Abstract
Den microfluidic probe (MFP) letter å utføre lokal kjemi på biologiske substrater ved å avgrense nanoliter mengder væsker. Ved hjelp av en spesiell implementering av MFP, den hierarkiske hydrodynamisk strømningsbegrensnings (hHFC), er flere væsker samtidig bringes i kontakt med et substrat. Lokal kjemiske handling og flytende forme bruker hHFC, utnyttes til å skape celle mønstre ved lokalt lysering og fjerning av celler. Ved å benytte søkemulighetene på MFP, er brukerdefinerte mønstre av cellemonolagene opprettet. Denne protokollen muliggjør rask, i sanntid og romlig styrt mønstring celle, noe som kan tillate selektiv celle-celle og celle-matriks-interaksjonsstudier.
Introduction
I sitt opprinnelige miljø, celler i biologisk vev oppfatter en rekke biokjemiske og fysiske signaler regissere sin vekst, organisasjon og utvikling. Forstå disse stikkordene krever selektiv undersøkelse av celle-celle og celle-matrise interaksjoner. Dette nødvendiggjør utvikling av metoder for mønster cellemonolagene. Metoder for å geometrisk separate ulike celletyper i kultur (mønster) gjør brede studier av fysiske og kjemiske signaler i cellebiologi. De fleste av dagens tilnærminger for mønster cellelag 1-4 avhenge deponering celle-adhesjonsproteiner på overflater eller bruker microfabricated sjablonger for selektiv vekst på underlag. I motsetning til dette, her presenterer vi en fremgangsmåte for å raskt mønster cellemonolag in situ, dvs. celler i kultur, ved å fjerne celler som i utvalgte områder av monolaget. Metoder som utfører slike subtraktiv mønstring 5-9 usually krever spesialiserte underlag, overflatebehandling, kompleks operasjon, fysisk kontakt eller ablasjon ved hjelp av en laser, utilsiktet påvirker levende celler. Vi her bruker en microfluidic probe (MFP) 10,11, en ikke-kontakt skanning microfluidic teknologi som hydrodynamisk begrenser en væske på et substrat. En viktig del av multifunksjonsmaskinen er den microfabricated hodet inneholder mikro (figur 1). Den tilhørende plattform består av sprøytepumper for flytende kontroll, scener for skanning av kontroll og en invertert mikroskop for visualisering og feedback (figur 2). I sin grunnleggende konfigurasjon omfatter MFP hode to mikrokanaler med åpninger på toppen, en for injisering av et behandlingsvæske, og den andre for å aspirere den injiserte behandlingsvæsken sammen med noen nedsenking væske (figur 3A). Under drift MFP, er toppunktet i en fast avstand fra substratet. Når aspirasjon strømningshastighet (QA) er sufficiently høyere enn injeksjonsstrømningsmengden (Q-i), dvs. en Q: Q i ≥ 2,5, prosessvæsken er begrenset på substratet. Dette resulterer i en hydrodynamisk strømningsbegrensnings (HFC). Regionen der prosessvæsken er i direkte kontakt med substratet er betegnet fotavtrykk. For typiske driftsforhold, blir strømmen av prosessvæsken inne i HFC kjennetegnet ved et lavt Reynolds tall (Re ≈ 10 -2) og en høy Péclet nummer (Pe ≈ 10 2). Dette innebærer væske strømmer i laminær regime med konveksjon være den primære modusen for masseoverføring av kjemiske arter. De numeriske og analytiske modeller for flyt sperring er beskrevet andre steder 12-14.
I denne artikkelen bruker vi tilnærming til samtidig begrensnings flere behandlings væsker, som kalles hierarkisk HFC (hHFC) 14. Å implementere hHFC med multifunksjonsmaskinen, to additional åpninger er nødvendig for å tilveiebringe en sekundær kilde til injeksjon og aspirasjon. Dette gjør oss i stand til å begrense en væske i en annen væske. De indre (processing) flytende fordeler av å være skjermet fra bortkommen rusk på underlaget ved den ytre (skjerming) væske. I tillegg gir hHFC drift i to modi: (i) den nestede modus, der prosessvæsken i det indre HFC berøring med flaten (figur 3B), og (ii) den klemt modus, der den indre væsken mister kontakt og bare den ytre væsken er i kontakt med substratet (figur 3C). Bytte mellom de to modusene tillater brukere å utføre eller stoppe behandlingen underlaget og oppnås ved å kontrollere hode-til-overflate gap eller ved å endre forholdet mellom injeksjonsstrømmer (Q i2 / Q i1). For en gitt kanal geometri, kan fotavtrykk av prosessvæsken på substratet styres ved å modulere strømningsforhold (figur 3D). Sodium hydroksyd (NaOH) anvendes som den indre prosessvæsken for å lysere cellene, og lysatet blir kontinuerlig suget fra overflaten. Fordi de kjemiske virkningene av prosessvæsken blir lokalisert til den indre HFC fotavtrykk, de tilstøtende cellene forblir uforstyrret, noe som gir tid og rom undersøkelser av celle-celle interaksjoner. Skanne funksjonaliteten til MFP tillater etablering av brukerdefinerte geometrier av cellemønster (figur 4). Videre er valget av NaOH som behandlingsvæske har plass til nedstrøms-DNA-analyse (figur 7).
Protocol
1. MFP Head and Platform rengjøring og klargjøring
MERK: Denne protokollen bruker vertikalt orienterte silisium-glass hybrid MFP leder 15,16. Silisium-komponenten av hodet inneholder mikrokanalene, som er etset til en dybde på 100 um. Den etsede silisium er bundet til glasset ved hjelp av anodisk bonding. Kanalen utforming omfatter et mønster som består av seks kanaler, to hver for injeksjon og aspirasjon, og to for å injisere nedsenking væske (figur 1). De kanalene som brukes for å injisere væske nedsenking fylle mediet som omgir den biologiske prøven, og dermed unngår tap på grunn av fordampning og aspirasjon. De indre kanaler og ytre kanaler som brukes i det aktuelle arbeidet er 100 x 100 um og 200 x 100 um respektivt. Post fabrikasjon og prosessering, MFP hoder med klare kanaler og polerte spisser oppnås.
- Klargjøring av pumpestasjon og væskehåndteringapparater
- Bruk kapillærer med en 1/16 '' (1,59 mm) ytre diameter og 0,02 '' (0,51 mm) innvendig diameter for alle slanger som er koblet til sprøytene. Varier kapillær størrelse basert på søknad og få de riktige kontaktene og beslag til grensesnittet MFP hodet med sprøytene. Bruk av ultrarent vann hvor fortynningene er nødvendig.
- Rene sprøyter (250 - 500 mL volum) og sprøyte stempler ved ultralydbehandling i 0,5% blekemiddel i ultrarent vann før til- og post levende celleforsøk. Skyll dem grundig med vann. Fylle dem med vann ved neddykking deres spisser fullstendig i et vannbad og aspirering ved bruk av stemplet. Rens væsken mens i vannbad med sprøyten aksel kontakter forseglingen ved utgangen av sprøyten. Gjenta aspirer og rense inntil ingen luftbobler blir sett i sprøyten kolonner.
- Koble fylte sprøyter til sprøytepumper ved hjelp av Luer-Lock koblinger. Bruke en bryter ventil montert påpumper for å lede væske fra sprøyten til en av to kapillarer som fører enten til MFP hodet eller til de flytende reservoarer (figur 6). (Hvis ingen bryter ventil er tilgjengelig se avsnitt 1.4.4). Rens begge kapillærer med vann fra sprøytene ved en strømningshastighet på ca 10 - 50 ul / min, avhengig av størrelsen av sprøyten inntil omtrent 10 pl av vann som er igjen i sprøytene.
- Forhånds sette inn de renset kapillærene i en egnet mikrofluidkontakt / adapter som grensesnitt med kanal vias i hodet (for eksempel M1-kontakt - se materialer).
- MFP hodet forberedelse
- Rengjør MFP hodet ved ultralyd hjelp glass vaskemiddel for vanlig rengjøring eller 0,5% blekemiddel for strenge rengjøring, for 5 min. Rens kanaler med vann ved å dyppe apex i vann og bruke vakuum vias.
- Inspiser kanaler under et stereomikroskop for potensielle hindringer (tilstopping) og retorv forrige trinn om nødvendig.
- Monter ren hodet på hodet holderen og skru kontakten med pre-satt og renset rør på hodet. Skru hodeholder til den Z-fasen, som brukes for kontroll av gapet avstand mellom hodet og cellemonolaget.
- Kalibrering skanne stadier av MFP-plattformen
- Utfør endepunkt kalibrering av X-, Y- og Z-etapper før du kobler hodet til plattformen, ifølge produsentens protokoll med en passende programvare grensesnitt. Kalibrerte stadier sikre nøyaktighet i å posisjonere hodet MFP.
- Skaff en rå null gap avstand (nullstilling) ved å bringe hodet MFP over et kammer lysbilde uten celler og sakte ned i 5 mikrometer trinn. Ved sonde kontakt med substratet, bør Newtons ringer holdes. Dette er et grovt overslag. En nøyaktig posisjon skal oppnås etter å ha justert koplanaritet av sonden apex til substrate.
- For å sikre koplanaritet av sonden apex, justere vinkelen på hodet ved hjelp av et goniometer (i grenseflaten av hodet og Z scenen). Når dannet sikre at Newtons ringer er symmetrisk (figur 1). Flytt MFP hodet 20 mikrometer vekk fra underlaget og justere tilt med goniometer. Gjenta descend, nullstilling og tilt justering før Newtons ringer er symmetrisk ved kontakt. Med tilt justert, setter z posisjonen som produserer symmetriske Newton ringer som null.
MERK: Z-trinns styrer head-to-underlaget avstand, mens XY scenen styrer skanning av underlaget (figur 2). En detaljert forklaring finner du i vår tidligere arbeidet 14.
- Kjemiske preparater til lokal fjerning av cellelag
Forsiktig: Når det er hensiktsmessig, bruk sikkerhetsutstyr (f.eks nitril hansker, vernebriller) for kjemikalier under utarbeidelse. Bruk en røyk hood om nødvendig for å forberede løsninger. Forbered alle kjemikalier og buffere med ultrarent vann som fortynningsmiddel.- Fremstille 50 mM NaOH-oppløsning som prosessvæsken for den indre injeksjonskanalen (i2 med strømning Q I2 i figur 1).
- Klargjør utvinning bufferoppløsning som er nødvendig for den ytre injeksjon (i1 med strømning Q I1 i figur 1), som består av 1 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), 0,5% Tween 20, og 10 pM rhodamin B i 50 mM Tris (hydroksymetyl) aminometan i pH 8. For renselse, bruk vann i aspirasjonstrinnene sprøyter.
- Filtrere alle løsninger ved hjelp av en 0,2 mikrometer sprøyte filter. Degas alle filtrerte løsningene ved hjelp av en eksikator inntil oppløst luft stopp bobler til overflaten.
- Bruke avløpet linjen koblet til sprøytepumper, rense rest vann og aspirer de avgassede løsninger inn i injeksjonssprøyter på 40 ul / min før sprøytene er full (250 eller 500 mikroliter).Dette sikrer boble-fri fylling av sprøyter, kontakter og kapillærer. Sprøyten-bryterventilen-to-kapillar-systemet tillater fylling av sprøyter mid-eksperiment. I fravær av et slikt bytte ventil, kobler kapillærene fra hodet og fylle kapillærene og sprøyten ved å aspirere de avgassede løsninger før du kobler dem til hodet.
- Aspirering av behandling og skjerming av væsker gjennom kapillærene tillater bruk av små volumer under drift. Hvis kjemikaliene kan fremstilles i store volumer, fylle sprøyter med de nødvendige løsninger direkte. For eksempel kan aspirasjonstrinnene sprøyter som inneholder vann fylles ved hjelp av denne metode.
- Rens kapillærene til MFP hodet med de tildelte for hver kanal som definert i 1.4.1 og 1.4.2 væsker.
MERK: ekstraksjon bufferløsning beskytter NaOH i den indre begrensnings og rodamin-komponenten i bufferen muliggjør visualisering av the hHFC under drift. - Dersom cellene er over-sammenflytende, med celleaggregater som vises på den dyrkede flate, supplere ekstraksjon buffer med 10% proteinase K. Dette supplerer virkningen av NaOH på disse aggregatene ved oppløsning av denaturerte proteiner som lysatet kommer inn i innsugningskanaler. Dette forhindrer tilstopping av kanalene under drift.
- Utarbeidelse av cellemonolagene på kammer lysbilder
Forsiktig: Bruk en cellekultur hette for dyrking av cellene og håndtere utstyr som per forskrifter fastsatt av biosikkerhet offiser av laboratoriet. Merk spesielle krav til spesifikke cellelinjer og tilpasse protokollen og utstyr tilsvarende.- Bruk cellekultur inkubatorer (ved 5% CO 2 og ved 37 ºC) for kultur og utvidelse av celler til å være mønstret. Utfør utvidelse ved hjelp av standard cellekultur protokoller 17,18 i T-kolber. Bruk dyrking media som per kravene til den spesifikke cell tråd (f.eks, serum og antibiotika supplert DMEM for dyrking MCF7 og MDAMB 231).
- På nå celle konfluens i kulturflasker, trypsineres og samle celler og frø 2 x 10 5 celler / cm 2 i hvert av de to-kammers objektglass for mønstring og kulturen i løpet av 48 timer. Bruk av cellene i et av kamrene som en kontroll for cellevekst og levedyktighet.
- På nå celle konfluens på kammerobjektglass, inkuberes cellene i 45 minutter med 500 ul celle-tracker fargeløsning (som grønn - CMFDA eller oransje - CMRA) ved 10 uM konsentrasjon fremstilt i serumfritt medium. Dette er gjort for celle visualisering under mønstring. Vask de merkede cellene med PBS ved forsiktig skylle hvert kammer ved hjelp av en pipette, og senere kultur cellene i serum-supplert media for mønster eksperimenter.
- Oppnå et referansebilde av den celle-tracker-farget celleoverflate i den hensikt å celletelling. Dette gjøres for å sikrekonfluens av cellelaget. I tillegg fungerer den som et hjelpemiddel for kvantifisering eksperimenter hvis prøven utvinning og DNA-analyse er mål.
MERK: I tilfelle at cellen levedyktighet skal vurderes i løpet av mønster, kan cellene farget med en Live / Død cytotoksisitet kit i henhold til produsentens instruksjoner.
2. Opprette Hierarkisk Hydrodynamisk Flow Confinement (hHFC)
- Flytt MFP over cellen monolayer til et gap avstand på 50 mikrometer fra glass-slide. Dette gapet avstand samtidig som man sikrer kontakt mellom hHFC står også for enkeltlag overflate og tykkelse variasjon.
- Sprøyt NaOH på 6 eller 8 mL / min gjennom i2. Evaluere andre strømningshastigheter (dvs. Q I1, Q A1 og A2 Q) ved hjelp av strømnings reglene i figur 3.
- Modulere størrelsen av den indre HFC ved å endre forholdet mellom Q I2 / Q I1 ved hjelp av injeksjonssprøyter.For eksempel bruke en Q I1 mellom 1,3 ul / min og 4 mL / min, med Q I2 fastsatt til 8 mL / min, noe som resulterer i en NaOH grunnflate på 150 - 300 celler (100 - 200 mikrometer 2 / celle) ( Figur 3D).
- Injiser fullstendig medium fra de ytterste åpninger på MFP hodet ved en strømningshastighet på 20 ul / min for å ta hensyn til fordampning av media og aspirasjon under driften av den hHFC.
3. mønster cellemono Bruke hHFC
Merk: skannemønster bestemmer hvilke områder av cellemonolaget hvor cellene blir ekstrahert (subtraktiv mønster), og etterlater de gjenværende celler for å studere bestemte biologiske spørsmål. Dette mønsteret kan være rette linjer eller en rekke flekker, for eksempel. Komplekse mønstre krever utformingen av en passende skanning bane. For eksempel gir en rutete skanning bane et rutenett av celleområder (vist for eksempel i figur 4A
- Satt scenen programvare for å skanne sondehodet over cellen monolag i brukerdefinerte mønster (ved å sette X, Y og Z-koordinatene) ved en skannehastighet på 10 um / s ved et gap avstand på 50 mikron.
- Med den nestede hHFC i drift og i kontakt med monolaget, skanne MFP med en bane av det ønskede mønster for å bevirke mønstrede celle fjerning.
- For en co-kultur etter første celletype fjerning, frø en annen cellelinje for å fylle hullene, ved hjelp av metodene beskrevet i kapittel 1.5. Flytte mellom nestede og klemt moduser (ved å øke gapet avstand, for eksempel) for å kontrollere celle fjerning.
MERK: Skanningen hastighet kan ha å være undersoktegated for andre cellelinjer. Skanningen hastighet som brukes i denne demonstrasjons- effekter fullstendig cellefjerning i løpet av de skannede regioner for de benyttede cellelinjer.
4. Nedstrøms Processing for prøvetaking og DNA Amplification
- Forbered prøvetaking stasjonen for nedstrøms analyse av løsningen. For prøvetaking stasjon, kan du bruke en 3D trykt 8-stripen PCR rør holder. Alternativt kan velge en passende rørholder for å tjene som denne adapter, som er istand til å bli montert inne i skanneområdet av hodet utenfor underlaget. Tørk slangeholderen med 70% etanol eller andre overflate decontaminants basert på den som er ønsket for anvendelsen stringens. Bruk en magnetisk klipp på røret holder for å feste den på underlaget holder.
- Etter å ha forberedt prøvetakingsstasjonen, plasserer MFP hodet 100 mikrometer fra monolaget. Begynne å operere hHFC med 50 mM NaOH-oppløsning som prosessvæsken for den indre injeksjonskanal med strømningshastigheter på 1, 6, -7 Og -17,5 mL / min for henholdsvis Q I1, Q I2, Q A1 og Q A2.
- Når strømningsbegrensnings har stabilisert seg (i ca. 10 sek), ned sondehodet til et gap avstand på 50 mikron for å utføre NaOH basert lokal lysering av den valgte sub-populasjon av celler med hHFC. Når lysis av sub-populasjonen er fullført (ca. 30 sek per footprint), dirigere hodet mot rørene i prøvestasjonen. Løs ut samlet lysat til PCR-rør direkte (figur 6).
- For nedstrøms prosessering av løsningen, først nøytralisere pH i oppløsningen ved å blande lysatet med Tris-buffer (1: 1). Etter nøytralisering, oppvarme lysatet til 95 ° C i 30 minutter. Deretter direkte laste lysat til en standard qPCR arbeidsflyt som fastsatt av leverandøren av instrumentet.
Representative Results
Den beskrevne protokoll for hurtig subtraktiv mønstring av cellemonolagene er demonstrert ved bruk av en bestanddel MFP plattform med flere (figur 1 og 2). Protokollen benytter den hierarkiske hydrodynamisk strømningsbegrensnings (hHFC, figur 3) for lokalt å behandle og fjerne celler fra cellemonosjikt, ved hjelp av NaOH som prosessvæsken. Den hHFC konfigurasjon omfatter en indre og en ytre HFC HFC. Det avgrensede NaOH i den indre hHFC innfører kjemiske handling og skjærkraft på cellene i kontakt. Innenfor denne fotavtrykk, blir cellene homogent utsatt for kjemisk innvirkning av NaOH, på grunn av konveksjon drevet masseoverføring innenfor og med neglisjerbar diffusjon til regionen utenfor begrensnings. Skjær på cellene på den annen side, kan endres ved å variere strømningshastigheten av NaOH. For å forenkle driftsparametre, valgte vi å gjøre kjemisk handling den dominerende mekanismen for cellefjerning i forhold til skjær. Tilberegne skjærkraften påført av hHFC på overflaten, ble en endelig-element modellen bygget ved hjelp av COMSOL Multiphysics 5,0. Simuleringer ble kjørt med CFD-modulen for laminære strømmer. To innløpsgrensebetingelser til injeksjonsåpningene av geometrien og to utløpsgrensebetingelser til aspirasjon åpningene (figur 5) ble anvendt for omfanget av strømningshastigheter og åpningsdimensjonene som brukes i den aktuelle demonstrasjonen. I modellen oppnådd, strømnings regler bestemmes skjærprofilen, mens strømningshastigheten definert størrelsen av skjærkraft på overflaten. Praktisk talt, en kombinasjon av begge bestemmer om hHFC berøring med flaten. Å holde disse faktorene i tankene, setter vi ut for å finne et utvalg av strømningsrater for drift for å oppnå kjemisk dominerende celle fjerning. For å opprette en hHFC, bruker vi strømmen regel av en total aspirasjon til injeksjons flow rate ratio på 3,5. De andre strømningsReglene ble definert til å redusere tilstopping innenfor aspirasjonstrinnene kanaler,som kan være forårsaket av denaturerte proteiner som stikker til kanalflater. Ved hjelp av den utviklede modell, har vi funnet strømningshastigheter fra 5 til 10 ul / min for å oversette en skjærspenning mellom 1 og 3 N / m 2. Uten den kjemiske virkning av NaOH, for eksempel i tilfellet med utvinning buffer, skjærspenningen ville ikke være høy nok til å fjerne cellene 19. Innenfor den observerte serien, ser vi at driften ved høyere strømningshastigheter er mer praktisk på grunn av forstyrrelser i strømningsbanen ved lave aspirasjon strømningsrater (dvs. Q I2 <4 mL / min) på grunn av celleavfall i kanalene.
Tatt i betraktning den undersøkte skjærprofilen og praktiske hensyn, NaOH-strømningshastigheter (Q I2) på 6 og 8 ul / min brukes for mønstrings eksperimenter og Q I1, Q A1 og Q A2 i henhold til flyt reglene som er vist i figur 3. Forholdet injeksjonsstrømmer (Q I2 / Q I1) lar us for ytterligere å modulere størrelsen på hHFC fotavtrykk (figur 3D og figur 4B), med det underliggende prinsipp utarbeidet av Autebert et al., 14. Ved hjelp av væske-shaping evne til hHFC kombinert med høy oppløsning skanning evne til MFP plattform, demonstrerer vi levende celle gittergenerering ved flere skalaer, og dessuten viser anvendelsen av den gitte protokoll i utviklingen av ko-kulturer (figur 4C).
Plattformen gjør det også mulig for oss å utføre prøven lysat gjenfinning for nedstrøms analyse. Som viser kvaliteten av den oppnådde løsningen, satte vi samplet lokalt lyserte celler fra ett til fem spor i to uavhengige forsøk, som viser variasjonen i mengder av DNA oppnådd fra lysatet (figur 7). Her har vi forsterket DNA som finnes i lysat bruker p-aktin primere (forover: GGATGCAGAAGGAGATCACT og omvendt: CGATCCACACGGAGTACTTG ) Ved anvendelse av 4 ul av den nøytraliserte lysatet i hver PCR-reaksjon.
Figur 1. Moduler av MFP-plattformen og hodet. (A) De operative moduler av plattformen omfatter motorisert sprøyter, motoriserte scener og en kontroller. At maskinen er koblet til en motorisert Z-stadiet for å kontrollere gapet avstanden mellom hodet og substratet, og substratet holderen er festet til X- og Y-motoriserte trinn utgjør skannesystemet. (B) Den MFP Hodet har fluidic vias å koble pumpestasjon, monteringshull for å montere hodet på Z-scenen, og kanaler som kommer ut av polert apex. Toppunktet er innstilt i samme plan til cellekulturen substratet. Symmetrisk Newtons ringer kan observeres når apex og underlaget er i samme plan og i kontakt. p_upload / 54447 / 54447fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. MFP plattformen. Skanneplattformen med høy oppløsning er utstyrt med en maskinert hode holder grensesnitt med høy presisjon motorisert Z-trinnet. Substratholderen er koblet til XY trinnet for skanning formål. For utvinning av lysatet for genetisk analyse, er en 3D samplings trykt stasjon festes magnetisk til den side av substratet holderen (vist i innfelt). Sprøytepumper, en invertert mikroskop, kontrollere og skjermer er plassert rundt plattformen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
3 "src =" / files / ftp_upload / 54447 / 54447fig3.jpg "/>
Figur 3. Hierarkisk hydrodynamisk flyt sperring (hHFC) for romlig og tidsmessig kontroll av celle fjerning. (A) Skjematisk av en enkelt HFC. (B) nestet og (C) klemt virke hHFC drift. (D) Bilde av fotavtrykket for to forskjellige injeksjon / aspirasjon strømforhold. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Mønstre av cellemonolagene ved hjelp av multifunksjonsmaskinen. (A) Cell-grid generasjon av programmert skanning av maskinen på en MDA-MB-231 cellemonolaget. Cellene ble farget med grønn celle-tracker fargestoff. (B) Fotavtrykket for de ulike injeksjons forholdstall (n) På en MCF7 celle monolag. Den skjematiske viser den forventede variasjon i formen på den indre HFC med en endring i n. (C) Mønstret co-kultur ved subtraktiv mønstring av MCF7- enkeltlag fulgt av seeding MDA-MB-231 celler i trekkes regionene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Skjærspenning på overflaten ved påføring hHFC. Skjærspenningen på overflaten øker lineært med den indre injeksjonsstrømningshastighet. Den høyeste skjær punktet er funnet mellom de to indre åpninger (nederst til høyre innfelt), der prosessvæsken trange (rød strømningsrør, øverst til venstre innfelt). Åpningsdimensjonene som brukes i finite-element modellen er 200, 100, 100 og 200 mikrometer for i1, i2, a1og a2 hhv. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Driftsmåter MFP-plattform for å utføre cellefjerning og mønstring. (A) Skjematisk av strømningsbanen for subtraktiv mønster av cellelyse. For enkelhets skyld er bare en av hver injeksjon og aspirasjon strømningsbaner er vist. Sprøytene er fylt ved hjelp av tømmeventilen i pumpene. i1 og i2 er brukt til injisering av ekstraksjon buffer og NaOH, respektivt. (B) Skjematisk av strømningsbanen for lysat utvinning. Denne strømningsveien aktiveres etter samling av cellelysat for analyse ved bruk av strømningsbanen i (A). Vennligst klikkk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. Nedstrøms-analyse av DNA fra cellelysat ved hjelp av qPCR. (A) Amplification plott av DNA i lysatet ble ekstrahert fra 5 spor (5 FP) og en avtrykk (1 fp). Kontrollene ble trukket ut etter lysat samling for begge tilfellene. (B) Smelt kurver av DNA amplifisert fra lysatet som viser kvaliteten av det ekstraherte DNA. qPCR ble utført (N = 2, n = 3) for å forsterke β-aktin-genet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur S1. En skalert bilde av kanal design for 6-kanals MFP hodetbrukes for mønstrings eksperimenter. Kanaler som utfører hHFC er 200, 100, 100, 200 mikrometer brede, og 100 um dypt. De to ytterste kanaler, som etterfylle nedsenking væske er 500 mikrometer brede og 100 um dypt. En GDS-fil for samme design har blitt gitt som et supplement til denne artikkelen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Vi presenterer en allsidig protokoll for subtraktive mønstring av cellemonolagene som muliggjør hurtig dannelse av romlig definerte cellemønstre. Selektiv oppløsning av cellemonolagene blir utført ved anvendelse av NaOH som prosessvæsken i hHFC. NaOH umiddelbart denatures proteinene som finnes i cellemembranen. Vi anbefaler bruk av 50 mM konsentrasjon av NaOH for å sikre nedstrøms prosessering av lysatet. Denne konsentrasjonen kan økes for raskere fjernelse celle, forutsatt lysat nedstrøms prosessering er ikke et mål. Den hHFC sikrer at ubehandlet omkringliggende områdene av cellemonolaget forblir upåvirket og er tilgjengelig for enten å utvide mønster eller sondering andre egenskaper cellene.
Hastigheten av cellefjerning er en funksjon av både den kjemiske og skjærpresentert av strømningen. Vi velger en rekkevidde på strømningshastigheter å ha kjemi dominerende celle fjerning. Skanning hastigheter på 10-20 & #181; m / sek ved hjelp av en NaOH-injeksjonsstrømningshastighet på 6 - 8 mL / min brukes for å lette "hurtig" subtraktiv mønster. Den raske frekvensen av celle fjerning løser noen utfordringer flattrykk basert mønster tilnærminger 20,21. Disse fremgangsmåter krever en mekanisme for å begrense vekst av celler i romlig definerte områder, for eksempel, ved selektiv avsetning av celle adhesjonsproteiner via mikrokontakttrykking og etterfølgende såing av cellene for å oppnå et mønster. De er begrenset ved lav gjennomstrømning og kreve flere sekvensielle trinn for mønstergenerering, så vel som en ny sjablong / stempel for hvert mønster. Den beskrevne metoden krever ikke selektiv vekst av celler i definerte områder, og overvinner flere begrensninger ved å utføre subtraktiv mønster i motsetning til trykking, mens ikke kreve noen ekstra behandling av cellekulturen substratet.
Med protokollen skissert i denne artikkelen, gjennomstrømningen av mønster cellemonoer økt, mens få umiddelbar visuell tilbakemelding av mønsteret generert. Dette muliggjør sanntids modifikasjon av mønstrene. En slik styring kan være avgjørende i situasjoner hvor cellenes levedyktighet på en gitt overflate er ikke homogent. En annen fordel ved fremgangsmåten er at det samme hode og kjemi kan anvendes for å generere flere mønstre, og dermed redusere antall trinn som er involvert i å generere et mønstret celle monolag.
Dimensjonene på kanalene i hodet og hode geometri kan skaleres i henhold til kravene for programmet, noe som tillater kontroll over oppløsningen av mønster. Alle eksperimenter i nåværende arbeid ble utført ved hjelp av en MFP hode med fast blenderåpning dimensjoner, spesielt med indre åpninger på 100 × 100 mikrometer og ytre åpninger på 200 × 100 mikrometer. Denne utformingen med større ytre åpninger ble valgt for å sikre kontinuerlig drift av hHFC uten tilstopping av åpningene etterStray celleavfall. Vi har testet hoder med indre åpningsdimensjonene 50 × 50 mikrometer og 50 mikrometer avstand mellom dem, med vellykkede resultater i cellen fjerning. Bruk av mindre blenderåpninger, ned til 10 × 10 mm med 10 mm avstand, ville tillate skalering til et mindre fotavtrykk størrelse (~ 30 × 30 mm), og dermed gjør en høyere oppløsning i mønster. Vi observerte driftsproblemer med blender størrelser mindre enn 10 mikrometer grunn av tilstopping fra partikler. På grunn av slike driftsvanskeligheter, er 100 mikrometer det samme som nivået av oppløsningen og dermed en begrensning av den beskrevne teknikk. Men vi kan løse dette ved hjelp av flytende utformingen evne til hHFC. Vi har vist at oppløsningen av cellefjerning kan være innstilt for et gitt sett av åpningsdimensjonene ved å kontrollere Q I2 / Q I1 (figur 4b), og toppunktet-til-substrat gap 10,14. De trinn som benyttes i den aktuelle arbeidet har en minste trinnstørrelse på 100 nm.En kombinasjon av disse kontrollerbare parametre kan forbedre romlig oppløsning av cellefjerning i form av fotavtrykket størrelse og skanning avstand.
Hvis mønstrede ko-kulturer er ønskelig å studere bestemte celle-celleinteraksjoner mellom forskjellige celletyper, kan sekvensiell såing og mønstring bli utført ved hjelp av protokollen beskrevet. Endelig kan forøkbare DNA av høy kvalitet oppnås fra lysatet, slik det fremgår av den snevre topp i DNA smeltekurven (se figur 7). Vi evaluerte en DNA-mengde på ca. 1,6 ng fra en enkelt fotavtrykk (ca. 300 celler) ved anvendelse qPCR, som er nær teoretisk forventning (6-8 pg / celle). Dette indikerer en mengde av det ekstraherte DNA egnet for flere nedstrømsprosesser, mens man unngår bruk av DNA isoleringsmetoder. Dette åpner muligheter for DNA-analyse-baserte lokale sondering av dyrkede celler. Evnen til å forme hHFC væsker kan også brukes for å avsette levende celler og proteiner på activated flater, som i kombinasjon med den subtraktive mønstring og sekvensiell ko-dyrking presentert i denne protokollen muliggjør dannelsen av komplekse celle og celle-matriks-mønster på kultur substrater. Allsidigheten og den styring som tilveiebringes ved hHFC basert subtraktiv mønstring av cellemonolagene og muligheten for å utføre DNA-analyse på de ekstraherte celler, gir et kraftig nytt verktøy satt til biologer å utføre romlig oppløste studier som involverer celle-interaksjoner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Microfluidic Probe (MFP) | Silicon/glass hybrid probe head with channels patterned in silicon. Fabrication done in-house at IBM Research - Zürich | ||
| Lab Tek II Chamber slides with 2 chambers | ThermoFisher scientific, USA | 154461 | 2 Chamber chamber slides for cell culture with each chamber providing an area of 4 cm2 and capable of holding up to 3 ml of media volume |
| Chemicals and cell lines | |||
| Sodium Hydroxide, Tris-Cl, Ethylenediaminetetraaceticacid, Rhodamine B | SigmaAldrich chemicals, USA | S5881, 252859, E9884, R6626 | Chemicals used for processing and shielding liquids |
| Proteinase K | Qiagen, Germany | 19131 | protease to digest denatuired proteins |
| Deconex 16 Plus | Bohrer Chemie, Switzerland | Universal cleaning agent for labaratory consumables. Used for non stringent cleaning. | |
| DNA away | ThermoFisher scientific, USA | 7010 | Surface decontaminant that denatures DNA and DNAases. |
| DMEM, high glucose, GLUTAMAX supplement | ThermoFisher scientific, USA | 10566-016 | Culturing medium for epithelial cells. |
| CellTracker Green CMFDA dye | ThermoFisher scientific, USA | C7025 | Membrane permeant live cell labeling dye. Dye active for 72 hours. |
| CellTracker Orange CMRA dye | ThermoFisher scientific, USA | C34551 | |
| β-actin genomic primers for qPCR | Integrated DNA technologies, USA | Custom oligos used for DNA quality validation and qPCR. | |
| MCF7 breast carcinoma cells | ATCC, USA | ATCC HTB-22 | Cell lines used to produce co-cultures. |
| MDA-MB-231 breast carcinoma cells | ATCC, USA | ATCC HTB-26 | |
| Equipment and fluidic connections | |||
| Motorized high precision stages | Custom machined components. Linear axis motors from LANG GmBH, Germany | Customized linear axis stages from LT series | 3 × LT for 3 axes. LSTEP controller used for interfacing stages and PC through RS 232 port. |
| Syringes | Hamilton, Switzerland | 1700 TLLX series | Interchangeable with syringes provided by other manufacturers with a 250-500 µl range. |
| Nemesys low pressure syringe pumps | cetoni GmbH, Germany | Component of pumping station. | |
| Circular M1-connector | Dolomite microfluidics, United Kingdom | 3000051 | Interface between vias in MFP head and tubing |
| Tilt/rotation stage Goniometer | OptoSigma, USA | KKD-25C | Goniometer to adjust coplanarity of MFP apex |
| DS Fi2 HD color camera (CCD) | Nikon, Switzerland | Controlled using DS-U3 controller unit | |
| Software | |||
| Win - Commander | LANG GmBH, Germany | Stage control software. | |
| Qmix Elements | cetoni GmbH, Germany | Pump control software. | |
| NIS Elements | Nikon, Switzerland | Basic research module for image acquisition and analysis. | |
References
- Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. J. Cell Sci. 123 (Pt 24), 4201-4213 (2010).
- Goubko, C. A., Cao, X. Patterning multiple cell types in co-cultures: A review. Mater. Sci. Eng. C. 29 (6), 1855-1868 (2009).
- Kaji, H., Camci-Unal, G., Langer, R., Khademhosseini, A. Engineering systems for the generation of patterned co-cultures for controlling cell-cell interactions. Biochim. Biophys. Acta. 1810 (3), 239-250 (2011).
- Cho, C. H., Park, J., Tilles, A. W., Berthiaume, F., Toner, M., Yarmush, M. L. Layered patterning of hepatocytes in co-culture systems using microfabricated stencils. Biotechniques. 48 (1), 47-52 (2010).
- Schütze, K., Lahr, G. Identification of expressed genes by laser-mediated manipulation of single cells. Nat. Biotechnol. 16 (8), 737-742 (1998).
- Salazar, G. T. A., Wang, Y., et al. Micropallet arrays for the separation of single, adherent cells. Anal. Chem. 79 (2), 682-687 (2007).
- Guillaume-Gentil, O., Zambelli, T., Vorholt, J. A. Isolation of single mammalian cells from adherent cultures by fluidic force microscopy. Lab Chip. 14 (2), 402-414 (2014).
- Iwata, F., Adachi, M., Hashimoto, S. A single-cell scraper based on an atomic force microscope for detaching a living cell from a substrate. J. Appl. Phys. 118 (13), (2015).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J. Lab. Autom. 17 (1), 59-65 (2012).
- Juncker, D., Schmid, H., Delamarche, E. Multipurpose microfluidic probe. Nat. Mater. 4 (8), 622-628 (2005).
- Kaigala, G. V., Lovchik, R. D., Delamarche, E. Microfluidics in the "open space" for performing localized chemistry on biological interfaces. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 51 (45), 11224-11240 (2012).
- Qasaimeh, M. A., Gervais, T., Juncker, D. Microfluidic quadrupole and floating concentration gradient. Nat. Commun. 2 (May), 464 (2011).
- Christ, K. V., Turner, K. T. Design of hydrodynamically confined microfluidics: controlling flow envelope and pressure. Lab Chip. 11 (8), 1491-1501 (2011).
- Autebert, J., Kashyap, A., Lovchik, R. D., Delamarche, E., Kaigala, G. V. Hierarchical hydrodynamic flow confinement: efficient use and retrieval of chemicals for microscale chemistry on surfaces. Langmuir. 30 (12), 3640-3645 (2014).
- Kaigala, G. V., Lovchik, R. D., Drechsler, U., Delamarche, E. A Vertical Microfluidic Probe. Langmuir. 27 (9), 5686-5693 (2011).
- Cors, J. F., Lovchik, R. D., Delamarche, E., Kaigala, G. V. A compact and versatile microfluidic probe for local processing of tissue sections and biological specimens. Rev. Sci. Instrum. 85 (3), 034301 (2014).
- Pollard, J. W., Walker, J. M. Basic Cell Culture Protocols. , Humana Press. (1997).
- Mitry, R. R., Hughes, D. R. Human cell culture protocols. Methods Mol. Biol. Springer. 531 (1), (2012).
- Sakai, K., Ushida, T., Nagase, T., Nakamigawa, H. Quantitative analysis of cell detachment by shear stress. Mater. Sci. Eng. C. 17 (1-2), 55-58 (2001).
- Rodriguez, N. M., Desai, R. A., Trappmann, B., Baker, B. M., Chen, C. S. Micropatterned multicolor dynamically adhesive substrates to control cell adhesion and multicellular organization. Langmuir. 30 (5), 1327-1335 (2014).
- Tasoglu, S., Demirci, U. Bioprinting for stem cell research. Trends Biotechnol. 31 (1), 10-19 (2013).
