemik etki değiştirir. Bu nedenle, ALE gen fonksiyonu veya ağ düzenleme veya "hızlandırılmış evrim" için bir hammadde olarak incelemek için kullanılabilir. ALE çalışmaları da, antibiyotiklere dirençli bakterilerin gelişimini taklit tehlikeli ilaca dirençli bakteri türleri ortaya hangi mekanizma ile gösteren yararlıdır. Evrim yörünge (örneğin stres toleransı gibi) istenen fenotipleri yol genetik değişiklikler ortaya çıkarılması, genom üzerinde kazınmış gibi bir kez gelişti suşları 8 elde edilir sonraki engeldir. mevcut nesil dizileme teknolojileri arasında, Illumina ve İyon Torrent platformları nükleotid ikameleri ya da gelişmiş suşların ortaya çıkan küçük indellerin saptanması için uygun olan, ve her ikisi de uygun bulunmaktadır. değişken tespiti, genellikle bir referans dizileri kısa oku eşleme içerir için, ata soyunun genomu dizisinin mevcudiyeti önemlidir. Kurucu soybaşının genom sekansı, kamu veri kullanılabilir olsa da, gerçek başlangıç suşunda ek farklılıklar olabilir, çünkü gelişmiş bir ile eş zamanlı olarak, sekans genellikle arzu edilir. Mutasyon tanımlaması için protokoller web'de ya da bir literatür araştırması 9,10 üzerinden kolayca kullanılabilir. Örneğin, BRESEQ nesil dizileme verileri 11 kullanılarak laboratuvar evrimleşmiş mikropların genomik analiz için özel olarak tasarlanmış bir boru hattıdır. (Örneğin, bu Örnek veriler, vahşi tipli, DST50, DST100 ve DST160 olarak), belirli dönüm varlık gösteren suşların karşılaştırılması evrimleşmiş suşunun dizisini sağlayabilirs ve belirli bir stresör sonuçları içine fikir vermek. Bu nedenle, bilgi ve sistem biyolojisi ve sistemik pertürbasyon değişkenlerin tanımlanması ile birleştiğinde ALE deneyleri, uygulamaları, yakın gelecekte beklenmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mini-chemostat fermentor | Biotron Inc. | - | manufactured by special order |
| silicon tubing | Cole-Parmer | Masterflex L/S 13 | tubing size can be varied depending on the dilution rate and the size of fermentor jar. |
| reservoir jar | Bellco | Media storage bottle | 20 L |
| chemicals | Sigma-Aldrich | - | reagent grade |
| glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | ACS reagent |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5% |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | ACS reagent, ≥99% |
| Na2HPO4·2H2O | Sigma-Aldrich | 4272 | 98.5-101% |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 | ACS reagent, ≥99% |
| MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | ACS reagent, ≥98% |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 793639 | ACS reagent, ≥96% |
| thiamine·HCl | Sigma-Aldrich | T4625 | reagent grade, ≥99% |
| Na2·succinate·6H2O | Sigma-Aldrich | S2378 | ReagentPlus, ≥99% |
References
- Rando, O. J., Verstrepen, K. J. Timescales of genetic and epigenetic inheritance. Cell. 128, 655-668 (2007).
- Kim, H. J., et al. Short-term differential adaptation to anaerobic stress via genomic mutations by Escherichia coli strains K-12 and B lacking alcohol dehydrogenase. Front Microbiol. 5, 476 (2014).
- Mendizabal, I., Keller, T. E., Zeng, J., Yi, S. V. Epigenetics and evolution. Integr Comp Biol. 54, 31-42 (2014).
- Lee, J. Y., Seo, J., Kim, E. S., Lee, H. S., Kim, P. Adaptive evolution of Corynebacterium glutamicum resistant to oxidative stress and its global gene expression profiling. Biotechnol Lett. 35, 709-717 (2013).
- Lee, J. Y., et al. Artificial oxidative stress-tolerant Corynebacterium glutamicum. AMB Express. 4, 15 (2014).
- Narang, A. The steady states of microbial growth on mixtures of substitutable substrates in a chemostat. J Theor Biol. 190, 241-261 (1998).
- Kwon, Y. D., Kim, S., Lee, S. Y., Kim, P. Long-term continuous adaptation of Escherichia coli to high succinate stress and transcriptome analysis of the tolerant strain. J Biosci Bioeng. 111, 26-30 (2011).
- Barrick, J. E., Lenski, R. E. Genome dynamics during experimental evolution. Nat Rev Genet. 14, 827-839 (2013).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
- McKenna, A., et al. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).
- Deatherage, D. E., Barrick, J. E. Identification of mutations in laboratory-evolved microbes from next-generation sequencing data using breseq. Methods Mol Biol. 1151, 165-188 (2014).
