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Neuroscience

तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के गणन क्लोनल assays का उपयोग

Published: October 4, 2016 doi: 10.3791/54456
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Neural Stem Cell Laboratory, Institute of Medical Biology, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR)

Summary

तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (एनएससी) कोशिकाओं जो स्वयं को नवीनीकृत और तीन तंत्रिका प्रजातियों में अंतर कर सकते करने के लिए देखें। यहाँ, हम एक दिया सेल प्रतिरूप की शर्तों के तहत neurosphere गठन और भेदभाव का उपयोग कर जनसंख्या में एनएससी आवृत्ति निर्धारित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है।

Abstract

astrocytes, न्यूरॉन्स और oligodendrocytes - तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (एनएससी) नवीनीकरण नहीं आत्म और तीन प्रमुख तंत्रिका प्रजातियों उत्पन्न करने की क्षमता है। एनएससी और तंत्रिका progenitors (एनपीएस) आमतौर पर neurospheres के रूप में इन विट्रो में सुसंस्कृत हैं। इस प्रोटोकॉल में विस्तार से वर्णन कैसे प्रतिरूप की शर्तों के तहत एक दिया सेल की आबादी में एनएससी आवृत्ति निर्धारित करने के लिए। प्रोटोकॉल एक घनत्व है कि प्रतिरूप neurospheres की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है पर कोशिकाओं के बोने के साथ शुरू होता है। neurospheres तो संभाग coverslips को हस्तांतरित और वातानुकूलित माध्यम है, जो neurospheres की भेदभाव की क्षमता को अधिकतम में प्रतिरूप की शर्तों के तहत भेदभाव कर रहे हैं। अंत में, एनएससी आवृत्ति neurosphere गठन और multipotency क्षमताओं के आधार पर गणना की है। इस प्रोटोकॉल के यूटिलिटीज उम्मीदवार एनएससी मार्कर के मूल्यांकन, एनएससी की शुद्धि, और एनपीएस से एनएससी भेद करने की क्षमता शामिल है। इस विधि को प्रदर्शन करने के लिए 13 दिन लगते हैं, जो ज्यादा रोंमौजूदा तरीकों की तुलना में horter एनएससी आवृत्ति गणना करने के लिए।

Introduction

तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (एनएससी) केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) कि स्वयं को नवीनीकृत और multipotent हो सकता है की कोशिकाओं रहे हैं। एनएससी पहले भ्रूण अग्रमस्तिष्क के विकास के दौरान निर्दिष्ट और ऐसे पार्श्व निलय के subventricular क्षेत्र (SVZ) और हिप्पोकैम्पस के दांतेदार गाइरस (डीजी) के रूप में विशिष्ट क्षेत्रों में वयस्क मस्तिष्क में जारी रहती है करने के लिए जारी कर रहे हैं। एनएससी लाइनों की संख्या में इस तरह के बैटन रोग 1 के रूप में स्ट्रोक और अन्य मस्तिष्क संबंधी बीमारियों के उपचार के लिए नैदानिक परीक्षण में इस्तेमाल किया जा रहा है।

एनएससी और तंत्रिका progenitors (एनपीएस) चल 3 आयामी अंडाकार आकृति संरचनाओं neurospheres कहा जाता है के रूप में संस्कृति में प्रचारित कर रहे हैं। Neurosphere संस्कृति प्रणाली, 1990 के दशक में रेनॉल्ड्स और वेइस द्वारा विकसित किया गया था जब उन्होंने पाया कि भ्रूण और वयस्क cortical कोशिकाओं epidermal वृद्धि कारक (EGF) और बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक (bFGF) 2-4 की उपस्थिति में बांट सकता है। Neurospheres सी के एक विषम मिश्रण से मिलकर बनता हैविकास के विभिन्न चरणों में 5 उपवर्गों के शामिल एल। यह विशेष रूप से एनपीएस की उपस्थिति के कारण एनएससी neurospheres से प्राप्त आंकड़ों का उपयोग करते हुए अध्ययन करने के लिए चुनौती दे रहा है। इसलिए, यह neurospheres से एनएससी को समृद्ध करने के लिए महत्वपूर्ण है। वर्तमान में, चार मुख्य तरीकों इन विट्रो में एनएससी के लिए संतुष्ट करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। सबसे पहले कोशिका की सतह मार्कर का उपयोग है। लुईस-एक्स (लेक्स) और CD133 (भी Prominin1 के रूप में जाना जाता है) सबसे प्रमुख कोशिका की सतह एनएससी मार्करों 6-9 कर रहे हैं। Syndecan -1, पायदान -1 और Integrin-beta1 अन्य सतह प्रोटीन है कि एनएससी 10 के लिए बेहतर कर रहे हैं। दूसरा डाई अपवर्जन है। यह दिखाया गया है कि एक ओर जनसंख्या कोशिकाओं है, जो फ्लोरोसेंट डीएनए बाध्यकारी डाई Hoechst 33342 बाहर पंप करने के लिए अद्वितीय क्षमता है, एनएससी 11 के लिए समृद्ध कर रहे हैं। तीसरा रूपात्मक चयन का इस्तेमाल होता है। यह प्रदर्शन किया गया है कि वृद्धि की सेल आकार और विघटन के साथ कोशिकाओं को उनके समकक्षों की तुलना में अधिक 5,12,13 एनएससी बंदरगाह। चौथा एनएससी सु के अतिरिक्त हैसंस्कृति के माध्यम से rvival कारकों। यह chondroitin सल्फेट proteoglycan की है कि इसके अलावा दिखाया गया है और apolipoprotein ई एनएससी अस्तित्व को बढ़ाता है और इस प्रकार एनएससी आवृत्ति 14,15 बढ़ जाती है। हालांकि प्रतिलेखन कारक सहित कई मार्कर एनएससी 16,17 के साथ संबद्ध किया गया है, इन मार्करों में से कोई भी शुद्धता के लिए एनएससी को समृद्ध करने में सक्षम हैं। निश्चित एनएससी मार्कर की कमी के कारण, यह एनएससी यों और इन विट्रो में एनपीएस से उन्हें अलग करने के लिए एक चुनौती बनी हुई है।

प्रारंभिक अध्ययन एनएससी 7,11,13 यों तो neurosphere गठन परख (एनएफए) का इस्तेमाल किया। इस परख में, अलग कोशिकाओं neurospheres के लिए फार्म सुसंस्कृत हैं और neurospheres की संख्या चढ़ाया चुना गया है हर 100 कोशिकाओं के लिए उत्पन्न। यह मान neurosphere गठन इकाई (NFU) के रूप में करार दिया है। अगर सब neurospheres एनएससी से उठता NFU एनएससी आवृत्ति के बराबर होती है। हालांकि, यह दिखाया गया था कि NFU एनएससी आवृत्ति overestimates के रूप में neurospheres दोनों एन एस द्वारा गठित कर रहे हैंसीएस और जल्दी एनपीएस 5। इस प्रकार, यह पूरी तरह से neurosphere गठन के आधार पर एनएससी गणना करने के लिए गलत है। यह करने के लिए अपनी क्षमता के आधार पर एनएससी यों के लिए संभव हो सकता है, आत्म नवीनीकृत बड़े पैमाने पर पैदा करना और multipotent neurospheres उत्पन्न करते हैं।

एनएससी, जो EGF और bFGF उत्तरदायी हैं, आम तौर पर कम से कम दस मार्ग के लिए जीवित है और इस प्रकार संस्कृति 4,18-20 में व्यापक आत्म नवीकरण क्षमता प्रदर्शित करते हैं। एनपीएस, जो रूप में अच्छी तरह EGF और bFGF उत्तरदायी हैं, यह भी एक कुछ अंश के समय की एक विस्तारित अवधि के लिए, लेकिन नहीं करने के लिए neurospheres उत्पन्न कर सकता है। इसलिए, यह व्यापक रूप से स्वीकार किया गया है कि सदाशयी एनएससी कम से कम दस मार्ग के लिए neurosphere गठन के आधार पर निष्पक्ष सटीकता के साथ समझा जा सकता है। ज्यादातर अध्ययनों में, हालांकि, आत्म नवीकरण आमतौर पर माध्यमिक या तृतीयक neurosphere गठन के आधार पर लंबे समय प्रयोगात्मक दस मार्ग के लिए आवश्यक होने के कारण मापा जाता है। इसलिए, माध्यमिक एनएफए मोटे तौर पर आत्म नवीकरण क्षमता शर्त तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकतासमझना आबादी है, लेकिन सही एनएससी आवृत्ति गणना करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है।

एनएससी एनपीएस की तुलना में एक अधिक से अधिक proliferative क्षमता है। एनएससी की यह संपत्ति लुइस एट अल द्वारा इस्तेमाल किया गया था। तंत्रिका कॉलोनी के गठन सेल परख (NCFCA) 21,22 - एनएससी गणन के लिए एक परख विकसित करने के लिए। इस परख में, एकल कक्षों एक कोलेजन युक्त semisolid मैट्रिक्स में 3 सप्ताह के लिए सुसंस्कृत हैं। इन संस्कृति शर्तों के तहत, यह दिखाया गया था कि कोशिकाओं है कि व्यास में 2 मिमी ऊपर neurospheres फार्म tripotent हैं और लंबी अवधि के लिए स्वयं को नवीनीकृत कर सकते हैं। इन कोशिकाओं को एनएससी के रूप में परिभाषित कर रहे हैं। इसलिए, एनएससी को प्रभावी ढंग से एनपीएस से प्रतिष्ठित हैं।

एनएससी astrocytes, oligodendrocytes और न्यूरॉन्स में अंतर करने की क्षमता है। neurospheres के भेदभाव के लिए, विकास के कारकों को हटा रहे हैं और सीरम संस्कृति के माध्यम से जोड़ा जाता है। सभी तीन तंत्रिका प्रजातियों, तो सेल कि कि neurosphere शुरू की एक neurosphere में मनाया जाता है, तो मैंएक एनएससी है। हालांकि, भेदभाव परख कुछ सीमाएँ हैं। सबसे पहले, संस्कृति भेदभाव के लिए इस्तेमाल की स्थिति में सभी तीन तंत्रिका प्रजातियों की पीढ़ी के लिए इष्टतम नहीं हो सकता। वास्तव में, एक एकल neurosphere भेदभाव प्रक्रिया में महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु होती है और ज्यादातर astrocyte पीढ़ी होता है (Tham एम और अहमद एस, अप्रकाशित)। दूसरा, वहाँ clonality का मुद्दा है। एनएससी, गठन और neurospheres के भेदभाव की सटीक गणना के लिए प्रतिरूप की स्थिति है, जहां प्रत्येक neurosphere एक एकल कोशिका से उत्पन्न होती है के तहत किया जाना है। थोक निलंबन संस्कृतियों में, एकत्रीकरण दोनों सेलुलर और neurosphere का स्तर 23-25 पर होता है। इसलिए, यह प्रत्येक neurosphere के लिए कई कोशिकाओं या neurospheres, जो neurosphere गिनती और multipotency के मूल्यांकन पेचीदा से उठता लिए संभव है। हाल ही में सबूत से पता चलता है कि कोशिकाओं के एकत्रीकरण 0.5 कोशिकाओं / μL या नीचे, और कम चढ़ाना घनत्व में नहीं होती है संस्कृति प्लेटों Neu दौरान स्थानांतरित नहीं कर रहे हैं जबrosphere गठन 15। इस प्रकार इस तरह के कम घनत्व में संवर्धन कोशिकाओं clonality सुनिश्चित करेगी।

वर्तमान में, NCFCA सबसे अधिक इस्तेमाल किया एनपीएस से एनएससी भेद और एनएससी आवृत्ति गणना करने के लिए विधि है। NCFCA, हालांकि, तीन सप्ताह की एक अपेक्षाकृत लंबे समय की आवश्यकता है। यहाँ, हम एनएससी की क्षमता multipotent neurospheres के लिए फार्म के आधार पर एनएससी आवृत्ति गणना करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। इस प्रोटोकॉल प्रदर्शन करने के लिए केवल 13 दिन लगते हैं। के रूप में कोलेजन मैट्रिक्स neurospheres के आंदोलन को रोकता है NCFCA clonality सुनिश्चित करता है। संस्कृति इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल की स्थिति भी अनुमति देता है clonality भर में बनाए रखा जा सकता है। उदाहरण के लिए, 50-अच्छी तरह से संभाग coverslips का उपयोग सुनिश्चित करता है कि neurospheres एक-दूसरे से संपर्क के बिना अलग होगा। इसके अलावा, हम वातानुकूलित माध्यम है कि भेदभाव के दौरान neurotrophic कारकों की आपूर्ति neurospheres (चित्रा 1) के भेदभाव क्षमता को अधिकतम करने के लिए उपयोग।

Protocol

पशुओं के उपचार IACUC और NACLAR दिशा निर्देशों के अनुसार ((http://www.brc.astar.edu.sg/index.php?sectionID-11) का प्रदर्शन किया और पशु विभाग द्वारा अनुमोदित किया गया था।
नोट: neurosphere संस्कृतियों भ्रूण (E14) C57BL की अग्रमस्तिष्क / 6 चूहों के रूप में पहले से वर्णित 5 से तैयार थे।

1. क्लोनल नमूना Neurospheres की संस्कृति दिवस (1)

  1. , EGF (अंतिम एकाग्रता: 20 एनजी / एमएल), bFGF (अंतिम एकाग्रता: 10 एनजी /: (1x अंतिम एकाग्रता) B27 पूरक के साथ Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम / पोषक तत्व एफ 12 (DMEM / F12) मध्यम संयोजन से एनएससी विकास मध्यम तैयार एमएल) और पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (अंतिम एकाग्रता: 1x)।
  2. 1 एमएल एनएससी मध्यम विकास और 1 एमएल 0.05 एन सोडियम 7 मिनट के लिए आरटी पर हाइड्रोक्साइड में E14.5 माउस neurospheres अलग कर देना। पिपेट कोशिकाओं ऊपर और नीचे कभी कभी निलंबन में कोशिकाओं को रखने के लिए। तटस्थ 0.05 एन हाइड्रोक्लोरिक एसिड के 1 एमएल जोड़ेंक्षार ize।
    नोट: neurosphere कोशिकाओं को एक 10 सेमी संस्कृति डिश में 20,000 कोशिकाओं / एमएल पर वरीयता प्राप्त और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में 5 डी के लिए सुसंस्कृत हैं। उम्मीद की उपज के बाद प्रति 10 सेमी पकवान के बारे में 10 मिलियन कोशिकाओं है। इन कोशिकाओं को तो अलग और कदम 1.2 और 1.3, क्रमशः के रूप में वर्णित प्रतिरूप घनत्व वरीयता प्राप्त कर रहे हैं।
    1. Trypan ब्लू धुंधला हो जाना और एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की संख्या को पूरा करें।
  3. एक 96 अच्छी तरह से थाली में 50 कोशिकाओं / एमएल या नीचे 100 μL एनएससी मध्यम विकास में के घनत्व पर बीज एकल E14.5 माउस neurosphere कोशिकाओं। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% 1 के लिए सीओ 2 में कोशिकाओं को सेते डब्ल्यू प्रतिरूप neurospheres उत्पन्न करते हैं।
    नोट: इस clonality घनत्व में neurosphere गठन के दौरान यह सुनिश्चित किया है के रूप में कोशिकाओं को एक दूसरे से संपर्क नहीं करते।

2. वातानुकूलित माध्यम के लिए Neurospheres की संस्कृति (3 दिन)

  1. 1.2 चरण में वर्णित के रूप में E14.5 माउस neurospheres अलग कर देना।
  2. ई से बीज एकल कक्षोंएक 10 सेमी संस्कृति डिश में एक 10 एमएल एनएससी मध्यम विकास में 20,000 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर 14.5 माउस neurospheres। थोक सुसंस्कृत neurospheres उत्पन्न करने के लिए 5 डी के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में कोशिकाओं को सेते हैं।

3. neurosphere की तैयारी वातानुकूलित माध्यम दिवस (8)

  1. के 700 μL के मिश्रण से कोटिंग समाधान तैयार 0.01% पाली एल Lysine (पीएलएल), 1 मिलीग्राम की 70 μL / एमएल laminin और फॉस्फेट खारा बफर के 6230 μL (पीबीएस)।
  2. कोट 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए पीएलएल / laminin समाधान के 7 मिलीलीटर के साथ एक 10 सेमी संस्कृति पकवान।
  3. एक 10 एमएल सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग करना, एक 15 एमएल शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब सभी थोक सुसंस्कृत neurospheres हस्तांतरण। आरटी पर 1 मिनट के लिए 171 XG पर neurospheres अपकेंद्रित्र और पूरी तरह से सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
  4. और भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) (अंतिम एकाग्रता: 0.5%) विज्ञापन: (1x अंतिम एकाग्रता) B27 के साथ DMEM / F12 मध्यम संयोजन से एनएससी भेदभाव मध्यम तैयारD 10 neurospheres के लिए एनएससी भेदभाव माध्यम एमएल। ऊपर पिपेट और एक बार कुछ नीचे neurospheres resuspend।
  5. महाप्राण पीएलएल / 10 सेमी संस्कृति पकवान से laminin और 10 एमएल पीबीएस के साथ एक बार धो लें। पीएलएल / laminin लेपित 10 सेमी संस्कृति डिश के लिए सभी neurospheres स्थानांतरण। 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हे / एन, 5% सीओ 2 neurospheres के लिए पकवान का पालन करने के लिए।

4. नमूना Neurospheres की NFU का निर्धारण दिवस (8)

  1. अच्छी तरह से एक खुर्दबीन के तहत प्रत्येक में गठन, (खंड 1 1 दिन पर वरीयता प्राप्त) neurospheres की संख्या की गणना।
    नोट: जो NFU देता है 100 चढ़ाया कोशिकाओं प्रति गठन neurospheres की संख्या, निर्धारित करते हैं।

50-अच्छी तरह से संभाग coverslip करने के लिए नमूना Neurospheres 5. स्थानांतरण दिवस (8)

  1. कोट 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए पीएलएल / laminin कोटिंग समाधान के 10 μL के साथ एक 50-अच्छी तरह से संभाग coverslip के प्रत्येक अच्छी तरह से।
    ध्यान दें: के रूप में वर्णित कोटिंग समाधान तैयार3.1 कदम।
  2. 3 एक्स 50 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र पीबीएस प्रत्येक के 30 एमएल युक्त ट्यूबों तैयार करें। बाँझ संदंश का प्रयोग, लेपित 50 अच्छी तरह से संभाग coverslip को हटा दें। पीबीएस की पहली ट्यूब, दूसरे और फिर पीबीएस के तीसरे ट्यूब के द्वारा पीछा में संभाग coverslip डुबकी, कोटिंग समाधान को धोने के लिए।
  3. संभाग coverslip के कुओं से किसी भी शेष तरल aspirate।
  4. धीरे 96 अच्छी तरह से पकवान के प्रत्येक अच्छी तरह से सभी मध्यम और neurospheres पिपेट और एक एकल 10 सेमी संस्कृति डिश को हस्तांतरण।
  5. एक माइक्रोस्कोप के तहत, एक P10 micropipette एक 10 μL विंदुक टिप के साथ फिट का उपयोग कर एक नमूना neurosphere उठाओ। सुनिश्चित करें कि केवल एक ही neurosphere 2 μL के लिए पिपेट स्तंभ की स्थापना द्वारा हर बार उठाया है। प्रत्येक neurosphere के लिए एक नया पिपेट टिप का उपयोग करें।
  6. लेपित 50 अच्छी तरह से संभाग coverslip की एक अच्छी तरह से केंद्र पर neurosphere स्थानांतरण।
  7. दोहराएँ 5.5 और 5.6 कदम संभाग coverslip conta के प्रत्येक अच्छी तरह से जब तकएक neurosphere इन।
    नोट: neurospheres एक खुर्दबीन एक लामिना का प्रवाह हुड में या एक benchtop पर रखा तहत उठाया जा सकता है।
  8. संभाग coverslip के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 10 एनएससी की μL भेदभाव माध्यम जोड़ें। एक 10 सेमी संस्कृति डिश और पिपेट पीबीएस एनएससी भेदभाव माध्यम के सूखने को रोकने के लिए पकवान के किनारों के साथ में संभाग coverslip रखें। एक 10 सेमी संस्कृति डिश में दो संभाग coverslips के लिए ऊपर रखें। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में रात भर संभाग coverslip (10 सेमी संस्कृति डिश में निहित) सेते हैं।

6. नमूना Neurospheres के भेदभाव दिवस (9)

  1. एक 15 एमएल शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब थोक सुसंस्कृत neurospheres (धारा 3 से) से भेदभाव माध्यम स्थानांतरण। सुनिश्चित करें कि भेदभाव माध्यम के 2-3 एमएल detaching से पालन कोशिकाओं को रोकने के लिए संस्कृति डिश में बनी हुई है। एक 20 एमएल बाँझ सिरिंज का प्रयोग, एक 0.2 μ के माध्यम से भेदभाव माध्यम से पारितएम फिल्टर किसी भी कोशिकाओं या मलबे को हटाने के लिए।
  2. फ़िल्टर भेदभाव माध्यम वापस 10 सेमी संस्कृति पालन कोशिकाओं से युक्त डिश के लिए स्थानांतरण।
  3. बाँझ संदंश का प्रयोग, धीरे एक औंधा ढंग से भेदभाव माध्यम पर संभाग coverslip जगह ऐसी है कि नमूना neurospheres नीचे की ओर का सामना करना पड़ रहे हैं। 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 डी भेदभाव माध्यम से संभाग coverslip सेते हैं, 5% सीओ 2।
    नोट: नमूना neurospheres भेदभाव माध्यम के साथ संपर्क में हैं, लेकिन नीचे फर्क कोशिकाओं के साथ संपर्क में नहीं है।

7. विभेदित Neurospheres की फिक्सिंग दिवस (12)

  1. धीरे 10 सेमी संस्कृति बाँझ संदंश का उपयोग पकवान से संभाग coverslip को हटा दें। धीरे वातानुकूलित माध्यम से धोने के लिए पीबीएस में coverslip डुबकी।
  2. coverslip से सिलिकॉन गैसकेट दूर छील। coverslip को तोड़ने से बचने के लिए और धीरे धीरे इस प्रदर्शन करना। पक्ष का ध्यान रखना जहां वेंई भेदभाव neurospheres पालन कर रहे हैं।
  3. coverslip के आकार के लिए आयल फिल्म में कटौती के एक टुकड़े पर 4% paraformaldehyde (पीएफए) की पिपेट 1 एमएल। धीरे पीएफए ​​के साथ संपर्क में नीचे की ओर का सामना करना पड़ neurospheres साथ आयल फिल्म पर coverslip जगह। आरटी पर 20 मिनट के लिए neurospheres को ठीक करें।
    सावधानी: पीएफए ​​विषाक्त दोनों तरल और वाष्प के रूप में है और दहनशील है। वाष्प की साँस लेना से बचने और त्वचा और आंखों के साथ संपर्क करें। हमेशा के लिए एक हवादार धूआं हुड में पीएफए ​​संभाल।
  4. आयल फिल्म के एक टुकड़े पर पीबीएस के पिपेट 1 एमएल। धीरे neurospheres कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए पीबीएस के साथ संपर्क में नीचे की ओर का सामना करना पड़ के साथ coverslip रखकर neurospheres धो लें।
  5. दोहराएँ कदम 7.4 दो बार।

8. विभेदित Neurospheres की O4 धुंधला (12 दिन)

  1. पीबीएस में 3% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) तैयार करें। आयल फिल्म के एक टुकड़े पर 3% बीएसए की पिपेट 1 एमएल। धीरे Placin द्वारा neurospheres ब्लॉकजी coverslip आरटी पर 30 मिनट के लिए बीएसए के साथ संपर्क में (neurospheres नीचे का सामना करना पड़ के साथ)।
  2. माउस विरोधी O4 आईजीएम एंटीबॉडी के पिपेट 1 एमएल (1: 300 3% BSA में कमजोर पड़ने) आयल फिल्म के एक टुकड़े पर और एंटीबॉडी के साथ संपर्क में नीचे की ओर का सामना करना पड़ neurospheres साथ आयल फिल्म पर coverslip जगह। O4 धुंधला आरटी पर 2 घंटे के लिए घटित करने के लिए अनुमति दें।
  3. कदम 7.4 में वर्णित के रूप में पीबीएस के साथ दो बार coverslip धो लें।
  4. हरी फ्लोरोसेंट डाई संयुग्मित-विरोधी माउस आईजीएम माध्यमिक एंटीबॉडी के पिपेट 1 एमएल (1: 500 3% BSA में कमजोर पड़ने) आयल फिल्म के एक टुकड़े पर और एंटीबॉडी के साथ संपर्क में नीचे की ओर का सामना करना पड़ neurospheres साथ आयल फिल्म पर coverslip जगह । अंधेरे में आरटी पर 1 घंटे के लिए छोड़ दें।
    नोट: इस कदम के बाद से एक अंधेरे वातावरण में immunostaining प्रदर्शन करना।
  5. कदम 7.4 में वर्णित के रूप में पीबीएस के साथ दो बार coverslip धो लें।

9. Tuj1 और glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) धुंधलाविभेदित Neurospheres का दिवस (12)

  1. 3% बीएसए को: ट्राइटन एक्स 100 (0.5% अंतिम एकाग्रता) जोड़कर समाधान permeabilizing तैयार करें। आयल फिल्म के एक टुकड़े पर समाधान permeabilizing की पिपेट 1 एमएल। आरटी पर 20 मिनट के लिए permeabilizing समाधान के साथ संपर्क में नीचे की ओर का सामना करना पड़ neurospheres साथ आयल फिल्म पर coverslip रखें।
  2. कदम 7.4 में वर्णित के रूप में पीबीएस के साथ दो बार coverslip धो लें।
  3. माउस के पिपेट 1 एमएल विरोधी Tuj1 आईजीजी 2A एंटीबॉडी (1: 3% BSA में 500 कमजोर पड़ने) और खरगोश विरोधी GFAP आईजीजी एंटीबॉडी (1: 3% BSA में 1,000 कमजोर पड़ने) आयल फिल्म और जगह coverslip के एक टुकड़े पर पर एंटीबॉडी के साथ संपर्क में नीचे की ओर का सामना करना पड़ neurospheres साथ आयल फिल्म। Tuj1 और GFAP धुंधला आरटी पर 2 घंटे के लिए घटित करने के लिए अनुमति दें।
    नोट: दोनों एंटीबॉडी एक ही समाधान के रूप में तैयार किया जा सकता है।
  4. कदम 7.4 में वर्णित के रूप में पीबीएस के साथ दो बार coverslip धो लें।
  5. लाल फ्लोरोसेंट डाई की पिपेट 1 एमएलसंयुग्मित-विरोधी माउस आईजीजी 2A (1: 3% BSA में 500 कमजोर पड़ने) और अब तक लाल फ्लोरोसेंट डाई संयुग्मित-विरोधी खरगोश आईजीजी (1: 3% BSA में 500 कमजोर पड़ने) आयल फिल्म और जगह के एक टुकड़े पर माध्यमिक एंटीबॉडी एंटीबॉडी के साथ संपर्क में नीचे की ओर का सामना करना पड़ neurospheres साथ आयल फिल्म पर coverslip। आरटी पर 1 घंटे के लिए छोड़ दें।
    नोट: दोनों एंटीबॉडी एक ही समाधान के रूप में तैयार किया जा सकता है।
  6. कदम 7.4 में वर्णित के रूप में पीबीएस के साथ दो बार coverslip धो लें।
  7. पीबीएस में 300 एनएम के लिए 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) शेयर समाधान पतला। नाभिक धुंधला के लिए आरटी पर 2 मिनट के लिए DAPI के साथ संपर्क में नीचे की ओर का सामना करना पड़ neurospheres साथ आयल फिल्म पर आयल फिल्म और जगह coverslip के एक टुकड़े पर DAPI की पिपेट 1 एमएल।
  8. कदम 7.4 में वर्णित के रूप में विआयनीकृत पानी के साथ पीबीएस के साथ एक बार और दो बार coverslip धो लें। एक उपयुक्त बढ़ते माध्यम का उपयोग कर एक गिलास स्लाइड पर coverslip माउंट और आरटी पर हे / एन सूखे के लिए अनुमति देते हैं।

10 भारतीय सैन्य अकादमीविभेदित Neurospheres की Ging (13 दिन)

  1. एक confocal खुर्दबीन एक 40x का उपयोग कर के तहत छवि neurospheres। oligodendrocytes, न्यूरॉन्स और astrocytes क्रमश: पता लगाने के लिए 488 एनएम, 594 एनएम और 647 एनएम लेज़रों का प्रयोग करें।
  2. unipotent, bipotent और tripotent neurospheres का प्रतिशत निर्धारित करते हैं।
    नोट: - oligodendrocytes, न्यूरॉन्स और astrocytes 5,14,15,26 शक्ति neurosphere की क्षमता तीन तंत्रिका प्रजातियों में अंतर करने से निर्धारित होता है। Oligodendrocytes O4 (धारा 8) के लिए सकारात्मक धुंधला द्वारा पहचाने जाते हैं। न्यूरॉन्स Tuj1 (धारा 9) के लिए सकारात्मक धुंधला द्वारा पहचाने जाते हैं। Astrocytes GFAP (धारा 9) के लिए सकारात्मक धुंधला द्वारा पहचाने जाते हैं। एक unipotent neurosphere वंश का केवल एक में अलग करता है और सकारात्मक या तो O4, GFAP या Tuj1 के लिए दाग चाहिए। एक bipotent neurosphere किसी भी दो प्रजातियों में अलग करता है और सकारात्मक O4 और GFAP या O4 और Tuj1 या GFAP और Tuj1 के लिए दाग चाहिए। एक tripotent neurosphere अलगसभी तीन प्रजातियों में iates और सकारात्मक O4, GFAP और Tuj1 के लिए दाग चाहिए।
  3. निर्धारित बनाने के लिए निम्न सूत्र का उपयोग करके ब्याज की आबादी में एनएससी आवृत्ति:
    एनएससी आवृत्ति = (tripotent neurospheres की NFU x%) / 100%।

Representative Results

हम एनएससी के लिए संतुष्ट करने के लिए लेक्स, एक ज्ञात कोशिका की सतह एनएससी मार्कर 7, की क्षमता का आकलन करने के लिए इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है। इस अध्ययन से डेटा वर्णन कैसे एनएससी प्रोटोकॉल में प्रतिरूप assays का उपयोग कर रहे हैं प्रगणित इस्तेमाल किया जाएगा। E14.5 माउस neurosphere कोशिकाओं विरोधी लेक्स एंटीबॉडी के साथ incubated रहे थे। बाद में, कोशिकाओं है कि लेक्स (लेक्स +) और कोशिकाओं है कि लेक्स (लेक्स -) व्यक्त नहीं करते व्यक्त करते छंटनी (FACS) प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल द्वारा 50 कोशिकाओं / एमएल पर वरीयता प्राप्त और 1 विकेटकीपर के लिए प्रतिरूप neurospheres उत्पन्न करने के लिए छोड़ दिया गया। समय चूक इमेजिंग से पता चलता है कि neurospheres 50 कोशिकाओं में उत्पन्न / एमएल प्रतिरूप (चित्रा 2) कर रहे हैं। के लिए लेक्स + और लेक्स NFU - कोशिकाओं को निर्धारित किया गया था। यह दिखाया है कि लेक्स + कोशिकाओं एक काफी अधिक neurosphere गठन क्षमता लेक्स की तुलना में है - कोशिकाओं (चित्रा 3 जी)। उत्पन्न neurospheres तो भेदभाव कर रहे थेप्रतिरूप परिस्थितियों में, बाद में immunostained और imaged (चित्रा 3 ए-ई)। कोशिकाओं (चित्रा 3F) - लेक्स + कोशिकाओं लेक्स की तुलना में काफी अधिक tripotent neurospheres उत्पन्न करते हैं। एनएससी आवृत्ति तो NFU पर और tripotent neurospheres (चित्रा 3 जी) के% आधारित गणना की गई। लेक्स के आधार पर चयन, अधिक से अधिक 14 गुना से एनएससी आवृत्ति को समृद्ध, लेक्स एक एनएससी मार्कर के रूप में मान्य। हम यह भी E14.5 माउस इस प्रोटोकॉल के 27 और 28 NCFCA का उपयोग कर neurospheres की एनएससी आवृत्ति निर्धारित किया है। दोनों तरीकों E14.5 माउस neurospheres में लगभग 2% की तुलना एनएससी आवृत्ति की रिपोर्ट।

आकृति 1
चित्रा 1. क्लोनल शर्तों के तहत neurosphere भेदभाव के लिए प्रोटोकॉल। नमूना neurospheres प्रतिरूप परिस्थितियों में विकसित व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक पीएलएल / laminin-सी में रखा जाता हैएक 50 अच्छी तरह से संभाग coverslip की अच्छी तरह से oated, और ओ पालन / एन की अनुमति दी। उसी दिन, थोक सुसंस्कृत neurospheres एक PLL / laminin लेपित 10 सेमी पकवान में भेदभाव माध्यम में चढ़ाया, और ओ पालन / एन की अनुमति है। अगले दिन, थोक सुसंस्कृत neurospheres से वातानुकूलित माध्यम से फ़िल्टर और 10 सेमी डिश में वापस रखा गया है। नमूना neurospheres तो वातानुकूलित माध्यम पर उल्टे और अंतर करने के लिए 3-4 दिनों के लिए 28। अनुमति दी जाती है कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्र 2
E14.5 neurospheres से निकाली गई चित्रा 2. एक प्रतिरूप neurosphere के विकास। प्रकोष्ठों अलग और / एमएल 96 अच्छी तरह से थाली में 50 कोशिकाओं पर वरीयता प्राप्त थे। व्यक्तिगत कोशिकाओं समय चूक इमेजिंग के लिए 6 डी ट्रैक किए गए थे। ओ की छवियाँne इस तरह के सेल एक neurosphere में बढ़ दिखाया गया है। ध्यान दें कि neurosphere clonality बनाए रखता है। (क) 0 दिन; (ख) 1.19.45; (ग) 2.95.37; (घ) 3.32.76; (ई) 4.46.53; (च) 5.61.44; जहां पहले नंबर दिन को संदर्भित करता है, दूसरे नंबर दिन के अंश को संदर्भित करता है, और तीसरे नंबर एच के अंश को दर्शाता है। 10X बढ़ाई। स्केल पट्टी, 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. क्लोनल Neurospheres और एनएससी फ्रीक्वेंसी की गणन के भेदभाव। एकल neurospheres के लिए 3 डी उठाया और 50-अच्छी तरह से संभाग coverslip में भेदभाव कर रहे थे। एक tripotent neurosphere स्टेशन के एक प्रतिनिधि छवि(क) DAPI ined और (ख) GFAP immunostained, (ग) Tuj1 और (घ) O4। (ई) (क) के ओवरले शो - (घ)। स्केल बार, 65 माइक्रोन। (च) लेक्स + और लेक्स द्वारा उत्पन्न unipotent, bipotent और tripotent neurospheres के% - कोशिकाओं (मतलब ± SEM, एन = 3)। (G) लेक्स + और लेक्स में एनएससी आवृत्ति -। NFU के उत्पाद और tripotent neurospheres के% के रूप में गणना की कोशिकाओं यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

हम ही प्रतिरूप की शर्तों के तहत एनएससी की गणना का वर्णन है। महत्वपूर्ण कदम ताजा एनएससी विकास और भेदभाव माध्यम के उपयोग, और भी कोट करने के लिए हौसले से तैयार पीएलएल / laminin समाधान के उपयोग संभाग coverslips, साथ ही संस्कृति व्यंजन शामिल हैं। इस neurospheres का इष्टतम विकास और भेदभाव की स्थिति सुनिश्चित करता है। अच्छी गुणवत्ता वाले एंटीबॉडी के उपयोग को प्रभावी ढंग से न्यूरॉन्स और glia, साथ ही प्रतिरूप neurospheres है कि अन्य neurospheres के साथ संपर्क में नहीं हैं के चुनिंदा उठा पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण हैं। इसके अलावा, यह उठाया neurospheres सुनिश्चित करने के लिए सूख नहीं है महत्वपूर्ण है। यह हर 10 neurospheres उठा के बाद एक अच्छी तरह से भेदभाव माध्यम के 10 μL जोड़ने की सिफारिश की है। यह नमूना प्रति एक 10 सेमी पकवान में एक संभाग coverslip का उपयोग करने के लिए विभिन्न नमूनों से neurospheres के बीच पार बात से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। दो coverslips (विभिन्न नमूनों से प्रत्येक युक्त neurospheres) में रखा जाता है तोवही 10 सेमी पकवान, एक coverslip से neurospheres कारक है कि अन्य coverslip में neurospheres की प्रवृत्ति बदल सकता है विशिष्ट प्रजातियों में अंतर करने के लिए जारी हो सकता है। वही 10 सेमी डिश में दो coverslips भी नमूने के बीच मिश्रण में हो सकता है।

घटना NFU या एनएससी आवृत्ति की उम्मीद की तुलना में कम है, यह सुनिश्चित करें कि कम बीतने संख्या neurospheres किया जाता है। यह भी महत्वपूर्ण है कि स्वस्थ कम बीतने neurospheres वातानुकूलित माध्यम पैदा करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। इसके बाद, यदि neurospheres इस तरह के 96 अच्छी तरह से थाली में के रूप में छोटे व्यास, के साथ कुओं में सुसंस्कृत हैं, तो यह मुश्किल पैंतरेबाज़ी और एक micropipette का उपयोग neurospheres लेने के लिए होगा। इस मामले में, neurospheres एक बड़ा संस्कृति डिश के लिए, इस तरह के एक 6 अच्छी तरह से पकवान के रूप में, पहले उठा लिए स्थानांतरण। उठाया neurospheres से कुछ संस्कृति और immunostaining के दौरान संभाग coverslip से लिफ्ट बंद हो सकती है। संस्कृति के दौरान संभाग coverslip के आंदोलन, और कम गहन धोने कम से कमimmunostaining दौरान हैैं, neurospheres की टुकड़ी से बचने के लिए मदद मिलेगी।

प्रारंभिक अध्ययन केवल एनएफए 7,11,13 का उपयोग मात्रा एनएससी। हालांकि, एनएफए एनएससी आवृत्ति overestimates के रूप में दोनों एनएससी और जल्दी एनपीएस neurospheres 5 उत्पन्न करते हैं। लुइस एट अल। एनएससी NCFCA 21,22 के रूप में जाना यों की एक अन्य विधि विकसित की है। NCFCA एक कोलेजन आधारित मैट्रिक्स में एकल कक्षों संवर्धन करना शामिल है clonality सुनिश्चित करने के लिए है, और यह दिखाया गया था कि व्यास में 2 मिमी ऊपर neurospheres केवल एनएससी से बनते हैं। NCFCA के लिए इसी प्रकार, clonality इस प्रोटोकॉल के दौरान यह सुनिश्चित किया है। इस प्रतिरूप घनत्व में neurospheres पैदा करने और संभाग coverslips में neurospheres फर्क द्वारा हासिल की है। संभाग coverslips के उपयोग के लाभ के एक नंबर प्रदान करता है। संभाग coverslip प्रत्येक नमूना neurosphere अन्य नमूना neurospheres के साथ शारीरिक संपर्क कर रहे है, जिससे भेदभाव के दौरान clonality सुनिश्चित बिना अंतर करने के लिए अनुमति देता है।संभाग coverslip भेदभाव माध्यम नमूना neurospheres लगातार वातानुकूलित करने और अधिकतम भेदभाव सुनिश्चित करने के लिए अनुमति देने के लिए निलंबित कर दिया पर रखा जा सकता है। भेदभाव के दौरान वातानुकूलित मध्यम और सीरम के अभाव में, neurospheres के अस्तित्व कम हो जाती है और neurospheres ज्यादातर astrocytes (Tham एम और अहमद एस, अप्रकाशित) उत्पन्न करते हैं। इसके अलावा, immunostained neurospheres आसानी से समय की लंबी अवधि के लिए भंडारित किया जा सकता है और संभाग coverslips माइक्रोस्कोप गिलास स्लाइड पर सीधे रखा जा सकता है। इसके अतिरिक्त, immunostained neurospheres की इमेजिंग के रूप में एक जल्दी, छोटे अच्छी तरह से संभाग में neurosphere का पता लगाने के लिए एक छवि पर कब्जा है, और अगले अच्छी तरह से करने के लिए पर स्थानांतरित कर सकते हैं आसान बना दिया है।

हम दोनों प्रोटोकॉल इस पांडुलिपि 27 और NCFCA 28 में वर्णित का उपयोग E14.5 माउस neurosphere संस्कृति में एनएससी आवृत्ति निर्धारित किया है। E14.5 माउस neurospheres में एनएससी आवृत्ति दोनों मेरे द्वारा निर्धारितthods तुलना कर रहे हैं। NCFCA एनएससी कि multipotent कर रहे हैं और लंबी अवधि के आत्म नवीकरण क्षमता विश्लेषण करता है। चूंकि हमारे विधि से एनएससी आवृत्ति है कि NCFCA से तुलनीय है, हमारे प्रोटोकॉल से readout एनएससी आवृत्ति overestimate करने के लिए प्रतीत नहीं होता है। NCFCA तीन सप्ताह पूरा होने की आवश्यकता है और मुख्य रूप से सेल चढ़ाना और मध्यम आपूर्ति शामिल है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल प्रदर्शन करने के लिए 13 दिन की आवश्यकता है और कदम की एक अलग श्रृंखला, जैसे, neurosphere उठा और immunostaining शामिल है। इस प्रोटोकॉल एक वैकल्पिक तरीका एनएससी गणना करने के लिए के रूप में काम कर सकता है। शोधकर्ताओं ने उनके नमूनों में एनएससी आवृत्ति को सत्यापित करने के लिए दोनों NCFCA और इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर सकते हैं।

इस प्रोटोकॉल की एक सीमा है कि महत्वपूर्ण कदम की एक श्रृंखला के सभी दिन 8. 50-अच्छी तरह से संभाग coverslip करने के लिए वातानुकूलित माध्यम की तैयारी, नमूना neurospheres की NFU का दृढ़ संकल्प, और नमूना neurospheres के हस्तांतरण पर प्रदर्शन किया जा रहा है होने की जरूरत है दा पर प्रदर्शनY 8. एक इन चरणों को पूरा करने के लिए समय ले सकता है। इसके अलावा, यह अभ्यास की आवश्यकता है एक कुशल तरीके से इन चरणों को पूरा करने के लिए।

Neurospheres व्यापक रूप से एनएससी समारोह और व्यवहार का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, neurospheres दोनों एनएससी और एनपीएस से मिलकर बनता है। इसलिए, यह एनएससी जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए neurospheres से एनएससी संतुष्ट करने के लिए महत्वपूर्ण है। वर्तमान में, कोशिका की सतह मार्कर, डाई बहिष्कार संपत्ति के रूप में अच्छी तरह से सेल आकार और विघटन एनएससी 6,7,9-13,29,30 के लिए संतुष्ट करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इस प्रोटोकॉल संभावित एनएससी मार्कर द्वारा एनएससी के संवर्धन यों की है, और एक निश्चित एनएससी मार्कर के लिए खोज की सुविधा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हाल के अध्ययनों से चार एनएससी आवृत्ति 5,14,15,26 गणना करने के लिए इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है।

Acknowledgments

हम इस अनुसंधान के वित्तपोषण के लिए विज्ञान, प्रौद्योगिकी और अनुसंधान (एक * स्टार), सिंगापुर के लिए एजेंसी को धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL conical centrifuge tubes  BD 352096
50 mL conical centrifuge tubes  BD 352070
20 mL sterile syringe   BD 300141
50 mL sterile syringe  BD 300144
Fetal Bovine Serum (FBS)  Biowest S1810
Mouse anti-Tuj1 IgG2a antibody Covance MMS-435P-100
Rabbit anti-GFAP IgG antibody Dako Z033401
Hemocytometer  Hausser Scientific 3100
Microscope fitted to laminar flow hood  Leica MZ6
Glass slides Marienfeld-superior 1000200
Mouse anti-O4 IgM antibody  Merck Millipore MAB345
Hydromount National Diagnostics HS-106
Microscope Nikon Eclipse TS100-F
Laminar flow hood NuAire NU-543
96-well culture dishes NUNC 167008
10-cm culture dishes  NUNC 150350
Paraffin film Parafilm PM999
Human Epidermal Growth Factor (EGF)  Peprotech AF-100-15
Recombinant human basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)  Peprotech 100-18B
0.2 µm filter  Sartorius Stedim 16534-K
0.45 µm filter Sartorius Stedim 16555-K
1.0 N Sodium Hydroxide (NaOH)  Sigma-Aldrich S2770
1.0 N Hydrochloric acid (HCl)  Sigma-Aldrich H9892
Trypan Blue  Sigma-Aldrich T8154
Poly-L-Lysine (PLL)  Sigma-Aldrich P8920
Paraformaldehyde (PFA) powder  Sigma-Aldrich P6148 Toxic
Bovine Serum Albumin (BSA) powder  Sigma-Aldrich A7906
50-well chambered coverslips  Sigma-Aldrich C7735
Stir plate with heat function  Stuart UC152
DMEM/F12 medium Thermo Fisher Scientific 11320-033
B27 supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
Penicillin-Streptomycin  Thermo Fisher Scientific 15140-122
Laminin Thermo Fisher Scientific 23017-015
1x Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ (DPBS) Thermo Fisher Scientific 14190144
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody Thermo Fisher Scientific A21042
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG2a antibody Thermo Fisher Scientific A21135
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG antibody Thermo Fisher Scientific A31573
4’,6’-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)  Thermo Fisher Scientific D3571
Cell-culture centrifuge Thermo Fisher Scientific  RT1 75002383
Pasteur pipettes Thermo Fisher Scientific 10006021
CO2 incubator
Ventilated fume-hood
Aspirator
Confocal microscope
Micropipettes
Micropipette tips
Plastic pipettes
Multichannel pipettes
Glass beaker
Sterile forceps
pH meter

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References

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तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के गणन क्लोनल assays का उपयोग
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Narayanan, G., Yu, Y. H., Tham, M., Gan, H. T., Ramasamy, S., Sankaran, S., Hariharan, S., Ahmed, S. Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays. J. Vis. Exp. (116), e54456, doi:10.3791/54456 (2016).

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