Summary
Neurale stamcellen (NSC) verwijzen naar cellen die kunnen zichzelf vernieuwen en differentiëren in de drie neurale geslachten. We beschrijven hier een protocol NSC frequentie te bepalen in een bepaalde celpopulatie via neurosfeer vorming en differentiatie onder klonale omstandigheden.
Abstract
Neurale stamcellen (NSC) hebben de mogelijkheid om zichzelf te vernieuwen en het genereren van de drie grote neurale lineages - astrocyten, neuronen en oligodendrocyten. NSCs en neurale voorlopercellen (NP) zijn vaak gekweekt in vitro als neurospheres. Dit protocol beschrijft in detail hoe de NSC frequentie in een bepaalde cel populatie onder klonale voorwaarden vast te stellen. Het protocol begint met het zaaien van de cellen bij een dichtheid die het mogelijk maakt voor de productie van klonale neurosferen. De neurosferen worden vervolgens overgebracht naar chambered dekglaasjes en gedifferentieerde onder klonale omstandigheden in geconditioneerd medium dat de differentiatie potentieel van de neurosferen maximaliseert. Tenslotte wordt de NSC frequentie berekend op basis van neurosfeer vorming en multipotent mogelijkheden. Nut van deze protocollen zijn evaluatie van kandidaat NSC markers zuivering van NSCs, en het vermogen om NSCs onderscheiden van NP. Deze methode duurt 13 dagen om te presteren, dat is veel sHorter dan de huidige methoden om NSC frequentie te sommen.
Introduction
Neurale stamcellen (NSC's) zijn cellen van het centrale zenuwstelsel (CNS) die hernieuwen en zijn multipotente. NSC eerst gespecificeerd tijdens de ontwikkeling van de embryonale voorhersenen en blijven bestaan in de volwassen hersenen op specifieke gebieden zoals subventriculaire zone (SVZ) van de laterale ventrikels en de dentate gyrus (DG) van de hippocampus. Een aantal NSC lijnen worden gebruikt in klinische studies voor de behandeling van beroerte en andere neurologische aandoeningen zoals de ziekte van Batten 1.
NSCs en neurale voorlopercellen (NP) worden gekweekt in cultuur als drijvende 3-dimensionale structuren sferoïde genoemd neurospheres. Het neurosfeercultuur systeem is ontwikkeld door Reynolds en Weiss in de vroege jaren 1990, toen ze dat embryonale en volwassen corticale cellen in de aanwezigheid van epidermale groeifactor (EGF) en basische fibroblast groeifactor (bFGF) 2-4 kan verdelen. Neurosferen bestaan uit een heterogeen mengsel van cells bestaande uit subklassen in verschillende ontwikkelingsstadia 5. Het een uitdaging om specifiek bestuderen NSCs gebruikt gegevens uit neurospheres door de aanwezigheid van NP. Daarom is het van cruciaal belang om NSCs verrijken van neurospheres. Momenteel zijn vier belangrijkste methoden gebruikt om te verrijken voor NSCs in vitro. Eerst is het gebruik van celoppervlak markers. Lewis-X (LEX) en CD133 (ook bekend als Prominin1) zijn de voornaamste celoppervlak markers NSC 6-9. Syndecan-1, Notch-1 en integrine-beta1 andere oppervlakte-eiwitten die verrijken NSCs 10. Ten tweede is de kleurstof uitsluiting. Aangetoond is dat de zij-populatie cellen, die het unieke vermogen te pompen uit de fluorescerende DNA-bindende kleurstof Hoechst 33342 hebben, worden verrijkt NSC 11. Ten derde is het gebruik van morfologische selectie. Er is aangetoond dat cellen met toegenomen grootte en granulariteit cel haven NSC meer dan hun tegenhangers 5,12,13. Ten vierde is de toevoeging van NSC survival factoren aan het kweekmedium. Het is aangetoond dat toevoeging van chondroïtinesulfaat proteoglycanen en apolipoproteïne E verbetert NSC overleving vergroot dan ook NSC frequentie 14,15. Hoewel veel markers waaronder transcriptiefactoren zijn geassocieerd met NSC 16,17, geen van deze markers kunnen NSC verrijken zuiverheid. Vanwege het ontbreken van definitieve NSC markers, blijft het een uitdaging om NSCs kwantificeren en ze onderscheiden van NP in vitro.
Initial studies gebruikten de neurosphere formatie assay (NFA) te kwantificeren NSCs 7,11,13. In deze assay, gedissocieerde cellen worden gekweekt om neurosferen vormen en het aantal neurosferen gegenereerd voor elke 100 cellen uitgeplaat bepaald. Deze waarde wordt genoemd als de Neurosfeer Formation Unit (NFU). De NFU is gelijk aan de NSC frequentie als alle neurospheres voortvloeien uit NSC. Er werd aangetoond dat de NFU overschat de NSC frequentie als neurosferen worden gevormd door zowel NSCs en vroege NP 5. Derhalve is het onjuist te noemen NSC uitsluitend gebaseerd op neurosphere formatie. Het zou mogelijk te kwantificeren NSCs op basis van hun vermogen om zichzelf te vernieuwen, verspreiden op grote schaal en het genereren van multipotente neurospheres.
NSC, dat EGF en bFGF responsief zijn, meestal overleven gedurende ten minste tien passages en dus uitgebreide zelfvernieuwingscapaciteit in cultuur 4,18-20 weer te geven. NPs, welke EGF en bFGF responsief zijn en kan ook neurosferen enkele passages maar niet voor langere tijd realiseren. Derhalve is het algemeen aanvaard dat bonafide NSCs kunnen worden geteld met eerlijke nauwkeurigheid gebaseerd op neurosphere vorming gedurende ten minste tien passages. In de meeste studies echter zelfvernieuwing wordt gewoonlijk gemeten op basis van secundaire of tertiaire vorming neurosfeer vanwege de lange tijd die nodig experimentele tien passages. Derhalve kan de secundaire NFA worden gebruikt om breed vergelijken zelfvernieuwing capaciteit between populaties, maar kan niet worden gebruikt om nauwkeurig te sommen NSC frequentie.
NSC's hebben een grotere proliferatieve vermogen vergeleken NP. Deze eigenschap van NSC werd gebruikt door Louis et al. de neurale kolonievormende cel assay (NCFCA) 21,22 - met een test voor NSC opsomming te ontwikkelen. In deze assay, enkele cellen worden gedurende 3 weken in een collageenbevattende halfvaste matrix. Onder deze kweekomstandigheden werd aangetoond dat cellen die neurosferen boven 2 mm diameter kunnen vormen tripotent en kunnen hernieuwen voor lange termijn. Deze cellen worden gedefinieerd als NSC. Daarom worden de NSCs daadwerkelijk onderscheiden NP.
NSC's hebben de mogelijkheid om te differentiëren tot astrocyten, oligodendrocyten en neuronen. Voor differentiatie van neurosferen worden groeifactoren verwijderd en serum toegevoegd aan het kweekmedium. Als alle drie neurale geslachten waargenomen in een neurosfeer, dan is de cel die dat neurosfeer geïnitieerd is een NSC. De differentiatie test een aantal beperkingen. Ten eerste kunnen de kweekomstandigheden voor differentiatie niet optimaal voor het genereren van drie neurale geslachten zijn. In feite, in een enkele neurosfeer differentiatieproces significante celdood optreedt en meestal astrocyt wordt gegenereerd (Tham M en S Ahmed, ongepubliceerd). Ten tweede is er de kwestie clonaliteit. Voor nauwkeurige telling van NSCs vorming en differentiatie van neurosferen moet uitgevoerd onder klonale omstandigheden, waarbij elke neurosfeer ontstaat uit een enkele cel. In bulk suspensiekweken, aggregatie vindt plaats op zowel cellulaire en neurosphere niveaus 23-25. Daarom is het mogelijk voor elke neurosphere ontstaan uit meerdere cellen of neurosferen, die neurosfeer tellen en evaluatie van multipotent bemoeilijkt. Uit recente gegevens blijkt dat de samenvoeging van de cellen treedt niet op bij lage plating dichtheid van 0,5 cellen / ul of minder, en wanneer de cultuur platen niet tijdens neu worden verplaatstrosphere formatie 15. Zo kweken van cellen bij zulke lage dichtheid zou zorgen clonaliteit.
Momenteel is de NCFCA is de meest gebruikte methode om NSCs onderscheiden van NP en sommen NSC frequentie. De NCFCA vereist echter een relatief lange tijd van drie weken. We beschrijven hier een protocol NSC frequentie opsommen gebaseerd op het vermogen van NSC multipotente neurosferen vormen. Dit protocol duurt slechts 13 dagen uit te voeren. De NCFCA zorgt clonaliteit de collageenmatrix beweging van de neurosferen voorkomt. De kweekomstandigheden die in dit protocol kunnen ook clonaliteit gehele te handhaven. Bijvoorbeeld, het gebruik van 50-well chambered dekglaasjes zodat de neurosferen zal differentiëren zonder contact met elkaar. Verder gebruiken we geconditioneerd medium dat neurotrofe factoren levert bij differentiatie de differentiatie potentieel van de neurosferen (figuur 1) te maximaliseren.
Protocol
De behandeling van de dieren werd uitgevoerd in overeenstemming met de IACUC en NACLAR richtlijnen en goedgekeurd door de afdeling dier ((http://www.brc.astar.edu.sg/index.php?sectionID-11).
OPMERKING: neurosfeerculturen werden bereid uit de voorhersenen van embryonale (E14) C57BL / 6-muizen zoals eerder beschreven 5.
1. Cultuur van klonen Sample Neurosferen (dag 1)
- Bereid NSC groeimedium combineert Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium / Nutrient F-12 (DMEM / F12) medium met B27 supplement (eindconcentratie: 1x), EGF (eindconcentratie: 20 ng / ml), bFGF (eindconcentratie: 10 ng / ml) en penicilline / streptomycine (uiteindelijke concentratie: 1x).
- Distantiëren E14.5 muis neurosferen in 1 ml NSC groeimedium en 1 ml 0,05 N natriumhydroxide gedurende 7 min bij RT. Pipetteer de cellen op en neer af aan cellen in suspensie te houden. Voeg 1 ml 0,05 N zoutzuur tot neutraalize de alkali.
OPMERKING: Neurosfeer cellen worden geënt bij 20.000 cellen / ml in een 10 cm kweekschaal en worden gedurende 5 dagen bij 37 ° C, 5% CO2. De verwachte opbrengst na ongeveer 10 miljoen cellen per 10 cm schotel. Deze cellen worden vervolgens gedissocieerd en geënt bij klonale dichtheid zoals beschreven in stap 1,2 en 1,3, respectievelijk.- Voer celgetal met behulp van trypan Blue kleuring en een hemocytometer.
- Zaad één E14.5 muis neurosfeercellen bij een dichtheid van 50 cellen / ml of lager in 100 ul NSC groeimedium in een 96-putjes. Incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 1 w klonale neurosferen te genereren.
OPMERKING: klonaliteit verzekerd tijdens neurosphere formatie bij deze dichtheid als de cellen niet met elkaar in contact.
2. Cultuur van Neurosferen voor geconditioneerd Medium (dag 3)
- Distantiëren E14.5 muis neurosferen zoals beschreven in stap 1.2.
- Zaad enkele cellen van E14,5 muis neurosferen met een dichtheid van 20.000 cellen / ml in een 10 ml NSC groeimedium in een 10 cm kweekschaal. Incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 5 d bulk gekweekte neurosferen te genereren.
3. Voorbereiding van Neurosfeer Geconditioneerd Medium (Dag 8)
- Bereid bekledingsoplossing door het mengen van 700 ui 0,01% poly-L-lysine (PLL), 70 ui 1 mg / ml laminine en 6230 ui fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Coat een 10 cm kweekschaal met 7 ml PLL / laminine oplossing gedurende 2 uur bij 37 ° C.
- Met behulp van een 10 ml serologische pipet alle bulk gekweekte neurosferen een 15 ml conische centrifugebuis. Centrifugeer de neurosferen bij 171 xg gedurende 1 min bij kamertemperatuur en volledig verwijderen van het supernatant.
- Bereid NSC differentiatie medium door het combineren van DMEM / F12 medium met B27 (uiteindelijke concentratie: 1x) en Fetal Bovine Serum (FBS) (uiteindelijke concentratie: 0,5%) Add 10 ml van NSC differentiatie medium tot neurospheres. Pipet op en neer een paar keer om de neurospheres mengen.
- Aspireren PLL / Laminine van 10 cm kweekschaal en eenmaal wassen met 10 ml PBS. Transfer alle neurosferen de PLL / laminine beklede 10 cm kweekschaal. Incubeer O / N bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende de neurosferen te houden aan de schotel.
4. Vaststelling van de NFU van Sample Neurosferen (Dag 8)
- Tel het aantal neurosferen (gezaaid op dag 1, punt 1), gevormd in elk putje onder een microscoop.
OPMERKING: Bepaal het aantal neurosferen gevormd per 100 cellen uitgeplaat, waarbij de NFU geeft.
5. Overdracht van Sample Neurosferen tot 50-well Chambered Coverslip (Dag 8)
- Coat elk putje van een 50 putjes chambered dekglaasje met 10 pi van PLL / laminine bekledingsoplossing gedurende 2 uur bij 37 ° C.
OPMERKING: Bereid bekledingsoplossing zoals is beschreven instap 3.1. - Bereid 3 x 50 ml conische centrifugebuizen met 30 ml PBS per. Met behulp van een steriel pincet, verwijder de gecoate 50-well chambered dekglaasje. Dompel de chambered dekglaasje in de eerste buis PBS, gevolgd door de tweede en de derde buis PBS, de bekledingsoplossing af te wassen.
- Aspireren resterende vloeistof uit de putjes van de chambered dekglaasje.
- Voorzichtig pipet alle medium en neurosferen uit elk putje van de 96-putjes en overgebracht naar een 10 cm kweekschaal.
- Onder een microscoop, kies een monster neurosphere met behulp van een micropipet P10 uitgerust met een 10 pi pipet tip. Dat slechts enkele neurosfeer telkens wordt opgevangen door de pipet kolom 2 pl. Gebruik een nieuwe pipet tip voor elke neurosphere.
- Breng de neurosfeer op het midden van een putje van de beklede 50 putjes chambered dekglaasje.
- Herhaal stap 5.5 en 5.6 tot en met elk putje van de chambered dekglaasje Contains een neurosphere.
LET OP: De neurosferen kan onder een microscoop geplaatst in een laminaire stroming kap of op een benchtop worden geplukt. - Voeg 10 ul van NSC differentiatie medium aan elk putje van de chambered dekglaasje. Plaats de chambered dekglaasje in een 10 cm kweekschaal en pipet PBS langs de randen van de schaal om uitdroging van de NSC differentiatiemedium voorkomen. Plaats maximaal twee chambered dekglaasjes in een 10 cm cultuur schotel. Incubeer de chambered dekglaasje (in de 10 cm kweekschaal) overnacht bij 37 ° C, 5% CO2.
6. Differentiatie van Sample Neurosferen (Dag 9)
- Breng de differentiatie medium uit de totale gekweekte neurosferen (uit paragraaf 3) om een 15 ml conische centrifugebuis. Zorg ervoor dat de 2-3 ml van differentiatie medium blijft in de cultuur schotel om te voorkomen dat gehandeld cellen uit los. Met behulp van een 20 ml steriele spuit, passeren de differentiatie medium door een 0,2 μm filter om alle cellen en vuil te verwijderen.
- Breng de gefilterde differentiatie medium terug naar de 10 cm cultuur schotel met de aangehechte cellen.
- Met behulp van een steriel pincet, plaats voorzichtig het chambered dekglaasje op de differentiatie medium in een omgekeerde, zodanig dat het monster neurospheres naar beneden worden geconfronteerd. Incubeer de chambered dekglaasje met differentiatiemedium voor 3 dagen bij 37 ° C, 5% CO2.
Opmerking: Het monster neurosferen in contact met het differentiatiemedium maar niet in contact met de differentiërende cellen eronder.
7. Vaststelling van gedifferentieerde Neurosferen (Dag 12)
- Verwijder de chambered dekglaasje uit de 10 cm cultuur schotel met behulp van een steriel pincet. Voorzichtig Dompel de dekglaasje in PBS te wassen het geconditioneerd medium.
- Trek het silicone pakking van het dekglaasje. Voer deze voorzichtig en langzaam om te voorkomen dat het breken van het dekglaasje. Kennis te nemen van de kant waar the gedifferentieerde neurospheres worden nageleefd.
- Pipetteer 1 ml 4% paraformaldehyde (PFA) op een stuk paraffine film gesneden om de grootte van het dekglaasje. Plaats voorzichtig de dekglaasje op paraffine film met de neurosferen naar beneden in contact met het PFA. Bevestig de neurosferen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
Let op: PFA is giftig, zowel in vloeibare en dampvorm en is brandbaar. Vermijd inademing van dampen en contact met de huid en ogen. handvat PFA altijd in een goed geventileerde zuurkast. - Pipetteer 1 ml PBS op een stuk film paraffine. Was de neurosferen Hiertoe plaatst het dekglaasje met de neurosferen naar beneden in contact met PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Herhaal stap 7.4 nog twee keer.
8. O4 kleuring van gedifferentieerde Neurosferen (Dag 12)
- Bereid 3% runderserumalbumine (BSA) in PBS. Pipetteer 1 ml van de 3% BSA op een stuk film paraffine. Blokkeer de neurospheres door voorzichtig PlacinG het dekglaasje (de neurosferen naar beneden) in contact met de BSA gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Pipetteer 1 ml muizen anti-O4 IgM antilichaam (1: 300 verdunning in 3% BSA) op een stuk film paraffine en plaats het dekglaasje op paraffine film met de neurosferen naar beneden in contact met het antilichaam. Sta O4 kleuring optreedt gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
- Was het dekglaasje tweemaal met PBS zoals in stap 7,4.
- Pipetteer 1 ml groene fluorescente kleurstof geconjugeerd anti-muis IgM secundair antilichaam (1: 500 verdunning in 3% BSA) op een stuk paraffine film en plaats het dekglaasje op paraffine film met de neurosferen naar beneden in contact met het antilichaam . Laat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.
OPMERKING: Voer immunokleuring in een donkere omgeving van deze stap verder. - Was het dekglaasje tweemaal met PBS zoals in stap 7,4.
9. Tuj1 en Glial Fibrillaire zuur eiwit (GFAP) kleuringvan gedifferentieerde Neurosferen (Dag 12)
- Bereid permeabilisatie door toevoeging van Triton X-100 (eindconcentratie: 0,5%) aan de 3% BSA. Pipetteer 1 ml van permeabiliserende oplossing op een stuk film paraffine. Plaats dekglaasje op paraffine film met de neurosferen naar beneden in contact met de permeabilisatie oplossing gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Was het dekglaasje tweemaal met PBS zoals in stap 7,4.
- Pipetteer 1 ml muis anti-Tuj1 IgG2a-antilichaam (1: 500 verdunning in 3% BSA) en konijn anti-GFAP IgG antilichaam (1: 1000 verdunning in 3% BSA) op een stuk paraffine film en plaats dekglaasje op paraffine film met de neurosferen naar beneden in contact met de antilichamen. Toestaan Tuj1 en GFAP kleuring optreedt gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Beide antilichamen kunnen worden bereid als een enkele oplossing. - Was het dekglaasje tweemaal met PBS zoals in stap 7,4.
- Pipetteer 1 ml rode fluorescerende kleurstofgeconjugeerde anti-muizen IgG2a (1: 500 verdunning in 3% BSA) en verre rode fluorescerende kleurstof geconjugeerd anti-konijn IgG (1: 500 verdunning in 3% BSA) secundaire antilichamen op een stuk paraffine film en plaats dekglaasje op de paraffine film met de neurosferen naar beneden in contact met de antilichamen. Laat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Beide antilichamen kunnen worden bereid als een enkele oplossing. - Was het dekglaasje tweemaal met PBS zoals in stap 7,4.
- Verdun 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) stockoplossing aan 300 nM in PBS. Pipetteer 1 ml DAPI op een stuk film paraffine en plaats dekglaasje op paraffine film met de neurosferen naar beneden in contact met DAPI gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur kernen kleuring.
- Was het dekglaasje eenmaal met PBS en tweemaal met gedeïoniseerd water zoals beschreven in stap 7.4. Monteer het dekglaasje op een glasplaatje met een geschikt fixeermiddel en laten drogen O / N bij kamertemperatuur.
10. ImaGing van gedifferentieerde Neurosferen (Dag 13)
- Afbeelding neurosferen onder een confocale microscoop met een 40X. Gebruik de lasers bij 488 nm, 594 nm en 647 nm tot oligodendrocyten, neuronen en astrocyten te detecteren, respectievelijk.
- Bepaal het percentage van unipotente, bipotent en tripotent neurospheres.
OPMERKING: Sterkte wordt bepaald door het vermogen van de neurosfeer differentiëren tot drie neurale lineages - oligodendrocyten, astrocyten en neuronen 5,14,15,26. Oligodendrocyten worden geïdentificeerd door positieve kleuring voor O4 (rubriek 8). Neuronen worden geïdentificeerd door positieve kleuring voor Tuj1 (hoofdstuk 9). Astrocyten worden geïdentificeerd door positieve kleuring voor GFAP (hoofdstuk 9). Een unipotente neurosphere differentieert zich in slechts één van de afstamming en moet positief vlek voor zowel O4, GFAP of Tuj1. Een bipotent neurosphere differentieert in twee lijnen en moeten positief vlek voor O4 en GFAP of O4 en Tuj1 of GFAP en Tuj1. Een tripotent neurosphere verschillendeiates in alle drie de lijnen en moeten positief vlek voor O4, GFAP en Tuj1. - Bepaal NSC frequentie in de populatie van belang met behulp van de volgende formule:
NSC frequentie = (NFU x% van tripotent neurospheres) / 100%.
Representative Results
We hebben dit protocol gebruikt om het vermogen van LeX, een bekende celoppervlak marker NSC 7, te verrijken NSC beoordelen. Gegevens uit deze studie worden gemaakt hoe NSC worden opgesomd met de klonale assays in het protocol. E14.5 muis neurosfeercellen werden geïncubeerd met anti-LeX antilichaam. Vervolgens cellen die LeX (LeX +) en cellen die niet tot expressie LeX (LeX -) tot expressie werden geënt bij 50 cellen / ml door Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) en men liet klonale neurosferen te genereren voor 1 week. Time-lapse imaging blijkt dat de gegenereerde neurosferen bij 50 cellen / ml zijn klonale (Figuur 2). De NFU Lex + en LeX - cellen werd bepaald. Er wordt aangetoond dat LeX + cellen een significant hogere neurosfeer vorming vermogen vergeleken met LeX - cellen (Figuur 3g). De neurosferen gegenereerd werden vervolgens gedifferentieerdonder omstandigheden klonale vervolgens immunostained en afgebeeld (Figuur 3a-e). LeX + cellen te genereren aanzienlijk meer tripotent neurospheres dan LeX - cellen (figuur 3f). De NSC frequentie werd vervolgens berekend op basis van de NFU en% van tripotent neurospheres (figuur 3g). Selectie op basis van LeX, verrijkt NSC frequentie van meer dan 14 maal, valideren LeX als NSC marker. We hebben ook bepaald de NSC frequentie van E14.5 muis neurosferen met dit protocol 27 en NCFCA 28. Beide methoden rapporteren vergelijkbaar NSC frequentie van ongeveer 2% in E14.5 muis neurospheres.
Figuur 1. Protocol voor Neurosfeer Differentiatie onder klonen Voorwaarden. Sample neurospheres geteeld onder klonale voorwaarden zijn individueel geplaatst in elk PLL / laminine-coated putje van een 50 putjes chambered dekglaasje en liet hechten O / N. Op dezelfde dag, zijn bulk gekweekt neurospheres uitgezet in differentiatie medium in een PLL / laminine beklede 10 cm schotel, en mag O hechten / N. De volgende dag, geconditioneerde medium van de massa gekweekte neurosferen wordt gefiltreerd en opnieuw in de 10 cm schaaltje gebracht. Het monster neurospheres worden vervolgens omgekeerd op het geconditioneerde medium en mogen differentiëren voor 3-4 dagen 28. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Groei van een klonale Neurosfeer. Cellen verkregen uit E14.5 neurosferen werden gedissocieerd en geënt bij 50 cellen / ml in 96-putjes. Individuele cellen werden bijgehouden voor 6 d door time-lapse imaging. Beelden van one dergelijke cel groeien tot een neurosphere wordt getoond. Merk op dat de neurosphere handhaaft clonaliteit. (A) 0 dagen; (B) 1.19.45; (C) 2.95.37; (D) 3.32.76; (E) 4.46.53; (F) 5.61.44; waarbij het eerste getal verwijst naar de dag, tweede getal staat voor de fractie van de dag, en derde nummer verwijst naar de fractie van de h. 10x vergroting. Schaal bar, 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Differentiatie van klonen Neurosferen en telling van NSC Frequency. Single neurospheres werden opgepikt en gedifferentieerd in 50-well chambered dekglaasje 3 d. Een representatief beeld van een tripotent neurosphere stained met (a) en DAPI immunologisch voor (b) GFAP, (c) Tuj1 en (d) O4. (E) Toont de overlay van (a) - (d). Schaal bar, 65 micrometer. (F) Het% unipotente, bipotent en tripotent neurosferen gegenereerd door LeX + en LeX - cellen (gemiddelde ± SEM, n = 3). (G) NSC frequentie in LeX + en LeX -. Cellen berekend als het product van de NFU en% van tripotent neurospheres Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
We beschrijven hee de opsomming van NSCs onder klonale omstandigheden. Kritische stappen omvatten het gebruik van verse NSC groei en differentiatie medium, en ook het gebruik van vers bereide PLL / laminine oplossing het bekleden van de chambered dekglaasjes, evenals de kweekschalen. Dit zorgt voor optimale groei en differentiatie van neurosferen omstandigheden. Het gebruik van goede kwaliteit antilichamen tegen de neuronen en glia, evenals de selectieve plukken van klonale neurosferen die niet in contact met andere neurosferen effectief detecteren kritisch. Bovendien is het belangrijk te zorgen voor de geplukte neurosferen niet opdrogen. Aanbevolen wordt 10 ul van differentiatiemedium toevoegen aan elk putje na ophalen elke 10 neurosferen. Het is belangrijk om een chambered dekglaasje gebruiken op een 10 cm schaal per monster overspraak tussen neurosferen uit verschillende monsters te vermijden. Als twee dekglaasjes (elk neurosferen uit verschillende monsters) worden in deDezelfde 10 cm schaal, neurosferen uit een dekglaasje zou loslaten factoren die de neiging van neurosferen kunnen veranderen in de andere dekglaasje te differentiëren tot specifieke lijnen. Twee dekglaasjes in dezelfde 10 cm schaal kan ook leiden tot verwarring tussen de monsters.
In het geval dat de NFU en de NSC frequentie is lager dan verwacht, ervoor te zorgen dat de lage passage aantal neurospheres worden gebruikt. Het is ook belangrijk dat gezonde lage passage neurosferen worden gebruikt voor het genereren geconditioneerd medium. Vervolgens, als de neurosferen worden gekweekt in putjes met kleine diameter, zoals in 96-putjes, dan zal het moeilijk te manoeuvreren en kies neurosferen met behulp van een micropipet. In dit geval brengt de neurosferen met een grotere kweekschaal, zoals een 6-putjes voorafgaand aan het plukken. Sommige van de geplukte neurosferen kunnen tillen van de chambered dekglaasje tijdens de cultuur en immunokleuring. Het minimaliseren van de beweging van de chambered dekglaasje tijdens de cultuur en minder intensieve washing tijdens immunokleuring, zou helpen om detachement van neurosferen te voorkomen.
Initial studies gekwantificeerd NSC met alleen de NFA 7,11,13. Echter, de NFA overschat de NSC frequentie als zowel NSCs en vroege NP genereren neurospheres 5. Louis et al. Ontwikkelden een andere methode NSC zogenaamde NCFCA 21,22 kwantificeren. De NCFCA behelst kweken enkele cellen in een collageen gebaseerde matrix klonaliteit waarborgen, en er werd aangetoond dat neurosferen boven 2 mm diameter worden gevormd door enkel NSC. Net als bij de NCFCA wordt clonaliteit verzekerd in dit protocol. Dit wordt bereikt door het genereren van neurosferen bij klonale dichtheid en differentiatie van neurosferen in chambered dekglaasjes. Het gebruik van chambered dekglaasjes geeft een aantal voordelen. De chambered dekglaasje kan elk monster neurosphere om onderscheid te maken, zonder fysiek contact met andere monster neurospheres, waardoor wordt gewaarborgd klonaliteit tijdens differentiatie.De chambered dekglaasje geplaatst kan worden opgehangen aan de differentiatie medium om het monster neurospheres continu te voorzien en om een maximale differentiatie te garanderen. In afwezigheid van geconditioneerd medium en serum tijdens differentiatie, overleving van de neurosferen afneemt en de neurosferen meestal genereren astrocyten (Tham M en S Ahmed, ongepubliceerd). Bovendien kan de immunogekleurde neurosferen geschikt worden opgeslagen gedurende langere tijd en de chambered dekglaasjes kan direct op de microscoop glasplaatjes gemonteerd. Daarnaast is beeldvorming van de immuun-neurosferen gemakkelijk gemaakt als men snel de neurosphere in de kleine goed chambered kunt vinden, afzonderlijke beelden, en ga naar de volgende ook.
We hebben de NSC frequentie in E14.5 muis neurosphere cultuur met behulp van zowel de in dit handschrift 27 en NCFCA 28 beschreven protocol vastgesteld. De NSC frequentie in E14.5 muis neurosferen bepaald door zowel mede werkwijze wordt vergelijkbaar. De NCFCA somt NSC dat multipotente zijn en op lange termijn zelfvernieuwingscapaciteit. Aangezien de NSC frequentie Aanbevolen methode is vergelijkbaar met die van NCFCA gaat de uitlezing van ons protocol lijkt erop dat de NSC frequentie overschatten. De NCFCA vereist drie weken worden afgerond en gaat het vooral om de cel plating en middelgrote aanvulling. De hier beschreven protocol vereist 13 dagen uit te voeren en het gaat om een andere reeks stappen, bijvoorbeeld neurosphere plukken en immunokleuring. Dit protocol zou kunnen dienen als alternatief voor NSC sommen. Onderzoekers kunnen zowel NCFCA en dit protocol te gebruiken om NSC frequentie controleren in hun monsters.
Een beperking van dit protocol is dat een aantal belangrijke stappen staan te worden uitgevoerd op dag 8. De bereiding van het geconditioneerde medium, bepaling van NFU monster neurosferen en overdracht van monster neurosferen de 50-well chambered dekglaasje moeten uitgevoerd op day 8. Men zou de tijd nemen om deze stappen uit te voeren. Bovendien vereist oefening om deze stappen uit te voeren op een efficiënte wijze.
Neurosferen zijn op grote schaal gebruikt om NSC en gedrag te bestuderen. Echter, neurospheres bestaan uit zowel NSCs en NP's. Daarom is het belangrijk om NSCs verrijken van neurospheres NSC studie biologie. Op dit moment hebben celoppervlak markers, kleurstof uitsluiting goederen, alsmede celgrootte en granulariteit gebruikt om te verrijken voor NSC 6,7,9-13,29,30. Dit protocol kan worden gebruikt om de verrijking van NSC kwantificeren NSC potentiële markers, en het zoeken naar een definitieve NSC marker vergemakkelijken. Vier recente studies hebben dit protocol gebruikt om NSC frequentie 5,14,15,26 sommen.
Acknowledgments
We danken het Agentschap voor Wetenschap, Technologie en Onderzoek (A * STAR), Singapore voor de financiering van dit onderzoek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical centrifuge tubes | BD | 352096 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | BD | 352070 | |
| 20 mL sterile syringe | BD | 300141 | |
| 50 mL sterile syringe | BD | 300144 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S1810 | |
| Mouse anti-Tuj1 IgG2a antibody | Covance | MMS-435P-100 | |
| Rabbit anti-GFAP IgG antibody | Dako | Z033401 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Microscope fitted to laminar flow hood | Leica | MZ6 | |
| Glass slides | Marienfeld-superior | 1000200 | |
| Mouse anti-O4 IgM antibody | Merck Millipore | MAB345 | |
| Hydromount | National Diagnostics | HS-106 | |
| Microscope | Nikon Eclipse | TS100-F | |
| Laminar flow hood | NuAire | NU-543 | |
| 96-well culture dishes | NUNC | 167008 | |
| 10-cm culture dishes | NUNC | 150350 | |
| Paraffin film | Parafilm | PM999 | |
| Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant human basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| 0.2 µm filter | Sartorius Stedim | 16534-K | |
| 0.45 µm filter | Sartorius Stedim | 16555-K | |
| 1.0 N Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| 1.0 N Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Poly-L-Lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Paraformaldehyde (PFA) powder | Sigma-Aldrich | P6148 | Toxic |
| Bovine Serum Albumin (BSA) powder | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| 50-well chambered coverslips | Sigma-Aldrich | C7735 | |
| Stir plate with heat function | Stuart | UC152 | |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320-033 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017-015 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody | Thermo Fisher Scientific | A21042 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG2a antibody | Thermo Fisher Scientific | A21135 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG antibody | Thermo Fisher Scientific | A31573 | |
| 4’,6’-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
| Cell-culture centrifuge | Thermo Fisher Scientific | RT1 75002383 | |
| Pasteur pipettes | Thermo Fisher Scientific | 10006021 | |
| CO2 incubator | |||
| Ventilated fume-hood | |||
| Aspirator | |||
| Confocal microscope | |||
| Micropipettes | |||
| Micropipette tips | |||
| Plastic pipettes | |||
| Multichannel pipettes | |||
| Glass beaker | |||
| Sterile forceps | |||
| pH meter |
References
- Ahmed, S. The culture of neural stem cells. J. Cell. Biochem. 106 (1), 1-6 (2009).
- Reynolds, B. A., Tetzlaff, W., Weiss, S. A multipotent EGF-responsive striatal embryonic progenitor cell produces neurons and astrocytes. J. Neurosci. 12 (11), 4565-4574 (1992).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and Population Analyses Demonstrate That an EGF-Responsive Mammalian Embryonic CNS Precursor Is a Stem Cell. Dev. Biol. 175 (1), 1-13 (1996).
- Narayanan, G., et al. Single-Cell mRNA Profiling Identifies Progenitor Subclasses in Neurospheres. Stem Cells and Dev. 21 (18), 3351-3362 (2012).
- Uchida, N., et al. Direct isolation of human central nervous system stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (26), 14720-14725 (2000).
- Capela, A., Temple, S. LeX/ssea-1 Is Expressed by Adult Mouse CNS Stem Cells, Identifying Them as Nonependymal. Neuron. 35 (5), 865-875 (2002).
- Capela, A., Temple, S. LeX is expressed by principle progenitor cells in the embryonic nervous system, is secreted into their environment and binds Wnt-1. Dev. Biol. 291 (2), 300-313 (2006).
- Corti, S., et al. Isolation and characterization of murine neural stem/progenitor cells based on Prominin-1 expression. Exp. Neurol. 205 (2), 547-562 (2007).
- Nagato, M., et al. Prospective characterization of neural stem cells by flow cytometry analysis using a combination of surface markers. J. Neurosci. Res. 80 (4), 456-466 (2005).
- Kim, M., Morshead, C. M. Distinct Populations of Forebrain Neural Stem and Progenitor Cells Can Be Isolated Using Side-Population Analysis. J. Neurosci. 23 (33), 10703-10709 (2003).
- Murayama, A., Matsuzaki, Y., Kawaguchi, A., Shimazaki, T., Okano, H. Flow cytometric analysis of neural stem cells in the developing and adult mouse brain. J. Neurosci. Res. 69 (6), 837-847 (2002).
- Rietze, R. L., Valcanis, H., Brooker, G. F., Thomas, T., Voss, A. K., Bartlett, P. F. Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain. Nature. 412 (6848), 736-739 (2001).
- Tham, M., et al. CSPG Is a Secreted Factor that Stimulates Neural Stem Cell Survival Possibly by Enhanced EGFR Signaling. PLoS ONE. 5 (12), e15341 (2010).
- Gan, H. T., Tham, M., Hariharan, S., Ramasamy, S., Yu, Y. H., Ahmed, S. Identification of ApoE as an autocrine/paracrine factor that stimulates neural stem cell survival via MAPK/ERK signaling pathway. J. Neurochem. 117 (3), 565-578 (2011).
- Ramasamy, S., Narayanan, G., Sankaran, S., Yu, Y. H., Ahmed, S. Neural stem cell survival factors. Arch. Biochem. Biophys. 534 (1-2), 71-87 (2013).
- Ahmed, S., et al. Transcription factors and neural stem cell self-renewal, growth and differentiation. Cell Adh. Migr. 3 (4), 1-12 (2009).
- Gritti, A., et al. Multipotent Neural Stem Cells Reside into the Rostral Extension and Olfactory Bulb of Adult Rodents. J. Neurosci. 22 (2), 437-445 (2002).
- Gritti, A., et al. Epidermal and Fibroblast Growth Factors Behave as Mitogenic Regulators for a Single Multipotent Stem Cell-Like Population from the Subventricular Region of the Adult Mouse Forebrain. J. Neurosci. 19 (9), 3287-3297 (1999).
- Vescovi, A. L., et al. Isolation and cloning of multipotential stem cells from the embryonic human CNS and establishment of transplantable human neural stem cell lines by epigenetic stimulation. Exp. Neurol. 156 (1), 71-83 (1999).
- Azari, H., Louis, S. A., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (49), e2639 (2011).
- Louis, S. A., et al. Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony-Forming Cell Assay. Stem Cells. 26 (4), 988-996 (2008).
- Coles-Takabe, B. L., et al. Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).
- Mori, H., Fujitani, T., Kanemura, Y., Kino-Oka, M., Taya, M. Observational examination of aggregation and migration during early phase of neurosphere culture of mouse neural stem cells. J. Biosci. Bioeng. 104 (3), 231-234 (2007).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat. Methods. 3 (10), 801-806 (2006).
- Yu, Y. H., et al. Purification, Visualization, and Molecular Signature of Neural Stem Cells. Stem Cells and Dev. 25 (2), 189-201 (2016).
- Yu, Y. H. C1qR1 is comparable with LeX and Prom1 as a neural stem cell marker. Identification of mouse embryonic neural stem cell surface markers. , Chapter 3.5, Figure 3.17 (2012).
- Tham, M. Neural colony-forming cell assay. A role for chondroitin sulfate proteoglycan in regulating the survival and growth of neural stem cells. , Chapter 3.6.3, Figure 3.22A (2009).
- Yuan, S. H., et al. Cell-Surface Marker Signatures for the Isolation of Neural Stem Cells, Glia and Neurons Derived from Human Pluripotent Stem Cells. PLoS ONE. 6 (3), e17540 (2011).
- Hall, P. E., Lathia, J. D., Miller, N. G. A., Caldwell, M. A., Ffrench-Constant, C. Integrins Are Markers of Human Neural Stem Cells. Stem Cells. 24 (9), 2078-2084 (2006).
