Abstract
Den mikrofluid sonde (MFP) letter udfører lokal kemi på biologiske substrater ved at begrænse nanoliter mængder af væsker. Ved at bruge en bestemt implementering af MFP, den hierarkiske hydrodynamisk flow indespærring (hHFC), er flere væsker samtidigt bringes i kontakt med et substrat. Lokale kemiske påvirkninger og flydende formgivning ved hjælp af hHFC, udnyttes til at skabe celle mønstre ved lokalt lysere og fjerne celler. Ved at udnytte scanning evne til MFP, er brugerdefinerede mønstre af cellemonolag oprettet. Denne protokol muliggør hurtig, real-time og rumligt kontrolleret celle mønsterdannelse, som kan tillade selektiv celle-celle- og celle-matrix-interaktionsundersøgelser.
Introduction
I deres oprindelige miljø, celler i biologiske væv opfatter en række biokemiske og fysiske signaler dirigerer deres vækst, organisation og udvikling. Forståelsen af disse signaler kræver selektiv undersøgelse af celle-celle og celle-matrix interaktioner. Dette nødvendiggør udvikling af metoder til mønsterdannelse cellemonolag. Metoder til geometrisk separate forskellige celletyper i kultur (mønster) muliggør brede undersøgelser af fysiske og kemiske signaler i cellebiologi. De fleste af de nuværende metoder til mønstret cellelag 1 - 4 afhænger af deponering celle-adhæsionsproteiner på overflader eller ved hjælp mikrofabrikerede stencils til selektiv vækst på substrater. I modsætning hertil her præsenterer vi en metode til hurtigt mønster cellemonolag in situ, dvs. celler i kultur, ved at fjerne celler i udvalgte regioner af monolaget. Metoder, der udfører sådanne subtraktiv mønster 5 - 9 usually kræver specialiserede substrater, overfladebehandling, kompleks operation, fysisk kontakt eller ablation ved hjælp af en laser, uforvarende påvirker levende celler. Vi her anvender en mikrofluid probe (MFP) 10,11, en ikke-kontakt scanning mikrofluid teknologi, hydrodynamisk indeslutter en væske på et substrat. En vigtig del af MFP er den mikrofremstillede hoved indeholder mikrokanaler (figur 1). Den tilhørende platform består af sprøjtepumper til flydende kontrol, etaper til scanning af kontrol og et omvendt mikroskop til visualisering og feedback (figur 2). I sin grundlæggende konfiguration, MFP hovedet omfatter to mikrokanaler med åbninger i spidsen, et til at injicere en procesvæske og den anden til opsugning den injicerede behandlingsvæske sammen med nogle nedsænkning væske (figur 3A). Under MFP operation, spidsen er i en fast afstand fra substratet. Når opsugningsstrømningshastighed (Qa) er sufficiently højere end indsprøjtningsstrømningsstørrelsen (Q i), dvs., Q a: Q i ≥ 2,5, procesvæsken er begrænset på substratet. Dette resulterer i en hydrodynamisk flow indespærring (HFC). Den region, hvori procesvæsken er i direkte kontakt med substratet betegnes fodaftryk. For typiske driftsforhold er strømmen af behandlingen væske i HFC kendetegnet ved et lavt Reynolds tal (Re ≈ 10 -2) og en høj Péclet nummer (Pe ≈ 10 2). Dette indebærer flydende strømme i laminar regime med konvektion er den primære form for massetransport af kemiske stoffer. De numeriske og analytiske modeller for flow indespærring er beskrevet andetsteds 12-14.
I dette papir, bruger vi tilgang af samtidig begrænsende flere forarbejdning væsker, som kaldes hierarkisk HFC (hHFC) 14. At gennemføre hHFC med MFP, to additional åbninger er nødvendig for at give en sekundær kilde til injektion og aspiration. Dette gør det muligt for os at begrænse en væske i en anden væske. De indre (behandling) flydende fordele ved at være beskyttet mod omstrejfende snavs på underlaget af den ydre (afskærmning) væske. Desuden hHFC tillader drift i to tilstande: (i) nested mode, hvor procesvæsken i de indre HFC i kontakt med overfladen (figur 3B), og (ii) den pinched, i hvilken den indre væske taber kontakt og kun den ydre væske er i kontakt med substratet (figur 3C). Skiftet mellem de to tilstande giver brugerne mulighed for at bevirke eller stoppe behandlingen substratet og opnås ved at styre hoved-mod-overflade mellemrum eller ved at ændre forholdet mellem injektion strømme (Q i2 / Q i1). For en given kanal geometri, kan fodaftryk af procesvæsken på substratet styres ved at modulere strømningsforhold (figur 3D). Natrium hydroxid (NaOH) anvendes som den indre procesvæske for at lysere cellerne, og lysatet kontinuerligt aspireret fra overfladen. Fordi de kemiske virkninger af procesvæsken er lokaliseret til den indre HFC fodaftryk, de tilstødende celler forbliver uforstyrret, som tillader spatiotemporale studier af celle-celle-interaktioner. Scanningen funktionalitet MFP tillader oprettelsen af brugerdefinerede geometrier af celle mønstre (figur 4). Endvidere er valget af NaOH som behandlingsvæske rumme nedstrøms DNA-analyse (figur 7).
Protocol
1. MFP hoved og Platform Rengøring og klargøring
BEMÆRK: Denne protokol anvender lodret orienteret silicium-glas hybrid MFP hoveder 15,16. Silicium komponent af hovedet indeholder mikrokanaler, som er ætset til en dybde på 100 um. Den ætsede silicium er bundet til glas ved brug af anodisk binding. Kanalen design omfatter et mønster bestående af seks kanaler, to hver til injektion og aspiration, og to til injektion af nedsænkning væske (figur 1). Anvendte kanaler til injektion af nedsænkning væske genopbygge medierne omkring den biologiske prøve, hvorved der undgås tab på grund af aspiration og inddampning. De indvendige kanaler og udvendige kanaler, der anvendes i det nuværende arbejde er 100 × 100 um og 200 × 100 um henholdsvis. Indlæg fabrikation og forarbejdning, MFP hoveder med klare kanaler og polerede spidser opnås.
- Fremstilling af pumpestationen og væske-håndteringapparat
- Brug kapillærer med en 1/16 '' (1,59 mm) ydre diameter og 0,02 '' (0,51 mm) indvendig diameter for alle slanger forbundet til sprøjterne. Varier kapillær størrelse er baseret på anvendelse og få de relevante stik og beslag til interface MFP hovedet med sprøjterne. Brug ultrarent vand, uanset hvor fortyndinger er nødvendige.
- Rene sprøjter (250 - 500 pi volumen) og sprøjte stemplerne ved lydbehandling i 0,5% blegemiddelopløsning i ultrarent vand før til- og post levende celle eksperimenter. Skyl dem grundigt med vand. Fylde dem med vand ved at nedsænke deres spidser fuldstændigt i et vandbad og opsugning ved hjælp af stemplet. Rense væsken mens i vandbadet med sprøjten aksel kontaktes tætningen ved udgangen fra sprøjten. Gentag aspirat og udrensning indtil ingen luftbobler ses i sprøjten kolonner.
- Tilslut fyldte injektionssprøjter til sprøjtepumper hjælp Luer-lock konnektorer. Brug en omskifterventil monteret påpumper til at lede væsken fra sprøjten til en af to kapillærer førende enten til MFP hovedet eller til de flydende reservoirer (figur 6). (Hvis der ikke afbryder ventil er tilgængelig se afsnit 1.4.4). Rense begge kapillærer med vand fra sprøjterne ved en strømningshastighed på cirka 10 - 50 pl / min, afhængigt af størrelsen af sprøjten, indtil ca. 10 pi vand tilbage i sprøjterne.
- Pre-sæt de rensede kapillærer i en passende mikrofluid konnektor / adapter der grænseflader med kanal vias i hovedet (f.eks M1-stik - se materialer).
- MFP forberedelse hoved
- Rens MFP hovedet ved lydbehandling hjælp glasvarer rengøringsmiddel til standard rengøring eller 0,5% blegemiddel for stringent rengøring, i 5 min. Rense kanaler med vand ved nedsænkning toppunktet i vand og påføring af vakuum på de vias.
- Undersøg kanaler under et stereomikroskop for potentielle forhindringer (tilstopning) og retørv det forrige trin om nødvendigt.
- Monter ren hoved på indehaveren hovedet og skru stik med pre-indsat og renset slanger på hovedet. Skrue hovedholderen til Z-trin, som anvendes til bekæmpelse af mellemrummet afstand mellem hovedet og cellemonolaget.
- Kalibrering af scanning stadier af MFP-platformen
- Udfør endpoint kalibrering af X-, Y- og Z-faser inden etablering af hovedet til platformen, ifølge producentens protokol med en passende software interface. Kalibreret stadier sikrer nøjagtighed i positionering af MFP hovedet.
- Anskaf en rå nul hul afstand (nulstilling) ved at bringe MFP hovedet over et kammer dias uden celler og langsomt ned i 5 um trin. Ved probe kontakt med substratet, bør observeres Newtons ringe. Dette er et groft skøn. En nøjagtig position skal indhentes efter justering koplanaritet af sonden apex til substrate.
- At sikre koplanaritet af sonden apex, justere hældningen af hovedet under anvendelse af et goniometer (ved grænsefladen af hovedet og Z fase). Når de dannes sikre, at Newtons ringe er symmetriske (figur 1). Flyt MFP hovedet 20 um væk fra underlaget og justere tilt hjælp af goniometer. Gentag nedstigning, nulstilling og tilt justering, indtil Newtons ringe er symmetrisk ved kontakt. Med tilt justeret, sat z position som producerer symmetriske Newton ringe som nul.
BEMÆRK: Z-fase styrer hoved-til-substrat afstand, mens XY-scene styrer skanning af substratet (figur 2). En detaljeret forklaring kan findes i vores tidligere arbejde 14.
- Kemiske præparater til lokal fjernelse af cellelag
Forsigtig: Hvis det er relevant, brug sikkerhedsudstyr (fx nitrilhandsker, sikkerhedsbriller) for de kemikalier, der forberedes. Brug en røg hood eventuelt for fremstilling af opløsninger. Forbered alle kemikalier og buffere med ultrarent vand som fortyndingsmiddel.- Forbered 50 mM NaOH-opløsning som procesvæsken for den indre injektionskanalen (i2 med flow Q I2 i figur 1).
- Forbered udvinding pufferopløsning kræves til den ydre injektion (i1 med flow Q I1 i figur 1), sammensat af 1 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), 0,5% Tween 20, og 10 uM rhodamin B i 50 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethan på pH 8. udrensning, brug vand i aspiration sprøjter.
- Filter alle løsninger ved hjælp af en 0,2 um sprøjte filter. Degas alle filtrerede løsninger ved hjælp af en ekssikkator, indtil luften stopper opløst boblende op til overfladen.
- Brug af drænledning forbundet med sprøjtepumper, rense rest vand opsuges de afgassede opløsninger i injektionssprøjter ved 40 pl / min, indtil sprøjterne er fuld (250 eller 500 pi).Dette sikrer boble-fri fyldning af sprøjter, stik og kapillærer. Sprøjten-omskifterventil-to-kapillar system tillader fyldning af sprøjter mid-eksperiment. I mangel af en sådan omstilling ventil, frakoble kapillærerne fra hovedet og fylde kapillærer og sprøjten ved at suge de afgassede opløsninger før du sætter dem til hovedet.
- Opsugning forarbejdning og afskærmning væsker gennem kapillærerne tillader anvendelse af små volumener under drift. Hvis kemikalierne kan tilberedes i store mængder, fylde sprøjter med de nødvendige løsninger direkte. For eksempel kan aspiration sprøjter, der indeholder vand fyldes ved hjælp af denne fremgangsmåde.
- Rens kapillærerne til MFP hovedet med væsker, der tildeles for hver kanal, som defineret i 1.4.1 og 1.4.2.
BEMÆRK: Ekstraktionen pufferopløsning afskærmer NaOH i den indre indespærring og rhodamin komponent i bufferen letter visualiseringen af the hHFC under drift. - Hvis cellerne er over-sammenflydende, med celleaggregater optræder på den dyrkede overflade, supplere ekstraktionsbuffer med 10% Proteinase K. Dette supplerer virkningen af NaOH disse aggregater ved opløsning denaturerede proteiner som lysatet træder aspirationstrinnene kanaler. Dette forhindrer tilstopning af kanalerne under drift.
- Fremstilling af cellemonolag på kammerskiver
Forsigtig: Brug en cellekultur hætte til dyrkning af cellerne og håndtere udstyr som pr regler fastsat af biosikkerhed officer af laboratoriet. Bemærk særlige krav specifikke cellelinier og tilpasse protokol og udstyr i overensstemmelse hermed.- Brug cellekultur inkubatorer (ved 5% CO2 og ved 37 ºC) til kultur og udvidelse af celler, der skal mønstret. Udfør ekspansion under anvendelse af standard cellekultur protokoller 17,18 i T-kolber. Brug dyrkning medier som pr kravene i den specifikke cell linje (fx serum og antibiotikum suppleret DMEM til dyrkning MCF7 og MDAMB 231).
- På at nå celle konfluens i dyrkningskolberne, Trypsinisér og indsamle celler og frø 2 × 10 5 celler / cm2 i hvert af de 2-kammer dias for mønsterdannelse og kultur over 48 timer. Brug af cellerne i et af kamrene som en kontrol for cellevækst og levedygtighed.
- På at nå celle konfluens på kammerobjektglas, inkuberes cellerne i 45 minutter med 500 pi celle-tracker farveopløsning (f.eks grøn - CMFDA eller orange - CMRA) ved 10 uM koncentration fremstillet i serum-frit medium. Dette gøres for celle visualisering under mønster. Vask de mærkede celler med PBS ved forsigtigt at skylle hvert kammer ved hjælp af en pipette, og efterfølgende kultur cellerne i serum-suppleret medier til mønstringen eksperimenter.
- Opnå et referencebillede af cellen-tracker-farvede celleoverfladen med henblik på celletælling. Dette sker for at sikrekonfluens på cellelaget. Desuden tjener som en hjælp til kvantificering eksperimenter, hvis prøve nyttiggørelse og DNA-analyse er mål.
BEMÆRK: I tilfælde af at celle levedygtighed skal vurderes under mønster, kan cellerne farves med en Live / Dead cytotoksicitet kit i overensstemmelse med producentens anvisninger.
2. Oprettelse af Hierarkisk Hydrodynamisk Flow Indespærring (hHFC)
- Flyt printeren over cellemonolaget til et hul afstand på 50 um fra objektglasset. Denne forskel afstand samtidig sikre kontakt mellem hHFC også tegner sig for monolag overflade og tykkelse variation.
- Injicer NaOH ved 6 eller 8 pl / min gennem i2. Evaluere andre strømningshastigheder (dvs. Q I1, Q A1 og Q A2) under anvendelse af flow reglerne i figur 3.
- Modulere størrelsen af den indre HFC ved at ændre forholdet mellem Q I2 / Q I1 hjælp af injektionssprøjter.Brug f.eks en Q I1 mellem 1,3 pl / min og 4 pl / min, med Q I2 fastsat til 8 pl / min, hvilket resulterer i en NaOH fodaftryk 150 - 300 celler (100 - 200 um 2 / celle) ( figur 3D).
- Injicer komplet medium fra de ydre-mest åbninger på MFP hoved ved en flowhastighed på 20 pl / min for at tage højde for fordampning af medierne og aspiration under driften af hHFC.
3. mønstret cellemonolag Brug hHFC
Bemærk: Scanningen mønster fastlægger de områder cellemonolaget hvor cellerne udvindes (subtraktiv mønster), der forlader de resterende celler til at studere specifikke biologiske spørgsmål. Dette mønster kan være rette linier eller et array af pletter, f.eks. Komplekse mønstre kræver udformning af en egnet scanning bane. For eksempel kan en ternet scanning bane giver et gitter af celleområder (for eksempel vist i figur 4A
- Sætte scenen software til at scanne sonden hovedet over cellemonolaget i brugerdefinerede mønstre (ved at indstille X, Y og Z-koordinaterne) ved en scanning hastighed på 10 um / s ved en afstand på 50 um.
- Med den indlejrede hHFC i drift og i kontakt med monolaget, scanne MFP med en bane af det ønskede mønster at bevirke mønstrede celle fjernelse.
- For en co-kultur efter den første fjernelse celletype, frø en anden cellelinje at udfylde de huller, ved brug af metoder, der er beskrevet i afsnit 1.5. Flytte mellem indlejrede og klemte tilstande (ved at øge kløften afstand, for eksempel) til at styre celle fjernelse.
BEMÆRK: Scanningen hastighed kan være undersøgated for andre cellelinjer. Scanningen hastighed, der anvendes i denne demonstration effekter komplet celle fjernelse over scannede regioner for de anvendte cellelinjer.
4. Downstream Processing for Sampling og DNA Amplification
- Forbered prøveudtagning station for nedstrøms analyse af lysatet. For prøvetagning station, skal du bruge et 3D trykt 8-strimmel PCR-rør holder. Alternativt, vælge en passende rørholder at tjene som denne adapter, som er i stand til at blive monteret inden i skanningsområde af hovedet uden for substratet. Tør holderen røret med 70% ethanol eller andre overflade dekontaminanter baseret på det ønskede for anvendelsen stringens. Brug en magnetisk klip på indehaveren af røret for at fastgøre det på holderen underlaget.
- Efter udarbejdelsen prøvetagning station, placere MFP hovedet 100 um fra monolag. Begynd at betjene hHFC med 50 mM NaOH-opløsning som behandlingen væske til den indre injektion kanal med flowhastigheder på 1, 6, -7 Og -17,5 pi / min for Q I1, Q I2, Q A1 og Q A2 henholdsvis.
- Når strømmen indespærring er stabiliseret (i ca. 10 sek), ned proben hoved til en afstand på 50 um til udføre NaOH baserede lokale lysis af det valgte sub-population af celler med hHFC. Når lyse af den delpopulation er færdig (ca. 30 sek pr fodaftryk), dirigere hovedet mod rørene i prøveudtagningen station. Skubbe opsamlet lysat i PCR-rørene direkte (figur 6).
- For nedstrøms forarbejdning af lysatet, først neutralisere pH af opløsningen ved blanding lysatet med Tris-buffer (1: 1). Efter neutralisering opvarme lysatet til 95 ºC i 30 minutter. Derefter direkte indlæse lysatet til en standard qPCR arbejdsgang som indstillet af leverandøren af instrumentet.
Representative Results
Den beskrevne protokol til hurtig subtraktiv mønsterdannelse af cellemonolag påvises ved anvendelse af en multi-komponent MFP platform (figur 1 og 2). Protokollen anvender den hierarkiske hydrodynamisk flow indespærring (hHFC; figur 3) til lokalt behandle og fjerne celler fra cellemonolag, anvendelse af NaOH som procesvæsken. Den hHFC konfiguration omfatter et indre HFC og en ydre HFC. Den begrænset NaOH i den indre hHFC introducerer kemisk handling og forskydning på cellerne i kontakt. Inden for denne fodaftryk cellerne homogent udsat for kemiske virkning af NaOH, på grund af konvektion drevet massetransport i og med ubetydelig diffusion til regionen uden for fødslen. Den forskydning på cellerne på den anden side, kan ændres ved at variere strømningshastigheden af NaOH. For at forenkle driftsparametre, valgte vi at gøre kemiske virkning den dominerende mekanisme for celle fjernelse i forhold til forskydning. Tilestimere forskydningskraften anvendes af hHFC på overfladen, blev en finite-element model bygget ved hjælp comsol multiphysics 5,0. Simuleringer blev kørt ved brug af CFD-modul til laminare strømninger. To indløbs- randbetingelser til injektion åbninger geometri og to outlet randbetingelser til aspiration åbninger (figur 5) blev anvendt for den række af strømningshastigheder og blænde dimensioner, der anvendes i den aktuelle demonstration. I modellen opnået, strømmen regler dikteret shear profil, mens strømningshastighederne defineret størrelsen af forskydning på overfladen. Praktisk, en kombination af begge bestemmer om hHFC kontakt med overfladen. Holde disse faktorer i tankerne, vi satte os for at finde en række strømningshastigheder for drift for at opnå kemisk dominerende fjernelse celle. For at oprette en hHFC bruger vi strømmen regel i en samlet aspiration indsprøjtningsstrømningsstørrelsen forholdet 3,5 til. De andre flow anvendte regler blev defineret til at minimere tilstopning inden aspirationstrinnene kanaler,som kan være forårsaget af denaturerede proteiner klæber til kanal overflader. Brug af den udviklede model, fandt vi strømningshastigheder fra 5 til 10 pl / min oversætte til en forskydningsspænding på mellem 1 og 3 N / m2. Uden den kemiske virkning af NaOH, for eksempel i tilfælde af ekstraktionsbuffer, forskydningsspændingen ville ikke være høj nok til at fjerne cellerne 19. Inden den observerede interval, bemærker vi, at drift ved højere strømningshastigheder er mere praktisk på grund af forstyrrelser i strømningsbanen ved lave aspiration strømningshastigheder (dvs. Q I2 <4 pl / min) på grund cellerester i kanalerne.
I betragtning af den undersøgte shear profil og praktiske overvejelser, NaOH strømningshastigheder (Q I2) af 6 og 8 pi / min anvendes til mønsterdannende eksperimenter og Q I1, Q A1 og Q A2 i henhold til reglerne flow vist i figur 3. Forholdet af injektion strømme (Q I2 / Q I1) tillader us for yderligere at modulere størrelsen af hHFC fodaftryk (figur 3D og figur 4B), med det underliggende princip uddybet af Autebert et al. 14. Brug af væske-udformningen evne hHFC kombineret med høj opløsning scanning evne MFP platform udviser vi levende celle gitter generation på flere skalaer og vis endvidere anvendelsen af den given protokol i udviklingen co-kulturer (figur 4C).
Platformen giver os også mulighed for at udføre prøven lysat hentning for downstream analyse. For at vise kvaliteten af den opnåede lysat, stikprøven vi lokalt lyserede celler fra et og fem fodspor i to uafhængige forsøg, der viser variationen i mængder på DNA opnået fra lysatet (figur 7). Her har vi amplificeret DNA indeholdt i lysatet hjælp Ø-actin primere (fremad: GGATGCAGAAGGAGATCACT og omvendt: CGATCCACACGGAGTACTTG ) Under anvendelse af 4 pi af den neutraliserede lysat i hver PCR-reaktion.
Figur 1. Moduler af MFP-platformen og hovedet. (A) De operationelle moduler af platformen omfatter motoriserede sprøjter, motoriserede scener og en controller. Printeren er forbundet til en motoriseret Z-trin for at kontrollere mellemrummet afstanden mellem hovedet og substratet, og substratholderen er fastgjort til X- og Y-motoriseret faser i den scanning system. (B) MFP hoved har fluide vias at forbinde pumpestationen, monteringshuller at montere hovedet på Z-scenen, og kanaler, der kommer ud af poleret spids. Toppunktet er indstillet i samme plan til cellekulturen substrat. Symmetrisk Newtons ringe kan observeres, når toppunktet og substratet er koplanare og i kontakt. p_upload / 54.447 / 54447fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. MFP platform. Den høje opløsning scanning platform er udstyret med en bearbejdet hovedholder grænseflade med høj præcision motoriseret Z-fase. substratholderen er forbundet til XY-scene til scanning formål. For inddrivelse af lysatet for downstream analyse, er en 3D trykt prøveudtagning station klippet magnetisk til siden af substratet holder (vist i indsat). Sprøjte pumper, et omvendt mikroskop, controllere og skærme er placeret omkring platformen. Klik her for at se en større version af dette tal.
3 "src =" / files / ftp_upload / 54.447 / 54447fig3.jpg "/>
Figur 3. Hierarkisk hydrodynamisk flow indespærring (hHFC) for rumlig og tidsmæssig styring af celle fjernelse. (A) Skematisk af en enkelt HFC. (B) Indlejret og (C) klemt tilstand af hHFC operation. (D) Billede af fodaftryk for to forskellige injektion / aspiration flow nøgletal. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Mønstre af cellemonolag ved hjælp af MFP. (A) Cell-grid generation af programmeret scanning af MFP på en MDA-MB-231 cellemonolaget. Celler blev farvet med grøn celle-tracker farvestof. (B) Den fodaftryk for de forskellige injektion nøgletal (n) På en MCF7 cellemonolaget. Den skematiske viser den forventede variation i formen af den indre HFC med en ændring i n. (C) Mønstrede co-kultur ved subtraktiv mønster af MCF7 monolag efterfulgt af såning MDA-MB-231 celler i trækkes regioner. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Forskydningsspænding på overfladen ved anvendelsen hHFC. Forskydningsspændingen på overfladen stiger lineært med den indre indsprøjtningsstrømningsstørrelsen. Det højeste shear punkt findes mellem de to indre åbninger (nederst til højre indsat), hvor behandlingen væske er begrænset (rød flow linjer, øverst til venstre indsat). Blænden dimensioner anvendt i finite-element model er 200, 100, 100 og 200 um for i1, i2, a1og a2, henholdsvis. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Driftsformer for MFP platform til at udføre celle fjernelse og mønsterdannelse. (A) Skematisk af strømningsvejen for subtraktiv mønsterdannelse ved cellelyse. For overskuelighedens skyld er kun en af hver injektion og aspiration strømningsveje vist. Sprøjterne udfyldt med afløbsventilen i pumperne. i1 og i2 anvendes til injektion af ekstraktion buffer og NaOH hhv. (B) Skematisk flow vej for lysat opsving. Denne strømningsvej aktiveres efter indsamling af cellelysatet til analyse under anvendelse af strømningsvejen i (A). Venligst click her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. Downstream analyse af DNA fra cellelysat ved hjælp qPCR. (A) Amplification plots af DNA i lysat ekstraheret fra 5 fodspor (5 fp) og 1 fodaftryk (1 fp). Kontroller blev ekstraheret efter lysat kollektion til begge tilfælde. (B) Smelt kurver af DNA amplificeret fra lysatet viser kvaliteten af det ekstraherede DNA. qPCR blev udført (N = 2, n = 3) for at forstærke β-actin gen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur S1. En skaleret billede af kanal design for 6-kanals MFP hovedanvendes til mønsterdannende eksperimenter. Kanaler udfører hHFC er 200, 100, 100, 200 um bred, og 100 um dyb. De to yderste kanaler, som genopbygge nedsænkning væske er 500 um brede og 100 um dyb. En GDS fil til det samme design er stillet som et supplement til denne artikel. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Vi præsenterer en alsidig protokol for den subtraktive mønster af cellemonolag der muliggør hurtig generation af rumligt definerede celle mønstre. Selektiv lyse af cellemonolag udføres under anvendelse af NaOH som procesvæsken i hHFC. NaOH går denaturerer proteiner i cellemembranen. Vi anbefaler anvendelse af 50 mM koncentration af NaOH for at sikre nedstrøms forarbejdning af lysatet. Denne koncentration kan øges for hurtigere celle fjernelse, forudsat lysat nedstrøms behandling ikke er et mål. Den hHFC sikrer, at de uforarbejdede omkringliggende områder af cellemonolaget forblive upåvirket og er tilgængelige for enten udvide mønster eller sondering andre egenskaber af cellerne.
Hastigheden af celle fjernelse er en funktion af både kemi og forskydning præsenteret af strømningen. Vi vælger en rækkevidde på flowhastigheder at have kemi dominerende fjernelse celle. Scanning hastigheder på 10 - 20 & #181; m / sek under anvendelse af en NaOH-injektion strømningshastighed på 6 - 8 pi / min anvendes til at fremme "hurtig" subtraktiv mønsterdannelse. Den hastige celle fjernelse adresserer nogle udfordringer ved overfladen trykning står baseret mønster nærmer 20,21. Disse metoder kræver en mekanisme til at begrænse væksten af celler i rumligt afgrænsede områder, for eksempel ved selektiv aflejring af celleadhæsionsproteiner via micro-kontakt trykning og efterfølgende podning af celler for at opnå mønsteret. De er begrænset af lav gennemløb og kræve flere sekventielle trin for mønster generation samt en ny stencil / stempel for hvert mønster. Den beskrevne fremgangsmåde kræver ikke selektiv vækst af celler på definerede områder, og overvinder adskillige begrænsninger ved at udføre subtraktiv mønsterdannelse i modsætning til trykning, mens der ikke kræver nogen yderligere behandling af cellekulturen substrat.
Med protokollen beskrevet i dette dokument, gennemløb af mønstret cellemonolagforøges, mens få øjeblikkelig visuel feedback på det mønster genereret. Dette letter realtid modifikation af mønstrene. kan være afgørende i situationer, hvor cellelevedygtighed på en given overflade ikke er homogen sådan kontrol. En anden fordel ved fremgangsmåden er, at den samme hoved og kemi kan anvendes til at generere flere mønstre, hvorved antallet af faser i at generere et mønstret cellemonolag.
Dimensionerne af kanalerne i hovedet og den geometri kan skaleres i henhold til kravene i ansøgningen, således at kontrol over løsningen af mønstret. Alle eksperimenter i det nuværende arbejde blev udført ved hjælp af en MFP hoved med faste blænde dimensioner, specielt med indvendige åbninger på 100 × 100 um og ydre åbninger på 200 × 100 um. Dette design med større udvendige åbninger blev valgt for at sikre kontinuerlig drift af hHFC uden tilstopning af hullerne vedomstrejfende cellerester. Vi har testet hoveder med indre blænde dimensioner 50 × 50 um og 50 um afstand mellem dem, med gode resultater i celle fjernelse. Anvendelse af mindre åbninger, ned til 10 × 10 um med 10 um afstand, ville tillade skalering til et mindre fodaftryk størrelse (~ 30 × 30 um), således at en højere opløsning i mønster. Vi observerede operationelle spørgsmål med blænde størrelser mindre end 10 um grundet tilstopning fra partikler. På grund af sådanne operative vanskeligheder, 100 um er den nuværende grænse på opløsning og dermed en begrænsning af den beskrevne teknik. Men vi kan løse dette ved hjælp af flydende udformningen evne til hHFC. Vi har vist, at løsningen af celle fjernelse kan være indstillet til et givet sæt af blænde dimensioner ved at kontrollere Q I2 / Q I1 (figur 4b) og toppunktet-til-substrat mellemrum 10,14. De etaper, der anvendes i det nuværende arbejde har et trin størrelse på 100 nm minimum.En kombination af disse styrbare parametre kan forbedre den rumlige opløsning af celle fjernelse med hensyn til fodaftryk størrelse og scanning afstand.
Hvis der ønskes mønstrede co-kulturer til undersøgelse af specifikke celle-celle interaktioner mellem forskellige celletyper, kan sekventiel podning og mønsterdannelse udføres ved anvendelse af protokollen beskrevet. Endelig kan der opnås amplificerbart DNA af høj kvalitet fra lysatet, som tydeligt ved ental top i DNA'et smelte kurve (se figur 7). Vi evaluerede en DNA mængde på omkring 1,6 ng fra en enkelt fodaftryk (ca. 300 celler) under anvendelse af qPCR, hvilket er tæt på den teoretiske forventning (6-8 pg / celle). Dette indikerer en mængde af den ekstraherede DNA velegnet til flere efterfølgende processer samtidig undgår brugen af DNA isoleringsmetoder. Dette åbner muligheder for DNA-analyse-baserede lokale sondering af dyrkede celler. Evne hHFC at forme væsker kan også anvendes til at deponere levende celler og proteiner på ackede overflader, som i kombination med den subtraktive mønsterdannelse og sekventiel co-dyrkning præsenteres i denne protokol kan oprettelsen af komplekse celle- og celle-matrix-mønstre på kultursubstrater. Alsidigheden og kontrol, som hHFC-baserede subtraktiv mønster af cellemonolag og muligheden for at udføre DNA-analyser på de udtrukne celler, giver et stærkt nyt værktøj indstillet til biologer at udføre rumligt løst undersøgelser med celle-interaktioner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Microfluidic Probe (MFP) | Silicon/glass hybrid probe head with channels patterned in silicon. Fabrication done in-house at IBM Research - Zürich | ||
| Lab Tek II Chamber slides with 2 chambers | ThermoFisher scientific, USA | 154461 | 2 Chamber chamber slides for cell culture with each chamber providing an area of 4 cm2 and capable of holding up to 3 ml of media volume |
| Chemicals and cell lines | |||
| Sodium Hydroxide, Tris-Cl, Ethylenediaminetetraaceticacid, Rhodamine B | SigmaAldrich chemicals, USA | S5881, 252859, E9884, R6626 | Chemicals used for processing and shielding liquids |
| Proteinase K | Qiagen, Germany | 19131 | protease to digest denatuired proteins |
| Deconex 16 Plus | Bohrer Chemie, Switzerland | Universal cleaning agent for labaratory consumables. Used for non stringent cleaning. | |
| DNA away | ThermoFisher scientific, USA | 7010 | Surface decontaminant that denatures DNA and DNAases. |
| DMEM, high glucose, GLUTAMAX supplement | ThermoFisher scientific, USA | 10566-016 | Culturing medium for epithelial cells. |
| CellTracker Green CMFDA dye | ThermoFisher scientific, USA | C7025 | Membrane permeant live cell labeling dye. Dye active for 72 hours. |
| CellTracker Orange CMRA dye | ThermoFisher scientific, USA | C34551 | |
| β-actin genomic primers for qPCR | Integrated DNA technologies, USA | Custom oligos used for DNA quality validation and qPCR. | |
| MCF7 breast carcinoma cells | ATCC, USA | ATCC HTB-22 | Cell lines used to produce co-cultures. |
| MDA-MB-231 breast carcinoma cells | ATCC, USA | ATCC HTB-26 | |
| Equipment and fluidic connections | |||
| Motorized high precision stages | Custom machined components. Linear axis motors from LANG GmBH, Germany | Customized linear axis stages from LT series | 3 × LT for 3 axes. LSTEP controller used for interfacing stages and PC through RS 232 port. |
| Syringes | Hamilton, Switzerland | 1700 TLLX series | Interchangeable with syringes provided by other manufacturers with a 250-500 µl range. |
| Nemesys low pressure syringe pumps | cetoni GmbH, Germany | Component of pumping station. | |
| Circular M1-connector | Dolomite microfluidics, United Kingdom | 3000051 | Interface between vias in MFP head and tubing |
| Tilt/rotation stage Goniometer | OptoSigma, USA | KKD-25C | Goniometer to adjust coplanarity of MFP apex |
| DS Fi2 HD color camera (CCD) | Nikon, Switzerland | Controlled using DS-U3 controller unit | |
| Software | |||
| Win - Commander | LANG GmBH, Germany | Stage control software. | |
| Qmix Elements | cetoni GmbH, Germany | Pump control software. | |
| NIS Elements | Nikon, Switzerland | Basic research module for image acquisition and analysis. | |
References
- Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. J. Cell Sci. 123 (Pt 24), 4201-4213 (2010).
- Goubko, C. A., Cao, X. Patterning multiple cell types in co-cultures: A review. Mater. Sci. Eng. C. 29 (6), 1855-1868 (2009).
- Kaji, H., Camci-Unal, G., Langer, R., Khademhosseini, A. Engineering systems for the generation of patterned co-cultures for controlling cell-cell interactions. Biochim. Biophys. Acta. 1810 (3), 239-250 (2011).
- Cho, C. H., Park, J., Tilles, A. W., Berthiaume, F., Toner, M., Yarmush, M. L. Layered patterning of hepatocytes in co-culture systems using microfabricated stencils. Biotechniques. 48 (1), 47-52 (2010).
- Schütze, K., Lahr, G. Identification of expressed genes by laser-mediated manipulation of single cells. Nat. Biotechnol. 16 (8), 737-742 (1998).
- Salazar, G. T. A., Wang, Y., et al. Micropallet arrays for the separation of single, adherent cells. Anal. Chem. 79 (2), 682-687 (2007).
- Guillaume-Gentil, O., Zambelli, T., Vorholt, J. A. Isolation of single mammalian cells from adherent cultures by fluidic force microscopy. Lab Chip. 14 (2), 402-414 (2014).
- Iwata, F., Adachi, M., Hashimoto, S. A single-cell scraper based on an atomic force microscope for detaching a living cell from a substrate. J. Appl. Phys. 118 (13), (2015).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J. Lab. Autom. 17 (1), 59-65 (2012).
- Juncker, D., Schmid, H., Delamarche, E. Multipurpose microfluidic probe. Nat. Mater. 4 (8), 622-628 (2005).
- Kaigala, G. V., Lovchik, R. D., Delamarche, E. Microfluidics in the "open space" for performing localized chemistry on biological interfaces. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 51 (45), 11224-11240 (2012).
- Qasaimeh, M. A., Gervais, T., Juncker, D. Microfluidic quadrupole and floating concentration gradient. Nat. Commun. 2 (May), 464 (2011).
- Christ, K. V., Turner, K. T. Design of hydrodynamically confined microfluidics: controlling flow envelope and pressure. Lab Chip. 11 (8), 1491-1501 (2011).
- Autebert, J., Kashyap, A., Lovchik, R. D., Delamarche, E., Kaigala, G. V. Hierarchical hydrodynamic flow confinement: efficient use and retrieval of chemicals for microscale chemistry on surfaces. Langmuir. 30 (12), 3640-3645 (2014).
- Kaigala, G. V., Lovchik, R. D., Drechsler, U., Delamarche, E. A Vertical Microfluidic Probe. Langmuir. 27 (9), 5686-5693 (2011).
- Cors, J. F., Lovchik, R. D., Delamarche, E., Kaigala, G. V. A compact and versatile microfluidic probe for local processing of tissue sections and biological specimens. Rev. Sci. Instrum. 85 (3), 034301 (2014).
- Pollard, J. W., Walker, J. M. Basic Cell Culture Protocols. , Humana Press. (1997).
- Mitry, R. R., Hughes, D. R. Human cell culture protocols. Methods Mol. Biol. Springer. 531 (1), (2012).
- Sakai, K., Ushida, T., Nagase, T., Nakamigawa, H. Quantitative analysis of cell detachment by shear stress. Mater. Sci. Eng. C. 17 (1-2), 55-58 (2001).
- Rodriguez, N. M., Desai, R. A., Trappmann, B., Baker, B. M., Chen, C. S. Micropatterned multicolor dynamically adhesive substrates to control cell adhesion and multicellular organization. Langmuir. 30 (5), 1327-1335 (2014).
- Tasoglu, S., Demirci, U. Bioprinting for stem cell research. Trends Biotechnol. 31 (1), 10-19 (2013).
