Summary
Neurale stamceller (NSC) refererer til celler, som kan forny sig selv og differentiere til de tre neurale slægter. Her beskriver vi en protokol til at bestemme NSC frekvens i en given celle population ved hjælp neurosfære dannelse og differentiering under klonede betingelser.
Abstract
Neurale stamceller (NSC) har evnen til at forny sig selv og generere de tre store neurale slægter - astrocytter, neuroner og oligodendrocytter. NSC'er og neurale stamceller (NPS) er almindeligvis dyrkes in vitro som neurosfærer. Denne protokol beskriver i detaljer, hvordan at bestemme NSC frekvensen i en given celle population under klonede betingelser. Protokollen begynder med podning af cellerne ved en densitet, der muliggør frembringelsen af klonale neurosfærer. Neurosfærerne overføres derefter til kamre dækglas og differentieres under klonale forhold i konditioneret medium, som maksimerer differentieringen potentiale neurosfærer. Endelig er NSC frekvens beregnes på basis af neurosfære dannelse og multipotency kapaciteter. Værker af denne protokol omfatter en evaluering af kandidat NSC markører, oprensning af NSC'er, og evnen til at skelne NSC'er fra NP'er. Denne metode tager 13 dage at udføre, hvilket er meget shorter end nuværende fremgangsmåder til optælling NSC frekvens.
Introduction
Neurale stamceller (NSC) er celler i centralnervesystemet (CNS), der kan forny sig selv og er multipotente. NSC er først angivet under udviklingen af den embryonale forhjernen og fortsætte med at forblive i den voksne hjerne på bestemte områder såsom subventrikulære zone (SVZ) i de laterale ventrikler og gyrus dentatus (GD) i hippocampus. Et antal NSC linjer bliver brugt i kliniske forsøg til behandling af slagtilfælde og andre neurologiske sygdomme, såsom Batten sygdom 1.
NSC og neurale stamfædre (NPS) opformeres i kultur som flydende 3-dimensionelle sfæroide strukturer kaldet neurosfærer. Neurosfæren dyrkningssystemet udviklet af Reynolds og Weiss i begyndelsen af 1990'erne, da de fandt, at embryonale og voksne corticale celler kunde dele i nærvær af epidermal vækstfaktor (EGF) og basal fibroblastvækstfaktor (bFGF) 2-4. Neurosfærer består af en heterogen blanding af calen bestående af underklasser på forskellige udviklingsstadier 5. Det er en udfordring at specifikt studere NSC'er anvende oplysninger fra neurosfærer grund af tilstedeværelsen af NP'er. Derfor er det afgørende at berige NSC'er fra neurosfærer. På nuværende tidspunkt er fire vigtigste metoder blevet anvendt til at berige for NSC'er in vitro. Første er anvendelsen af celleoverflademarkører. Lewis-X (LeX) og CD133 (også kendt som Prominin1) er de mest fremtrædende celleoverflade NSC markører 6-9. Syndecan-1, Notch-1 og Integrin-beta1 er andre overfladeproteiner, der beriger for NSC'er 10. Andet er farvestoffet udstødelse. Det er blevet vist, at de side-population-celler, som har den unikke evne til at pumpe den fluorescerende DNA-bindende farvestof Hoechst 33342, er beriget med NSC'er 11. Tredje er anvendelsen af morfologisk udvælgelse. Det er blevet påvist, at celler med øget cellestørrelse og granularitet havn mere NSC'er end deres kolleger 5,12,13. Fjerde er tilføjelsen af NSC survival faktorer til dyrkningsmediet. Det er blevet vist, at tilsætning af Chondroitinsulfat proteoglycan og Apolipoprotein E forbedrer NSC overlevelse og dermed øger NSC frekvens 14,15. Selvom mange markører, herunder transkriptionsfaktorer har været forbundet med NSC'er 16,17, ingen af disse markører er i stand til at berige NSC'er til renhed. På grund af manglen på en endelig NSC markører, er det fortsat en udfordring at kvantificere NSC'er og skelne dem fra nationale parlamenter in vitro.
Indledende undersøgelser anvendte neurosfæren dannelse assay (NFA) at kvantificere NSC'er 7,11,13. I dette assay dissocierede celler dyrkes til dannelse neurosfærer og antallet af neurosfærer genereret for hver 100 udpladede celler bestemmes. Denne værdi betegnes som neurosfæren Formation Unit (NFU). NFU er lig med NSC frekvens, hvis alle neurosfærer skyldes NSC'er. Imidlertid blev det vist, NFU overvurderer NSC frekvens som neurosfærer dannet af begge NSCs og begyndelsen NP'er fem. Således er det forkert at opregne NSC'er udelukkende baseret på neurosfære-formation. Det kunne være muligt at kvantificere NSC'er baseret på deres evne til selv at forny, formere udførligt og generere multipotente neurosfærer.
NSC, som er EGF og bFGF lydhør, normalt overleve i mindst ti passager og dermed vise omfattende selvfornyelse kapacitet i kultur 4,18-20. Nationale parlamenter, som er EGF og bFGF lydhør samt, kunne også generere neurosfærer for nogle få passager, men ikke for en længere periode. Derfor er det blevet almindeligt accepteret, at bona fide NSC kan opregnes med rimelig nøjagtighed baseret på neurosfære dannelse i mindst ti passager. I de fleste undersøgelser har imidlertid selvfornyelse måles normalt baseret på sekundær eller tertiær neurosfære dannelse grund af den lange tid, der kræves eksperimentelle ti passager. Derfor kan den sekundære NFA anvendes til stort set sammenligne selvfornyelse evne between populationer, men kan ikke anvendes til nøjagtig optælle NSC frekvens.
NSC har en større proliferativ evne sammenlignet med NP'er. Denne egenskab af NSC blev brugt af Louis et al. at udvikle et assay for NSC tælling - den neurale kolonidannende celleassay (NCFCA) 21,22. I dette assay enkelte celler er dyrket i 3 uger i en collagen-holdig halvfast matrix. Under disse dyrkningsbetingelser blev det vist, at celler, der danner neurosfærer over 2 mm i diameter er tripotent og kan forny sig selv for langsigtet. Disse celler er defineret som NSC'er. Derfor er NSC'er effektivt skelnes fra NP'er.
NSC har evnen til at differentiere til astrocytter, oligodendrocytter og neuroner. For differentiering af neurosfærer, er vækstfaktorer fjernes og serum sættes til dyrkningsmediet. Hvis der observeres alle tre neurale slægter i en neurosfære, så den celle, indledte at neurosfære is en NSC. Imidlertid differentieringen assayet har visse begrænsninger. For det første kan de dyrkningsbetingelser, der anvendes til differentiering ikke optimale til generering af alle tre neurale cellelinier. Faktisk i en enkelt neurosfære differentiering proces, signifikant celledød indtræffer og hovedsagelig astrocyt generation forekommer (Tham M og Ahmed S, ikke publiceret). For det andet er der spørgsmålet om klonalitet. For nøjagtig tælling af NSC, dannelse og differentiering af neurosfærer skal udføres under klonede forhold, hvor hver neurosfære opstår fra en enkelt celle. I bulk-suspensionskulturer, aggregering forekommer ved både cellulære og neurosfære niveauer 23-25. Derfor er det muligt for hver neurosfære at hidrøre fra flere celler eller neurosfærer, hvilket komplicerer neurosfære optælling og evaluering af multipotency. Nye beviser viser, at aggregering af celler ikke forekommer ved lav udpladningsdensitet på 0,5 celler / pi eller derunder og når dyrkningsplader ikke flyttes under neurosphere formation 15. Således at dyrke celler på en sådan lav densitet vil sikre klonalitet.
I øjeblikket er NCFCA er den mest anvendte metode til at skelne NSC'er fra NP'er og opregne NSC frekvens. The NCFCA, kræver imidlertid en relativ lang tid på tre uger. Her beskriver vi en protokol til at optælle NSC frekvens baseret på evnen af NSC at danne multipotente neurosfærer. Denne protokol tager kun 13 dage at udføre. Den NCFCA sikrer klonalitet som kollagenmatrixen forhindrer bevægelse af neurosfærer. De dyrkningsbetingelser, der anvendes i denne protokol tillader også klonalitet skal føres i hele. For eksempel brugen af 50-brønd kamre dækglas sikrer, at neurosfærer vil differentiere uden at kontakte hinanden. Ydermere benyttes konditioneret medium, der leverer neurotrofiske faktorer under differentiering at maksimere differentiering potentiale neurosfærerne (figur 1).
Protocol
Behandlingen af dyr blev udført i overensstemmelse med de IACUC og NACLAR retningslinjer og godkendt af dyret afdeling ((http://www.brc.astar.edu.sg/index.php?sectionID-11).
BEMÆRK: neurosfære-kulturer blev fremstillet fra forhjernen af embryonale (E14) C57BL / 6-mus som tidligere beskrevet 5.
1. Kultur Klonale Sample Neurosfærer (dag 1)
- Forbered NSC vækstmedium ved at kombinere Dulbeccos Modificerede Eagles Medium / Nutrient F-12 (DMEM / F12) medium med B27 supplement (slutkoncentration: 1x), EGF (slutkoncentration: 20 ng / ml), bFGF (slutkoncentration: 10 ng / ml) og penicillin / streptomycin (slutkoncentration: 1x).
- Dissociér E14.5 mus neurosfærer i 1 ml NSC vækstmedium og 1 ml 0,05 N natriumhydroxid i 7 minutter ved stuetemperatur. Pipette celler op og ned lejlighedsvis at holde cellerne i suspension. Tilsæt 1 ml 0,05 N saltsyre til neutralize alkaliet.
BEMÆRK: neurosfære-celler podes ved 20.000 celler / ml i en 10 cm dyrkningsskål og dyrkes i 5 dage ved 37 ° C, 5% CO2. Det forventede afkast efter er omkring 10 millioner celler pr 10 cm skål. Disse celler dissocieres derefter og podet ved klontæthed som beskrevet i trin 1.2 og 1.3, henholdsvis.- Udfør celletallet hjælp Trypan Blå farvning og et hæmocytometer.
- Seed enkelt E14.5 mus neurosfære celler ved en densitet på 50 celler / ml eller derunder i 100 pi NSC vækstmedium i en 96-brønds skål. Inkuber cellerne ved 37 ° C, 5% CO2 i 1 w for at generere klonale neurosfærer.
BEMÆRK: Klonalitet sikres under neurosfære dannelse på dette massefylde som cellerne ikke berører hinanden.
2. Kultur Neurosfærer for konditioneret medium (Dag 3)
- Dissociér E14.5 mus neurosfærer som beskrevet i trin 1.2.
- Seed enkelte celler fra E14.5 muse neurosfærer med en tæthed på 20.000 celler / ml i en 10 ml NSC vækstmedium i en 10 cm dyrkningsskål. Inkuber cellerne ved 37 ° C, 5% CO2 i 5 d for at generere bulk-dyrkede neurosfærer.
3. Udarbejdelse af neurosfære konditioneret medium (dag 8)
- Forbered coatingopløsning ved blanding 700 pi 0,01% poly-L-lysin (PLL), 70 pi 1 mg / ml laminin og 6230 pi phosphatpufret saltvand (PBS).
- Coat en 10 cm dyrkningsskål med 7 ml PLL / Laminin opløsning i 2 timer ved 37 ° C.
- Ved hjælp af en 10 ml serologisk pipette alle bulk dyrkede neurosfærer til en 15 ml konisk centrifugerør. Centrifuger neurosfærer ved 171 xg i 1 minut ved stuetemperatur og fjern supernatanten fuldstændig.
- Forbered NSC differentiering medium ved at kombinere DMEM / F12 medium med B27 (slutkoncentration: 1x) og føtalt bovint serum (FBS) (slutkoncentration: 0,5%) Add 10 ml NSC differentiering medium til neurosfærer. Pipette op og ned et par gange for at resuspendere neurosfærer.
- Aspirer PLL / Laminin fra 10 cm dyrkningsskål og vask en gang med 10 ml PBS. Overføre alle neurosfærer til PLL / laminin-overtrukne 10 cm dyrkningsskål. Inkuber O / N ved 37 ° C, 5% CO2 i neurosfærerne klæbe til skålen.
4. Bestemmelse af NFU af Sample Neurosfærer (dag 8)
- Tæl antallet af neurosfærer (seedede på dag 1, afsnit 1) dannet i hver brønd under et mikroskop.
BEMÆRK: Bestem antallet af neurosfærer dannet pr 100 celler forgyldt, hvilket giver NFU.
5. Overdragelse af Sample Neurosfærer til 50-brønd Chambered Coverslip (dag 8)
- Coat hver brønd i en 50-brønd kamre dækglas med 10 pi PLL / Laminin coatingopløsning i 2 timer ved 37 ° C.
BEMÆRK: Forbered belægning løsning som beskrevet itrin 3.1. - Forbered 3 x 50 ml konisk centrifugerør indeholdende 30 ml PBS hver. Ved hjælp af steril pincet, fjern den coatede 50-godt kamre dækglas. Dyp kamre dækglas i det første rør PBS, efterfulgt af den anden og derefter det tredje rør PBS, at vaske belægningsopløsningen.
- Aspirere den resterende væske fra brøndene i kamre dækglas.
- pipette forsigtigt alle mellemstore og neurosfærer fra hver brønd i 96 brønde fad og overføre det til en enkelt 10 cm dyrkningsskål.
- Under et mikroskop, vælge en prøve neurosfære anvendelse af en P10 mikropipette monteret med en 10 pi pipettespids. Sørg for, at kun en enkelt neurosfære er plukket hver gang ved at indstille pipette kolonnen til 2 uL. Brug en ny pipettespids til hver neurosfære.
- Overfør neurosfære på midten af en brønd i den overtrukne 50-brønds kamre dækglas.
- Gentag trin 5.5 og 5.6 indtil hver brønd af kamre dækglas contains en neurosfære.
BEMÆRK: neurosfærer kan afhentes under et mikroskop placeret i en laminar flow hætte eller på en bordplade. - Tilsæt 10 pi NSC differentiering medium til hver brønd i kamre dækglas. Placer kamre dækglas i en 10 cm dyrkningsskål og pipette PBS langs kanterne af skålen for at forhindre udtørring af NSC differentiering medium. Placere op til to kamre dækglas i en 10 cm dyrkningsskål. Inkubér kamre dækglas (indeholdt i 10 cm dyrkningsskål) natten over ved 37 ° C, 5% CO2.
6. Differentiering af Sample Neurosfærer (dag 9)
- Overfør differentiering medium fra bulk dyrkede neurosfærer (fra punkt 3) til en 15 ml konisk centrifugerør. Sørg for, at 2-3 ml differentiering medium forbliver i kulturen parabol for at forhindre klæbet celler fra løsgøre. Ved hjælp af en 20 ml steril sprøjte, passere differentiering medium gennem et 0,2 μm filter til fjernelse af eventuelle celler eller debris.
- Transfer tilbage til 10 cm dyrkningsskål indeholdende de adhærerede celler den filtrerede differentiering medium.
- Under anvendelse af sterile pincetter, anbring forsigtigt kamre dækglas på differentiering medium i en omvendt måde, således at prøven neurosfærer vender nedad. Inkubere kamre dækglas med differentieringen medium i 3 dage ved 37 ° C, 5% CO2.
BEMÆRK: Prøven neurosfærer er i kontakt med differentieringen medium, men ikke i kontakt med de differentierende celler nedenunder.
7. Fastsættelse af differentierede Neurosfærer (Dag 12)
- Fjern forsigtigt det kamre dækglas fra 10 cm dyrkningsskål med sterile pincetter. dyppe forsigtigt dækglasset i PBS at vaske konditioneret medium.
- Træk silikone pakning fra dækglasset. Udfør denne blidt og langsomt for at undgå at bryde dækglasset. Vær opmærksom på den side, hvor the differentierede neurosfærer overholdes.
- Pipetter 1 ml 4% paraformaldehyd (PFA) på et stykke paraffin film skåret til størrelsen af dækglasset. Placer forsigtigt dækglas på paraffin film med neurosfærerne nedad i kontakt med PFA. Fastsætte neurosfærer i 20 minutter ved stuetemperatur.
Advarsel: PFA er giftigt både i flydende og dampform og er brændbart. Undgå indånding af dampe og kontakt med hud og øjne. Altid håndtere PFA i et ventileret stinkskab. - Pipetter 1 ml PBS på et stykke paraffin film. Vask neurosfærerne ved forsigtigt at placere dækglasset med neurosfærerne nedad i kontakt med PBS i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Gentag trin 7.4 to gange mere.
8. O4 Farvning af differentieret Neurosfærer (Dag 12)
- Forbered 3% bovint serumalbumin (BSA) i PBS. Pipetter 1 ml 3% BSA på et stykke paraffin film. Bloker neurosfærer ved forsigtigt placing dækglasset (med neurosfærerne nedad) i kontakt med BSA i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Pipetter 1 ml muse-anti-O4 IgM antistof (1: 300 fortynding i 3% BSA) på et stykke paraffin film og placere dækglasset på paraffin film med neurosfærerne nedad i kontakt med antistoffet. Tillad O4 farvning at forekomme i 2 timer ved stuetemperatur.
- Vask dækglasset to gange med PBS som beskrevet i trin 7.4.
- Pipetter 1 ml grønt fluorescerende farvestof konjugeret-anti-muse-IgM sekundært antistof (1: 500 fortynding i 3% BSA) på et stykke paraffin film og placere dækglasset på paraffin film med neurosfærerne nedad i kontakt med antistoffet . Orlov til 1 time ved stuetemperatur i mørke.
BEMÆRK: Udfør immunfarvning i mørke omgivelser fra dette trin og frem. - Vask dækglasset to gange med PBS som beskrevet i trin 7.4.
9. TUJ1 og gliafibrillært surt protein (GFAP) Farvningaf differentierede Neurosfærer (Dag 12)
- Forbered permeabiliserende opløsning ved tilsætning af Triton-X 100 (slutkoncentration: 0,5%) til 3% BSA. Pipetter 1 ml permeabiliserende opløsning på et stykke paraffin film. Placer dækglas på paraffin film med neurosfærerne nedad i kontakt med permeabiliserende opløsning i 20 minutter ved stuetemperatur.
- Vask dækglasset to gange med PBS som beskrevet i trin 7.4.
- Pipetter 1 ml muse-anti-TUJ1 IgG2a antistof (1: 500 fortynding i 3% BSA) og kanin-anti-GFAP-IgG-antistof (1: 1000 fortynding i 3% BSA) på et stykke paraffin film og sted dækglas på paraffin film med neurosfærerne nedad i kontakt med antistofferne. Tillad TUJ1 og GFAP-farvning at forekomme i 2 timer ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Begge antistoffer kan fremstilles som en enkelt opløsning. - Vask dækglasset to gange med PBS som beskrevet i trin 7.4.
- Pipetter 1 ml rødt fluorescerende farvestofkonjugeret-anti-muse-IgG 2a (1: 500 fortynding i 3% BSA) og langt rødt fluorescerende farvestof konjugeret-anti-kanin IgG (1: 500 fortynding i 3% BSA) sekundære antistoffer på et stykke paraffin film og sted dækglasset på paraffin film med neurosfærerne nedad i kontakt med antistofferne. Lad i 1 time ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Begge antistoffer kan fremstilles som en enkelt opløsning. - Vask dækglasset to gange med PBS som beskrevet i trin 7.4.
- Fortynd 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) stamopløsning til 300 nM i PBS. Pipetter 1 ml DAPI på et stykke paraffin film og sted dækglas på paraffin film med neurosfærerne nedad i kontakt med DAPI i 2 minutter ved stuetemperatur i kerner farvning.
- Vask dækglasset gang med PBS og to gange med deioniseret vand som beskrevet i trin 7.4. Montere dækglasset på et objektglas under anvendelse af en egnet monteringsmedium og lad tørre O / N ved stuetemperatur.
10. Imaging af differentierede Neurosfærer (Dag 13)
- Billede neurosfærer under en konfokal mikroskop ved hjælp af en 40X. Brug lasere ved 488 nm, 594 nm og 647 nm for at påvise oligodendrocytter, neuroner og astrocytter, hhv.
- Bestem procentdelen af unipotente, bipotente og tripotent neurosfærer.
BEMÆRK: Styrken bestemmes ved evnen af neurosfæren til at differentiere til de tre neurale slægter - oligodendrocytter, neuroner og astrocytter 5,14,15,26. Oligodendrocytter identificeres ved positiv farvning for O4 (afsnit 8). Neuroner identificeres ved positiv farvning for TUJ1 (afsnit 9). Astrocytter identificeres ved positiv farvning for GFAP (afsnit 9). En unipotente neurosfære differentierer ind kun en af afstamning og bør positivt plette til enten O4, GFAP eller TUJ1. En bipotent neurosfære differentierer i to slægter og bør positivt plette for O4 og GFAP eller O4 og TUJ1 eller GFAP og TUJ1. En tripotent neurosphære anderledesIates ind i alle tre slægter og bør positivt plette for O4, GFAP og TUJ1. - Bestem NSC frekvens i populationen af interesse ved hjælp af følgende formel:
NSC frekvens = (NFU x% af tripotent neurosfærer) / 100%.
Representative Results
Vi har brugt denne protokol til at vurdere evnen lex, en kendt celle overflade NSC markør 7, for at berige for NSC. Data fra denne undersøgelse vil blive anvendt til at illustrere, hvordan NSC'er optælles under anvendelse af de klonale assays i protokollen. E14.5 mus neurosfære-celler blev inkuberet med anti-LeX antistof. Efterfølgende celler, som udtrykker Lex (LeX +), og celler, som ikke udtrykker Lex (LeX -) blev podet med 50 celler / mL ved fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) og efterladt for at generere klonale neurosfærer i 1 wk. Time-lapse billeddannelse viser, neurosfærerne genereret ved 50 celler / ml er klonal (figur 2). NFU for LeX + og LeX - celler blev bestemt. Det vises, at lex + celler har en væsentlig højere neurosfære dannelse kapacitet sammenlignet med LeX - celler (figur 3g). Neurosfærerne genererede blev derefter differentieretunder klonale betingelser, efterfølgende immunfarvet og afbildes (figur 3a-e). Lex + celler genererer betydeligt flere tripotent neurosfærer end LeX - celler (figur 3f). NSC frekvens blev derefter beregnet baseret på NFU og% af tripotent neurosfærer (figur 3g). Udvælgelse baseret på Lex beriger NSC frekvens med mere end 14 gange, validering LeX som NSC markør. Vi har også bestemt NSC hyppigheden af E14.5 mus neurosfærer ved hjælp af denne protokol 27 og NCFCA 28. Begge metoder rapporterer sammenlignelig NSC frekvens på omkring 2% i E14.5 mus neurosfærer.
Figur 1. Protokol for neurosfære Differentiering under Klonale Betingelser. Sample neurosfærer dyrket under klonede betingelser er individuelt placeret i hver PLL / laminin-coated brønd af en 50-brønds kamre dækglas og får lov til at klæbe O / N. På samme dag, bliver store dyrkede neurosfærer udpladet i differentiering medium i en PLL / Laminin-coated 10 cm skål og fik lov til at klæbe O / N. Den næste dag, konditioneret medium fra bulk dyrkede neurosfærer filtreres og føres tilbage i 10 cm skål. Eksempelbillederne neurosfærer derefter vendes på konditionerede medium og fik lov til at differentiere i 3-4 dage 28. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Vækst af en klonal neurosfære. Celler afledt af E14.5 neurosfærer blev dissocieret og podet ved 50 celler / ml i 96-brønds skål. Individuelle celler blev sporet i 6 d ved time-lapse billeddannelse. Billeder af one sådan celle udvikle sig til en neurosfære er vist. Bemærk, at neurosfære opretholder klonalitet. (A) 0 dage; (B) 1.19.45; (C) 2.95.37; (D) 3.32.76; (E) 4.46.53; (F) 5.61.44; hvor det første tal refererer til den dag, andet tal refererer til den del af dagen, og tredje tal refererer til den del af den h. 10X forstørrelse. Scale bar, 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Differentiering af Klonal Neurosfærer og optælling af NSC Frequency. Enkelte neurosfærer blev plukket og differentieret i 50-godt kamre dækglas i 3 d. Et repræsentativt billede af en tripotent neurosfære stained med (a) DAPI og immunfarvet for (b) GFAP, (c) TUJ1 og (d) O4. (E) Viser overlejring af (a) - (d). Scale bar, 65 um. (F)% af unipotente, bipotente og tripotent neurosfærer dannet af Lex + og LeX - celler (gennemsnit ± SEM, n = 3). (G) NSC frekvens i LeX + og LeX -. Celler beregnet som produktet af NFU og% af tripotent neurosfærer Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Vi beskriver hee opregningen af NSC'er under klonede betingelser. Kritiske trin indbefatter anvendelsen af frisk NSC vækst og differentiering medium, og også anvendelsen af frisk fremstillet PLL / laminin opløsning til at overtrække kamre dækglas, samt dyrkningsskålene. Dette sikrer optimale vækst- og differentieringsfaktorer betingelser for neurosfærer. Anvendelsen af god kvalitet antistoffer til effektivt at detektere de neuroner og glia, samt den selektive plukning af klonale neurosfærer, som ikke er i kontakt med andre neurosfærer, er kritiske. Endvidere er det vigtigt at sikre de plukkede neurosfærer ikke tørrer ud. Det anbefales at tilføje 10 uL af differentiering medium til hver brønd efter plukningen hver 10 neurosfærer. Det er vigtigt at bruge en kamre dækglas i en 10 cm skål per prøve at undgå krydstale mellem neurosfærer fra forskellige prøver. Hvis to dækglas (der hver indeholder neurosfærer fra forskellige prøver) er anbragt isamme 10 cm skål, kan neurosfærer fra én dækglas frigive faktorer, der kan ændre tilbøjelighed neurosfærer i den anden dækglasset til at differentiere til specifikke afstamninger. To dækglas i samme 10 cm skål kan også resultere i blanding op mellem prøver.
I tilfælde NFU eller NSC frekvens er lavere end forventet, at lav passagenummer neurosfærer anvendes. Det er også vigtigt, at sunde lavpassage neurosfærer anvendes til generering konditioneret medium. Hvis dernæst neurosfærerne dyrkes i brønde med lille diameter, såsom i 96-brønds skål, så vil det være vanskeligt at manøvrere og bryde neurosfærer anvendelse af en mikropipette. I dette tilfælde, overføre neurosfærer til et større dyrkningsskål, såsom en 6-brønds skål, før plukning. Nogle af de plukkede neurosfærer kan løfte fra kamre dækglas under dyrkning og immunfarvning. Minimering af bevægelsen af kamre dækglas under dyrkning, og mindre intensiv vasking under immunfarvning, vil bidrage til at undgå frigørelse af neurosfærer.
Indledende undersøgelser kvantificeres NSC'er kun med NFA 7,11,13. Men NFA overvurderer, NSC frekvens som både NSC'er og tidlige NP'er generere neurosfærer 5. Louis et al. Udviklet en anden metode til at kvantificere NSC'er kendt som NCFCA 21,22. Den NCFCA involverer dyrkning enkelte celler i en kollagenbaseret matrix at sikre klonalitet, og det blev vist, at neurosfærer over 2 mm i diameter dannes af kun NSC'er. Svarende til NCFCA, er klonalitet sikres i hele denne protokol. Dette opnås ved at generere neurosfærer ved klonal densitet og differentiering af neurosfærer i kamre dækglas. Anvendelsen af kamre dækglas giver en række fordele. Den kamre dækglas tillader hver prøve neurosfære at differentiere uden at have fysisk kontakt med andre prøve neurosfærer og dermed sikre klonalitet under differentiering.Den kamre dækglas kan placeres ophængt på differentiering medium til Lad prøven neurosfærer skal løbende konditioneres og for at sikre maksimal differentiering. I fravær af konditioneret medium og serum under differentiering, overlevelse neurosfærer falder, og neurosfærerne meste generere astrocytter (Tham M og Ahmed S, ikke offentliggjort). Desuden kan de immunfarvet neurosfærer bekvemt opbevares i længere tid og de kamre dækglas kan monteres direkte på mikroskopet objektglas. Derudover er billeddannelse af de immunfarvet neurosfærer nemt som man hurtigt kan finde neurosfære i den lille kamre godt, tage et billede, og gå videre til den næste brønd.
Vi har bestemt NSC frekvens i E14.5 mus neurosfære kultur ved hjælp af både protokollen beskrevet i dette manuskript 27 og NCFCA 28. NSC frekvens i E14.5 mus neurosfærer bestemt af både migthods er sammenlignelige. Den NCFCA opregner NSC'er der er multipotente og har langsigtede selvfornyelse kapacitet. Da NSC frekvens fra vores metode kan sammenlignes med, at der fra NCFCA, er udlæsningen fra vores protokol ikke at overvurdere NSC frekvens. Den NCFCA kræver tre uger, der skal udfyldes og hovedsagelig involverer celleudpladning og mellemstore genopfyldning. Protokollen beskrevet her kræver 13 dage til at udføre og involverer en anden række trin, fx neurosfære plukning og immunfarvning. Denne protokol kunne tjene som en alternativ metode til at opregne NSC'er. Forskere kan bruge både NCFCA og denne protokol til at kontrollere NSC frekvens i deres prøver.
En begrænsning af denne protokol er, at en række vigtige skridt skal alle udføres på dagen 8. Forberedelsen af konditioneret medium, bestemmelse af NFU af prøven neurosfærer, og overførsel af prøven neurosfærer til 50-godt kamre dækglas skal være udført på day 8. Man kunne tage tid at udføre disse trin. Desuden kræver det praksis at udføre disse trin på en effektiv måde.
Neurosfærer er ofte blevet brugt til at studere NSC funktion og adfærd. Men neurosfærer består af både NSC'er og NP'er. Derfor er det vigtigt at berige NSC'er fra neurosfærer at studere NSC biologi. I øjeblikket har celleoverflademarkører, farveeksklusion ejendom og til cellestørrelse og granularitetskravene blevet anvendt til at berige for NSC'er 6,7,9-13,29,30. Denne protokol kan bruges til at kvantificere berigelse NSC'er potentielle NSC markører, og for at lette søgningen efter en endelig NSC markør. Fire nylige undersøgelser har brugt denne protokol at optælle NSC frekvens 5,14,15,26.
Acknowledgments
Vi takker agenturet for Videnskab, Teknologi og Forskning (A * STAR), Singapore for at finansiere denne forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical centrifuge tubes | BD | 352096 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | BD | 352070 | |
| 20 mL sterile syringe | BD | 300141 | |
| 50 mL sterile syringe | BD | 300144 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S1810 | |
| Mouse anti-Tuj1 IgG2a antibody | Covance | MMS-435P-100 | |
| Rabbit anti-GFAP IgG antibody | Dako | Z033401 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Microscope fitted to laminar flow hood | Leica | MZ6 | |
| Glass slides | Marienfeld-superior | 1000200 | |
| Mouse anti-O4 IgM antibody | Merck Millipore | MAB345 | |
| Hydromount | National Diagnostics | HS-106 | |
| Microscope | Nikon Eclipse | TS100-F | |
| Laminar flow hood | NuAire | NU-543 | |
| 96-well culture dishes | NUNC | 167008 | |
| 10-cm culture dishes | NUNC | 150350 | |
| Paraffin film | Parafilm | PM999 | |
| Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant human basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| 0.2 µm filter | Sartorius Stedim | 16534-K | |
| 0.45 µm filter | Sartorius Stedim | 16555-K | |
| 1.0 N Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| 1.0 N Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Poly-L-Lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Paraformaldehyde (PFA) powder | Sigma-Aldrich | P6148 | Toxic |
| Bovine Serum Albumin (BSA) powder | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| 50-well chambered coverslips | Sigma-Aldrich | C7735 | |
| Stir plate with heat function | Stuart | UC152 | |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320-033 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017-015 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody | Thermo Fisher Scientific | A21042 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG2a antibody | Thermo Fisher Scientific | A21135 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG antibody | Thermo Fisher Scientific | A31573 | |
| 4’,6’-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
| Cell-culture centrifuge | Thermo Fisher Scientific | RT1 75002383 | |
| Pasteur pipettes | Thermo Fisher Scientific | 10006021 | |
| CO2 incubator | |||
| Ventilated fume-hood | |||
| Aspirator | |||
| Confocal microscope | |||
| Micropipettes | |||
| Micropipette tips | |||
| Plastic pipettes | |||
| Multichannel pipettes | |||
| Glass beaker | |||
| Sterile forceps | |||
| pH meter |
References
- Ahmed, S. The culture of neural stem cells. J. Cell. Biochem. 106 (1), 1-6 (2009).
- Reynolds, B. A., Tetzlaff, W., Weiss, S. A multipotent EGF-responsive striatal embryonic progenitor cell produces neurons and astrocytes. J. Neurosci. 12 (11), 4565-4574 (1992).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and Population Analyses Demonstrate That an EGF-Responsive Mammalian Embryonic CNS Precursor Is a Stem Cell. Dev. Biol. 175 (1), 1-13 (1996).
- Narayanan, G., et al. Single-Cell mRNA Profiling Identifies Progenitor Subclasses in Neurospheres. Stem Cells and Dev. 21 (18), 3351-3362 (2012).
- Uchida, N., et al. Direct isolation of human central nervous system stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (26), 14720-14725 (2000).
- Capela, A., Temple, S. LeX/ssea-1 Is Expressed by Adult Mouse CNS Stem Cells, Identifying Them as Nonependymal. Neuron. 35 (5), 865-875 (2002).
- Capela, A., Temple, S. LeX is expressed by principle progenitor cells in the embryonic nervous system, is secreted into their environment and binds Wnt-1. Dev. Biol. 291 (2), 300-313 (2006).
- Corti, S., et al. Isolation and characterization of murine neural stem/progenitor cells based on Prominin-1 expression. Exp. Neurol. 205 (2), 547-562 (2007).
- Nagato, M., et al. Prospective characterization of neural stem cells by flow cytometry analysis using a combination of surface markers. J. Neurosci. Res. 80 (4), 456-466 (2005).
- Kim, M., Morshead, C. M. Distinct Populations of Forebrain Neural Stem and Progenitor Cells Can Be Isolated Using Side-Population Analysis. J. Neurosci. 23 (33), 10703-10709 (2003).
- Murayama, A., Matsuzaki, Y., Kawaguchi, A., Shimazaki, T., Okano, H. Flow cytometric analysis of neural stem cells in the developing and adult mouse brain. J. Neurosci. Res. 69 (6), 837-847 (2002).
- Rietze, R. L., Valcanis, H., Brooker, G. F., Thomas, T., Voss, A. K., Bartlett, P. F. Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain. Nature. 412 (6848), 736-739 (2001).
- Tham, M., et al. CSPG Is a Secreted Factor that Stimulates Neural Stem Cell Survival Possibly by Enhanced EGFR Signaling. PLoS ONE. 5 (12), e15341 (2010).
- Gan, H. T., Tham, M., Hariharan, S., Ramasamy, S., Yu, Y. H., Ahmed, S. Identification of ApoE as an autocrine/paracrine factor that stimulates neural stem cell survival via MAPK/ERK signaling pathway. J. Neurochem. 117 (3), 565-578 (2011).
- Ramasamy, S., Narayanan, G., Sankaran, S., Yu, Y. H., Ahmed, S. Neural stem cell survival factors. Arch. Biochem. Biophys. 534 (1-2), 71-87 (2013).
- Ahmed, S., et al. Transcription factors and neural stem cell self-renewal, growth and differentiation. Cell Adh. Migr. 3 (4), 1-12 (2009).
- Gritti, A., et al. Multipotent Neural Stem Cells Reside into the Rostral Extension and Olfactory Bulb of Adult Rodents. J. Neurosci. 22 (2), 437-445 (2002).
- Gritti, A., et al. Epidermal and Fibroblast Growth Factors Behave as Mitogenic Regulators for a Single Multipotent Stem Cell-Like Population from the Subventricular Region of the Adult Mouse Forebrain. J. Neurosci. 19 (9), 3287-3297 (1999).
- Vescovi, A. L., et al. Isolation and cloning of multipotential stem cells from the embryonic human CNS and establishment of transplantable human neural stem cell lines by epigenetic stimulation. Exp. Neurol. 156 (1), 71-83 (1999).
- Azari, H., Louis, S. A., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (49), e2639 (2011).
- Louis, S. A., et al. Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony-Forming Cell Assay. Stem Cells. 26 (4), 988-996 (2008).
- Coles-Takabe, B. L., et al. Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).
- Mori, H., Fujitani, T., Kanemura, Y., Kino-Oka, M., Taya, M. Observational examination of aggregation and migration during early phase of neurosphere culture of mouse neural stem cells. J. Biosci. Bioeng. 104 (3), 231-234 (2007).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat. Methods. 3 (10), 801-806 (2006).
- Yu, Y. H., et al. Purification, Visualization, and Molecular Signature of Neural Stem Cells. Stem Cells and Dev. 25 (2), 189-201 (2016).
- Yu, Y. H. C1qR1 is comparable with LeX and Prom1 as a neural stem cell marker. Identification of mouse embryonic neural stem cell surface markers. , Chapter 3.5, Figure 3.17 (2012).
- Tham, M. Neural colony-forming cell assay. A role for chondroitin sulfate proteoglycan in regulating the survival and growth of neural stem cells. , Chapter 3.6.3, Figure 3.22A (2009).
- Yuan, S. H., et al. Cell-Surface Marker Signatures for the Isolation of Neural Stem Cells, Glia and Neurons Derived from Human Pluripotent Stem Cells. PLoS ONE. 6 (3), e17540 (2011).
- Hall, P. E., Lathia, J. D., Miller, N. G. A., Caldwell, M. A., Ffrench-Constant, C. Integrins Are Markers of Human Neural Stem Cells. Stem Cells. 24 (9), 2078-2084 (2006).
