Summary
Neurala stamceller (NSCs) avser celler som kan själv förnya och differentiera in de tre neurala linjerna. Här beskriver vi ett protokoll för att bestämma NSC frekvens i en given cellpopulation med hjälp av neurosfären bildning och differentiering i klonala betingelser.
Abstract
Neurala stamceller (NSCs) har förmågan att själv förnya och generera de tre stora neurala härstamningar - astrocyter, nervceller och oligodendrocyter. NSCs och neurala stamceller (NPS) är vanligtvis odlas in vitro som neuro. Detta protokoll beskriver i detalj hur man bestämmer NSC frekvensen i en given cellpopulation enligt klonala betingelser. Protokollet börjar med ympning av cellerna vid en densitet som möjliggör generering av klonala neurosfärer. Neurosfärerna överförs sedan till chambered täckglas och differentieras enligt klonala betingelser i konditionerat medium, som maximerar differentieringspotential av neurosfärerna. Slutligen NSC frekvensen beräknas utifrån neurosfärbildning och multipotens kapacitet. Nytta av det här protokollet inbegripa en utvärdering av kandidat NSC markörer, rening av NSCs, och förmågan att skilja NSCs från NPS. Denna metod tar 13 dagar att utföra, vilket är mycket shorter än nuvarande metoder för att räkna upp NSC frekvens.
Introduction
Neurala stamceller (NSCs) är celler i det centrala nervsystemet (CNS) som kan själv förnya och är multipotenta. NSCs först specificeras under utvecklingen av embryonala framhjärnan och fortsätter att framhärda i den vuxna hjärnan på specifika regioner såsom subventrikulära zonen (SVZ) av de laterala ventriklarna och dentate gyrus (GD) i hippocampus. Ett antal NSC linjer används i kliniska prövningar för behandling av stroke och andra neurologiska sjukdomar såsom Batten sjukdom 1.
NSCs och neurala stamceller (NPS) förökas i kulturen som flytande tre-dimensionella sfäroida strukturer som kallas neuro. Neurosphere kultur Systemet har utvecklats av Reynolds och Weiss i början av 1990-talet, när de fann att embryonala och vuxna kortikala celler kan dela i närvaro av epidermal tillväxtfaktor (EGF) och basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF) 2-4. Neuro består av en heterogen blandning av calnar bestående av underklasser i olika utvecklingsstadier 5. Det är en utmaning att specifikt studera NSCs med hjälp av data som erhållits från neuro på grund av förekomsten av NPS. Därför är det viktigt att berika NSCs från neuro. För närvarande har fyra huvudsakliga metoder använts för att anrika för NSCs in vitro. Första är användningen av cellytemarkörer. Lewis-X (LEX) och CD133 (även känd som Prominin1) är den mest framträdande cellytan NSC markörer 6-9. Syndekan-1, Notch-1 och integrin-beta1 är andra ytproteiner som berikar för NSCs 10. Andra är färgämnet utslagning. Det har visat sig att sidobefolknings celler, som har en unik förmåga att pumpa ut den fluorescerande DNA-bindande färgämnet Hoechst 33342, anrikas för NSCs 11. Tredje är användningen av morfologisk selektion. Det har visats att celler med ökad cellstorlek och kornighet hamn mer NSCs än sina motsvarigheter 5,12,13. Fjärde är tillägget av NSC SUrvival faktorer till odlingsmediet. Det har visats att tillsats av Kondroitinsulfat proteoglykan och Apolipoprotein E förhöjer NSC överlevnad och ökar således NSC frekvens 14,15. Även om många markörer inklusive transkriptionsfaktorer har förknippats med NSCs 16,17, ingen av dessa markörer har möjlighet att berika NSCs till renhet. På grund av bristen på definitiva NSC markörer, är det fortfarande en utmaning att kvantifiera NSCs och skilja dem från NP in vitro.
Initiala studier använde neurosphere bildningsanalys (NFA) att kvantifiera NSCs 7,11,13. I denna analys, dissocierade celler odlas för att bilda neurosfärer, och antalet neurosfärer som genereras för varje 100 celler utstrukna bestäms. Detta värde kallas den paketbildande enheten neurosphere (NFU). NFU är lika med NSC frekvens om alla neuro uppstår från NSCs. Emellertid visades det att NFU skattar NSC frekvens som neurosfärer bildas genom båda NSCs och tidig NP 5. Således är det fel att räkna NSCs baserat enbart på neurosphere bildning. Det kan vara möjligt att kvantifiera NSCs baserat på deras förmåga att själv förnya, föröka sig mycket och generera multineuro.
NSCs, som är EGF och bFGF lyhörd, vanligtvis överleva åtminstone tio passager och därmed visa omfattande självförnyelse kapacitet i kultur 4,18-20. NP, som är EGF och bFGF reagerar också, kan också generera neuro för ett par passager men inte för en längre tid. Därför har det varit allmänt accepterat att bona fide NSCs kan räknas upp med rättvis noggrannhet baserad på neurosfärbildning under minst tio passager. I de flesta studier har dock självförnyelse mäts vanligtvis baserat på sekundär eller tertiär neurosphere bildning på grund av den långa experimentella tid som krävs för tio passager. Följaktligen kan den sekundära NFA användas för att i stort sett jämföra självförnyelse förmåga betlan populationer, men kan inte användas för att exakt räkna NSC frekvens.
NSCs har en större förmåga att föröka sig jämfört med NP. Denna egenskap hos NSCs användes av Louis et al. att utveckla en analys för NSC uppräkning - neurala kolonibildande cellanalys (NCFCA) 21,22. I denna analys, enskilda celler odlas i 3 veckor i ett kollageninnehållande halvfast matris. Under dessa odlingsbetingelser, visade det sig att celler som bildar neurosfärer över 2 mm i diameter är tripotent och kan själv förnya för lång sikt. Dessa celler definieras som NSCs. Därför är NSCs effektivt skiljas från NPS.
NSCs har förmågan att differentiera till astrocyter, oligodendrocyter och neuroner. För differentiering av neurosfärer, är tillväxtfaktorer avlägsnas och serum sättes till odlingsmediet. Om alla tre neurala linjer observeras i en neurosphere, då cellen som initierade det neurosphere iär en NSC. Emellertid har differentieringsanalysen vissa begränsningar. För det första kan de odlingsbetingelser som används för differentiering inte optimalt för generation av alla tre neurala härstamningar. I själva verket i en enda neurosfär differentieringsprocessen, sker signifikant celldöd och mestadels astrocyt generering inträffar (Tham M och Ahmed S, opublicerad). För det andra är frågan om clonality. För exakt uppräkning av NSCs, bildning och differentiering av neurosfärer måste utföras under klon förhållanden, där varje neurosphere uppstår från en enda cell. I bulksuspensionsodlingar sker aggregering på både cellulära och neurosfärnivåer 23-25. Följaktligen är det möjligt för var och neurosfär härröra från flera celler eller neurosfärer, vilket komplicerar neurosfären räkning och utvärdering av multipotens. Nya rön visar att aggregering av celler inte förekommer vid låga plätering densitet av 0,5 celler / mikroliter eller lägre, och när odlingsplattor inte flyttas under neurosphere bildningen 15. Således odling av celler vid en sådan låg densitet skulle säkerställa clonality.
För närvarande är NCFCA den vanligaste metoden för att skilja NSCs från NP och räkna NSC frekvens. Den NCFCA kräver emellertid en relativt lång tid på tre veckor. Här beskriver vi ett protokoll för att räkna NSC frekvens baserad på förmågan hos NSCs att bilda multineuro. Detta protokoll tar bara 13 dagar att utföra. Den NCFCA säkerställer clonality som kollagenmatrisen förhindrar förflyttning av neuro. De odlingsbetingelser som används i detta protokoll kan också clonality upprätthållas hela tiden. Till exempel användning av 50-brunnars kammarförsedda täckglas säkerställer att neurosfärerna kommer att skilja utan att kontakta varandra. Vidare använder vi konditionerat medium som levererar neurotrofa faktorer under differentiering för att maximera differentieringspotential av neurosfärer (Figur 1).
Protocol
Behandlingen av djur utfördes i enlighet med IACUC och NACLAR riktlinjer och godkänts av djuravdelningen ((http://www.brc.astar.edu.sg/index.php?sectionID-11).
OBS: neurosfärkulturer framställdes från framhjärnan av embryonala (E14) C57BL / 6-möss som tidigare beskrivits 5.
1. Kultur av klonade Sample Neuro (Dag 1)
- Förbereda NSC tillväxtmedium genom att kombinera modifierade Eagles medium / Nutrient F-12 (DMEM / F12) medium Dulbeccos med B27 supplement (slutkoncentration: 1x), EGF (slutlig koncentration: 20 ng / ml), bFGF (slutlig koncentration: 10 ng / ml) och penicillin / streptomycin (slutlig koncentration: 1x).
- Dissociera E14.5 mouse neurosfärer i en ml NSC tillväxtmedium och 1 ml 0,05 N natriumhydroxid under 7 min vid rumstemperatur. Pipett celler upp och ner ibland för att hålla celler i suspension. Tillsätt 1 ml av 0,05 N saltsyra till neutraltize alkalit.
OBS: neurosfärceller sås vid 20.000 celler / ml i en 10 cm odlingsskål och odlas under 5 d vid 37 ° C, 5% CO2. Den förväntade avkastningen efter ca 10 miljoner celler per 10 cm skål. Dessa celler är sedan dissocieras och såddes vid klonal densitet som beskrivs i steg 1,2 och 1,3, respektive.- Utföra cellräkning med användning av Trypan Blue-färgning och en hemocytometer.
- Utsädesenkel E14.5 mus neurosfärceller vid en densitet av 50 celler / ml eller lägre i 100 mikroliter NSC tillväxtmedium i en 96-brunnars skål. Inkubera cellerna vid 37 ° C, 5% CO2 under 1 w för att alstra klonala neurosfärer.
OBS: Clonality säkerställs under neurosphere bildning vid denna densitet som cellerna inte i kontakt med varandra.
2. Kultur av Neuro för konditionerat medium (Dag 3)
- Dissociera E14.5 mouse neurosfärer som beskrivs i steg 1,2.
- Utsädes enstaka celler från E14.5 mus neurosfärer vid en densitet av 20.000 celler / ml i en 10 ml NSC tillväxtmedium i en 10 cm odlingsskål. Inkubera cellerna vid 37 ° C, 5% CO2 under 5 d för att generera bulk odlade neurosfärer.
3. Beredning av neurosphere konditionerat medium (Dag 8)
- Bereda beläggningslösningen genom att blanda 700 | il av 0,01% Poly-L-lysin (PLL), 70 | il av 1 mg / ml laminin och 6230 mikroliter av fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Coat en 10 cm odlingsskål med 7 ml PLL / Laminin lösning under 2 h vid 37 ° C.
- Med hjälp av en 10 ml serologisk pipett, överföra alla bulk odlade neuro till en 15 ml koniskt centrifugrör. Centrifugera neurosfärerna vid 171 xg under 1 min vid RT och avlägsna supernatanten fullständigt.
- Förbereda NSC differentieringsmedium genom att kombinera DMEM / F12-medium med B27 (slutkoncentration: 1x) och fetalt bovint serum (FBS) (slutkoncentration: 0,5%) Add 10 ml NSC differentieringsmedium till neuro. Pipett upp och ner några gånger för att suspendera neuro.
- Aspirera PLL / Laminin från 10 cm odlingsskål och tvätta en gång med 10 ml PBS. Överför alla neuro till PLL / Laminin-belagda 10 cm odlingsskål. Inkubera O / N vid 37 ° C, för att 5% CO2 under neurosfärerna vidhäfta till skålen.
4. Fastställande av NFU av prov Neuro (Dag 8)
- Räkna antalet neurosfärer (sådda på dag ett; avsnitt 1) utformad i varje brunn under ett mikroskop.
OBS: Bestäm antalet neurosfärer som bildas per 100 celler pläterade, vilket ger NFU.
5. Överföring av Sample Neuro till 50 brunnar Chambered Cover (Dag 8)
- Belägga varje brunn i en 50-brunnars chambered täckglas med 10 mikroliter av PLL / Laminin beläggningslösningen i 2 h vid 37 ° C.
OBS: Förbered beläggningslösning som beskrivs isteg 3,1. - Förbereda 3 x 50 ml koniska centrifugrör innehållande 30 mL PBS vardera. Använda steril pincett, ta bort den belagda 50 brunnar kammare täck. Doppa chambered täckglas in i det första röret hos PBS, följt av den andra och sedan det tredje röret i PBS, för att tvätta bort beläggningslösningen.
- Aspirera eventuell kvarvarande vätska från brunnarna i chambered täckglas.
- pipett försiktigt alla medium och neuro från varje brunn i 96-bra maträtt och överföra den till en enda 10 cm odlingsskål.
- Under ett mikroskop, välj en prov neurosphere med hjälp av en P10 mikropipett försedd med en 10 mikroliter pipettspets. Säkerställa att endast en enda neurosfär plockas varje gång genom att ställa in pipetten kolumnen till 2 mikroliter. Använd en ny pipettspets för varje neurosphere.
- Överför neurosphere på mitten av en brunn i den belagda 50 brunnar kammare täck.
- Upprepa steg 5,5 och 5,6 tills varje brunn i kammartäck contains en neurosfär.
OBS! Neuro kan plockas under ett mikroskop placeras i ett laminärt flöde huva eller på en bänk. - Tillsätt 10 mikroliter av NSC differentieringsmedium till varje brunn på kammartäckglas. Placera chambered täckglas i en 10 cm odlingsskål och pipett PBS längs kanterna på skålen för att förhindra uttorkning av NSC differentieringsmedium. Placera upp till två kamrar täck i en 10 cm odlingsskål. Inkubera chambered täckglas (som finns i 10 cm odlingsskål) över natten vid 37 ° C, 5% CO2.
6. Differentiering av Sample Neuro (dag 9)
- Överför differentieringsmedium från bulk odlade neuro (från punkt 3) till en 15 ml koniskt centrifugrör. Se till att 2-3 ml differentieringsmedium kvar i odlingsskålen att förhindra vidhäftade celler lossnar. Med användning av en 20 ml steril spruta, passera differentieringsmedium genom ett 0,2 μm filter för att avlägsna eventuella celler eller debris.
- Transfer tillbaka till 10 cm odlingsskål innehållande de vidhäftade cellerna den filtrerade differentieringsmedium.
- Med användning av steril pincett försiktigt placera chambered täckglas på den differentieringsmedium i ett inverterat sätt så att provneurosfärer är vända nedåt. Inkubera chambered täckglas med differentieringsmedium för 3 d vid 37 ° C, 5% CO2.
OBS: Provneurosfärer är i kontakt med differentieringsmedium, men inte i kontakt med de differentierande cellerna under.
7. Fastställande av Differentierad Neuro (dag 12)
- Ta försiktigt bort chambered täck från 10 cm odlingsskål med steril pincett. doppa försiktigt täck i PBS för att tvätta bort konditionerat medium.
- Dra av silikon packningen från täckglas. Utför detta försiktigt och långsamt för att undvika att bryta täck. Ta del av den sida där the differentierade neuro följs.
- Pipettera 1 ml av 4% paraformaldehyd (PFA) på en bit paraffinfilm skuren till storleken på täckglas. Placera försiktigt täck på paraffinfilmen med neuro vända nedåt i kontakt med PFA. Fäst neuro under 20 min vid RT.
Varning: PFA är giftig i både flytande och ångform och är brännbar. Undvik inandning av ångor och kontakt med hud och ögon. Hantera alltid PFA i ett ventilerat dragskåp. - Pipettera 1 ml PBS på en bit paraffinfilm. Tvätta neurosfärerna genom att försiktigt placera täckglas med neurosfärerna vänd nedåt i kontakt med PBS under 10 min vid rumstemperatur.
- Upprepa steg 7,4 ytterligare två gånger.
8. O4 Färgning av differentierade Neuro (dag 12)
- Förbereda 3% bovint serumalbumin (BSA) i PBS. Pipettera 1 ml av 3% BSA på en bit paraffinfilm. Blockera neurosfärerna genom att försiktigt placing täckglas (med neurosfärerna nedåt) i kontakt med BSA under 30 min vid RT.
- Pipettera 1 ml av mus-anti-O4 IgM-antikropp (1: 300 utspädning i 3% BSA) på en bit paraffinfilm och placera täckglaset på paraffinfilm med neurosfärerna vända nedåt i kontakt med antikroppen. Låt O4 färgning inträffa under 2 h vid RT.
- Tvätta täckglas två gånger med PBS såsom beskrivs i steg 7,4.
- Pipettera 1 ml av grönt fluorescerande färgämne konjugerat-anti-mus-IgM sekundär antikropp (1: 500 utspädning i 3% BSA) på en bit paraffinfilm och placera täckglaset på paraffinfilm med neurosfärerna vända nedåt i kontakt med antikroppen . Låt stå i en timme vid RT i mörker.
OBS: Utför immunfärgning i en mörk miljö från detta steg framåt. - Tvätta täckglas två gånger med PBS såsom beskrivs i steg 7,4.
9. Tuj1 och gliafibrillärt surt protein (GFAP) Färgningdifferentierade Neuro (dag 12)
- Bered permeabilisering lösning genom att tillsätta Triton-X 100 (slutkoncentration: 0,5%) till 3% BSA. Pipettera 1 ml av permeabilisering lösningen på en bit paraffinfilm. Placera täckglas på paraffinfilm med neurosfärerna vända nedåt i kontakt med permeabilisering lösning under 20 min vid RT.
- Tvätta täckglas två gånger med PBS såsom beskrivs i steg 7,4.
- Pipettera 1 ml av mus-anti-Tuj1 IgG2a-antikropp (1: 500 utspädning i 3% BSA) och kanin-anti-GFAP-IgG-antikropp (1: 1000 utspädning i 3% BSA) på en bit paraffinfilm och placera täckglas på paraffinfilm med neurosfärerna vända nedåt i kontakt med antikropparna. Tillåt Tuj1 och GFAP färgning inträffa under 2 h vid RT.
OBS: Båda antikropparna kan framställas som en enda lösning. - Tvätta täckglas två gånger med PBS såsom beskrivs i steg 7,4.
- Pipettera 1 ml av rött fluorescerande färgämnekonjugerat-anti-mus-IgG 2a (1: 500 utspädning i 3% BSA) och bortre röda fluorescerande färgämne konjugerat-anti-kanin-IgG (1: 500 utspädning i 3% BSA) sekundära antikroppar på en bit paraffinfilm och plats täckglas på den paraffinfilm med neurosfärerna vända nedåt i kontakt med antikropparna. Låt stå i 1 h vid RT.
OBS: Båda antikropparna kan framställas som en enda lösning. - Tvätta täckglas två gånger med PBS såsom beskrivs i steg 7,4.
- Späd 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) stamlösning till 300 nM i PBS. Pipettera 1 ml DAPI på en bit paraffinfilm och placera täckglas på paraffinfilm med neurosfärerna vända nedåt i kontakt med DAPI under 2 minuter vid RT under kärnor färgning.
- Tvätta täckglas gång med PBS och två gånger med avjoniserat vatten såsom beskrivs i steg 7,4. Montera täckglas på en glasplatta med användning av ett lämpligt monteringsmedium och låt torka O / N vid RT.
10. Imaging differentierade Neuro (dag 13)
- Bildneuro enligt ett konfokalmikroskop med hjälp av en 40X. Använd lasrar vid 488 nm, 594 nm och 647 nm för att detektera oligodendrocyter, nervceller och astrocyter resp.
- Bestäm procentandelen unipotent, bipotent och tripotent neuro.
OBS: Potensen bestämdes genom förmågan hos neurosfären att differentieras till de tre neurala härstamningar - oligodendrocyter, nervceller och astrocyter 5,14,15,26. Oligodendrocyter identifieras genom positiv färgning för O4 (avsnitt 8). Nervceller identifieras genom positiv färgning för Tuj1 (avsnitt 9). Astrocyter identifieras genom positiv färgning för GFAP (avsnitt 9). En unipotent neurosphere differentierar till endast en av linjen och bör positivt färgas antingen O4, GFAP eller Tuj1. En bipotent neurosphere differentierar i vilka två linjer och bör positivt färgas för O4 och GFAP eller O4 och Tuj1 eller GFAP och Tuj1. En tripotent neurosfär annorlundaiates i alla tre linjer och bör positivt färgas för O4, GFAP och Tuj1. - Bestäm NSC frekvens i populationen av intresse genom att använda följande formel:
NSC frekvens = (NFU x% av tripotent neuro) / 100%.
Representative Results
Vi har använt detta protokoll för att bedöma förmågan hos Lex, en känd cellytan NSC markör 7, för anrikning av NSCs. Data från denna studie kommer att användas för att illustrera hur NSCs räknas med hjälp av klonala analyser i protokollet. E14.5 mouse neurosfärceller inkuberades med anti-Lex antikropp. Därefter celler som uttrycker LeX (LeX +) och celler som inte uttrycker LeX (Lex -) såddes med 50 celler / ml genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) och lämnades att alstra klonala neurosfärer för en wk. Time-lapse avbildning visar att neuro genereras vid 50 celler / ml är klonal (Figur 2). NFU för LeX + och Lex - celler bestämdes. Det visas att lex + celler har en betydligt högre neurosphere bildning förmåga jämfört med Lex - celler (figur 3g). Neurosfärerna alstrade ades sedan differentierasenligt klonala betingelser, därefter immun och avbildas (Figur 3a-e). Lex + celler generera betydligt fler tripotent neuro än Lex - celler (figur 3f). NSC frekvens beräknades därefter baserat på NFU och% av tripotent neuro (figur 3g). Urval baserat på Lex berikar NSC frekvens av mer än 14 gånger, validering LeX som NSC markör. Vi har också bestämt NSC frekvensen av E14.5 mus neuro använder detta protokoll 27 och NCFCA 28. Båda metoderna rapporterar jämförbar NSC frekvens på ca 2% i E14.5 mouse neurosfärer.
Figur 1. Protokoll för neurosphere differentiering i Klon villkor. Provneuro odlade under klon förhållanden placeras individuellt i varje PLL / Laminin-coated brunn i en 50-brunnars kammartäckglas, och tilläts vidhäfta O / N. På samma dag, är bulk odlade neurosfärer på platta i differentieringsmedium i en PLL / Laminin-belagda 10 cm skål och tilläts vidhäfta O / N. Nästa dag, konditionerat medium från bulk odlade neurosfärer filtreras och placeras tillbaka i 10 cm skål. Provneuro sedan inverteras på det konditionerade mediet och får differentiera under 3-4 dagar 28. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Tillväxt av en klonal neurosfär. Celler härledda från E14.5 neurosfärer dissocierades och såddes med 50 celler / ml i 96-brunnsskål. Individuella celler spåras för 6 d av time-lapse avbildning. Bilder från One sådan cell växa till en neurosfär visas. Observera att neurosphere bibehåller clonality. (A) 0 dagar; (B) 1.19.45; (C) 2.95.37; (D) 3.32.76; (E) 4.46.53; (F) 5.61.44; där den första siffran avser dagen avser andra nummer till den del av dagen, och tredje siffran avser den del av h. 10x förstoring. Skala bar, 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Differentiering av Klonneuro och räkning av NSC frekvens. Enstaka neuroplockades och differentieras i 50-väl kammare täck för 3 d. En representativ bild av en tripotent neurosphere stasökte med (a) DAPI och immunfärgades för (b) GFAP, (c) Tuj1 och (d) O4. (E) Visar en överlagring av (a) - (d). Skalstock, 65 | j, m. (F)% av unipotent, bipotent och tripotent neuro genereras av Lex + och Lex - celler (medelvärde ± SEM, n = 3). (G) NSC frekvens i LeX + och Lex -. Celler beräknas som produkten av NFU och% av tripotent neuro Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Vi beskriver Hee räkning av NSCs i klonala betingelser. Kritiska steg innefattar användning av färska NSC tillväxt och differentieringsmedium, och även användningen av nyberedd PLL / Laminin lösning för att belägga chambered täckglas, såväl som odlingsskålarna. Detta säkerställer optimal tillväxt och differentierings villkoren för neuro. Användningen av god kvalitet antikroppar för att effektivt upptäcka nervceller och glia, samt selektiv plockning av klonala neuro som inte är i kontakt med andra neuro, är kritisk. Dessutom är det viktigt att se till att plockas neuro inte torkar upp. Det rekommenderas att lägga till 10 mikroliter av differentiering medium till varje brunn efter plockning var 10 neuro. Det är viktigt att använda ett kamrar täck i en 10 cm skål per prov för att undvika överhörning mellan neuro från olika prover. Om två täck (var och en innehåller neuro från olika prover) placeras iSamma 10 cm skål, neuro från en täck kan frigöra faktorer som kan påverka benägenheten av neuro i den andra täck att differentiera till specifika linjer. Två täckglas i samma 10 cm skål kan också resultera i blandning upp mellan prover.
I händelse av NFU eller NSC frekvensen är lägre än väntat, att lågt passagenummer neuro används. Det är också viktigt att friska låga passageneurosfärer används för generering av konditionerat medium. Nästa, om neuro odlas i brunnar med liten diameter, såsom i 96-bra maträtt, då blir det svårt att manövrera och plocka neuro med hjälp av en mikropipett. I detta fall överför neurosfärerna till en större odlingsskål, såsom en 6-brunnsskål, före plockning. Några av de plockade neuro kan lyfta från kammartäck under kultur och immunfärgning. Minimera rörelse kammartäck under odling, och mindre intensiv tvätting under immunfärgning, skulle bidra till att undvika avlossning av neuro.
Inledande studier kvantifieras NSCs enbart med hjälp av NFA 7,11,13. Men Livsmedelsverket överskattar NSC frekvens som både NSCs och tidiga NP genererar neuro 5. Louis et al. Utvecklat en annan metod för att kvantifiera NSCs kallas NCFCA 21,22. Den NCFCA involverar odling av enstaka celler i en kollagenbaserad matris för att säkerställa klonalitet, och det visade sig att neurosfärer över 2 mm i diameter bildas genom endast NSCs. I likhet med NCFCA är clonality garanteras i hela detta protokoll. Detta uppnås genom att generera neuro på klonal täthet och differentierande neurosfärerna i kammartäck. Användningen av chambered täckglas ger ett antal fördelar. Chambered täck tillåter varje prov neurosphere att differentiera utan fysisk kontakt med andra provneuro därigenom säkerställa clonality under differentiering.Chambered täck kan placeras upphängd på differentieringsmedium för att tillåta provneuro kontinuerligt rade och för att säkerställa maximal differentiering. I frånvaro av konditionerat medium och serum under differentiering, överlevnad neuro minskar och neuro mestadels generera astrocyter (Tham M och Ahmed S, opublicerade). Dessutom kan de immunneuro lämpligen lagras under lång tid och kammartäck kan monteras direkt på mikroskopglas. Dessutom är avbildning av immunneuro görs enkelt som man kan snabbt hitta neurosphere i den lilla kammare väl, ta en bild och gå vidare till nästa brunn.
Vi har bestämt NSC frekvensen i E14.5 mus neurosphere kultur med hjälp av både det protokoll som beskrivs i detta manuskript 27 och NCFCA 28. NSC frekvensen i E14.5 mus neuro bestäms av både migthods är jämförbara. Den NCFCA räknar NSCs som är multipotenta och har långsiktiga självförnyelse kapacitet. Eftersom NSC frekvensen från vår metod är jämförbar med den från NCFCA, betyder utläsningen från våra protokoll verkar inte att överskatta NSC frekvensen. Den NCFCA kräver tre veckor som skall slutföras och främst innebär cell plätering och medel påfyllning. Protokollet som beskrivs här kräver 13 dagar att utföra och innebär en annan serie av steg, till exempel, neurosphere plockning och immunfärgning. Detta protokoll skulle kunna tjäna som en alternativ metod för att räkna NSCs. Forskare kan använda både NCFCA och detta protokoll för att kontrollera NSC frekvens i sina prover.
En begränsning av detta protokoll är att en rad viktiga steg måste alla utförs på dagen 8. Beredningen av konditionerat medium, bestämning av NFU av provneuro, och överföring av provneuro till 50 brunnar chambered täck måste vara utförs på day 8. Man kan ta tid att slutföra de här stegen. Dessutom kräver det praxis att utföra dessa steg på ett effektivt sätt.
Neurosfärer har använts i stor utsträckning för att studera NSC funktion och beteende. Men neuro består av både NSCs och NPS. Därför är det viktigt att berika NSCs från neuro att studera NSC biologi. För närvarande har cellytmarkörer, färgexklusion egendom samt cellstorlek och kornighets använts för att anrika för NSCs 6,7,9-13,29,30. Detta protokoll kan användas för att kvantifiera anrikning av NSCs potentiella NSC markörer, och för att underlätta sökandet efter en slutgiltig NSC markör. Fyra nya studier har använt detta protokoll för att räkna NSC frekvens 5,14,15,26.
Acknowledgments
Vi tackar byrån för vetenskap, teknologi och forskning (A * STAR), Singapore för att finansiera denna forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical centrifuge tubes | BD | 352096 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | BD | 352070 | |
| 20 mL sterile syringe | BD | 300141 | |
| 50 mL sterile syringe | BD | 300144 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S1810 | |
| Mouse anti-Tuj1 IgG2a antibody | Covance | MMS-435P-100 | |
| Rabbit anti-GFAP IgG antibody | Dako | Z033401 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Microscope fitted to laminar flow hood | Leica | MZ6 | |
| Glass slides | Marienfeld-superior | 1000200 | |
| Mouse anti-O4 IgM antibody | Merck Millipore | MAB345 | |
| Hydromount | National Diagnostics | HS-106 | |
| Microscope | Nikon Eclipse | TS100-F | |
| Laminar flow hood | NuAire | NU-543 | |
| 96-well culture dishes | NUNC | 167008 | |
| 10-cm culture dishes | NUNC | 150350 | |
| Paraffin film | Parafilm | PM999 | |
| Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant human basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| 0.2 µm filter | Sartorius Stedim | 16534-K | |
| 0.45 µm filter | Sartorius Stedim | 16555-K | |
| 1.0 N Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| 1.0 N Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Poly-L-Lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Paraformaldehyde (PFA) powder | Sigma-Aldrich | P6148 | Toxic |
| Bovine Serum Albumin (BSA) powder | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| 50-well chambered coverslips | Sigma-Aldrich | C7735 | |
| Stir plate with heat function | Stuart | UC152 | |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320-033 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017-015 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody | Thermo Fisher Scientific | A21042 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG2a antibody | Thermo Fisher Scientific | A21135 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG antibody | Thermo Fisher Scientific | A31573 | |
| 4’,6’-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
| Cell-culture centrifuge | Thermo Fisher Scientific | RT1 75002383 | |
| Pasteur pipettes | Thermo Fisher Scientific | 10006021 | |
| CO2 incubator | |||
| Ventilated fume-hood | |||
| Aspirator | |||
| Confocal microscope | |||
| Micropipettes | |||
| Micropipette tips | |||
| Plastic pipettes | |||
| Multichannel pipettes | |||
| Glass beaker | |||
| Sterile forceps | |||
| pH meter |
References
- Ahmed, S. The culture of neural stem cells. J. Cell. Biochem. 106 (1), 1-6 (2009).
- Reynolds, B. A., Tetzlaff, W., Weiss, S. A multipotent EGF-responsive striatal embryonic progenitor cell produces neurons and astrocytes. J. Neurosci. 12 (11), 4565-4574 (1992).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and Population Analyses Demonstrate That an EGF-Responsive Mammalian Embryonic CNS Precursor Is a Stem Cell. Dev. Biol. 175 (1), 1-13 (1996).
- Narayanan, G., et al. Single-Cell mRNA Profiling Identifies Progenitor Subclasses in Neurospheres. Stem Cells and Dev. 21 (18), 3351-3362 (2012).
- Uchida, N., et al. Direct isolation of human central nervous system stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (26), 14720-14725 (2000).
- Capela, A., Temple, S. LeX/ssea-1 Is Expressed by Adult Mouse CNS Stem Cells, Identifying Them as Nonependymal. Neuron. 35 (5), 865-875 (2002).
- Capela, A., Temple, S. LeX is expressed by principle progenitor cells in the embryonic nervous system, is secreted into their environment and binds Wnt-1. Dev. Biol. 291 (2), 300-313 (2006).
- Corti, S., et al. Isolation and characterization of murine neural stem/progenitor cells based on Prominin-1 expression. Exp. Neurol. 205 (2), 547-562 (2007).
- Nagato, M., et al. Prospective characterization of neural stem cells by flow cytometry analysis using a combination of surface markers. J. Neurosci. Res. 80 (4), 456-466 (2005).
- Kim, M., Morshead, C. M. Distinct Populations of Forebrain Neural Stem and Progenitor Cells Can Be Isolated Using Side-Population Analysis. J. Neurosci. 23 (33), 10703-10709 (2003).
- Murayama, A., Matsuzaki, Y., Kawaguchi, A., Shimazaki, T., Okano, H. Flow cytometric analysis of neural stem cells in the developing and adult mouse brain. J. Neurosci. Res. 69 (6), 837-847 (2002).
- Rietze, R. L., Valcanis, H., Brooker, G. F., Thomas, T., Voss, A. K., Bartlett, P. F. Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain. Nature. 412 (6848), 736-739 (2001).
- Tham, M., et al. CSPG Is a Secreted Factor that Stimulates Neural Stem Cell Survival Possibly by Enhanced EGFR Signaling. PLoS ONE. 5 (12), e15341 (2010).
- Gan, H. T., Tham, M., Hariharan, S., Ramasamy, S., Yu, Y. H., Ahmed, S. Identification of ApoE as an autocrine/paracrine factor that stimulates neural stem cell survival via MAPK/ERK signaling pathway. J. Neurochem. 117 (3), 565-578 (2011).
- Ramasamy, S., Narayanan, G., Sankaran, S., Yu, Y. H., Ahmed, S. Neural stem cell survival factors. Arch. Biochem. Biophys. 534 (1-2), 71-87 (2013).
- Ahmed, S., et al. Transcription factors and neural stem cell self-renewal, growth and differentiation. Cell Adh. Migr. 3 (4), 1-12 (2009).
- Gritti, A., et al. Multipotent Neural Stem Cells Reside into the Rostral Extension and Olfactory Bulb of Adult Rodents. J. Neurosci. 22 (2), 437-445 (2002).
- Gritti, A., et al. Epidermal and Fibroblast Growth Factors Behave as Mitogenic Regulators for a Single Multipotent Stem Cell-Like Population from the Subventricular Region of the Adult Mouse Forebrain. J. Neurosci. 19 (9), 3287-3297 (1999).
- Vescovi, A. L., et al. Isolation and cloning of multipotential stem cells from the embryonic human CNS and establishment of transplantable human neural stem cell lines by epigenetic stimulation. Exp. Neurol. 156 (1), 71-83 (1999).
- Azari, H., Louis, S. A., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (49), e2639 (2011).
- Louis, S. A., et al. Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony-Forming Cell Assay. Stem Cells. 26 (4), 988-996 (2008).
- Coles-Takabe, B. L., et al. Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).
- Mori, H., Fujitani, T., Kanemura, Y., Kino-Oka, M., Taya, M. Observational examination of aggregation and migration during early phase of neurosphere culture of mouse neural stem cells. J. Biosci. Bioeng. 104 (3), 231-234 (2007).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat. Methods. 3 (10), 801-806 (2006).
- Yu, Y. H., et al. Purification, Visualization, and Molecular Signature of Neural Stem Cells. Stem Cells and Dev. 25 (2), 189-201 (2016).
- Yu, Y. H. C1qR1 is comparable with LeX and Prom1 as a neural stem cell marker. Identification of mouse embryonic neural stem cell surface markers. , Chapter 3.5, Figure 3.17 (2012).
- Tham, M. Neural colony-forming cell assay. A role for chondroitin sulfate proteoglycan in regulating the survival and growth of neural stem cells. , Chapter 3.6.3, Figure 3.22A (2009).
- Yuan, S. H., et al. Cell-Surface Marker Signatures for the Isolation of Neural Stem Cells, Glia and Neurons Derived from Human Pluripotent Stem Cells. PLoS ONE. 6 (3), e17540 (2011).
- Hall, P. E., Lathia, J. D., Miller, N. G. A., Caldwell, M. A., Ffrench-Constant, C. Integrins Are Markers of Human Neural Stem Cells. Stem Cells. 24 (9), 2078-2084 (2006).
