Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

신경 줄기 세포의 열거 클론 세이를 이용하여

doi: 10.3791/54456 Published: October 4, 2016

Summary

신경 줄기 세포 (NSCs의)는 자기 갱신과 세 가지 신경 계통으로 분화 할 수 세포를 참조하십시오. 여기서는 클론 조건 neurosphere 형성 및 분화를 이용하여 주어진 세포 집단에서 NSC 주파수를 결정하는 프로토콜을 기술한다.

Abstract

성상 세포, 신경 세포 및 희소 돌기 아교 세포 - 신경 줄기 세포 (NSCs을)를 갱신 자신과 세 가지 주요 신경 계통을 생성 할 수있는 기능이 있습니다. NSCs의 신경 전구 세포 (NPS는) neurosphere를 같은 시험관 내에서 일반적으로 배양한다. 이 프로토콜은 클론 조건 하에서 주어진 세포 인구의 NSC 주파수를 결정하는 방법을 자세히 설명합니다. 프로토콜은 neurosphere를 클론의 생성을 허용하는 농도로 세포의 파종 시작된다. neurosphere를 다음 챔버 커버 슬립에 전송하고 neurosphere를의 분화 잠재력을 극대화 컨디셔닝 매체에서 클론 조건에서 차별화된다. 마지막으로, NSC 주파수 neurosphere 능성 형성 및 기능에 기초하여 계산된다. 이 프로토콜의 유틸리티 후보 NSC 마커의 평가, NSCs을 정화하고, NP에에서 NSCs을 구별 할 수있는 능력을 포함한다. 이 방법은 다량의 인 수행 십삼일 얻어현재의 방법보다 horter는 NSC 주파수를 열거합니다.

Introduction

신경줄 기세포 (NSCs의)은 자기 갱신 및 능성 수있는 중추 신경계 (CNS)의 셀이다. NSCs을 먼저 배아 전뇌의 개발 기간 동안 지정된 및 측면 심실의 뇌실 영역 (SVZ)와 해마의 치아 이랑 (DG)으로 특정 지역에서 성인 뇌에 계속 계속된다. NSC 라인들의 개수는 배튼 병 (1)과 같은 행정 및 다른 신경 질환의 치료를위한 임상에 사용되고있다.

NSCs의 신경 전구 세포 (NPS는) neurosphere를 호출 3 차원 회전 타원체 구조를 부동으로 문화에 전파됩니다. 이들은 배아 및 성체 피질 세포는 표피 성장 인자 (EGF)와 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF) 2-4의 존재 나눌 수 있다는 것을 발견했을 neurosphere 배양 시스템은 1990 년대 초 레이놀즈와 바이스에 의해 개발되었다. neurosphere를은 C의 이종 혼합 구성다른 발달 단계 5에서 서브 클래스의 포함 ELL 학생. 이 때문에 구체적으로 된 NP의 존재 neurosphere를 얻은 데이터를 이용 NSCs의 공부 도전. 그러므로, neurosphere를으로부터 NSCs의 농축 중요하다. 현재, 네 가지 방법은 시험 관내 NSCs을 위해 농축하는데 사용되어왔다. 먼저 세포 표면 마커의 사용이다. 루이스-X (LEX)와 (도 Prominin1라고도 함) CD133은 NSC가 6-9 마커 가장 눈에 띄는 세포 표면입니다. Syndecan-1, 노치-1과 인테그린-β1은 NSCs의 10 풍요롭게 다른 표면 단백질이다. 두 번째 염료 제외입니다. 형광 DNA 결합 훽스트 33342 염색을 펌프에 고유 한 능력을 가지고 사이드 인구 셀, 11 NSCs의 농축되는 것으로 나타났다. 셋째 형태 선택의 사용이다. 증가 셀 크기와 입도와 세포가 자신의 대응 5,12,13보다 더 NSCs의 항구 것을 증명하고있다. 넷째 NSC 스와의 추가이다문화 매체에 rvival 요인. 그것은 콘드로이틴 황산 프로테오글리칸의 추가를 보였다과 아포 지단백 E는 NSC의 생존을 향상시키고, 따라서 NSC 주파수 14, 15을 증가시킨다. 전사 인자를 포함하여 많은 마커 NSCs의 16, 17과 연관되어 있지만, 이러한 마커 중 어느 것도 순도에 NSCs을 농축 할 수 없습니다. 최종 NSC 마커의 부족으로 인해, 그것은 NSCs의 정량화 및 시험 관내에서 NP에 구별 할 과제로 남아.

초기 연구는 NSCs의 7,11,13을 정량화하기 위해 neurosphere 형성 분석 (NFA)를 사용했다. 이 분석에서, 세포를 해리 neurosphere를 형성하는 배양하고 neurosphere를 수가 결정된다 도금 매 100 세포 생성. 이 값은 Neurosphere 형성 장치 (NFU)로 불린다. 모든 neurosphere를가 NSCs을에서 발생하는 경우 NFU는 NSC 주파수를 동일합니다. 그러나, neurosphere를 양쪽 NS에 의해 형성되는 것과 NFU은 NSC 주파수 과대 평가 것으로 나타났다CS 초 NP에 5. 따라서, 전적으로 neurosphere 형성에 따라 NSCs의를 열거 할 수 정확합니다. 그것은 그들의 능력에 따라 NSCs을 정량화 할 수있을 수있다, 자기 갱신 광범위하게 확산 및 능성 neurosphere를를 생성합니다.

응답 EGF와 bFGF에있는 NSCs의는 일반적으로 최소 10 구절 생존 따라서 문화 4,18-20 광범위한 자기 갱신 용량을 표시합니다. 물론 반응 EGF 및 bFGF를이다 NPS는, 또한 장시간 몇 통로 아니지만위한 neurosphere를 생성 할 수있다. 따라서, 널리 선의 NSCs의 적어도 열 통로 용 neurosphere 형성에 기초한 공정 정밀도로 열거 할 수 있다고 인정되어왔다. 대부분의 연구에서, 그러나, 자기 갱신은 일반적으로 인한 열 통로에 필요한 장기 실험 시간에 2 차 또는 3 차 neurosphere 형성에 기초하여 측정된다. 이 때문에, NFA 차 광범위자가 재생산 능력 내기를 비교하는데 사용될 수있다싸우는 인구는하지만 정확하게 NSC 주파수를 열거 할 수 없습니다.

NSCs의은 NP에 비해 더 증식 능력을 가지고있다. NSCs을의이 속성은 루이 등의 알에 의해 사용되었다. 신경 식민지 형성 세포 분석 (NCFCA) 21, 22 - NSC 열거에 대한 분석을 개발. 이 분석에서, 단일 세포는 콜라겐 - 함유 매트릭스 반고체 3 주 동안 배양된다. 이러한 배양 조건에서, 그것은 직경이 2mm 이상 neurosphere를 형성 세포가 tripotent하고 장기적으로 자기 갱신 할 수 있습니다 것으로 나타났다. 이 세포들은 NSCs의로 정의됩니다. 따라서, NP는 NSCs을 효과적으로 구별된다.

NSCs의 성상은, 희소 돌기 아교 세포 및 신경 세포로 분화 할 수있는 능력을 가지고있다. neurosphere를 분화를 들어, 성장 인자를 제거하고, 혈청 배양 배지에 첨가한다. 세 가지 신경 계통은 그 neurosphere을 시작한 후, 셀 neurosphere에서 관찰하는 경우 전NSC는이야. 그러나, 차별화 분석은 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 차별화에 사용 된 배양 조건은 세 가지 신경 계통의 생성을위한 최적되지 않을 수 있습니다. 사실, 단일 neurosphere 분화 과정에서 현저한 세포 사멸이 발생 주로 성상 세포 생성 (M 탐 및 미공개 아메드 S 등)를 발생한다. 둘째, clonality의 문제가 있습니다. NSCs의, neurosphere를 형성 및 분화의 정확한 계산을위한 각 neurosphere가 하나의 셀에서 발생 클론 조건 하에서 수행되어야한다. 벌크 현탁 배양에서 집계는 세포 및 neurosphere 수준 23-25 모두에서 발생한다. 각 neurosphere가 neurosphere 세고 능성의 평가를 복잡하게하거나 neurosphere를 여러 셀에서 발생하기 때문에, 그것이 가능하다. 최근의 증거는 세포의 집계는 0.5 세포 / 아래 μL 또는, 그리고 낮은 도금 밀도로 발생하지 않음을 보여줍니다 배양 플레이트는 NEU 동안 이동하지 않을 때rosphere 형성 15. 따라서 clonality을 보장 할 저밀도에서 세포를 배양.

현재는 NP에 NCFCA에서 NSCs의 구별 및 NSC 주파수를 열거 가장 널리 사용되는 방법이다. NCFCA 그러나 3 주 비교적 긴 시간을 필요로한다. 여기서는 능성 neurosphere를 형성하는 NSCs의 능력에 기초 NSC 주파수를 열거하는 프로토콜을 기술한다. 이 프로토콜은 수행하기 위해 단지 13 일이 소요됩니다. 콜라겐 매트릭스 neurosphere를 이동 방지 같이 NCFCA는 clonality을 보장한다. 이 프로토콜에서 사용되는 배양 조건은 clonality을 통하여 유지 될 수있다. 예를 들면, 50- 웰 챔버 커버 슬립의 사용은 neurosphere를 서로 접촉하지 않고 구별 할 것을 보장한다. 또한, 우리는 neurosphere를 (그림 1)의 분화 잠재력을 극대화하기 위해 차별화하는 동안 신경 영양 인자를 공급 매체 에어컨 사용합니다.

Protocol

동물의 치료는 동물 부서 ((http://www.brc.astar.edu.sg/index.php?sectionID-11)를 IACUC 및 NACLAR 지침에 따라 수행하고 승인을 받았다.
주 : Neurosphere 배양 / 6 마우스는 앞서 설명한 배아 5 (E14)의 C57BL 전뇌로부터 제조 하였다.

문화 클론 샘플 neurosphere를 1. (1 일)

  1. , EGF (최종 농도 20 NG / ㎖), bFGF를 (최종 농도 10 NG / : B27 보충제로 둘 베코 변형 이글 배지 / 보조제 F는-12 (DMEM은 / F12) 매체를 조합하여 (1X 최종 농도) NSC 성장 배지를 준비 mL) 및 페니실린 / 스트렙토 마이신 (최종 농도 : 1X).
  2. 1 mL의 NSC 성장 매체와 실온에서 7 분 1 mL의 0.05 N 수산화 나트륨에 E14.5 마우스 neurosphere를을 떼어 놓다. 피펫 세포는 위아래로 때때로 정지 세포를 유지합니다. 중립 0.05 N 염산 1 mL를 넣고알칼리을이지는.
    주 : Neurosphere 세포 10㎝ 배양 플레이트에 20,000 세포 / ㎖로 접종하고 37 ℃, 5 % CO 2에서 5 (D)에 대한 배양된다. 예상 수익률은 후 10cm 접시 당 약 1000 만 셀입니다. 이들 세포를 해리 단계는 각각 1.2 및 1.3에 기술 된 바와 같이 클론 밀도로 시딩한다.
    1. 트리 판 블루 염색 및 혈구를 사용하여 세포 수를 수행합니다.
  3. 96 웰 접시 / ㎖ 이하 100 μL NSC 성장 배지 50 세포의 밀도로 시드 단일 E14.5 마우스 neurosphere 셀. 클론 neurosphere를 생성하는 승 37 ° C 1, 5 % CO 2에서 세포를 품어.
    주 : 세포가 서로 접촉하지 않는 Clonality이 밀도 neurosphere 형성하는 동안 보장된다.

조정 배지에 대한 neurosphere를 2. 문화 (3 일)

  1. 단계 1.2에 설명 된대로 E14.5 마우스 neurosphere를을 떼어 놓다.
  2. E에서 씨앗 하나의 세포10cm의 배양 접시에서 10 ㎖ NSC 성장 배지에서 20,000 세포 / ㎖의 밀도 14.5 neurosphere를 마우스. 대량 배양 neurosphere를 생성하기 위해 5 일 동안 37 ° C에서 5 % CO 2에서 세포를 인큐베이션.

중간 금연실 Neurosphere 3. 준비 (8 일)

  1. 700 μL를 혼합하여 코팅액을 제조 0.01 % 폴리 -L- 라이신 (PLL) 70 mg을 1 μL / ㎖ 라미닌 및 인산염 완충 식염수 230 μL (PBS).
  2. 코트 37 ° C에서 2 시간 동안 PLL / 라미닌 용액 7 mL를 10㎝ 배양 플레이트.
  3. 10 ㎖의 혈청 피펫을 사용하여 15 mL의 원추형 원심 분리 튜브에 모두 벌크 배양 neurosphere를 옮긴다. 실온에서 1 분 동안 171 XG에 neurosphere를 원심 분리 완전히 뜨는을 제거합니다.
  4. 태아 소 혈청 (FBS) (최종 농도 0.5 %) 광고 (1X 최종 농도) B27에 DMEM / F12 배지를 조합 NSC 분화 배지를 준비neurosphere를에 NSC 차별화 매체의 D 10 ㎖. 최대 피펫과 몇 번 아래로 neurosphere를을 재현 탁 할 수 있습니다.
  5. 기음 PLL / 10 센티미터 배양 접시에서 라미닌 및 10 mL의 PBS로 한번 씻어. 는 PLL / 라미닌 코팅 10cm 배양 접시에 모든 neurosphere를 전송합니다. 37 ° C에서 O / N을 품어, neurosphere를 5 % CO 2는 접시를 준수합니다.

샘플 neurosphere를의 NFU 4. 결정 (8 일)

  1. (; 섹션 일일 1 시드) 잘 현미경으로 각각 형성 neurosphere를의 수를 계산합니다.
    참고 : NFU를 제공 도금 100 세포 당 형성 neurosphere를의 수를 결정합니다.

50 웰 챔버 커버 슬립에 샘플 neurosphere를 5. 전송 (8 일)

  1. 코트 37 ° C에서 2 시간 동안 PLL / 라미닌 코팅 용액 10 μL와 50 웰 챔버 커버 슬립의 각 웰.
    주 :에 기재된 코팅액을 제조3.1 단계.
  2. 각각 PBS 30 ㎖를 포함하는 3 × 50 mL의 원추형 원심 분리 튜브를 준비한다. 멸균 집게를 사용하여, 코팅 된 50 웰 챔버 커버 슬립을 제거합니다. 코팅 용액을 씻어, 제 다음 PBS의 제 튜브이어서 PBS의 제 튜브로 커버 슬립을 챔버 딥.
  3. 챔버 커버 슬립의 우물에서 남아있는 액체를 대기음.
  4. 조심스럽게 96 웰 접시의 각 우물에서 모든 매체 및 neurosphere를 피펫 단일 10cm의 배양 접시에 전송합니다.
  5. 현미경, 10 μL 피펫 팁 장착 된 P10의 마이크로 피펫을 사용하여 샘플 neurosphere를 선택. 단 하나의 neurosphere 2 μL에 피펫 열을 설정하여 각각의 시간을 포착되어 있는지 확인합니다. 각 neurosphere에 대한 새로운 피펫 팁을 사용합니다.
  6. 코팅 된 50 웰 챔버 커버 슬립의 잘의 중심 상에 neurosphere을 전송합니다.
  7. 반복 챔버 커버 슬립의 접점의 각 웰까지 5.5 및 5.6 단계neurosphere를 INS.
    주 :이 neurosphere를 층류 후드이나 탁상에 배치 현미경으로 포착 될 수있다.
  8. 챔버 커버 슬립의 각 웰에 10 μL NSC의 차별화 매체를 추가합니다. NSC의 분화 배지의 건조를 방지하기 위해 접시의 가장자리를 따라 10cm 배양 접시 피펫 PBS에서 챔버 커버 슬립을 놓는다. 한 10cm 배양 접시에 두 개의 챔버 커버 슬립까지 놓습니다. 하룻밤 37 ° C, 5 % CO 2에서 (10 센티미터 배양 접시에 포함)를 챔버 커버 슬립을 품어.

샘플 neurosphere를 6. 차별화 (9 일)

  1. 15 mL의 원뿔 원심 분리기 튜브 (섹션 3)에서 대량 배양 neurosphere를에서 분화 매체를 전송합니다. 차별화 매체의 2-3 ml의 분리에서 부착 된 세포를 방지하기 위해 배양 접시에 남아 있는지 확인합니다. 20 mL의 멸균 주사기를 사용하여, 0.2 μ 통해 분화 배지 합격m 필터는 모든 세포 나 이물질을 제거합니다.
  2. 다시 부착 된 세포를 포함하는 10cm 배양 접시에 필터링 된 차별화 매체를 전송합니다.
  3. 멸균 집게를 사용하여 부드럽게 샘플 neurosphere를 아래로 향되도록 반전 방식으로 차별화 매체에 챔버 커버 슬립을 배치합니다. 37 ° C에서 3 일의 차별화 매체와 챔버 커버 슬립을 품어, 5 % CO 2.
    주 : 샘플 neurosphere를가 분화 배지와 접촉하지만 밑의 분화 세포와 접촉한다.

차별화 된 neurosphere를 7. 고정 (주 12)

  1. 부드럽게 멸균 집게를 사용하여 10cm의 배양 접시에서 챔버 커버 슬립을 제거합니다. 부드럽게 컨디셔닝 매체를 씻어 PBS로 커버 슬립을 찍어.
  2. 커버 슬립의 실리콘 가스켓을 벗겨. 커버 슬립을 위반하지 않도록 부드럽게 천천히이를 수행합니다. 여기서 번째 측면을주의 깊게 살펴전자 차별화 된 neurosphere를가 부착되어 있습니다.
  3. 커버 슬립의 크기로 잘라 파라핀 필름 조각 상에 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)의 1 mL의 피펫. 조심스럽게 PFA와 접촉 아래로 향하게 neurosphere를 가진 파라핀 필름에 커버 슬립을 배치합니다. 실온에서 20 분 동안 neurosphere를 수정.
    주의 : PFA 독성 모두 액체 또는 증기 형태이며 가연성이다. 증기의 흡입을 피하고 피부와 눈에 문의하십시오. 항상 환기 흄 후드에서 PFA를 처리합니다.
  4. 파라핀 필름의 조각 위에 PBS의 피펫 1 mL를. 부드럽게 neurosphere를 실온에서 10 분 동안 PBS 접촉 아래쪽으로 향하게하여 커버 슬립을 배치하여 neurosphere를 씻는다.
  5. 단계를 반복 7.4 두 번 더.

차별화 된 neurosphere를 8. O4 염색 (주 12)

  1. PBS에서 3 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 준비한다. 파라핀 필름의 조각 상에 3 % BSA의 피펫 1 mL를. 부드럽게 placin하여 neurosphere를 차단g 실온에서 30 분 동안 BSA와 접촉 (neurosphere를 아래로 향하게)을 커버 슬립.
  2. 피펫 한 마우스 항 O4 대한 IgM 항체 ㎖의 파라핀 필름 조각 상 (1 3 % BSA 300 희석)와 항체와 접촉 아래쪽으로 향하게 neurosphere를 갖는 파라핀 필름상의 커버 슬립을 배치했다. O4 염색은 실온에서 2 시간 동안 발생할 수 있습니다.
  3. 단계 7.4에 설명 된대로 PBS로 두 번 커버 슬립을 씻으십시오.
  4. 녹색 형광 염료 결합 - 항 - 마우스 IgM의 이차 항체 피펫 1 ㎖ (1 : 500 3 % BSA에서 희석) 파라핀 필름 조각 상에 상기 항체와 접촉 아래쪽으로 향하게 neurosphere를 갖는 파라핀 필름상의 커버 슬립을 배치 . 어둠 속에서 실온에서 1 시간 동안 둡니다.
    주 : 이후이 단계에서 어두운 환경에서 면역 염색을 수행합니다.
  5. 단계 7.4에 설명 된대로 PBS로 두 번 커버 슬립을 씻으십시오.

9. Tuj1 및 glial fibrillary 산성 단백질 (GFAP) 염색차별화 된 neurosphere를의 (주 12)

  1. 3 % BSA로 : 트리톤-X 100 (0.5 % 최종 농도)를 추가하여 솔루션을 permeabilizing 준비합니다. 파라핀 필름의 조각에 솔루션을 permeabilizing의 피펫 1 mL를. 실온에서 20 분 동안 permeabilizing 솔루션과 접촉 아래로 향하게 neurosphere를 가진 파라핀 필름에 커버 슬립을 놓습니다.
  2. 단계 7.4에 설명 된대로 PBS로 두 번 커버 슬립을 씻으십시오.
  3. 마우스 피펫 1 ㎖의 항 Tuj1의 IgG 2A 항체 (1 : 500 3 % BSA에서 희석) 및 토끼 항 GFAP IgG 항체 (1 : 3 % BSA 1000 희석) 파라핀 필름 위 커버 슬립 조각 상에 항체와 접촉 아래쪽으로 향하게 neurosphere를 갖는 파라핀 필름. Tuj1 및 GFAP 염색은 실온에서 2 시간 동안 발생할 수 있습니다.
    주 : 두 항체는 단일 용액으로서 제조 될 수있다.
  4. 단계 7.4에 설명 된대로 PBS로 두 번 커버 슬립을 씻으십시오.
  5. 빨간색 형광 염료의 피펫 1 mL의결합 - 항 - 마우스 IgG의 2A (1 : 3 % BSA 500 희석) 및 원거리 적색 형광 염료 결합 - 항 - 토끼의 IgG (1 : 3 % BSA 500 희석) 파라핀 필름 위의 조각 상 이차 항체 항체와 접촉 아래쪽으로 향하게 neurosphere를 갖는 파라핀 필름 커버 슬립. 실온에서 1 시간 동안 둡니다.
    주 : 두 항체는 단일 용액으로서 제조 될 수있다.
  6. 단계 7.4에 설명 된대로 PBS로 두 번 커버 슬립을 씻으십시오.
  7. PBS 300 nm의 4 ', 6-diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI) 원액을 희석. 핵 염색 실온에서 2 분 동안 DAPI와 접촉 아래쪽으로 향하게 neurosphere를 가진 파라핀 필름에 파라핀 필름 및 장소 coverslip에 조각 위에 DAPI의 피펫 1 mL를.
  8. 단계 7.4에 기술 된 바와 같이 탈 이온수로 한 번 PBS와 두 번 커버 슬립을 씻으십시오. 적합한 설치 매체를 사용하여 유리 슬라이드에 커버 슬립을 마운트하고 실온에서 O / N을 건조 할 수 있습니다.

10. 난 ...차별화 된 neurosphere를의 카 (주 13)

  1. 40 배를 사용하여 공 초점 현미경 이미지 neurosphere를. 각각 희소 돌기 아교 세포, 신경 세포와 성상 세포를 감지하는 488 nm의, 594 nm에서 647 nm의 레이저를 사용합니다.
  2. 멱 일원, bipotent 및 tripotent neurosphere를의 비율을 결정합니다.
    참고 : - 희소 돌기 아교 세포, 신경 세포와 성상 세포 5,14,15,26 효능이 세 가지 신경 계통으로 분화 할 수있는 neurosphere의 능력에 의해 결정된다. 희소 돌기 아교 세포는 O4 (8 항)에 대한 긍정적 인 얼룩으로 식별됩니다. 뉴런은 Tuj1 (섹션 9)에 대한 긍정적 인 얼룩으로 식별됩니다. 성상 교세포는 GFAP (섹션 9)에 대한 긍정적 인 얼룩으로 식별됩니다. 멱 일원 neurosphere는 혈통의 한으로 차별화 긍정적 O4, GFAP 또는 Tuj1 중 하나에 대한 얼룩한다. bipotent의 neurosphere는 두 계통으로 차별화 적극적으로 O4와 GFAP 또는 O4 및 Tuj1 또는 GFAP 및 Tuj1에 대한 얼룩한다. 다른 tripotent의 neurosphere세 가지 계통으로 iates 긍정적 O4, GFAP 및 Tuj1에 대한 얼룩한다.
  3. 다음 공식을 사용하여 관심있는 인구 NSC 주파수를 결정합니다 :
    NSC 주파수 = (tripotent의 neurosphere를의 NFU의 X %)을 / 100 %.

Representative Results

우리 NSCs을 위해 농축 렉스 알려진 세포 표면 마커 NSC (7)의 능력을 평가하기 위해,이 프로토콜을 사용 하였다. 이 연구의 데이터는 NSCs의이 프로토콜의 클론 분석을 사용하여 열거하는 방법을 설명하기 위해 사용됩니다. E14.5 마우스 neurosphere 세포는 안티 렉스 항체로 배양 하였다. 그 후 렉스 (LEX를 -) 표현하지 않는 렉스 (LEX +) 세포를 발현하는 세포는 (FACS)을 정렬 형광 활성 세포 50 세포 / ㎖에 접종하고 1 주당 위해 클론 neurosphere를 생성하기 위해 남았다. 시간 경과 영상은 neurosphere를 50 세포에서 생성 된 것을 알 수 / ㎖의 클론 (그림 2)입니다. 렉스 +와 렉스의 NFU는 - 세포를 측정 하였다. 셀 (도 3G) - 이는 렉스 + 세포 렉스에 비해 상당히 높은 neurosphere 형성 능력을 가지고 있음을 나타낸다. 생성 된 neurosphere를는 차별화 된클론 조건 하에서 연속적으로 면역 염색하고 (도 3a-e)를 묘화. 세포 (그림 3 층) - 렉스 + 세포는 훨씬 더 tripotent의 렉스보다 neurosphere를를 생성합니다. NSC의 주파수는 다음과 NFU tripotent의 neurosphere를 (도 3g)의 %를 기준으로 계산 하였다. 렉스에 따라 선택은 NSC 마커로 렉스의 유효성을 검사 이상 14 배 NSC 주파수를 풍요롭게. 우리는 또한이 프로토콜 27 NCFCA (28)를 사용하여 E14.5 마우스 neurosphere를의 NSC 주파수를 결정했다. 두 가지 방법 모두 E14.5 마우스 neurosphere를 약 2 %의 비교 NSC 주파수를보고합니다.

그림 1
클론 조건에서 Neurosphere 차별화 그림 1. 프로토콜. 클론 조건 하에서 성장 샘플 neurosphere를 개별적으로 각각의 PLL / 라미닌-C에 위치물론 50 웰 챔버 커버 슬립의 oated 및 / N을 O를 부착 할 수있었습니다. 동일한 날에, 대량 배양 neurosphere를는 PLL / 라미닌 코팅 10cm 접시에 분화 배지에 도금 및 / N O를 부착 할 수있다. 대량 배양 neurosphere를 행 다음날, 배양 상청을 여과하고, 다시 10cm 접시에 배치된다. 샘플 neurosphere를 다음 조건 매체에 반전 3~4일 28. 차별화 할 수 있습니다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
E14.5의 neurosphere를에서 파생 된 그림 A 클론 Neurosphere 2. 성장. 세포는 해리와 96 웰 접시에 용액 / 50 세포에 접종 하였다. 개별 세포는 시간 경과 영상으로 6 일 동안 추적했다. 오의 이미지neurosphere으로 성장 북동 휴대가 표시됩니다. neurosphere가 clonality을 유지합니다. (가) 0일; (b) 1.19.45; (c) 2.95.37; (라) 3.32.76; (마) 4.46.53; (F) 5.61.44; 첫 번째 번호는 일을 의미하는 경우, 두 번째 숫자는 일의 비율을 의미하며, 세번째 수는 시간의 비율을 말한다. 10 배 확대. 스케일 바, 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 클론 neurosphere를하고 NSC 주파수의 열거 3. 차별화. 단일 neurosphere를 3 일 동안 50 웰 챔버 커버 슬립에 포착하고 차별화했다. tripotent의 neurosphere 역의 대표 이미지(a) DAPI로 리트 및 (b) GFAP에 대한 면역 염색, (c) Tuj1 및 (d) O4. (라) - (e)는 (가)의 오버레이를 표시합니다. 스케일 바, 65 μm의. (f)에 멱 일원, bipotent 및 tripotent 렉스 +와 렉스에 의해 생성 된 neurosphere를의 % - 세포 (평균 ± SEM, N = 3). 렉스 +와 렉스의 (g) NSC 주파수 -. NFU의 제품 및 tripotent의 neurosphere를의 %로 계산 셀 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

우리는 헤 클론 조건에서 NSCs을의 열거에 대해 설명합니다. 중요한 단계는 신선한 NSC 성장 및 분화 배지를 사용하고, 또한 도포에 갓 제조 PLL / 라미닌 용액의 사용 챔버 커버 슬립뿐만 아니라, 배양 접시를 포함한다. 이 neurosphere를 최적의 성장과 분화 조건을 보장합니다. 양질 항체의 사용은 효과적으로 신경 세포 및 아교 세포뿐만 아니라 다른 neurosphere를 접촉하지 않은 클론 neurosphere를 선택적 피킹을 검출하는, 중요하다. 또한, 건조하지 않는 촬상 neurosphere를 보장하는 것이 중요하다. 매 10 neurosphere를 따기 후 각 웰에 분화 매체의 10 μL를 추가하는 것이 좋습니다. 다른 샘플로부터 neurosphere를 사이에 크로스 토크를 피하기 위해 샘플 당 10cm 접시에 하나의 챔버가 커버 슬립을 사용하는 것이 중요하다. 두 커버 슬립 (다른 샘플에서 각각 neurosphere를 포함)을 배치하는 경우같은 10cm 접시, 하나의 coverslip에서 neurosphere를 특정 계통으로 분화하는 다른 커버 슬립에 neurosphere를의 성향을 바꿀 수있는 요소를 해제 할 수 있습니다. 같은 10cm 접시에 두 된 커버는 샘플 간의 믹스 업 될 수 있습니다.

NFU 또는 NSC 주파수가 예상보다 낮은 경우, 낮은 통로 번호 neurosphere를 사용되었는지 확인합니다. 건강 낮은 통로가 neurosphere를 조정 배지를 생성하기 위해 사용되는 것이 중요하다. neurosphere를은 96 웰 접시에 작은 지름을 가진 우물에서 배양하는 경우 다음에, 다음은 기동 및 마이크로 피펫을 사용하여 neurosphere를을 선택하기 어려울 것이다. 이 경우, 종래 따기 같은 6- 웰 접시 같은 큰 배양 접시에 neurosphere를 옮긴다. 촬상 neurosphere를 중 일부는 문화와 면역 염색 동안 챔버 커버 슬립으로부터 들어있다. 문화 동안 챔버 커버 슬립의 움직임, 덜 집중적 인 세척을 최소화면역 염색시 보내고, neurosphere를의 분리를 방지하기 위해 도움이 될 것이다.

초기 연구 만 NFA 7,11,13을 사용 NSCs의 정량화. NSCs의 초기 NP에 모두 neurosphere를 5로 생성하지만, NFA은 NSC 주파수 과대 평가. 루이스 등의 알은. NCFCA (21, 22)로 알려진 NSCs을 정량화하기 위해 다른 방법을 개발했다. NCFCA는 clonality 있도록 콜라겐 계 매트릭스 단일 세포를 배양하는 것을 포함하고, 직경 2mm 상기 neurosphere를 NSCs의 만에 의해 형성되는 것으로 나타났다. NCFCA 마찬가지로, clonality이 프로토콜을 통해 보장된다. 이는 클론 밀도 neurosphere를 생성하고 챔버 커버 슬립에 neurosphere를 차별화함으로써 달성된다. 챔버 커버 슬립의 사용은 많은 장점을 부여한다. 챔버 커버 슬립 각 샘플 neurosphere함으로써, 다른 샘플 neurosphere를 물리적 접촉을 갖는 분화 동안 clonality을 보장하지 않고 차별화 할 수 있습니다.챔버 커버 슬립은 샘플 neurosphere를 연속적으로 조절 될 최대 구별을 보장하기 위해 허용하는 분화 배지에 현탁 배치 될 수있다. 동안 분화 된 배지 및 혈청의 부재에서, neurosphere를 생존 감소하고 neurosphere를 주로 성상 세포 (탐 아메드 M 및 S, 미 출판)를 생성한다. 또한, 면역 염색 neurosphere를 편리하게 오랜 기간 동안 저장 될 수 있고, 챔버 커버 슬립 현미경 유리 슬라이드 상에 직접 장착 될 수있다. 한 빨리, 잘 챔버 작은에서 neurosphere를 찾아 이미지를 캡처하고, 다음 잘로 이동할 수 또한, 면역 염색 neurosphere를의 영상은 쉽게 이루어집니다.

우리는이 원고 (27)와 NCFCA (28)에 기술 된 프로토콜을 모두 사용 E14.5 마우스 neurosphere 문화의 NSC 주파수를 결정했다. 모두 나에 의해 결정 E14.5 마우스 neurosphere를의 NSC 주파수thods는 비교할 수 있습니다. NCFCA가 능성이며, 장기 자기 갱신 능력을 가지고 NSCs의를 열거합니다. 우리의 방법에서 NSC 주파수가 NCFCA에서에 필적하기 때문에, 우리의 프로토콜에서 판독은 NSC 주파수를 과대 평가하지 않는 것 같습니다. NCFCA 완료하는 데 삼주을 필요로하며, 주로 세포 도금 및 매체 보충을 포함한다. 여기에 설명 된 프로토콜을 수행 할 수 십삼일 요구 및 단계의 다른 시리즈, 예를 들어, neurosphere 따기 및 면역 염색을 포함한다. 이 프로토콜은 NSCs을 열거 할 수있는 다른 방법이 될 수 있습니다. 연구팀은 샘플에서 NSC 주파수를 확인 NCFCA이 프로토콜을 모두 사용할 수 있습니다.

이러한 프로토콜의 하나의 한계는 중요한 일련의 단계가 있어야 모두 일 제 50 웰 챔버 커버 슬립에 조정 된 배지의 제조 샘플 neurosphere를의 NFU 결정 및 샘플 neurosphere를 전송을 수행 할 필요가 있다는 다 수행Y 8. 하나는이 단계를 완료하려면 시간이 걸릴 수 있습니다. 또한, 효율적인 방법으로 이러한 단계를 수행하기 위해 실행을 요구한다.

neurosphere를 널리 NSC의 기능과 동작을 연구하는 데 사용되었다. 그러나 neurosphere를이 NSCs의와 NP에 모두 구성되어 있습니다. 그러므로, NSC 생물학을 연구하는 neurosphere를에서 NSCs을을 풍부하게하는 것이 중요하다. 현재, 세포 표면 마커 색소 배제 속성뿐만 아니라 세포의 크기 및 입도 NSCs의 6,7,9-13,29,30 위해 농축하는데 사용되어왔다. 이 프로토콜은 잠재적 NSC NSCs의 마커로의 농축을 정량화하고, 최종 NSC 마커의 검색을 용이하게하기 위해 사용될 수있다. 네 최근의 연구는 NSC 주파수 5,14,15,26을 열거이 프로토콜을 사용하고 있습니다.

Acknowledgments

우리는이 연구에 자금을 지원하기위한 과학, 기술 및 연구 (A * STAR의), 싱가포르의 기관 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL conical centrifuge tubes  BD 352096
50 mL conical centrifuge tubes  BD 352070
20 mL sterile syringe   BD 300141
50 mL sterile syringe  BD 300144
Fetal Bovine Serum (FBS)  Biowest S1810
Mouse anti-Tuj1 IgG2a antibody Covance MMS-435P-100
Rabbit anti-GFAP IgG antibody Dako Z033401
Hemocytometer  Hausser Scientific 3100
Microscope fitted to laminar flow hood  Leica MZ6
Glass slides Marienfeld-superior 1000200
Mouse anti-O4 IgM antibody  Merck Millipore MAB345
Hydromount National Diagnostics HS-106
Microscope Nikon Eclipse TS100-F
Laminar flow hood NuAire NU-543
96-well culture dishes NUNC 167008
10-cm culture dishes  NUNC 150350
Paraffin film Parafilm PM999
Human Epidermal Growth Factor (EGF)  Peprotech AF-100-15
Recombinant human basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)  Peprotech 100-18B
0.2 µm filter  Sartorius Stedim 16534-K
0.45 µm filter Sartorius Stedim 16555-K
1.0 N Sodium Hydroxide (NaOH)  Sigma-Aldrich S2770
1.0 N Hydrochloric acid (HCl)  Sigma-Aldrich H9892
Trypan Blue  Sigma-Aldrich T8154
Poly-L-Lysine (PLL)  Sigma-Aldrich P8920
Paraformaldehyde (PFA) powder  Sigma-Aldrich P6148 Toxic
Bovine Serum Albumin (BSA) powder  Sigma-Aldrich A7906
50-well chambered coverslips  Sigma-Aldrich C7735
Stir plate with heat function  Stuart UC152
DMEM/F12 medium Thermo Fisher Scientific 11320-033
B27 supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
Penicillin-Streptomycin  Thermo Fisher Scientific 15140-122
Laminin Thermo Fisher Scientific 23017-015
1x Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ (DPBS) Thermo Fisher Scientific 14190144
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody Thermo Fisher Scientific A21042
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG2a antibody Thermo Fisher Scientific A21135
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG antibody Thermo Fisher Scientific A31573
4’,6’-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)  Thermo Fisher Scientific D3571
Cell-culture centrifuge Thermo Fisher Scientific  RT1 75002383
Pasteur pipettes Thermo Fisher Scientific 10006021
CO2 incubator
Ventilated fume-hood
Aspirator
Confocal microscope
Micropipettes
Micropipette tips
Plastic pipettes
Multichannel pipettes
Glass beaker
Sterile forceps
pH meter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ahmed, S. The culture of neural stem cells. J. Cell. Biochem. 106, (1), 1-6 (2009).
  2. Reynolds, B. A., Tetzlaff, W., Weiss, S. A multipotent EGF-responsive striatal embryonic progenitor cell produces neurons and astrocytes. J. Neurosci. 12, (11), 4565-4574 (1992).
  3. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, (5052), 1707-1710 (1992).
  4. Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and Population Analyses Demonstrate That an EGF-Responsive Mammalian Embryonic CNS Precursor Is a Stem Cell. Dev. Biol. 175, (1), 1-13 (1996).
  5. Narayanan, G., et al. Single-Cell mRNA Profiling Identifies Progenitor Subclasses in Neurospheres. Stem Cells and Dev. 21, (18), 3351-3362 (2012).
  6. Uchida, N., et al. Direct isolation of human central nervous system stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 97, (26), 14720-14725 (2000).
  7. Capela, A., Temple, S. LeX/ssea-1 Is Expressed by Adult Mouse CNS Stem Cells, Identifying Them as Nonependymal. Neuron. 35, (5), 865-875 (2002).
  8. Capela, A., Temple, S. LeX is expressed by principle progenitor cells in the embryonic nervous system, is secreted into their environment and binds Wnt-1. Dev. Biol. 291, (2), 300-313 (2006).
  9. Corti, S., et al. Isolation and characterization of murine neural stem/progenitor cells based on Prominin-1 expression. Exp. Neurol. 205, (2), 547-562 (2007).
  10. Nagato, M., et al. Prospective characterization of neural stem cells by flow cytometry analysis using a combination of surface markers. J. Neurosci. Res. 80, (4), 456-466 (2005).
  11. Kim, M., Morshead, C. M. Distinct Populations of Forebrain Neural Stem and Progenitor Cells Can Be Isolated Using Side-Population Analysis. J. Neurosci. 23, (33), 10703-10709 (2003).
  12. Murayama, A., Matsuzaki, Y., Kawaguchi, A., Shimazaki, T., Okano, H. Flow cytometric analysis of neural stem cells in the developing and adult mouse brain. J. Neurosci. Res. 69, (6), 837-847 (2002).
  13. Rietze, R. L., Valcanis, H., Brooker, G. F., Thomas, T., Voss, A. K., Bartlett, P. F. Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain. Nature. 412, (6848), 736-739 (2001).
  14. Tham, M., et al. CSPG Is a Secreted Factor that Stimulates Neural Stem Cell Survival Possibly by Enhanced EGFR Signaling. PLoS ONE. 5, (12), e15341 (2010).
  15. Gan, H. T., Tham, M., Hariharan, S., Ramasamy, S., Yu, Y. H., Ahmed, S. Identification of ApoE as an autocrine/paracrine factor that stimulates neural stem cell survival via MAPK/ERK signaling pathway. J. Neurochem. 117, (3), 565-578 (2011).
  16. Ramasamy, S., Narayanan, G., Sankaran, S., Yu, Y. H., Ahmed, S. Neural stem cell survival factors. Arch. Biochem. Biophys. 534, (1-2), 71-87 (2013).
  17. Ahmed, S., et al. Transcription factors and neural stem cell self-renewal, growth and differentiation. Cell Adh. Migr. 3, (4), 1-12 (2009).
  18. Gritti, A., et al. Multipotent Neural Stem Cells Reside into the Rostral Extension and Olfactory Bulb of Adult Rodents. J. Neurosci. 22, (2), 437-445 (2002).
  19. Gritti, A., et al. Epidermal and Fibroblast Growth Factors Behave as Mitogenic Regulators for a Single Multipotent Stem Cell-Like Population from the Subventricular Region of the Adult Mouse Forebrain. J. Neurosci. 19, (9), 3287-3297 (1999).
  20. Vescovi, A. L., et al. Isolation and cloning of multipotential stem cells from the embryonic human CNS and establishment of transplantable human neural stem cell lines by epigenetic stimulation. Exp. Neurol. 156, (1), 71-83 (1999).
  21. Azari, H., Louis, S. A., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (49), e2639 (2011).
  22. Louis, S. A., et al. Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony-Forming Cell Assay. Stem Cells. 26, (4), 988-996 (2008).
  23. Coles-Takabe, B. L., et al. Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26, (11), 2938-2944 (2008).
  24. Mori, H., Fujitani, T., Kanemura, Y., Kino-Oka, M., Taya, M. Observational examination of aggregation and migration during early phase of neurosphere culture of mouse neural stem cells. J. Biosci. Bioeng. 104, (3), 231-234 (2007).
  25. Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat. Methods. 3, (10), 801-806 (2006).
  26. Yu, Y. H., et al. Purification, Visualization, and Molecular Signature of Neural Stem Cells. Stem Cells and Dev. 25, (2), 189-201 (2016).
  27. Yu, Y. H. C1qR1 is comparable with LeX and Prom1 as a neural stem cell marker. Identification of mouse embryonic neural stem cell surface markers. Chapter 3.5, Figure 3.17 (2012).
  28. Tham, M. Neural colony-forming cell assay. A role for chondroitin sulfate proteoglycan in regulating the survival and growth of neural stem cells. Chapter 3.6.3, Figure 3.22A (2009).
  29. Yuan, S. H., et al. Cell-Surface Marker Signatures for the Isolation of Neural Stem Cells, Glia and Neurons Derived from Human Pluripotent Stem Cells. PLoS ONE. 6, (3), e17540 (2011).
  30. Hall, P. E., Lathia, J. D., Miller, N. G. A., Caldwell, M. A., Ffrench-Constant, C. Integrins Are Markers of Human Neural Stem Cells. Stem Cells. 24, (9), 2078-2084 (2006).
신경 줄기 세포의 열거 클론 세이를 이용하여
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Narayanan, G., Yu, Y. H., Tham, M., Gan, H. T., Ramasamy, S., Sankaran, S., Hariharan, S., Ahmed, S. Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays. J. Vis. Exp. (116), e54456, doi:10.3791/54456 (2016).More

Narayanan, G., Yu, Y. H., Tham, M., Gan, H. T., Ramasamy, S., Sankaran, S., Hariharan, S., Ahmed, S. Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays. J. Vis. Exp. (116), e54456, doi:10.3791/54456 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter