Summary
Este protocolo descreve o uso de espectrofotometria para detectar estruturas de reflexão de raios ultravioleta sobre os organismos (neste exemplo, o sailfin molly Poecilia latipinna) e descreve testes de escolha dicotômicas para peixes que permitem inferências a serem feitas sobre o papel das pistas ultravioleta durante a escolha do parceiro.
Abstract
Muitos organismos usam pistas e sinais para além sensibilidade humana durante as interações sociais. É importante levar em conta a forma como os organismos percebem seus mundos ao tentar compreender o seu comportamento e ecologia. Sensibilidade ao espectro de ultravioleta (UV; 300-400 nm) é encontrado através de vários géneros de aves, peixes, répteis, anfíbios e até mamíferos. Este protocolo descreve uma técnica pela análise de organismos para a presença de estruturas de reflexão de UV e um método para testar se estes sinais são utilizados como sinais de sociais no contexto da escolha de parceiros. Um espectrofotómetro é utilizado para detectar a presença de reflectância de UV e a variação na intensidade reflexiva entre os indivíduos e os sexos. Um exemplo desta técnica é apresentada em que um teste de escolha do parceiro dicotómica expõe indivíduos sexualmente receptiva a indivíduos do sexo oposto cuja aparência visual pode ser manipulado por meio de filtros que transmitem, quer do espectro de comprimentos de onda de UV ou bloco completo. estesistema permitiu a determinação que as mulheres, mas não do sexo masculino, mollies sailfin (Poecilia latipinna) estavam usando marcas de UV como parte de suas decisões de acasalamento. Estes tipos de estudos servem para ampliar o conhecimento da gama de organismos que utilizam UV e fornecer insights sobre como UV desempenha um papel em suas vidas.
Introduction
Compreender os sinais e sinais utilizados nas interações sociais animais nos permite compreender a variação fenotípica dentro e entre as espécies. Esta variação desempenha um papel importante nos processos evolutivos, tais como a divergência populacional, a selecção sexual, e especiação. Muitas vezes, porém, os pesquisadores estão limitados a explorar as pistas mais óbvias para sistemas sensoriais humanos, especialmente aqueles dentro dos domínios visuais ou auditivas. Uso de espectrofotometria, no entanto, nos permite expandir nossas investigações para além do espectro visível humana e em comprimentos de onda que podem ser importantes em interações sociais em outras espécies.
Em particular, a comunicação de curto alcance proporcionada por luz ultravioleta (UV; 300-400 nm) sensibilidade tem o potencial de ser altamente vantajoso durante a escolha do parceiro 1. Muitos predadores visualmente caça de aves e peixes, por exemplo, não são capazes de detectar a radiação UV. Em sistemas onde os machos mostrar elaboradamentepara fêmeas, esses machos reduziria o risco de predação, mantendo a sua capacidade de atrair parceiros, explorando o espectro UV em vez de desenvolver sinais detectáveis no espectro visível 2,3 .. Se alguém deixa de considerar a possibilidade de que os organismos estão se comunicando uns com os outros usam esses "canais de comunicação privados", motoristas significativas de comportamento e evolução pode ser desperdiçada.
Este protocolo descreve uma investigação sobre o uso de pistas de UV para a escolha do companheiro na sailfin molly, Poecilia latipinna, um peixe polígamos que não conheceu anteriormente capacidade de detectar UV ou utilizar marcações UV. Esta espécie de peixe tem uma proximidade filogenética perto de outros peixes Vivípara sensíveis aos raios UV 4 e há evidências de que microspectroscopic P. latipinna, juntamente com outras espécies tais como P. Molly mexicana e P. formosa, possuem uma classe de cones (células fotorreceptoras responsáveis pela covisão lor), que são mais sensíveis para comprimentos de onda UV 5. Nesta espécie dimorfismo sexual, escolha feminina tem desempenhado um papel importante na evolução da dos machos barbatanas coloridas e ampliadas brilhantemente 6-9. Esta metodologia permite-nos explorar se UV é um meio adicional pelo qual as fêmeas avaliar a qualidade do sexo masculino.
A detecção e medição de marcações UV sobre P. latipinna usando um espectrofotómetro com uma sonda de fibra óptica é detalhado aqui. Além disso, se mollies fêmeas receptivas diferencialmente associar com machos vistos através de um filtro óptico de transmissão de luz de espectro total, incluindo UV-A ([UV +]; 320-700 nm) e os machos vistos através de um filtro anti-UV ([UV]; 400 - 700 nm) é discutida. Este método tem amplas aplicações para descobrir padrões de sensibilidade UV e cor em peixes e outros organismos, permitindo a investigação sobre uma variedade de questões que envolvem UV e seu papel no comportamento.
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Protocol
Todos os experimentos foram realizados com a aprovação do Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal da Ohio Wesleyan University.
1. Gravação UV refletância dos peixes usando um espectrofotômetro
- Calibrar um espectrofotômetro e fonte de luz com um padrão branco conhecido em toda a gama de comprimentos de onda a ser medido de acordo com as recomendações do instrumento ou software.
- Anestesiar os peixes, colocando em uma solução a 0,5% de acetato de 3 aminobenzoate-metano sal de ácido sulfônico (MS-222) tamponada com igual quantidade de bicarbonato de sódio até que o peixe deixa de responder. Uma vez que não responde, imediatamente colocar o peixe em um fundo preto, não-reflexivo. Nota: MS-222 é potencialmente tóxico, e devem ser usadas luvas em todos os momentos.
- Fazer todas as medições em uma sala escura para minimizar o excesso de luz além do que a fonte de luz espectrômetro.
- reflectância medida usando uma sonda de fibra óptica mantida contra o corpo do organismo. FaçoCertifique-se para formar um ângulo de 45 ° consistente entre as fibras ópticas e do corpo, como é construído em alguns modelos de sonda. Nota: Para manter a consistência de medição, pode ser desejável a média em vários scans (2 - 5) por região do corpo.
- Gravar dados de reflectância com software de análise de reflectância apropriada. Nota: O software utilizado aqui foi definido como: integração em tempo = 2,000 seg, média scans = 2, e de pixel suavização = 5. Os dados foram copiados e colados em uma planilha.
- Repetir em várias áreas do corpo para determinar a presença ou ausência de reflectância de UV e gama de variação fenotípica entre organismos. Nota: exames preliminares podem ser necessários para determinar qual, se houver, áreas do corpo mostram consistentemente marcações UV.
- Devolver o peixe para um aquário de exploração bem oxigenado até que esteja totalmente recuperado, como evidenciado por batidas opérculo normais e comportamentos de natação. Nota: um protector comercial para restaurar o revestimento mucoso para o corpo podem ser adicionados para ajudar na recuperação da pele.
- Repcomer em vários indivíduos, incluindo ambos os sexos, se desejar.
- Na planilha, onde todos os dados foram copiados, os dados do gráfico usando um gráfico de dispersão, com reflectância no eixo Y e comprimento de onda no eixo-X. picos de amplitude na gama dos UV (300-400 nm) indicar a presença de reflectância de UV sobre o peixe.
2. Os ensaios de acasalamento dicotômicas
Nota: Execute observações de controle, em que os peixes focal, filtros UV e filtros opacos estão no local. Nestes ensaios, quando os filtros são removidos opacas, peixes focal será exposto a partes do tanque indicam a presença e ausência de luz UV, mas que não possuem parceiros de acasalamento potenciais. Para mais detalhes sobre a validade dos testes de escolha dicotômicas neste experimento ver Palmer e Hankison (2015) 10, embora note que estes testes também têm desvantagens 11.
- Use indivíduos sexualmente receptivas como organismos focais. Use feminina P. latipinna <48 horas pós-parto 5 aND machos isolado para, pelo menos, 24 horas antes dos testes para melhorar a probabilidade de motivação sexual.
- Coloque um único indivíduo focal em uma área neutra adjacente a dois compartimentos de escolha. Para P. latipinna, usar um aquário teste 75,7 L (30,5 cm x 30,5 cm x 75 cm; Figura 1), dividido em três secções por meio de divisórias de Plexiglas transparente, formando uma área central para o indivíduo focal flanqueado por dois compartimentos de igual tamanho de escolha. Certifique-se de que nenhuma água ou olfativas pistas são compartilhadas entre as seções de tanques individuais. Repita o procedimento para cada indivíduo a ser observado.
Figura 1. Experimental Aquarium Setup Um aquário retangular dividido em três seções:. Uma área central que realizou o indivíduo focal e dois compartimentos finais que realizou pares de objetos (a figura mostra uma mulher no meio com machos de objeto nas extremidades). fil intercambiáveisters que ou reflectância UV bloqueado ou permitido poderia ser colocada sobre o divisórias de vidro que dividem as seções masculina e feminina do aquário. Esta figura é modificada a partir Palmer e Hankison (2015) 10. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Sob condições de iluminação de espectro total (iluminação cujo espectro se estende para o UV-A gama), isolar um parceiro de acasalamento potencial em cada compartimento final (compartimento escolha) do aquário teste. Garantir que os potenciais parceiros de acasalamento se parecem entre si, tanto quanto possível, em tamanho, coloração e exibir características, de modo que a principal diferença entre os dois parceiros de acasalamento isoladas é se eles aparecem atrás de um filtro que bloqueia ou transmite a luz UV.
NOTA: Pode ser preferível para gravar reflectância no espectro visível para permitir a melhor correspondência de cores possível, alembora aqui correspondente foi feito a olho nu. - Aclimatar indivíduos sob isolamento visuais (filtros opacos) por 15 min. Assegure-se que + e UV - filtros estão no lugar neste momento. Na sequência de aclimatação, remova os filtros opacos. Para assegurar que os desvios laterais não estão presentes (preferências inerente de um dos lados do tanque, independentemente do objecto), atribua aleatoriamente a + UV e UV - lados do tanque para cada cada ensaio.
- Grave a quantidade de tempo que o indivíduo focal passa dentro de zonas preferenciais específicas (áreas próximas aos compartimentos de escolha, neste caso cerca de dois corpos padrão comprimentos) usando cronômetros. No caso do peixe fêmea, isto é a quantidade de tempo que passa perto de cada um dos dois machos, e vice-versa para peixes focal do sexo masculino.
NOTA: O software gravador de eventos também pode ser utilizado para gravação. Quinze minutos ensaios foram utilizados neste experimento e os peixes que não visitar cada zona de preferência pelo menos uma vez foram excluídos dos resultados como sendo sem resposta. - Registar e analisar o tempo que os peixes passam quase vazio UV + e UV - compartimentos para garantir que não há um viés inerente para um ambiente de iluminação especial que podem influenciar a escolha de acasalamento dos peixes. Use testes t pareados para determinar se os indivíduos preferem uma condição UV particular.
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Representative Results
As Figuras 1 e 2 mostram a preferência do aquário de acasalamento configurar e locais de medição UV para nossos experimentos.
Medição da reflectância de UV permitiu a determinação de que a P. latipinna possuem características de UV, em especial ao longo dos lados do seu corpo (Figura 3), para além da variação individual em esses traços. Uma vez que as características de UV foram encontrados, ensaios revelaram que as mulheres, mas não macho, P. latipinna usar estas características em suas decisões de acasalamento (Feminino: t 15 = 4,08, p = 0,001; Masculino: t 14 = 0,67, p = 0,517; Figura 4). Que ambos os sexos possuem traços de UV, mas que os traços são usadas apenas por fêmeas como parte da preferência companheiro pode indicar um papel destas características em outras interações sociais, como shoaling ou forrageamento, em P. latipinna.
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Figura 2. Locais no latipinna Poecilia que foram medidos para UV refletância. Regiões foram inicialmente determinadas a partir de ensaios de reflectância preliminares com amostras de reflectância tomada através de quase todas as regiões do corpo. 1-3, DF (barbatana dorsal) e CF (caudal fin) referem-se a regiões do corpo mostrado na Figura 3 Esta figura é modificada a partir Palmer e Hankison (2015) 10.. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Média Spectra de macho e fêmea Poecilia latipinna. Os gráficos mostram as s médiosreflectância pectral medido em cinco locais (áreas laterais, nadadeira caudal, dorsal fin) SE. As áreas dentro de caixas representam reflectância no espectro de UV. Esta figura é modificada a partir Palmer e Hankison (2015) 10. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Média Associado Times of machos e fêmeas. Os gráficos mostram o tempo médio de SE que as fêmeas e machos passou perto compartimentos masculinos vistos através UV + e filtros UV durante os testes de controle e experimental. Esta figura é modificada a partir Palmer e Hankison (2015) 10. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Espectrofotometria foi bem sucedida na identificação de marcas UV em P. latipinna. Ambos os sexos de P. latipinna possuem marcações UV ao longo de seus lados. Além disso, alguns machos tinha marcas UV em suas barbatanas dorsais, traços encontrados anteriormente a ser importante nas preferências de acasalamento femininos 7.
Recomendamos a utilização de espectrofotometria de UV como um mecanismo para detectar a presença de marcas UV. Mais testes poderia determinar o seu papel nas interações sociais, incluindo preferências de acasalamento (conforme detalhado aqui). Alternativamente, as características UV pode influenciar shoaling, indivíduo, sexo, ou o reconhecimento de espécies, ou interações intrasexual 3, 12-15.
Apesar da utilidade de espectrofotometria para melhor compreender as características de UV de organismos, especialmente relacionadas com o seu comportamento social, existem algumas etapas críticas necessárias para compreender plenamente os comportamentos, e algumas limitações para o que pode be concluiu. Todos os experimentos devem testar se os indivíduos focais têm preferência por UV + ou UV - ambientes, incluindo controles sem indivíduos de teste nos tanques escolha de acompanhamento, especialmente como o bloqueio UV pode causar mudanças no "brilho" ou luminância os organismos observar. Enquanto luminância não tem sido mostrado para influenciar preferência feminina em espécies estreitamente relacionadas com P. latipinna 16-18 dados adicionais detalhando o papel dos testes de brilho e de preferência foi abordada em um estudo anterior 19 e poderia ser um passo importante para assegurar que a preferência não é baseada em mudanças de brilho. Alternativamente, as diferenças no fluxo de iluminação (brilho global por unidade de tempo) pode ser equalizado, permitindo um controle ainda maior das condições de iluminação em sistemas onde este é de preocupação 2,20.
Além disso, para os testes de escolha do companheiro, os indivíduos escolha deve ser acompanhada tão de perto quanto possível emtamanho e coloração (aka atratividade), de modo que a escolha reflete mais fortemente preferência por UV + ou UV -. As técnicas alternativas que permitem que um único indivíduo a ser visualizado tanto sob UV e UV + - pode ser útil para alguns organismos 21. Estes estudos podem permitir o controlo das eventuais diferenças de comportamento individual (como o mesmo indivíduo é visto sob UV + e UV - condições simultaneamente). Enquanto nós não vê diferenças comportamentais entre os nossos peixes em nosso projeto experimental, este aspecto pode ser importante para outros organismos ou desenhos experimentais. Além disso, estudos que reteste fêmeas individuais durante a mudança dos lados filtros UV 2, ou de que os filtros de switch a meio caminho através de um teste individual, também seria útil, tanto para controlar o viés de lado individual. Finalmente, embora espectrofotometria e preferências de acasalamento testes podem revelar esses aspectos do fenótipo de um organismo, o protocolo poderá fazêes não tem a capacidade de determinar plenamente o significado dos traços UV e que eles podem estar revelando-focal indivíduos. ensaios de aptidão para entender como traços UV são impactados pelo desenvolvimento, a herança, as condições ambientais (tais como previsibilidade de alimentos ou predadores), ou outros fatores seria útil para compreender melhor o significado eo papel das características UV.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spectrophotometer, P1000 | Ocean Optics | newer models are availabe | |
| DT 1000 xenon UV light source | Ocean Optics | newer models are availabe | |
| Ocean Optics Overture Software | Ocean Optics | newer software is available | |
| R200-Angle-UV bifurcated fiber-optic probe (Guided Wave) | Ocean Optics | newer models are availabe | |
| Certified reflectance standard, white | labsphere | ||
| 75.7 L Aquarium, divided | Experimental Builder | ||
| Full Spectrum Bulb | Nature's Sunlight | ||
| UV blocking sheet | GAM UV Sheet |
References
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