Summary
Neural stamceller (NSC) refererer til celler som kan fornye seg selv og skille ut de tre nevrale linjene. Her beskriver vi en protokoll for å bestemme NSC frekvens i en gitt cellepopulasjon ved bruk av neurosfære dannelse og differensiering i henhold klonale betingelser.
Abstract
Neural stamceller (NSC) har evnen til å fornye seg selv og generere de tre store nevrale linjene - astrocytter, nevroner og oligodendrocytter. NSCs og nevrale stamceller (NPS) er vanligvis dyrket in vitro som neurosfærer. Denne protokollen beskriver i detalj hvordan man skal bestemme NSC frekvens i en gitt cellepopulasjon i henhold klonale betingelser. Protokollen begynner med såing av cellene ved en tetthet som gjør det mulig for generering av klonale neurosfærer. Neurosfærene blir deretter overført til kamret Dekkglass og differensiert i henhold klonale forhold i kondisjonert medium, noe som maksimerer differensiering potensialet i neurosfærer. Til slutt blir den NSC frekvensen beregnet på grunnlag av neurosfære formasjons og multipotency evner. Verktøy av denne protokollen omfatter evaluering av kandidat NSC markører, rensing av NSC, og evnen til å skille NSCs fra NPs. Denne metoden tar 13 dager å utføre, noe som er mye shorter enn dagens metoder for å nummerere NSC frekvens.
Introduction
Neurale stamceller (NSC) er cellene i sentralnervesystemet (CNS) som kan fornye seg selv og er multipotent. NSCs først spesifisert under utviklingen av den embryonale brain og fortsette å vedvare i den voksne hjernen på bestemte områder som subventricular sone (SVZ) av laterale ventriklene og dentate gyrus (DG) av hippocampus. Et antall NSC linjer blir brukt i kliniske forsøk for behandling av slag og andre nevrologiske sykdommer så som Batten sykdom 1.
NSCs og nevrale stamceller (NPS) er dyrket i kultur som flytende tre-dimensjonale sfæroide strukturer som kalles neurosfærer. Neurosfærene kultur systemet ble utviklet av Reynolds og Weiss i begynnelsen av 1990, da de fant ut at embryonale og voksne kortikale celler kan dele i nærvær av epidermal vekstfaktor (EGF) og grunnleggende fibroblast vekstfaktor (bFGF) 2-4. Neurosfærer består av en heterogen blanding av calen bestående av underklasser på ulike utviklingsstadier 5. Det er utfordrende å spesifikt studere NSCs ved bruk av data oppnådd fra neurosfærene på grunn av tilstedeværelsen av NPS. Derfor er det avgjørende å berike NSCs fra neurosfærer. I dag har fire hovedmetoder vært brukt for å anrike for NSCs in vitro. Det første er anvendelsen av celleoverflatemarkører. Lewis-X (LEX) og CD133 (også kjent som Prominin1) er den mest fremtredende celleoverflaten NSC markører 6-9. Syndecan-en, Notch-en og Inte-beta1 er andre overflateproteiner som beriker for NSCs 10. Andre er utelukkelse fargestoff. Det har vist seg at side-populasjonsceller, som har den unike evne til å pumpe ut den fluorescerende DNA-bindende fargestoff Hoechst 33342, er anriket for NSCs 11. For det tredje er bruken av morfologiske valg. Det har blitt vist at celler med økt cellestørrelse og detalj havnen flere NSCs enn sine kolleger 5,12,13. Fjerde er tillegg av NSC survival faktorer til kulturen medium. Det har vist seg at tilsetning av Kondroitinsulfat proteoglykan og Apolipoprotein E forbedrer NSC overlevelse og dermed øker NSC frekvens 14,15. Selv om mange markører inkludert transkripsjonsfaktorer er blitt assosiert med NSCs 16,17, ingen av disse markørene er i stand til å berike NSCs til renhet. På grunn av mangel på definitive NSC markører, er det fortsatt en utfordring å kvantifisere NSCs og skille dem fra NPs in vitro.
Innledende studier brukes neurosfærene dannelsen analysen (NFA) for å kvantifisere NSCs 7,11,13. I denne analysen dissosierte cellene blir dyrket for å danne neurosfærer og antall neurosfærer generert for hver 100 celler belagt blir bestemt. Denne verdien er betegnet som neurosfærene Formation Unit (NFU). NFU lik NSC frekvens hvis alle Neurosfærene oppstå fra NSC. Imidlertid ble det vist at NFU overvurderer NSC frekvens som neurosfærer er utformet ved begge NSCs og tidlig NPs 5. Således er det unøyaktig å nummerere NSCs utelukkende basert på neurosfære formasjonen. Det kan være mulig å kvantifisere NSCs basert på deres evne til å fornye seg selv, sprer mye og generere multipotente neurosfærer.
NSC, som er EGF og bFGF responsive, vanligvis overleve i minst ti passasjer og dermed vise omfattende selvfornyelse kapasitet i kultur 4,18-20. NPs, som er EGF og bFGF responsive også, kan også generere Neurosfærene for et par passasjer, men ikke for en lengre periode. Derfor har det blitt allment akseptert at bona fide NSC kan være nummerert med rettferdig nøyaktighet basert på neurosfære dannelse i minst ti passasjer. I de fleste studier har imidlertid selvfornyelse måles vanligvis basert på sekundære eller tertiære neurosfære dannelse på grunn av den lange eksperimentelle tiden som kreves for ti passeringer. Derfor kan den sekundære NFA anvendes for å sammenligne bredt den selvfornyelse evne betlom bestander, men kan ikke brukes til nøyaktig nummerere NSC frekvens.
NSCs har en større proliferativ evne sammenlignet med NPS. Denne egenskapen av NSC ble brukt av Louis et al. for å utvikle en analyse for NSC oppregning - det neurale kolonidannende celleanalyse (NCFCA) 21,22. I denne analysen enkeltceller er dyrket i 3 uker i en kollagen-holdig halvfast matriks. Under disse dyrkningsbetingelser, ble det vist at celler som danner neurosfærer over 2 mm i diameter er tripotent og kan fornye seg selv på lang sikt. Disse cellene er definert som NSC. Derfor er NSCs effektivt skilles fra NPs.
NSCs har evnen til å differensiere til oligodendrocytter, astrocytter og neuroner. For differensiering av neurosfærer, blir vekstfaktorer fjernet og serum tilsettes til kulturmediet. Dersom alle tre neural linjene er observert i en neurosfære, da cellen som initierte den neurosfære jeger en NSC. Imidlertid har den differensiering-analysen noen begrensninger. For det første kan dyrkningsforholdene som benyttes for differensiering ikke være optimalt for generering av alle tre neural linjene. Faktisk, i en enkelt neurosfære differensieringsprosess, oppstår det betydelig celledød og for det meste astrocytt generasjon inntreffer (Tham M og Ahmed S, upublisert). For det andre er spørsmålet om klonalitet. For nøyaktig bestemmelse av NSCs, dannelse og differensiering av neurosfærer må utføres under klonale forhold, hvor hver enkelt neurosfære oppstår fra en enkelt celle. I bulk suspensjonskulturer oppstår aggregering på både mobil og neurosfære nivåene 23-25. Derfor er det mulig for hver enkelt neurosfære å skrive seg fra flere celler eller neurosfærer, som kompliserer neurosfære telling og evaluering av multipotency. Nyere bevis viser at aggregering av celler skjer ikke ved lave plette tetthet på 0,5 celler / mL eller mindre, og når kulturplater ikke blir beveget i løpet av neurosphere formasjon 15. Dermed dyrkning celler i så lav tetthet ville sikre klonalitet.
Foreløpig er NCFCA den mest brukte metoden for å skille NSCs fra NPs og nummerere NSC frekvens. Den NCFCA krever imidlertid en forholdsvis lang tid på tre uker. Her beskriver vi en protokoll for å nummerere NSC frekvens basert på evnen av NSCs til å danne multipotente neurosfærer. Denne protokollen tar bare 13 dager å utføre. Den NCFCA sikrer klonalitet som kollagenmatriksen hindrer bevegelse av neurosfærer. Dyrkningsbetingelsene anvendt i denne protokollen tillater også klonalitet skal opprettholdes i hele. For eksempel, ved bruk av 50-brønners kamret dekk sikrer at neurosfærene vil skille uten å kontakte hverandre. Videre bruker vi kondisjonert medium som leverer neurotrofiske faktorer i løpet av differensiering for å maksimere differensiering potensialet i de neurosfærer (figur 1).
Protocol
Behandlingen av dyr ble utført i samsvar med IACUC og NACLAR retningslinjer og godkjent av dyret avdeling ((http://www.brc.astar.edu.sg/index.php?sectionID-11).
MERK: neurosfære kulturer ble fremstilt fra forhjernen av embryonale (E14) C57BL / 6-mus som tidligere beskrevet 5.
1. Culture of Klonale Eksempel Neurosfærer (Dag 1)
- Forbered NSC vekstmedium ved å kombinere Dulbeccos modifiserte Eagles medium / Nutrient F-12 (DMEM / F12) medium med B27 supplement (sluttkonsentrasjon: 1x), EGF (sluttkonsentrasjon: 20 ng / ml), bFGF (sluttkonsentrasjon: 10 ng / ml) og penicillin / streptomycin (sluttkonsentrasjon: 1x).
- Dissosiere E14.5 muse neurosfærer i 1 ml NSC vekstmedium og 1 ml 0,05 N natriumhydroksyd i 7 minutter ved RT. Pipettes celler opp og ned noen ganger for å holde cellene i suspensjon. Tilsett 1 ml av 0,05 N saltsyre til nøytralize alkali.
MERK: neurosfære Cellene blir sådd ut på 20.000 celler / ml i en 10 cm kulturskål og dyrket i 5 d ved 37 ° C, 5% CO2. Forventet avkastning etter er om lag 10 millioner celler per 10 cm tallerken. Disse cellene blir deretter dissosiert og sådd ut ved klonal tetthet som beskrevet i trinn 1.2 og 1.3, respektivt.- Utfør celletall ved hjelp av trypanblått flekker og en hemocytometer.
- Seed enkelt E14.5 mus neurosfære-celler ved en tetthet på 50 celler / ml eller lavere i 100 ul NSC vekstmedium i en 96-brønners skål. Inkuber cellene ved 37 ° C, 5% CO2 i 1 m for å generere klonale neurosfærer.
MERK: klonalitet sikres under neurosfære dannelse på dette tetthet som cellene ikke kontakt med hverandre.
2. Culture of Neurosfærer for kondisjonerte mediet (Dag 3)
- Dissosiere E14.5 muse neurosfærer som beskrevet i trinn 1.2.
- Seed enkeltceller fra E14.5 mus neurosfærer ved en tetthet på 20.000 celler / ml i en 10 ml NSC vekstmedium i en 10 cm kulturskål. Inkuber cellene ved 37 ° C, 5% CO2 i 5 d for å generere bulk dyrkede neurosfærer.
3. Utarbeidelse av neurosfære Kondisjonert Medium (Dag 8)
- Fremstille beleggsløsning ved å blande 700 ul av 0,01% Poly-L-lysin (PLL), 70 ul av 1 mg / mL Laminin og 6230 ul av fosfatbufret saltvann (PBS).
- Belegge en 10 cm kulturskål med 7 ml av PLL / Laminin løsning i 2 timer ved 37 ° C.
- Ved hjelp av en 10 ml serologisk pipette, overføre alle bulk dyrkede Neurosfærene til en 15 ml konisk sentrifugerør. Sentrifuger Neurosfærene på 171 xg i 1 min ved RT og fjern supernatanten helt.
- Forbered NSC differensieringsmedium ved å kombinere DMEM / F12-medium med B27 (sluttkonsentrasjon: 1x) og bovint fosterserum (FBS) (sluttkonsentrasjon: 0,5%) Add 10 ml NSC differensieringsmedium til neurosfærer. Pipetter opp og ned et par ganger for å resuspendere neurosfærer.
- Sug PLL / Laminin fra 10 cm kultur tallerken og vaske en gang med 10 ml PBS. Overfør alle Neurosfærene til PLL / Laminin-belagt 10 cm kultur parabolen. Inkuber O / N ved 37 ° C, 5% CO 2 for neurosfærene holder seg til parabolen.
4. Fastsettelse av NFU av Sample Neurosfærer (Dag 8)
- Tell antall neurosfærer (utsådd på dag 1, avsnitt 1) som er utformet i hver brønn under et mikroskop.
MERK: Bestem antall neurosfærer dannet per 100 celler belagt, som gir NFU.
5. Overføring av Sample Neurosfærer til 50-brønn Chambered Coverslip (Dag 8)
- Belegge hver brønn av en 50-brønns kammer dekkglass med 10 ul av PLL / Laminin beleggløsning i 2 timer ved 37 ° C.
MERK: Forbered belegg løsning som beskrevet itrinn 3.1. - Fremstille 3 x 50 ml koniske sentrifugerør som inneholdt 30 ml PBS hver. Ved hjelp av steril tang, fjerne den belagte 50-brønn kammer dekkglass. Dypp kamret dekk inn i det første rør i PBS, etterfulgt av den andre og deretter det tredje røret i PBS, for å vaske av beleggoppløsningen.
- Aspireres eventuell gjenværende væske fra brønnene i kamret dekkglass.
- Forsiktig pipette alle medium og Neurosfærene fra hver brønn på 96-brønners skål og overføre den til en enkelt 10 cm kultur parabolen.
- Under et mikroskop, plukke en prøve neurosfære bruker en P10 mikropipette utstyrt med en 10 mL pipette tips. Sikre at bare et enkelt neurosfære oppfanges hver gang ved å sette pipette kolonne til 2 ul. Bruk en ny pipettespiss for hver neurosfære.
- Overfør neurosfærene på midten av en brønn av den belagte 50-brønns kammer dekkglass.
- Gjenta trinn 5.5 og 5.6 til hver brønn på Chambered dekk Contamoduler et neurosfære.
MERK: Neurosfærene kan plukkes under et mikroskop plassert i en laminær hette eller på en benkeplate Bøk. - Tilsett 10 mL av NSC differensieringsmedium til hver brønn av kammer, dekkglass. Plasser kamret dekkglass i en 10 cm kulturskål og pipette PBS langs kantene av formen for å forhindre uttørking av NSC differensieringsmedium. Plasser opp til to kamret Dekk i en 10 cm kultur parabolen. Inkuber kamret dekkglass (som inneholdes i 10 cm kulturskål) over natten ved 37 ° C, 5% CO2.
6. Differensiering av Sample Neurosfærer (Dag 9)
- Overfør differensieringsmediet fra bulk dyrkede neurosfærene (fra avsnitt 3) til et 15 ml konisk sentrifugerør. Sørg for at 2-3 ml differensiering medium forblir i kulturen fatet for å hindre overholdt celler løsner. Ved hjelp av en 20 ml steril sprøyte, passerer differensieringsmedium gjennom en 0,2 μm filter for å fjerne eventuelle celler eller rusk.
- Overfør den filtrerte differensieringsmediet tilbake til 10 cm kulturskål inneholdende det adherte celler.
- Ved å bruke steril pinsett, påfør kamret dekkglass på differensiering medium i en invertert slik måte at prøve neurosfærene vender nedover. Inkuber kamret dekkglass med differensiering medium i 3 dager ved 37 ° C, 5% CO2.
MERK: Prøve Neurosfærene er i kontakt med differensiering medium, men ikke i kontakt med de unike celler under.
7. Fastsettelse av Differensiert Neurosfærer (dag 12)
- Fjern forsiktig kamret dekkglass fra 10 cm kultur parabolen ved hjelp av steril tang. Forsiktig dyppe dekkglass i PBS for å vaske av kondisjonert medium.
- Skrelle av silikonpakning fra dekkglass. Utfør denne sakte og forsiktig for å unngå å bryte dekkglass. Legg merke til den siden hvor the differensiert Neurosfærene blir overholdt.
- Pipetter 1 ml 4% paraformaldehyd (PFA) på et stykke av parafin film kuttet til størrelsen på dekkglass. Forsiktig plassere dekkglass på parafin film med neurosfærene vender nedover i kontakt med PFA. Fastsette neurosfærene i 20 minutter ved RT.
Forsiktig: PFA er giftig både i flytende og dampform og er brennbart. Unngå innånding av damp og kontakt med hud og øyne. Alltid håndtere PFA i et ventilert avtrekkshette. - Pipetter 1 ml PBS på et stykke parafin film. Vask neurosfærene ved forsiktig å plassere dekkglass med neurosfærene vender nedover i kontakt med PBS i 10 minutter ved romtemperatur.
- Gjenta trinn 7.4 to ganger til.
8. O4 Farging av Differensiert Neurosfærer (dag 12)
- Fremstille 3% bovint serumalbumin (BSA) i PBS. Pipetter 1 ml av 3% BSA på et stykke parafin film. Blokker neurosfærene ved forsiktig placing dekkglass (med neurosfærene vendt nedover) i kontakt med BSA i 30 minutter ved RT.
- Pipetter 1 ml av mus anti-O4-IgM-antistoff (1: 300 fortynning i 3% BSA) på et stykke parafin film og plassere dekkglass på parafin film med neurosfærene vender nedover i kontakt med antistoffet. Tillat O4 farging å skje i 2 timer ved RT.
- Vask dekk to ganger med PBS som beskrevet i trinn 7.4.
- Pipetter 1 ml av grønt fluorescerende fargestoff-konjugert-anti-mus-IgM-sekundært antistoff (1: 500 fortynning i 3% BSA) på et stykke parafin film og plassere dekkglass på parafin film med neurosfærene vender nedover i kontakt med antistoffet . Permisjon for 1 time ved RT i mørket.
MERK: Utfør farging i mørke omgivelser fra dette trinnet og utover. - Vask dekk to ganger med PBS som beskrevet i trinn 7.4.
9. Tuj1 og Glial Fibrillary Surt Protein (GFAP) Fargingav Differensiert Neurosfærer (dag 12)
- Fremstille permeabilizing oppløsning ved tilsetning av Triton-X-100 (sluttkonsentrasjon: 0,5%) i 3% BSA. Pipetter 1 ml permeabilizing oppløsning på et stykke parafin film. Plasser dekkglass på parafinfilm med neurosfærene vender nedover i kontakt med den permeabilizing løsningen i 20 minutter ved RT.
- Vask dekk to ganger med PBS som beskrevet i trinn 7.4.
- Pipetter 1 ml av mus anti-Tuj1 IgG-2a-antistoff (1: 500 fortynning i 3% BSA) og kanin-anti-GFAP-IgG-antistoff (1: 1000 fortynning i 3% BSA) på et stykke parafin film og sted dekk videre parafin film med neurosfærene vender nedover i kontakt med antistoffene. Tillat Tuj1 og GFAP farging for å forekomme i 2 timer ved RT.
MERK: Begge antistoffer kan fremstilles som en enkelt løsning. - Vask dekk to ganger med PBS som beskrevet i trinn 7.4.
- Pipetter 1 ml rød fluorescerende fargestoffkonjugert-anti-mus-IgG-2a (1: 500 fortynning i 3% BSA) og langt rødt fluorescerende fargestoff-konjugert-anti-kanin-IgG (1: 500 fortynning i 3% BSA) sekundære antistoffer mot en del av parafin film og plass dekkglass på parafin film med neurosfærene vender nedover i kontakt med antistoffene. La i 1 time ved RT.
MERK: Begge antistoffer kan fremstilles som en enkelt løsning. - Vask dekk to ganger med PBS som beskrevet i trinn 7.4.
- Fortynn 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) stamløsning til 300 nM i PBS. Pipetter 1 ml av DAPI på et stykke parafin film og sted dekkglass på parafin film med neurosfærene vender nedover i kontakt med DAPI i 2 min ved RT i kjerner farging.
- Vask dekk en gang med PBS og to ganger med deionisert vann, som beskrevet i trinn 7.4. Monter dekkglass på en glassplate med en egnet monteringsmedium og la tørke O / N på RT.
10. Imaging av Differensiert Neurosfærer (dag 13)
- Bilde Neurosfærene under ett konfokal mikroskop bruker en 40X. Bruk lasere ved 488 nm, 594 nm og 647 nm å oppdage oligodendrocytter, nevroner og astrocytter, henholdsvis.
- Bestem prosentandel av unipotent, bipotent og tripotent neurosfærer.
MERK: Potens bestemmes ved evnen av neurosfærene til å differensiere til de tre linjene neural - oligodendrocytter, astrocytter og neuroner 5,14,15,26. Oligodendrocytter identifiseres med positiv farging for O4 (§ 8). Nerveceller er identifisert med positiv farging for Tuj1 (kapittel 9). Astrocytter er identifisert med positiv farging for GFAP (kapittel 9). En unipotent neurosfære skiller til kun en av avstamning og bør positivt beis for enten O4, GFAP eller Tuj1. En bipotent neurosfære skiller i alle to linjer og bør positivt beis for O4 og GFAP eller O4 og Tuj1 eller GFAP og Tuj1. En tripotent neurosfære annerledesIates inn alle tre linjene og bør positivt beis for O4, GFAP og Tuj1. - Bestem NSC frekvens i befolkningen av interesse ved hjelp av følgende formel:
NSC frekvens = (NFU x% av tripotent neurosfærer) / 100%.
Representative Results
Vi har brukt denne protokollen til å vurdere muligheten av lex, en kjent celleoverflaten NSC markør 7, for å berike for NSCs. Data fra denne studien vil bli benyttet til å illustrere hvordan NSCs er nummerert ved hjelp av de klonale forsøk i protokollen. E14.5 muse neurosfærer cellene ble inkubert med anti-Lex antistoff. Deretter celler som uttrykker Lex (lex +) og celler som uttrykker ikke lex (lex -) ble sådd ut på 50 celler / ml ved fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) og venstre for å generere klonale neurosfærer i 1 wk. Time-lapse avbildning viser at Neurosfærene generert på 50 celler / ml er klonale (figur 2). NFU for lex + og Lex - celler ble bestemt. Det er vist at Lex + celler har en betydelig høyere neurosfære formasjon evne i forhold til lex - celler (Figur 3g). Neurosfærene genererte ble så differensierti henhold klonale betingelser, deretter immunostained og avbildes (figur 3a-e). Lex + celler genererer betydelig mer tripotent Neurosfærene enn Lex - celler (Figur 3f). NSC frekvensen ble deretter beregnet på grunnlag av NFU og% av tripotent neurosfærer (Figur 3g). Utvalg basert på LEX, beriker NSC frekvens av mer enn 14 ganger, validere lex som NSC markør. Vi har også bestemt NSC hyppigheten av E14.5 mus neurosfærer ved hjelp av denne protokollen 27 og NCFCA 28. Begge metodene rapporterer sammenlign NSC frekvens på omkring 2% i E14.5 muse neurosfærer.
Figur 1. Protokoll for neurosfære Differensiering etter Klonale betingelser. Eksempel Neurosfærene dyrket under klonale forholdene er individuelt plassert i hver PLL / Laminin-coated godt av en 50-brønn kammer dekkglass, og lov til å følge O / N. På samme dag, er bulk kultivert Neurosfærene belagt i differensiering medium i en PLL / Laminin-belagt 10 cm tallerken, og lov til å følge O / N. Neste dag, kondisjonert medium fra bulk dyrkede Neurosfærene blir filtrert og plassert tilbake i 10 cm tallerken. Prøve Neurosfærene blir så snudd på kondisjonerte mediet og lov til å skille for 3-4 dager 28. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Vekst av et Klonal neurosfære. Celler avledet fra E14.5 neurosfærer ble dissosiert og sådd ut ved 50 celler / ml i 96-brønners skål. Individuelle celler ble sporet for 6 d av time-lapse imaging. Bilder av one slik celle vokser inn i en neurosfære er vist. Merk at neurosfærer opprett klonalitet. (A) 0 dager; (B) 1.19.45; (C) 2.95.37; (D) 3.32.76; (E) 4.46.53; (F) 5.61.44; der det første tallet viser til dag, viser andre tall til brøkdel av dagen, og tredje sifferet gjelder brøkdel av de h. 10X forstørrelse. Scale bar, 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Differensiering av Klonal Neurosfærer og telling av NSC Frequency. Enkelt Neurosfærene ble plukket og differensiert i 50-brønn kamret dekk for 3 d. En representant bilde av en tripotent neurosfære stastilt med (a) DAPI og immunofarget for (b) GFAP, (c) Tuj1 og (d) O4. (E) Viser overlapping av (a) - (d). Scale bar, 65 mikrometer. (F)% av unipotent, bipotent og tripotent neurosfærer som genereres av lex + og Lex - celler (gjennomsnitt ± SEM; n = 3). (G) NSC frekvens i lex + og lex -. Celler beregnet som produktet av NFU og% av tripotent neurosfærer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Vi beskriver hee opptellingen av NSCs henhold klonale forhold. Kritiske trinn omfatter bruk av frisk NSC vekst og differensiering medium, og også anvendelse av nyfremstilt PLL / Laminin løsning for å belegge dekkglass kamret, samt kulturskåler. Dette sikrer optimal vekst og differensieringsbetingelser neurosfærene. Bruken av god kvalitet antistoffer for effektivt å detektere neuroner og glia, så vel som den selektive plukking av klonale neurosfærer som ikke er i kontakt med andre neurosfærer, er kritiske. Videre er det viktig å sikre at de plukkede neurosfærene ikke tørker opp. Det anbefales å legge til 10 ul av differensieringsmedium til hver brønn etter plukking hver 10 neurosfærer. Det er viktig å bruke en kamret dekk i en 10 cm tallerken per prøve å unngå krysstale mellom Neurosfærene fra ulike prøver. Hvis to Dekkglass (hver inneholdende neurosfærer fra forskjellige prøver) er plassert isamme 10 cm tallerken, kanskje neurosfærer fra en dekk slipper faktorer som kan endre tilbøyelighet neurosfærer i den andre dekkglass for å skille ut spesifikke linjene. To Dekk i det samme 10 cm plate, kan også resultere i blanding mellom prøvene.
I tilfelle NFU eller NSC frekvensen er lavere enn forventet, at lav passasje antall neurosfærer brukes. Det er også viktig at friske lave passerings neurosfærer blir brukt for å generere kondisjonert medium. Deretter hvis neurosfærene blir dyrket i brønner med liten diameter, så som i 96-brønners skål, så vil det være vanskelig å manøvrere og plukke neurosfærer ved hjelp av en mikropipette. I dette tilfelle overfører neurosfærene til et større kulturskål, slik som en 6-brønners skål, før plukking. Noen av de plukket neurosfærer kan løfte av fra Chambered dekkglass under kultur og farging. Minimalisering av bevegelsen av kammer, dekkglass under kultur, og mindre intensiv vasking under farging, vil bidra til å unngå avløsning av neurosfærer.
Innledende studier kvantifisert NSCs med bare NFA 7,11,13. Men overvurderer NFA NSC frekvens som både NSCs og tidlig NPs generere neurosfærer 5. Louis et al., Utviklet en annen metode for å kvantifisere NSCs kjent som NCFCA 21,22. Den NCFCA involverer dyrkning av enkeltceller i et kollagenbasert matrise for å sikre klonalitet, og det ble vist at neurosfærer over 2 mm i diameter blir dannet av bare NSC. Ligner på NCFCA er klonalitet sikres gjennom denne protokollen. Dette oppnås ved å generere neurosfærer ved klonal tetthet og differensierende neurosfærene i kamret dekkglass. Bruken av kamret Dekk confers en rekke fordeler. Den kamret dekk gjør hver prøve neurosfære å skille uten å ha fysisk kontakt med andre prøve neurosfærer, og dermed sikre klonalitet under differensiering.Den kamret dekkglass kan plasseres opphengt på differensieringen medium for å tillate prøven neurosfærene å være kontinuerlig kondisjonering og for å sikre maksimal differensiering. I fravær av kondisjonert medium og serum i løpet av differensiering, overlevelse av neurosfærene avtar og neurosfærene for det meste generere astrocytter (Tham M og Ahmed S, upublisert). I tillegg kan De immun neurosfærene hensiktsmessig lagres over lengre tid, og kamret Dekkglass kan monteres direkte på mikroskopobjektglass. I tillegg er avbildning av De immun neurosfærer gjort enkelt som man raskt kan finne neurosfærer i den lille kammer godt, ta et bilde, og gå videre til neste brønn.
Vi har bestemt NSC frekvensen i E14.5 mus neurosfære kultur med både protokoll beskrevet i dette manuskriptet 27 og NCFCA 28. NSC frekvens i E14.5 mus Neurosfærene bestemmes av både megthods er sammenlignbare. Den NCFCA nummerer NSCs som er multipotent og har langsiktig selvfornyelse kapasitet. Siden NSC frekvens fra vår fremgangsmåte er sammenlignbar med den fra NCFCA, gjør avlesning fra vår protokollen ikke ut til å overvurdere NSC frekvens. Den NCFCA krever tre uker å bli fullført, og innebærer i hovedsak celle plating og mellomfylling. Protokollen er beskrevet her krever 13 dager å utføre, og innebærer en annen rekke tiltak, for eksempel, neurosfære plukking og farging. Denne protokollen kan tjene som en alternativ metode for å nummerere NSCs. Forskere kan bruke både NCFCA og denne protokollen for å bekrefte NSC frekvens i sine prøver.
En begrensning av denne protokollen er at en rekke viktige tiltak må alle utført på dag 8. utarbeidelse av kondisjonert medium, fastsettelse av NFU av utvalgs neurosfærer, og overføring av utvalgs neurosfærer til 50-brønn kammer, dekkglass må være utført på day 8. Man kan ta tid å fullføre disse trinnene. I tillegg krever det praksis å utføre fremgangsmåten på en effektiv måte.
Neurosfærer har blitt mye brukt til å studere NSC funksjon og adferd. Men neurosfærer bestå av både NSCs og NPs. Derfor er det viktig å anrike NSCs fra neurosfærene å studere NSC biologi. Foreløpig har celleoverflatemarkører, fargestoff utelukkelse eiendom samt cellestørrelse og detaljnivå blitt brukt til å berike for NSCs 6,7,9-13,29,30. Denne protokollen kan brukes til å kvantifisere anriking av NSCs av potensielle NSC markører, og for å lette søket etter en definitiv NSC markør. Fire nyere studier har brukt denne protokollen til å nummerere NSC frekvens 5,14,15,26.
Acknowledgments
Vi takker Direktoratet for Science, Technology and Research (A * STAR), Singapore for å finansiere denne forskningen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical centrifuge tubes | BD | 352096 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | BD | 352070 | |
| 20 mL sterile syringe | BD | 300141 | |
| 50 mL sterile syringe | BD | 300144 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S1810 | |
| Mouse anti-Tuj1 IgG2a antibody | Covance | MMS-435P-100 | |
| Rabbit anti-GFAP IgG antibody | Dako | Z033401 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Microscope fitted to laminar flow hood | Leica | MZ6 | |
| Glass slides | Marienfeld-superior | 1000200 | |
| Mouse anti-O4 IgM antibody | Merck Millipore | MAB345 | |
| Hydromount | National Diagnostics | HS-106 | |
| Microscope | Nikon Eclipse | TS100-F | |
| Laminar flow hood | NuAire | NU-543 | |
| 96-well culture dishes | NUNC | 167008 | |
| 10-cm culture dishes | NUNC | 150350 | |
| Paraffin film | Parafilm | PM999 | |
| Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant human basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| 0.2 µm filter | Sartorius Stedim | 16534-K | |
| 0.45 µm filter | Sartorius Stedim | 16555-K | |
| 1.0 N Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| 1.0 N Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Poly-L-Lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Paraformaldehyde (PFA) powder | Sigma-Aldrich | P6148 | Toxic |
| Bovine Serum Albumin (BSA) powder | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| 50-well chambered coverslips | Sigma-Aldrich | C7735 | |
| Stir plate with heat function | Stuart | UC152 | |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320-033 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017-015 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody | Thermo Fisher Scientific | A21042 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG2a antibody | Thermo Fisher Scientific | A21135 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG antibody | Thermo Fisher Scientific | A31573 | |
| 4’,6’-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
| Cell-culture centrifuge | Thermo Fisher Scientific | RT1 75002383 | |
| Pasteur pipettes | Thermo Fisher Scientific | 10006021 | |
| CO2 incubator | |||
| Ventilated fume-hood | |||
| Aspirator | |||
| Confocal microscope | |||
| Micropipettes | |||
| Micropipette tips | |||
| Plastic pipettes | |||
| Multichannel pipettes | |||
| Glass beaker | |||
| Sterile forceps | |||
| pH meter |
References
- Ahmed, S. The culture of neural stem cells. J. Cell. Biochem. 106 (1), 1-6 (2009).
- Reynolds, B. A., Tetzlaff, W., Weiss, S. A multipotent EGF-responsive striatal embryonic progenitor cell produces neurons and astrocytes. J. Neurosci. 12 (11), 4565-4574 (1992).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and Population Analyses Demonstrate That an EGF-Responsive Mammalian Embryonic CNS Precursor Is a Stem Cell. Dev. Biol. 175 (1), 1-13 (1996).
- Narayanan, G., et al. Single-Cell mRNA Profiling Identifies Progenitor Subclasses in Neurospheres. Stem Cells and Dev. 21 (18), 3351-3362 (2012).
- Uchida, N., et al. Direct isolation of human central nervous system stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (26), 14720-14725 (2000).
- Capela, A., Temple, S. LeX/ssea-1 Is Expressed by Adult Mouse CNS Stem Cells, Identifying Them as Nonependymal. Neuron. 35 (5), 865-875 (2002).
- Capela, A., Temple, S. LeX is expressed by principle progenitor cells in the embryonic nervous system, is secreted into their environment and binds Wnt-1. Dev. Biol. 291 (2), 300-313 (2006).
- Corti, S., et al. Isolation and characterization of murine neural stem/progenitor cells based on Prominin-1 expression. Exp. Neurol. 205 (2), 547-562 (2007).
- Nagato, M., et al. Prospective characterization of neural stem cells by flow cytometry analysis using a combination of surface markers. J. Neurosci. Res. 80 (4), 456-466 (2005).
- Kim, M., Morshead, C. M. Distinct Populations of Forebrain Neural Stem and Progenitor Cells Can Be Isolated Using Side-Population Analysis. J. Neurosci. 23 (33), 10703-10709 (2003).
- Murayama, A., Matsuzaki, Y., Kawaguchi, A., Shimazaki, T., Okano, H. Flow cytometric analysis of neural stem cells in the developing and adult mouse brain. J. Neurosci. Res. 69 (6), 837-847 (2002).
- Rietze, R. L., Valcanis, H., Brooker, G. F., Thomas, T., Voss, A. K., Bartlett, P. F. Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain. Nature. 412 (6848), 736-739 (2001).
- Tham, M., et al. CSPG Is a Secreted Factor that Stimulates Neural Stem Cell Survival Possibly by Enhanced EGFR Signaling. PLoS ONE. 5 (12), e15341 (2010).
- Gan, H. T., Tham, M., Hariharan, S., Ramasamy, S., Yu, Y. H., Ahmed, S. Identification of ApoE as an autocrine/paracrine factor that stimulates neural stem cell survival via MAPK/ERK signaling pathway. J. Neurochem. 117 (3), 565-578 (2011).
- Ramasamy, S., Narayanan, G., Sankaran, S., Yu, Y. H., Ahmed, S. Neural stem cell survival factors. Arch. Biochem. Biophys. 534 (1-2), 71-87 (2013).
- Ahmed, S., et al. Transcription factors and neural stem cell self-renewal, growth and differentiation. Cell Adh. Migr. 3 (4), 1-12 (2009).
- Gritti, A., et al. Multipotent Neural Stem Cells Reside into the Rostral Extension and Olfactory Bulb of Adult Rodents. J. Neurosci. 22 (2), 437-445 (2002).
- Gritti, A., et al. Epidermal and Fibroblast Growth Factors Behave as Mitogenic Regulators for a Single Multipotent Stem Cell-Like Population from the Subventricular Region of the Adult Mouse Forebrain. J. Neurosci. 19 (9), 3287-3297 (1999).
- Vescovi, A. L., et al. Isolation and cloning of multipotential stem cells from the embryonic human CNS and establishment of transplantable human neural stem cell lines by epigenetic stimulation. Exp. Neurol. 156 (1), 71-83 (1999).
- Azari, H., Louis, S. A., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (49), e2639 (2011).
- Louis, S. A., et al. Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony-Forming Cell Assay. Stem Cells. 26 (4), 988-996 (2008).
- Coles-Takabe, B. L., et al. Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).
- Mori, H., Fujitani, T., Kanemura, Y., Kino-Oka, M., Taya, M. Observational examination of aggregation and migration during early phase of neurosphere culture of mouse neural stem cells. J. Biosci. Bioeng. 104 (3), 231-234 (2007).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat. Methods. 3 (10), 801-806 (2006).
- Yu, Y. H., et al. Purification, Visualization, and Molecular Signature of Neural Stem Cells. Stem Cells and Dev. 25 (2), 189-201 (2016).
- Yu, Y. H. C1qR1 is comparable with LeX and Prom1 as a neural stem cell marker. Identification of mouse embryonic neural stem cell surface markers. , Chapter 3.5, Figure 3.17 (2012).
- Tham, M. Neural colony-forming cell assay. A role for chondroitin sulfate proteoglycan in regulating the survival and growth of neural stem cells. , Chapter 3.6.3, Figure 3.22A (2009).
- Yuan, S. H., et al. Cell-Surface Marker Signatures for the Isolation of Neural Stem Cells, Glia and Neurons Derived from Human Pluripotent Stem Cells. PLoS ONE. 6 (3), e17540 (2011).
- Hall, P. E., Lathia, J. D., Miller, N. G. A., Caldwell, M. A., Ffrench-Constant, C. Integrins Are Markers of Human Neural Stem Cells. Stem Cells. 24 (9), 2078-2084 (2006).
