Summary
الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) تشير إلى الخلايا التي يمكن تجديد الذات والتمايز إلى الأنساب العصبية ثلاثة. هنا، نحن تصف بروتوكول لتحديد تردد مجلس الأمن القومي في عدد السكان خلية معينة باستخدام neurosphere تشكيل والتمايز في ظل ظروف نسيلي.
Abstract
الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) لديها القدرة على تجديد الذات وتوليد الأنساب الرئيسية الثلاثة العصبية - النجمية، الخلايا العصبية و oligodendrocytes. NSCs والأسلاف العصبية (NPS) ومثقف عادة في المختبر كما neurospheres. يصف هذا البروتوكول بالتفصيل كيفية تحديد تردد مجلس الأمن القومي في عدد السكان خلية معينة في ظل ظروف نسيلي. يبدأ البروتوكول مع البذر من الخلايا في مناطق ذات كثافة التي تسمح لتوليد neurospheres نسيلي. ثم يتم نقل neurospheres إلى coverslips تشامبيريد ومتباينة في ظل ظروف نسيلي في وسط مشروط، الأمر الذي سيزيد من إمكانية التفريق بين neurospheres. وأخيرا، يتم حساب تردد مجلس الأمن القومي على أساس تشكيل وmultipotency قدرات neurosphere. وتشمل المرافق من هذا البروتوكول تقييم المرشح علامات مجلس الأمن القومي، وتنقية من NSCs، والقدرة على التمييز NSCs من مصادر القدرة النووية. هذه الطريقة تأخذ 13 يوما لإجراء، وهو الكثير الصورةhorter من الأساليب الحالية لتعداد تردد مجلس الأمن القومي.
Introduction
الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) هي خلايا الجهاز العصبي المركزي (CNS) التي يمكن تجديد الذات وهي متعدد القدرات. يتم تحديد NSCs لأول مرة خلال تطوير الدماغ الأمامي الجنينية وما زالت موجودة في الدماغ الكبار في مناطق معينة مثل منطقة subventricular (SVZ) من البطينات الجانبية والتلفيف المسنن (DG) من الحصين. يتم استخدام عدد من خطوط مجلس الأمن القومي في التجارب السريرية لعلاج السكتة الدماغية وغيرها من الأمراض العصبية مثل مرض باتن 1.
يتم نشر NSCs والأسلاف العصبية (NPS) في الثقافة عائمة الهياكل كروي 3-الأبعاد تسمى neurospheres. وقد تم تطوير هذا النظام الثقافة neurosphere بواسطة رينولدز وفايس في 1990s في وقت مبكر، عندما وجدوا أن الخلايا القشرية الجنينية والبالغين يمكن أن يقسم في وجود عامل نمو البشرة (EGF) وعامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF) 2-4. تتكون Neurospheres من خليط غير متجانس من جملتعلمي اللغة اإلنكليزية تتألف من الفئات الفرعية في مراحل نمو مختلفة 5. أنه يمثل تحديا لدراسة تحديدا NSCs باستخدام البيانات التي تم الحصول عليها من neurospheres بسبب وجود تلك المصادر. وبالتالي، فإنه من الأهمية بمكان لإثراء NSCs من neurospheres. في الوقت الحاضر، وقد استخدمت أربعة طرق رئيسية لإثراء لNSCs في المختبر. الأول هو استخدام علامات سطح الخلية. لويس-X (ليكس) وCD133 (المعروف أيضا باسم Prominin1) هي سطح الخلية أبرز NSC علامات 6-9. Syndecan-1، الشق-1 وإنتغرين-beta1 هي بروتينات السطحية الأخرى التي تثري لNSCs 10. والثاني هو استبعاد الصبغة. ولقد ثبت أن الخلايا جنبا إلى السكان، والتي لديها قدرة فريدة على لضخ الفلورسنت الحمض النووي ملزم صبغ هويشت 33342، وإثراء لNSCs 11. الثالث هو استخدام مجموعة المورفولوجية. وقد ثبت أن الخلايا مع زيادة حجم الخلية وتحبب تؤوي أكثر NSCs من نظرائهم 5،12،13. الرابع هو إضافة NSC سوالعوامل rvival إلى مستنبت. ولقد ثبت أن إضافة الكوندرويتن بروتيوغليكان كبريتات وئي E يعزز مجلس الأمن القومي البقاء على قيد الحياة، وبالتالي يزيد من مجلس الأمن القومي تردد 14،15. على الرغم من أن العديد من علامات بما في ذلك عوامل النسخ ارتبطت NSCs 16،17، فإن أيا من هذه العلامات هي قادرة على إثراء NSCs إلى النقاء. نظرا لعدم وجود علامات NSC نهائية، فإنه لا يزال يشكل تحديا لتحديد NSCs وتمييزها عن مصادر القدرة النووية في المختبر.
استخدمت الدراسات الأولية وفحص تشكيل neurosphere (النيجيري) لتحديد NSCs 7،11،13. في هذا الاختبار، وخلايا نأت يتم تربيتها لتشكيل neurospheres وإنشاء عدد من neurospheres لكل 100 خلية يتم تحديد مطلي. ويطلق على هذه القيمة على أنها وحدة تشكيل Neurosphere (NFU). وNFU يساوي تردد مجلس الأمن القومي إذا تنشأ عن neurospheres من NSCs. ومع ذلك، فقد تبين أن NFU يغالي تردد مجلس الأمن القومي كما تتشكل neurospheres من قبل كل من NSخدمات العملاء وأوائل مصادر القدرة النووية 5. وهكذا، كانت غير دقيقة لتعداد NSCs تستند فقط على تشكيل neurosphere. يمكن أن يكون من الممكن تحديد NSCs على أساس قدرتها على تجديد الذات، تنتشر على نطاق واسع وتوليد neurospheres متعددة القدرات.
NSCs، والتي هي EGF وbFGF الاستجابة، عادة البقاء على قيد الحياة لا يقل عن عشرة مقاطع وبالتالي عرض قدرة التجديد الذاتي واسعة في ثقافة 4،18-20. يمكن أن مصادر القدرة النووية، والتي هي EGF وbFGF تستجيب كذلك، أيضا توليد neurospheres لبضع فقرات ولكن ليس لفترة طويلة من الزمن. ومن هنا، قد قبلت على نطاق واسع أن NSCs حسن النية يمكن تعداد مع دقة عادلة على أساس تشكيل neurosphere للا يقل عن عشرة الممرات. في معظم الدراسات، ومع ذلك، يتم قياس التجديد الذاتي عادة على أساس تشكيل neurosphere الثانوي أو الجامعي بسبب الوقت الطويل التجريبية المطلوبة لمدة عشر فقرات. وبالتالي، فإن الاتحاد النيجيري الثانوي يمكن استخدامها للمقارنة على نطاق واسع في التجديد الذاتي القدرة الرهانسكان وين، ولكن لا يمكن استخدامها لتعداد بدقة تردد مجلس الأمن القومي.
NSCs ديهم قدرة التكاثري أكبر بالمقارنة مع مصادر القدرة النووية. تم استخدام هذه الخاصية من NSCs من قبل لويس وآخرون. لتطوير فحص لمجلس الأمن القومي التعداد - في تشكيل مستعمرة العصبية خلية فحص (NCFCA) 21،22. في هذا الاختبار، خلايا مفردة يتم تربيتها لمدة 3 أسابيع في مصفوفة نصف صلبة تحتوي على الكولاجين. في ظل هذه الظروف والثقافة، وتبين أن الخلايا التي تشكل neurospheres فوق 2 مم في القطر هي tripotent ويمكن تجديد الذات على المدى الطويل. وتعرف هذه الخلايا كما NSCs. لذلك، وتتميز NSCs بشكل فعال من مصادر القدرة النووية.
NSCs لديها القدرة على التمايز إلى الخلايا النجمية، قليلة التغصن والخلايا العصبية. لتمايز neurospheres، تتم إزالة عوامل النمو ويضاف المصل إلى مستنبت. إذا لوحظ كل الأنساب العصبية ثلاثة في neurosphere، ثم الخلية التي بدأ أن neurosphere طليالي لمجلس الأمن القومي. ومع ذلك، فإن فحص التمايز لديه بعض القيود. أولا، الظروف الثقافة تستخدم لتمييز قد لا تكون الأمثل لجيل من كل الأنساب العصبية ثلاثة. في الواقع، في عملية التمايز neurosphere واحدة، ويحدث موت الخلايا كبيرا ومعظمها يحدث جيل نجمية (ثام M وأحمد S، غير منشورة). ثانيا، هناك مسألة قابلية التنسيل. لتعداد دقيق للNSCs، وتشكيل وتمايز neurospheres يجب أن تجرى في ظروف نسيلي، حيث ينشأ كل neurosphere من خلية واحدة. في الثقافات تعليق بكميات كبيرة، ويحدث التجميع في كل الخلوية وneurosphere مستويات 23-25. وبالتالي، فمن الممكن لكل neurosphere إلى تنشأ من الخلايا أو neurospheres متعددة، مما يعقد العد neurosphere وتقييم multipotency. تشير الأدلة الحديثة إلى أن تجميع الخلايا لا تحدث في انخفاض كثافة الطلاء من 0.5 خلية / ميكرولتر أو أقل، وعندما لوحات ثقافة لا يتم نقل أثناء الامتحانات الوطنيةتشكيل rosphere 15. وهكذا زراعة الخلايا في مثل هذه الكثافة المنخفضة من شأنها ضمان قابلية التنسيل.
وفي الوقت الراهن، NCFCA هي الأكثر شيوعا طريقة للتمييز NSCs من مصادر القدرة النووية وتعداد تردد مجلس الأمن القومي. وNCFCA، ومع ذلك، يتطلب وقتا طويلا نسبيا من ثلاثة أسابيع. هنا، نحن تصف بروتوكول تعداد تردد مجلس الأمن القومي على أساس قدرة NSCs لتشكيل neurospheres متعددة القدرات. هذا البروتوكول يأخذ 13 يوما فقط لأداء. وNCFCA يضمن قابلية التنسيل مثل المصفوفة الكولاجين يمنع حركة neurospheres. شروط الثقافة المستخدمة في هذا البروتوكول يسمح أيضا قابلية التنسيل إلى الإبقاء طوال الوقت. على سبيل المثال، استخدام 50-جيدا coverslips غرف يضمن أن neurospheres سوف تفرق دون الاتصال بعضها البعض. وعلاوة على ذلك، ونحن نستخدم المتوسطة التي تزود عوامل عصبية خلال تمايز لتعظيم إمكانيات التفريق بين neurospheres (الشكل 1) مكيفة.
Protocol
تم إجراء معاملة الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية IACUC وNACLAR والموافقة من قبل وزارة الحيوان ((http://www.brc.astar.edu.sg/index.php؟sectionID-11).
أعدت الثقافات Neurosphere من الدماغ الأمامي من الجنينية (E14) C57BL / 6 الفئران كما هو موضح سابقا 5: ملاحظة.
1. ثقافة Neurospheres عينة نسيلي (يوم 1)
- إعداد NSC المتوسطة النمو من خلال الجمع بين التعديل النسر متوسطة / المغذيات F-12 (DMEM / F12) متوسطة Dulbecco ومع ملحق B27 (تركيز النهائي ما يلي: 1X)، EGF (تركيز النهائي: 20 نانوغرام / مل)، bFGF (تركيز النهائي: 10 نانوغرام / مل) والبنسلين / الستربتومايسين (تركيز النهائي ما يلي: 1X).
- فصل neurospheres E14.5 الماوس في 1 مل NSC متوسطة النمو و1 مل 0.05 N هيدروكسيد الصوديوم لمدة 7 دقائق على RT. خلايا ماصة صعودا وهبوطا في بعض الأحيان للحفاظ على الخلايا في تعليق. إضافة 1 مل من 0.05 N حمض الهيدروكلوريك إلى محايدإيزي القلوي.
ملاحظة: هي المصنفة خلايا Neurosphere في 20000 خلية / مل في طبق ثقافة 10 سم ويتم تربيتها لمدة 5 د على 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2. العائد المتوقع بعد حوالي 10 مليون خلية في صحن 10 سم. ثم يتم فصل هذه الخلايا والمصنف في كثافة نسيلي كما هو موضح في الخطوات 1.2 و 1.3، على التوالي.- أداء عدد الخلايا باستخدام تلطيخ التريبان الأزرق وعدادة الكريات.
- البذور خلايا E14.5 الماوس neurosphere واحدة في مناطق ذات كثافة من 50 خلية / مل أو أقل في 100 ميليلتر مجلس الأمن القومي المتوسطة النمو في صحن 96-جيدا. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 ل 1 ث لتوليد neurospheres نسيلي.
ويضمن قابلية التنسيل خلال تشكيل neurosphere في هذه الكثافة كما أن الخلايا لا الاتصال ببعضهم البعض: ملاحظة.
2. ثقافة Neurospheres عن مشروطة المتوسطة (يوم 3)
- فصل neurospheres الماوس E14.5 كما هو موضح في الخطوة 1.2.
- الخلايا وحيدة البذرة من E14.5 neurospheres الماوس في مناطق ذات كثافة من 20،000 خلية / مل في وسط النمو مل NSC 10 في طبق ثقافة 10 سم. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 لمدة 5 د لتوليد neurospheres مثقف بالجملة.
3. إعداد Neurosphere مكيفة المتوسطة (اليوم 8)
- يعد حل طلاء عن طريق خلط 700 ميكرولتر من 0.01٪ بولي-L-ليسين (PLL)، 70 ميكرولتر من 1 ملغ / مل Laminin و6،230 ميكرولتر من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
- معطف طبق ثقافة 10 سم مع 7 مل من محلول PLL / Laminin لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية.
- باستخدام ماصة المصلية 10 مل، ونقل جميع neurospheres مثقف بالجملة لمل أنبوب مخروطي الطرد المركزي 15. الطرد المركزي neurospheres في 171 x ج لمدة 1 دقيقة في RT وإزالة طاف تماما.
- إعداد NSC التمايز المتوسطة من خلال الجمع بين DMEM / F12 المتوسطة مع B27 (تركيز النهائي ما يلي: 1X) والجنين مصل بقري (FBS) (تركيز النهائي: 0.5٪) الإعلاند 10 مل من مجلس الأمن القومي التمايز المتوسطة إلى neurospheres. ماصة صعودا وهبوطا عدة مرات لresuspend وneurospheres.
- نضح PLL / Laminin من الطبق ثقافة 10 سم ويغسل مرة واحدة مع 10 مل من برنامج تلفزيوني. نقل جميع neurospheres إلى الطبق ثقافة 10 سم PLL / Laminin المغلفة. احتضان O / N عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 لneurospheres على الانضمام إلى الطبق.
4. تحديد NFU من عينة Neurospheres (اليوم 8)
- حساب عدد neurospheres (المصنف في يوم 1؛ القسم 1) تتشكل في كل بئر تحت المجهر.
ملاحظة: تحديد عدد neurospheres شكلت في 100 خلية مطلي، الذي يعطي NFU.
5. نقل Neurospheres نموذج 50-جيدا غرف ساترة (اليوم 8)
- معطف كل بئر من ساترة غرف 50-جيدا مع 10 ميكرولتر من PLL / Laminin حل الطلاء لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: يعد حل طلاء كما هو موضح فيخطوة 3.1. - إعداد 3 × 50 مل أنابيب مخروطية أجهزة الطرد المركزي التي تحتوي على 30 مل من برنامج تلفزيوني لكل منهما. باستخدام ملقط معقم، وإزالة المغلفة ساترة غرف 50-جيدا. تراجع ساترة غرف في الأنبوب الأول من برنامج تلفزيوني، تليها الثانية ثم الأنبوب الثالث من برنامج تلفزيوني، ليغسل الحل الطلاء.
- نضح أي السائل المتبقي من الآبار ساترة غرف.
- ماصة بلطف كل المتوسطة وneurospheres من كل بئر من صحن 96-جيدا وتحويلها إلى طبق ثقافة 10 سم واحد.
- تحت المجهر، واختيار neurosphere عينة باستخدام micropipette P10 مزودة 10 ميكرولتر ماصة. ضمان أنه ليس هناك سوى neurosphere واحدة يتم انتقاؤها في كل مرة عن طريق تحديد العمود ماصة لل2 ميكرولتر. استخدام غيض ماصة جديدة لكل neurosphere.
- نقل neurosphere على مركز بئر للالمغلفة ساترة غرف 50-جيدا.
- كرر الخطوات من 5.5 و 5.6 حتى كل بئر من المآخذ الكهربائية ساترة تشامبيريداعتصامات وneurosphere.
ملاحظة: قد تكون التقطت وneurospheres تحت المجهر وضعت في غطاء تدفق الصفحي أو على الفوق. - إضافة 10 ميكرولتر من مجلس الأمن القومي التمايز المتوسطة إلى كل بئر ساترة تشامبيريد. ضع ساترة غرف في طبق ثقافة 10 سم وماصة برنامج تلفزيوني على طول حواف الطبق لمنع جفاف التفريق المتوسطة مجلس الأمن القومي. ضع ما يصل الى اثنين coverslips في غرف واحدة طبق ثقافة 10 سم. احتضان ساترة غرف (الواردة في طبق ثقافة 10 سم) بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.
6. تمايز Neurospheres عينة (يوم 9)
- نقل متوسطة التمايز من neurospheres مثقف بالجملة (من القسم 3) لمل أنبوب مخروطي الطرد المركزي 15. تأكد من 2-3 مل من المتوسط التمايز يبقى في صحن الثقافة لمنع خلايا الالتزام من فصل. باستخدام محقنة معقمة 20 مل، وتمرير المتوسطة التمايز من خلال 0.2 μم فلتر لإزالة أي خلايا أو الحطام.
- نقل متوسطة التمايز التي تمت تصفيتها إلى صحن الثقافة 10 سم تحتوي على خلايا الالتزام.
- باستخدام ملقط معقم، ضع بلطف ساترة غرف على المدى المتوسط التمايز بطريقة معكوسة بحيث neurospheres عينة من أسفل. احتضان ساترة غرف مع متوسط التمايز لمدة 3 د عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.
ملاحظة: إن neurospheres عينة على اتصال مع المتوسط التمايز ولكن ليس في اتصال مع خلايا التفريق تحت.
7. إصلاح متباينة Neurospheres (يوم 12)
- إزالة بلطف ساترة غرف من الطبق ثقافة 10 سم باستخدام ملقط معقم. تراجع بلطف ساترة في برنامج تلفزيوني ليغسل المتوسطة مشروط.
- تقشر طوقا سيليكون من ساترة. تنفيذ هذا برفق وببطء لتجنب كسر ساترة. يحيط علما الجانب حيث اليتم الالتزام البريد متباينة neurospheres.
- ماصة 1 مل من 4٪ لامتصاص العرق (PFA) على قطعة من قطع الفيلم البارافين لحجم ساترة. وضع بلطف ساترة على الفيلم البارافين مع neurospheres التي تواجه هبوطا في اتصال مع PFA. إصلاح neurospheres لمدة 20 دقيقة في RT.
تحذير: PFA سامة سواء في شكل سائل وبخار وغير قابل للاحتراق. تجنب استنشاق بخار والاتصال مع الجلد والعينين. التعامل دائما PFA في غطاء الدخان التهوية. - ماصة 1 مل من برنامج تلفزيوني على قطعة من فيلم البارافين. غسل neurospheres عن طريق وضع بلطف ساترة مع neurospheres إلى أسفل في اتصال مع برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- كرر الخطوة 7.4 مرتين أخريين.
8. O4 تلون متباينة Neurospheres (يوم 12)
- إعداد 3٪ ألبومين المصل البقري (BSA) في برنامج تلفزيوني. ماصة 1 مل من 3٪ BSA على قطعة من فيلم البارافين. منع neurospheres التي كتبها placin بلطفز ساترة (مع neurospheres لأسفل) في اتصال مع ديوان الرقابة المالية لمدة 30 دقيقة في RT.
- ماصة 1 مل من الماوس مكافحة O4 الغلوبولين المناعي الأجسام المضادة (1: 300 التخفيف في 3٪ BSA) على قطعة من فيلم البارافين ووضع ساترة على الفيلم البارافين مع neurospheres التي تواجه هبوطا في اتصال مع الأجسام المضادة. السماح O4 تلطيخ لتحدث لمدة 2 ساعة على RT.
- غسل ساترة مرتين مع برنامج تلفزيوني كما هو موضح في الخطوة 7.4.
- ماصة 1 مل من الأخضر صبغة الفلورسنت مترافق المضادة الماوس الغلوبولين المناعي الأجسام المضادة الثانوية (1: 500 التخفيف في 3٪ BSA) على قطعة من فيلم البارافين ووضع ساترة على الفيلم البارافين مع neurospheres التي تواجه هبوطا في اتصال مع الأجسام المضادة . يترك لمدة 1 ساعة عند RT في الظلام.
ملاحظة: إجراء المناعية في بيئة مظلمة من هذه الخطوة فصاعدا. - غسل ساترة مرتين مع برنامج تلفزيوني كما هو موضح في الخطوة 7.4.
9. Tuj1 والدبقية ييفي الحمضية البروتين (GFAP) تلطيخمن متباينة Neurospheres (يوم 12)
- إعداد permeabilizing الحل بإضافة تريتون X-100 (تركيز النهائي: 0.5٪) إلى 3٪ BSA. ماصة 1 مل من permeabilizing حل على قطعة من فيلم البارافين. وضع ساترة على الفيلم البارافين مع neurospheres التي تواجه هبوطا في اتصال مع حل permeabilizing لمدة 20 دقيقة في RT.
- غسل ساترة مرتين مع برنامج تلفزيوني كما هو موضح في الخطوة 7.4.
- ماصة 1 مل من الماوس مكافحة Tuj1 مفتش 2A الأجسام المضادة (1: 500 التخفيف في 3٪ BSA) والأرنب مكافحة GFAP مفتش الأضداد (1: 1000 تخفيف في 3٪ BSA) على قطعة من فيلم البارافين ومكان ساترة على الفيلم البارافين مع neurospheres التي تواجه هبوطا في اتصال مع الأجسام المضادة. السماح Tuj1 وGFAP تلطيخ لتحدث لمدة 2 ساعة على RT.
ملاحظة: كل من الأجسام المضادة يمكن أن تكون على استعداد، كحل وحيد. - غسل ساترة مرتين مع برنامج تلفزيوني كما هو موضح في الخطوة 7.4.
- ماصة 1 مل من صبغة أحمر فلوريمترافق المضادة للماوس مفتش 2A (1: 500 التخفيف في 3٪ BSA) وبعيدة مفتش الأحمر صبغة الفلورسنت مترافق المضادة للأرنب (1: 500 التخفيف في 3٪ BSA) الأجسام المضادة الثانوية على قطعة من فيلم البارافين ومكان ساترة على الفيلم البارافين مع neurospheres التي تواجه هبوطا في اتصال مع الأجسام المضادة. يترك لمدة 1 ساعة على RT.
ملاحظة: كل من الأجسام المضادة يمكن أن تكون على استعداد، كحل وحيد. - غسل ساترة مرتين مع برنامج تلفزيوني كما هو موضح في الخطوة 7.4.
- تمييع الحل 4 "، 6 diamidino-2-phenylindole الأسهم (دابي) إلى 300 نانومتر في برنامج تلفزيوني. ماصة 1 مل من دابي على قطعة من فيلم البارافين ومكان ساترة على الفيلم البارافين مع neurospheres التي تواجه هبوطا في اتصال مع دابي لمدة 2 دقيقة على RT لتلطيخ أنويتها.
- غسل ساترة مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني ومرتين مع الماء منزوع الأيونات كما هو موضح في الخطوة 7.4. جبل ساترة على شريحة زجاجية باستخدام المتوسطة المتزايدة مناسبة والسماح ليجف O / N في RT.
10. معهد العالم العربيجينج من متباينة Neurospheres (يوم 13)
- neurospheres صورة تحت المجهر متحد البؤر باستخدام 40X. استخدام الليزر في 488 نانومتر، 594 نانومتر و 647 نانومتر للكشف عن الخلايا قليلة التغصن، الخلايا العصبية والخلايا النجمية، على التوالي.
- تحديد نسبة unipotent، bipotent وtripotent neurospheres.
يتم تحديد الفعالية من قدرة neurosphere على التمايز إلى الأنساب العصبية ثلاثة - قليلة التغصن، الخلايا العصبية والخلايا النجمية 5،14،15،26: ملاحظة. ويتم تحديد الخلايا قليلة التغصن من تلطيخ إيجابية ل(المادة 8) O4. ويتم تحديد الخلايا العصبية عن طريق تلطيخ إيجابية ل(المادة 9) Tuj1. ويتم تحديد الخلايا النجمية التي تلطيخ إيجابية ل(المادة 9) GFAP. وneurosphere unipotent يفرق في واحدة فقط من النسب، وينبغي أن وصمة عار إيجابي لأي O4، GFAP أو Tuj1. وneurosphere bipotent يفرق في أي اثنين من الأنساب، وينبغي أن وصمة عار إيجابيا لO4 وGFAP أو O4 وTuj1 أو GFAP وTuj1. وneurosphere tripotent مختلفةiates في جميع السلالات الثلاث وينبغي أن وصمة عار إيجابيا لO4، GFAP وTuj1. - تحديد تردد مجلس الأمن القومي في السكان من الاهتمام باستخدام الصيغة التالية:
مجلس الأمن القومي تردد = (NFU س٪ من neurospheres tripotent) / 100٪.
Representative Results
وقد استخدمنا هذا البروتوكول لتقييم قدرة ليكس، على سطح الخلية يعرف NSC علامة 7، لإثراء لNSCs. وسيتم استخدام البيانات من هذه الدراسة لتوضيح كيف يتم تعداد NSCs باستخدام فحوصات نسيلي في البروتوكول. حضنت E14.5 خلايا neurosphere الفأر مع مكافحة يكس الأجسام المضادة. وفي وقت لاحق، والخلايا التي تعبر عن ليكس (ليكس +) والخلايا التي لا تعبر عن ليكس (ليكس -) والمصنف في 50 خلية / مل من قبل خلية المنشط الإسفار الفرز (FACS) وتترك لتوليد neurospheres نسيلي ل1 أسبوع. يظهر التصوير في الوقت الفاصل بين أن neurospheres ولدت في 50 خلية / مل هي نسيلي (الشكل 2). وNFU ليكس + ويكس - تم تحديد الخلايا. وتبين أن ليكس + خلايا لديها أعلى بكثير قدرة تشكيل neurosphere مقارنة ليكس - الخلايا (الشكل الجيل الثالث 3G). ثم تم تفرقة بين neurospheres المتولدةفي ظل ظروف نسيلي، immunostained في وقت لاحق وتصوير (الشكل 3A-ه). خلايا ليكس + تولد أكثر بكثير neurospheres tripotent من ليكس - الخلايا (الشكل 3F). ثم تم احتساب تردد مجلس الأمن القومي على أساس NFU و٪ من neurospheres tripotent (الشكل الجيل الثالث 3G). الاختيار على أساس ليكس، يثري تردد مجلس الأمن القومي بأكثر من 14 أضعاف والتأكد من صحتها ليكس كعلامة مجلس الأمن القومي. ونحن مصممون أيضا على تردد مجلس الأمن القومي من neurospheres الماوس E14.5 باستخدام هذا البروتوكول 27 و 28 NCFCA. تقرير كلتا الطريقتين مجلس الأمن القومي تردد مماثل من حوالي 2٪ في neurospheres الماوس E14.5.
توضع الشكل 1. بروتوكول لNeurosphere التمايز تحت ظروف نسيلي. neurospheres عينة نمت في ظل ظروف نسيلي فردي في كل PLL / Laminin-جoated جيدا ساترة غرف 50-جيدا، وسمح للالتزام O / N. في نفس اليوم، ومطلي neurospheres مثقف بالجملة في متوسطة التمايز في PLL / المغلفة Laminin صحن 10 سم، ويسمح للالتزام O / N. ويتم ترشيح في اليوم التالي والمتوسطة مكيفة من neurospheres مثقف بالجملة ووضعها مرة أخرى في صحن 10 سم. ثم يتم مقلوب neurospheres عينة على المدى المتوسط مكيفة والسماح للتميز لمدة 3-4 أيام 28. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم فصلها الشكل 2. النمو من نسيلي Neurosphere. الخلايا المشتقة من neurospheres E14.5 والمصنف في 50 خلية / مل في صحن 96-جيدا. وتتبع الخلايا الفردية لمدة 6 يوميا بحلول الوقت الفاصل بين التصوير. صور سويرد شمال شرق هذه الخلايا المتنامية في neurosphere. لاحظ أن neurosphere يحافظ على قابلية التنسيل. (أ) 0 أيام؛ (ب) 1.19.45. (ج) 2.95.37. (د) 3.32.76. (ه) 4.46.53. (و) 5.61.44. حيث يشير الرقم الأول إلى اليوم، ويشير الرقم الثاني إلى جزء من اليوم، ويشير الرقم الثالث إلى جزء من ح. 10X التكبير. شريط الحجم، 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. تمايز نسيلي Neurospheres وتعداد NSC تردد. وقد اختار neurospheres واحد وتختلف في ساترة غرف 50-جيدا لمدة 3 د. صورة تمثيلية لستا tripotent neurosphereINED مع (أ) دابي وimmunostained ل(ب) GFAP، (ج) Tuj1 و (د) O4. (ه) يظهر تراكب من (أ) - (د). شريط النطاق، 65 ميكرون. (و)٪ من unipotent، bipotent وtripotent neurospheres الناتجة عن ليكس + ويكس - الخلايا (يعني ± SEM، ن = 3). (ز) مجلس الأمن القومي تردد في يكس + ويكس - خلايا محسوبة على أنها نتاج NFU و٪ من neurospheres tripotent الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
وصفنا ها تعداد NSCs في ظل ظروف نسيلي. وتشمل الخطوات الحاسمة استخدام مجلس الأمن القومي النمو والتمايز متوسطة جديدة، وأيضا استخدام الطازجة حل PLL / Laminin إلى معطف لل coverslips غرف، فضلا عن أطباق الثقافة. وهذا يضمن ظروف النمو والتمايز المثلى من neurospheres. استخدام أجسام مضادة نوعية جيدة للكشف عن فعالية الخلايا العصبية والخلايا الدبقية، وكذلك قطف الانتقائي للneurospheres نسيلي التي ليست على اتصال مع neurospheres الأخرى، أمرا حاسما. وعلاوة على ذلك، فمن المهم لضمان neurospheres اختار لا تجف. فمن المستحسن أن إضافة 10 ميكرولتر من متوسطة التمايز إلى كل بئر بعد اختيار كل 10 neurospheres. ومن المهم لاستخدام واحد ساترة في غرف واحدة طبق 10 سم في عينة لتجنب الحديث المتبادل بين neurospheres من عينات مختلفة. إذا وضعت اثنين من coverslips (التي تحتوي على كل neurospheres من عينات مختلفة) فينفس صحن 10 سم، neurospheres من ساترة واحد قد تفرج العوامل التي قد تغير ميل neurospheres في ساترة أخرى على التمايز إلى الأنساب محددة. اثنين coverslips في نفس الطبق 10 سم قد يؤدي أيضا إلى خلط بين العينات.
في حال NFU أو تردد مجلس الأمن القومي أقل مما كان متوقعا، وضمان أن يتم استخدام عدد قليل مرور neurospheres. ومن المهم أيضا أن يتم استخدام صحي neurospheres مرور المنخفض لتوليد المتوسطة مشروط. بعد ذلك، إذا كان neurospheres ومثقف في الآبار مع القطر الصغير، كما هو الحال في صحن 96-جيدا، وبعد ذلك سوف يكون من الصعب على المناورة واختيار neurospheres باستخدام micropipette. في هذه الحالة، ونقل neurospheres إلى صحن ثقافة أكبر، مثل طبق 6 جيدا قبل اختيار. بعض neurospheres التقطت قد رفع الخروج من ساترة تشامبيريد خلال الثقافة والمناعية. التقليل من حركة ساترة تشامبيريد خلال الثقافة، وأقل غسل مكثفجي خلال المناعية، من شأنه أن يساعد على تجنب مفرزة من neurospheres.
الدراسات الأولية كميا NSCs فقط باستخدام النيجيري 7،11،13. ومع ذلك، فإن الاتحاد النيجيري يغالي تردد مجلس الأمن القومي على حد سواء NSCs ومصادر القدرة النووية في وقت مبكر توليد neurospheres 5. لويس وآخرون. وضعت طريقة أخرى لقياس NSCs المعروفة باسم NCFCA 21،22. وNCFCA ينطوي على زراعة الخلايا وحيدة في مصفوفة على الكولاجين لضمان قابلية التنسيل، وتبين أن تتشكل neurospheres فوق 2 مم في القطر من NSCs فقط. على غرار NCFCA، ويضمن قابلية التنسيل طوال هذا البروتوكول. ويتحقق ذلك عن طريق توليد neurospheres في كثافة نسيلي والتمييز بين neurospheres في coverslips غرف. استخدام coverslips تشامبيريد يمنح عددا من المزايا. ساترة غرف تتيح لكل عينة neurosphere التفريق دون اتصال جسدي مع neurospheres عينة أخرى، وبالتالي ضمان قابلية التنسيل خلال التمايز.ساترة غرف يمكن وضعها مع وقف التنفيذ على المدى المتوسط التفريق للسماح للneurospheres العينة إلى أن يكون مشروطا باستمرار وضمان أقصى قدر من التمايز. في غياب المتوسطة مكيفة ومصل خلال التمايز، والبقاء للneurospheres النقصان وneurospheres توليد معظمها الخلايا النجمية (ثام M وأحمد S، غير منشورة). بالإضافة إلى ذلك، neurospheres immunostained يمكن تخزين مريح لفترة طويلة من الزمن ولل coverslips غرف يمكن تركيبه مباشرة على شرائح المجهر الزجاجية. بالإضافة إلى ذلك، يتم إجراء التصوير من neurospheres immunostained سهلا كما يمكن للمرء أن تحديد موقع بسرعة neurosphere في الصغيرة غرف جيدا، والتقاط الصور، والانتقال إلى البئر المقبل.
لقد قرر تردد مجلس الأمن القومي في E14.5 ثقافة الماوس neurosphere باستخدام كل من بروتوكول وصفها في هذه المخطوطة 27 و 28 NCFCA. تردد مجلس الأمن القومي في neurospheres الماوس E14.5 يحدده كل من ليthods قابلة للمقارنة. وNCFCA يعدد NSCs التي متعدد القدرات ويكون على المدى الطويل قدرة التجديد الذاتي. منذ تردد مجلس الأمن القومي من أسلوبنا هو مشابه لذلك من NCFCA، لا يبدو أن قراءات من بروتوكول لدينا أن نبالغ في تقدير تردد مجلس الأمن القومي. وNCFCA يتطلب ثلاثة أسابيع ليستكمل وينطوي أساسا طلاء الخلايا وتجديد المتوسط. بروتوكول الموصوفة هنا يتطلب 13 يوما لأداء وينطوي على سلسلة مختلفة من الخطوات، على سبيل المثال، قطف neurosphere والمناعية. هذا البروتوكول يمكن أن تكون بمثابة وسيلة بديلة لتعداد NSCs. يمكن للباحثين استخدام كل NCFCA وهذا البروتوكول للتحقق من تردد مجلس الأمن القومي في تلك العينات.
واحد الحد من هذا البروتوكول هو أن سلسلة من الخطوات المهمة يجب أن تكون جميع يؤديها في يوم 8. إعداد المتوسطة مكيفة، وتحديد NFU من neurospheres عينة، ونقل neurospheres العينة إلى ساترة 50-جيدا تشامبيريد يجب أن تكون تجرى على داص 8. واحد قد يستغرق وقتا طويلا لإتمام هذه الخطوات. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يتطلب ممارسة لتنفيذ هذه الخطوات بطريقة فعالة.
وقد استخدمت على نطاق واسع Neurospheres لدراسة وظيفة مجلس الأمن القومي والسلوك. ومع ذلك، تتكون neurospheres من كل من NSCs ومصادر القدرة النووية. وبالتالي، فمن المهم لإثراء NSCs من neurospheres لدراسة علم الأحياء مجلس الأمن القومي. حاليا، وقد استخدمت علامات سطح الخلية، صبغة الملكية الإقصاء وكذلك حجم الخلية وتحبب إلى إثراء لNSCs 6،7،9-13،29،30. هذا البروتوكول يمكن أن تستخدم لتحديد إثراء NSCs من علامات مجلس الأمن القومي المحتملة، وتسهيل عملية البحث عن علامة NSC نهائية. وقد استخدمت أربع دراسات حديثة هذا البروتوكول لتعداد NSC تردد 5،14،15،26.
Acknowledgments
نشكر الوكالة للعلوم والتكنولوجيا والبحوث (A * ستار) وسنغافورة لتمويل هذا البحث.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical centrifuge tubes | BD | 352096 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | BD | 352070 | |
| 20 mL sterile syringe | BD | 300141 | |
| 50 mL sterile syringe | BD | 300144 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S1810 | |
| Mouse anti-Tuj1 IgG2a antibody | Covance | MMS-435P-100 | |
| Rabbit anti-GFAP IgG antibody | Dako | Z033401 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Microscope fitted to laminar flow hood | Leica | MZ6 | |
| Glass slides | Marienfeld-superior | 1000200 | |
| Mouse anti-O4 IgM antibody | Merck Millipore | MAB345 | |
| Hydromount | National Diagnostics | HS-106 | |
| Microscope | Nikon Eclipse | TS100-F | |
| Laminar flow hood | NuAire | NU-543 | |
| 96-well culture dishes | NUNC | 167008 | |
| 10-cm culture dishes | NUNC | 150350 | |
| Paraffin film | Parafilm | PM999 | |
| Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant human basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| 0.2 µm filter | Sartorius Stedim | 16534-K | |
| 0.45 µm filter | Sartorius Stedim | 16555-K | |
| 1.0 N Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| 1.0 N Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Poly-L-Lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Paraformaldehyde (PFA) powder | Sigma-Aldrich | P6148 | Toxic |
| Bovine Serum Albumin (BSA) powder | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| 50-well chambered coverslips | Sigma-Aldrich | C7735 | |
| Stir plate with heat function | Stuart | UC152 | |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320-033 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017-015 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody | Thermo Fisher Scientific | A21042 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG2a antibody | Thermo Fisher Scientific | A21135 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG antibody | Thermo Fisher Scientific | A31573 | |
| 4’,6’-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
| Cell-culture centrifuge | Thermo Fisher Scientific | RT1 75002383 | |
| Pasteur pipettes | Thermo Fisher Scientific | 10006021 | |
| CO2 incubator | |||
| Ventilated fume-hood | |||
| Aspirator | |||
| Confocal microscope | |||
| Micropipettes | |||
| Micropipette tips | |||
| Plastic pipettes | |||
| Multichannel pipettes | |||
| Glass beaker | |||
| Sterile forceps | |||
| pH meter |
References
- Ahmed, S. The culture of neural stem cells. J. Cell. Biochem. 106 (1), 1-6 (2009).
- Reynolds, B. A., Tetzlaff, W., Weiss, S. A multipotent EGF-responsive striatal embryonic progenitor cell produces neurons and astrocytes. J. Neurosci. 12 (11), 4565-4574 (1992).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and Population Analyses Demonstrate That an EGF-Responsive Mammalian Embryonic CNS Precursor Is a Stem Cell. Dev. Biol. 175 (1), 1-13 (1996).
- Narayanan, G., et al. Single-Cell mRNA Profiling Identifies Progenitor Subclasses in Neurospheres. Stem Cells and Dev. 21 (18), 3351-3362 (2012).
- Uchida, N., et al. Direct isolation of human central nervous system stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (26), 14720-14725 (2000).
- Capela, A., Temple, S. LeX/ssea-1 Is Expressed by Adult Mouse CNS Stem Cells, Identifying Them as Nonependymal. Neuron. 35 (5), 865-875 (2002).
- Capela, A., Temple, S. LeX is expressed by principle progenitor cells in the embryonic nervous system, is secreted into their environment and binds Wnt-1. Dev. Biol. 291 (2), 300-313 (2006).
- Corti, S., et al. Isolation and characterization of murine neural stem/progenitor cells based on Prominin-1 expression. Exp. Neurol. 205 (2), 547-562 (2007).
- Nagato, M., et al. Prospective characterization of neural stem cells by flow cytometry analysis using a combination of surface markers. J. Neurosci. Res. 80 (4), 456-466 (2005).
- Kim, M., Morshead, C. M. Distinct Populations of Forebrain Neural Stem and Progenitor Cells Can Be Isolated Using Side-Population Analysis. J. Neurosci. 23 (33), 10703-10709 (2003).
- Murayama, A., Matsuzaki, Y., Kawaguchi, A., Shimazaki, T., Okano, H. Flow cytometric analysis of neural stem cells in the developing and adult mouse brain. J. Neurosci. Res. 69 (6), 837-847 (2002).
- Rietze, R. L., Valcanis, H., Brooker, G. F., Thomas, T., Voss, A. K., Bartlett, P. F. Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain. Nature. 412 (6848), 736-739 (2001).
- Tham, M., et al. CSPG Is a Secreted Factor that Stimulates Neural Stem Cell Survival Possibly by Enhanced EGFR Signaling. PLoS ONE. 5 (12), e15341 (2010).
- Gan, H. T., Tham, M., Hariharan, S., Ramasamy, S., Yu, Y. H., Ahmed, S. Identification of ApoE as an autocrine/paracrine factor that stimulates neural stem cell survival via MAPK/ERK signaling pathway. J. Neurochem. 117 (3), 565-578 (2011).
- Ramasamy, S., Narayanan, G., Sankaran, S., Yu, Y. H., Ahmed, S. Neural stem cell survival factors. Arch. Biochem. Biophys. 534 (1-2), 71-87 (2013).
- Ahmed, S., et al. Transcription factors and neural stem cell self-renewal, growth and differentiation. Cell Adh. Migr. 3 (4), 1-12 (2009).
- Gritti, A., et al. Multipotent Neural Stem Cells Reside into the Rostral Extension and Olfactory Bulb of Adult Rodents. J. Neurosci. 22 (2), 437-445 (2002).
- Gritti, A., et al. Epidermal and Fibroblast Growth Factors Behave as Mitogenic Regulators for a Single Multipotent Stem Cell-Like Population from the Subventricular Region of the Adult Mouse Forebrain. J. Neurosci. 19 (9), 3287-3297 (1999).
- Vescovi, A. L., et al. Isolation and cloning of multipotential stem cells from the embryonic human CNS and establishment of transplantable human neural stem cell lines by epigenetic stimulation. Exp. Neurol. 156 (1), 71-83 (1999).
- Azari, H., Louis, S. A., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (49), e2639 (2011).
- Louis, S. A., et al. Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony-Forming Cell Assay. Stem Cells. 26 (4), 988-996 (2008).
- Coles-Takabe, B. L., et al. Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).
- Mori, H., Fujitani, T., Kanemura, Y., Kino-Oka, M., Taya, M. Observational examination of aggregation and migration during early phase of neurosphere culture of mouse neural stem cells. J. Biosci. Bioeng. 104 (3), 231-234 (2007).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat. Methods. 3 (10), 801-806 (2006).
- Yu, Y. H., et al. Purification, Visualization, and Molecular Signature of Neural Stem Cells. Stem Cells and Dev. 25 (2), 189-201 (2016).
- Yu, Y. H. C1qR1 is comparable with LeX and Prom1 as a neural stem cell marker. Identification of mouse embryonic neural stem cell surface markers. , Chapter 3.5, Figure 3.17 (2012).
- Tham, M. Neural colony-forming cell assay. A role for chondroitin sulfate proteoglycan in regulating the survival and growth of neural stem cells. , Chapter 3.6.3, Figure 3.22A (2009).
- Yuan, S. H., et al. Cell-Surface Marker Signatures for the Isolation of Neural Stem Cells, Glia and Neurons Derived from Human Pluripotent Stem Cells. PLoS ONE. 6 (3), e17540 (2011).
- Hall, P. E., Lathia, J. D., Miller, N. G. A., Caldwell, M. A., Ffrench-Constant, C. Integrins Are Markers of Human Neural Stem Cells. Stem Cells. 24 (9), 2078-2084 (2006).
