Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Перечень нервных стволовых клеток, с помощью клоновых Assays

doi: 10.3791/54456 Published: October 4, 2016

Summary

Нервные стволовые клетки (NSCs) относятся к клеткам, которые могут самообновлению и дифференцируются в трех нейронных линий. Здесь мы опишем протокол для определения частоты НСК в данной популяции клеток с использованием нейросфера формирования и дифференциации при клоновых условиях.

Abstract

Нервные стволовые клетки (NSCs) обладают способностью к самообновлению и генерировать три основных нервных родословных - астроциты, нейроны и олигодендроциты. NSC , и нервные клетки - предшественники (NPS), как правило , культивируют в пробирке , как нейросферах. Этот протокол подробно описывает, как определить частоту НСК в данной популяции клеток при клоновых условиях. Протокол начинается с посевом клеток при плотности, что позволяет генерировать клоновых нейросферах. В нейросферы затем переносили в камерных покровные и дифференцируются в соответствии с клоновых условиях в кондиционированной среде, которая максимизирует дифференциацию потенциал нейросферах. И, наконец, частота НСК рассчитывается на основе нейросфера формирования и мультипотентность возможностей. Утилиты этого протокола включают оценку кандидатов НСК маркеров, очистку NSCs и способность различать NSCs от NPs. Этот метод занимает 13 дней, чтобы выполнить, что значительно shorter, чем нынешние методы для перечисления частоты НСК.

Introduction

Нервные стволовые клетки (NSC,) являются клетки центральной нервной системы (ЦНС), что может самообновлению и мультипотентны. NSCs сначала определены в процессе развития эмбрионального переднего мозга и продолжают сохраняться в мозге взрослого в конкретных регионах, таких как субвентрикулярной зоны (SVZ) боковых желудочков и зубчатую извилину (DG) гиппокампа. Ряд NSC линий используются в клинических испытаниях для лечения инсульта и других неврологических заболеваний , таких как болезнь 1 Баттена.

NSC, и нервные клетки-предшественники (NPS) размножают в культуре, как плавающий 3-мерные сфероидами структуры, называемые нейросферы. Система нейросфера культуры была разработана Рейнольдс и Weiss в начале 1990 - х годов, когда они обнаружили , что эмбриональные и взрослые корковые клетки могли бы разделить в присутствии эпидермального фактора роста (EGF) и основной фактор роста фибробластов (bFGF) 2-4. Нейросферах состоят из гетерогенной смеси Cгезов состоящие из подклассов на разных стадиях развития 5. Это является сложной задачей, чтобы конкретно изучить NSCs использованием данных, полученных из нейросферах из-за наличия NPs. Следовательно, крайне важно, чтобы обогатить NSCs от нейросферах. В настоящее время четыре основных метода были использованы для обогащения NSC , в пробирке. Во-первых, является использование маркеров клеточной поверхности. Льюис-X (LeX) и CD133 (также известный как Prominin1) являются наиболее известных на поверхности клетки маркеров НСК 6-9. Syndecan-1, Notch-1 и Интегринзависимая бета1 другие поверхностные белки , которые обогащают для NSCs 10. Во-вторых, исключение красителя. Было показано , что клетки из стороны населения, которые обладают уникальной способностью выкачать флуоресцентного ДНК-связывающий краситель Hoechst 33342, обогащены NSCs 11. В-третьих, является использование морфологического отбора. Было показано , что клетки с увеличенным размером клеток и зернистости гавани больше NSCs , чем их аналоги 5,12,13. В-четвертых, добавление НСК суrvival факторы к культуральной среде. Было показано , что добавление хондроитинсульфата протеогликанов и аполипопротеина Е повышает выживаемость NSC и , таким образом , увеличивает частоту NSC 14,15. Хотя многие маркеры , включая факторы транскрипции, были связаны с NSCs 16,17, ни один из этих маркеров не способны обогатить NSCs к чистоте. Из - за отсутствия окончательных маркеров НСК, остается проблемой для количественного определения NSCs и отличить их от NPs в пробирке.

Первоначальные исследования использовали анализ формирования нейросфера (NFA) для количественного определения NSCs 7,11,13. В этом анализе, диссоциированные клетки культивируют с образованием нейросферы и количество нейросферах генерируется на каждые 100 посеянных клеток определяется. Это значение называется как формирование блока нейросфера (NFU). NFU равна частоте NSC, если все нейросферы возникают из NSCs. Тем не менее, было показано, что NFU завышенную частоту NSC, как нейросферы формируются как NSCs и раннее NPs 5. Таким образом, было бы неправильно перечислить NSCs исключительно на основе нейросфера формации. Это может быть возможным дать количественную оценку NSCs на основе их способности к самообновлению, пролиферируют интенсивно и генерировать мультипотентных нейросферы.

NSCs, которые являются EGF и bFGF реагируют, как правило , выживают в течение по крайней мере десяти проходов и таким образом показывают способность обширную самообновлению в культуре 4,18-20. NPs, которые являются EGF и bFGF отзывчивым, а также, может также генерировать нейросферы за несколько проходов, но не в течение длительного периода времени. Следовательно, оно было широко признано , что добросовестные NSCs могут быть перечислены с достаточной точностью на основе нейросфера формирования , по крайней мере , десять проходов. В большинстве исследований, однако, самообновление обычно измеряется на основе формирования вторичного или третичного нейросфера вследствие длительного экспериментального времени, необходимого для десяти проходов. Следовательно, вторичное НЛА может быть использован в широком смысле сравнить ставку способность самообновленияWEEN популяции, но не может быть использован для точного перечисления частоты НСК.

NSCs имеют большую пролиферативную способность по сравнению с NPs. Это свойство было использовано NSCs Луи и др. разработать метод количественного подсчета НСК - нейронную анализ клеток колониеобразующей (NCFCA) 21,22. В этом анализе, одиночные клетки культивируют в течение 3-х недель в коллагенсодержащего полутвердой матрице. В этих условиях культивирования, было показано, что клетки, которые образуют нейросферы выше 2 мм в диаметре и могут tripotent самообновлению в течение длительного срока. Эти клетки определяются как NSCs. Поэтому NSCs эффективно отличать от NPs.

NSC, обладают способностью дифференцироваться в астроциты, олигодендроциты и нейроны. Для дифференциации нейросферах, факторы роста, удаляются и сыворотку добавляют к культуральной среде. Если все три нейронные родословные наблюдаются в нейросфера, то клетка, которая инициировала эту нейросфера яS НСК. Тем не менее, анализ дифференциации имеет некоторые ограничения. Во-первых, условия культивирования, используемые для дифференцировки не может быть оптимальным для генерации всех трех нейронными родословных. На самом деле, в одном процессе дифференцировки нейросфера, значительная гибель клеток происходит и в основном происходит генерация астроцитов (Tham М и Ахмеда S, неопубликованные). Во-вторых, есть вопрос о клональности. Для точного подсчета NSCs, формирования и дифференциации нейросферах должны быть выполнены в соответствии с клоновых условиях, где каждый нейросфера возникает из одной клетки. В объемных суспензионных культурах, агрегация происходит на клеточном и нейросфера уровнях 23-25. Следовательно, можно каждому нейросфера возникать из нескольких ячеек или нейросферах, что усложняет нейросфера подсчета и оценки мультипотентность. Последние данные показывают, что агрегация клеток не происходит при низкой плотности металлизации 0,5 клеток / мкл или ниже, и, когда культуральные планшеты не перемещаются во время Neuформирование rosphere 15. Таким образом, культивировании клеток при такой низкой плотности обеспечит клональности.

В настоящее время NCFCA является наиболее часто используемый метод, чтобы отличить NSCs от Соседства и перечислить частоты НСК. NCFCA, однако, требует относительно длительного времени трех недель. Здесь мы опишем протокол для перечисления частоты NSC основан на способности NSC, чтобы сформировать мультипотентных нейросферы. Этот протокол занимает всего 13 дней, чтобы выполнить. NCFCA обеспечивает клональности в качестве коллагеновой матрицы предотвращает движение нейросферах. Условия культивирования, используемые в данном протоколе также позволяет клональности будет поддерживаться на протяжении. Например, использование 50-луночных камерных покровные гарантирует, что нейросферы будет дифференцироваться, не контактируя друг с другом. Кроме того, мы используем кондиционированной среды , которая поставляет нейротрофических факторов в процессе дифференциации для максимизации дифференциации потенциала нейросферах (рисунок 1).

Protocol

Лечение животных проводилось в соответствии с руководящими принципами IACUC и NACLAR и одобрены отделом животных ((http://www.brc.astar.edu.sg/index.php?sectionID-11).
Примечание: нейросфера культуры были получены из переднего мозга эмбрионального (Е14) мышей C57BL / 6
, как описано ранее 5.

1. Культура клоновых образцов нейросферах (день 1)

  1. Готовят среду для роста НСК путем объединения Modified орла Средний / Питательная F-12 (DMEM / F12) среде Дульбекко с B27 добавки (конечная концентрация: 1 раз), EGF (конечная концентрация: 20 нг / мл), bFGF (конечная концентрация: 10 нг / мл) и пенициллин / стрептомицин (конечная концентрация: 1x).
  2. Диссоциируют нейросферы E14.5 мыши в 1 мл среды для роста НБК и 1 мл 0,05 N гидроксида натрия в течение 7 мин при комнатной температуре. Пипетировать клетки вверх и вниз, время от времени, чтобы держать клеток в суспензии. Добавить 1 мл 0,05 н соляной кислоты до нейтральной реакцииИзе щелочи.
    Примечание: нейросфера клетки высевают в количестве 20000 клеток / мл в культуральной чашке диаметром 10 см и культивировали в течение 5 дней при температуре 37 ° С, 5% СО 2. Ожидаемый выход после составляет около 10 миллионов клеток на 10 см чашку. Затем эти клетки диссоциируют и высевали при плотности клонального как описано в пунктах 1.2 и 1.3, соответственно.
    1. Выполнить подсчет клеток с помощью окрашивания трипановым синим и гемоцитометра.
  3. Семенной отдельные клетки E14.5 мыши нейросфера при плотности 50 клеток / мл или ниже в 100 мкл среды для роста NSC в 96-луночного блюдо. Инкубируйте клетки при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 в течение 1 Вт для создания клоновых нейросферы.
    Примечание: Клональность обеспечивается во время нейросфера формирования при этой плотности, так как клетки не контактируют друг с другом.

2. Культура нейросферах для кондиционированную среду (3-й день)

  1. Диссоциируют E14.5 нейросферы мыши, как описано в шаге 1.2.
  2. Семенной отдельные клетки из Е14.5 нейросферы мышь при плотности 20000 клеток / мл в 10 мл среды для роста NSC в культуральной чашке 10 см. Инкубируйте клетки при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 в течение 5 дней для создания объемных культивируемые нейросферы.

3. Подготовка нейросфера-кондиционированной среды (8-й день)

  1. Готовят раствор для нанесения покрытия путем смешивания 700 мкл 0,01% поли-L-лизин (PLL), 70 мкл 1 мг / мл ламинина и 6230 мкл забуференного фосфатом солевом растворе (ФБР).
  2. Покройте 10 см чашку для культивирования с 7 мл раствора ФАПЧ / ламининовым в течение 2 ч при 37 ° С.
  3. С помощью серологической пипетки на 10 мл, передать все сыпучие культивируемые нейросферы в 15 мл коническую центрифужную пробирку. Центрифуга нейросферы при 171 х г в течение 1 мин при комнатной температуре и полностью удалить супернатант.
  4. Готовят NSC дифференциации среды путем объединения DMEM / F12, В27 (конечная концентрация: 1x) и фетальной бычьей сыворотки (ФБС) (конечная концентрация: 0,5%) объявленияd 10 мл NSC дифференциации среды к нейросферах. Пипетировать вверх и вниз несколько раз, чтобы ресуспендирования нейросферы.
  5. Отберите ФАПЧ / Laminin от культуральной чашки 10 см и мыть один раз с 10 мл PBS. Перенесите все нейросферы к ФАПЧ / Laminin покрытием 10 см блюдо культуры. Выдержите O / N при температуре 37 ° С, 5% СО 2 в течение нейросферах прилипать к тарелке.

4. Определение NFU Образца нейросферах (8-й день)

  1. Подсчитайте количество нейросферах (посеянных на 1-й день, а в разделе 1), образованную в каждую лунку под микроскопом.
    Примечание: Определить количество нейросферах сформированных на 100 посеянных клеток, что дает NFU.

5. Передача образца нейросферах 50-луночного камерные покровное (8-й день)

  1. Шерсть в каждую лунку 50-луночного патроннике покровное с 10 мкл раствора для покрытия ФАПЧ / ламининовым в течение 2 ч при 37 ° С.
    Примечание: Приготовьте раствор для нанесения покрытия, как описано вшаг 3.1.
  2. Подготовьте 3 х 50 мл коническую центрифужные пробирки, содержащие 30 мл PBS каждого. С помощью стерильного пинцета удалите с покрытием 50-хорошо камерные покровное. Погрузить камерные покровное в первую трубу PBS, а затем второй, а затем третьей трубки PBS, чтобы смыть раствор для нанесения покрытия.
  3. Аспирируйте оставшуюся жидкость из лунок патроннике покровное.
  4. Аккуратно пипеткой всю среду и нейросферы из каждой лунки тарелки 96-луночного и передать его в один 10 см чашку для культивирования.
  5. Под микроскопом, выбрать образец нейросфера с использованием P10 микропипетки, снабженной 10 мкл кончика пипетки. Убедитесь, что только один нейросфера определена каждый раз, установив колонку пипетки 2 мкл. Используйте новый наконечник пипетки для каждого нейросфера.
  6. Передача нейросфера на центр колодца с покрытием 50-хорошо патроннике покровное.
  7. Повторите шаги 5.5 и 5.6 до тех пор каждую лунку камерно покровного КонтаIns в нейросфера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: нейросферы может быть выбран под микроскопом, помещенной в ламинарный или на стендовых испытаний.
  8. Добавьте 10 мкл среды NSC дифференцировки в каждую лунку Камер покровное. Поместите камерные покровное в 10 см культуры блюдо и пипетки PBS по краям тарелки, чтобы предотвратить высыхание дифференциации среды НСК. Поместите до двух камерных покровные в один 10 см блюдо культуры. Выдержите камерные покровное (содержащийся в культуральной чашке 10 см) в течение ночи при температуре 37 ° С, 5% СО 2.

6. Дифференциация образца нейросферах (День 9)

  1. Передача дифференциации среды из объемных культивируемых нейросферах (из раздела 3) в 15 мл коническую центрифужную пробирку. Убедитесь в том, что 2-3 мл дифференциации среды остается в культуре блюдо, чтобы предотвратить прилипшие клетки отсоединение. С помощью 20 мл стерильного шприца, проходят дифференцировку среды через 0,2 мкмм фильтр, чтобы удалить любые клетки или мусор.
  2. Передача фильтрованного дифференциации среды обратно в 10 см чашки для культивирования, содержащей прилипшие клетки.
  3. С помощью стерильного пинцета, осторожно поместить камерные покровное на дифференциации среды в перевернутом виде, так что образец нейросферы лицевой стороной вниз. Выдержите камерные покровное с дифференциацией среды в течение 3 дней при температуре 37 ° С, 5% СО 2.
    Примечание: Образцы нейросферы находятся в контакте с дифференциацией среде, но не в контакте с отличающих клетки ниже.

7. Крепление дифференцированной нейросферах (12 день)

  1. Осторожно удалите камерные покровное от 10 см чашку для культивирования с использованием стерильного пинцета. Осторожно опустите покровное в PBS, чтобы смыть кондиционированной среды.
  2. Лупиться силиконовую прокладку из покровного. Выполните это осторожно и медленно, чтобы избежать нарушения покровное. Обратите внимание на ту сторону, где йе дифференцированы нейросферы приклеены.
  3. Пипетка 1 мл 4% параформальдегида (PFA) на кусок парафина разреза пленки к размеру покровное. Аккуратно покровное на парафиновой пленки с нейросферах были направлены вниз в контакте с PFA. Закрепить нейросферы в течение 20 мин при комнатной температуре.
    Внимание: PFA является токсичным как в жидком, и в виде пара и является горючим. Избегайте вдыхания паров и контакта с кожей и глазами. Всегда обрабатывать PFA в вентилируемом вытяжном шкафу.
  4. Пипетка 1 мл PBS на кусочек парафиновой пленки. Вымойте нейросферы, осторожно помещая покровное с нейросферы на лицевой стороной вниз в контакте с PBS в течение 10 мин при комнатной температуре.
  5. Повторите шаг 7.4 еще два раза.

8. O4 Окрашивание дифференцированной нейросферах (12 день)

  1. Готовят 3% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS. Пипетка 1 мл 3% БСА на кусочек парафиновой пленки. Блокировать нейросферы, осторожно placinг покровное (при нейросферы лицевой стороной вниз) в контакте с БСА в течение 30 мин при комнатной температуре.
  2. Пипетка 1 мл мышиного антитела против O4 IgM антитела (1: 300 разбавлении в 3% БСА) на кусочек парафиновой пленки и поместите покровное на парафиновой пленки с нейросферах были направлены вниз в контакт с антителом. Разрешить О4 окрашивание отстояться в течение 2 ч при комнатной температуре.
  3. Промыть покровное дважды с PBS, как описано на стадии 7.4.
  4. Пипетка 1 мл зеленого флуоресцентного красителя, конъюгированного-анти-мышиных IgM-вторичным антителом (1: 500 разбавление в 3% БСА) на кусочек парафиновой пленки и поместите покровное на парафиновой пленки с нейросферах были направлены вниз в контакте с антителом , Оставьте в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните иммуноокрашивания в темноте от этого шага вперед.
  5. Промыть покровное дважды с PBS, как описано на стадии 7.4.

9. Tuj1 и глиальных фибриллярный кислый белок (GFAP) ОкрашиваниеДифференцированные из нейросферах (12 день)

  1. Готовят permeabilizing раствор путем добавления Тритон-X 100 (конечная концентрация: 0,5%) до 3% БСА. Пипетка 1 мл раствора permeabilizing на кусочек парафиновой пленки. Поместите покровное на парафиновой пленки с нейросферах были направлены вниз в контакте с permeabilizing раствор в течение 20 мин при комнатной температуре.
  2. Промыть покровное дважды с PBS, как описано на стадии 7.4.
  3. Пипетка 1 мл мышиного анти-Tuj1 IgG 2a антител (1: 500 разбавление в 3% БСА) и кроличьи антитела к GFAP антитела IgG (1: 1000 разведение в 3% БСА) на кусочек парафиновой пленки и место покровное на парафиновое пленка с нейросферах были направлены вниз в контакте с антителами. Разрешить Tuj1 и GFAP окрашивание отстояться в течение 2 ч при комнатной температуре.
    Примечание: Оба антитела могут быть получены в виде единого решения.
  4. Промыть покровное дважды с PBS, как описано на стадии 7.4.
  5. Пипетка 1 мл красного флуоресцентного красителяконъюгирован-анти-мышиного IgG 2a (1: 500 разбавление в 3% БСА) и далеко красный флуоресцентный краситель , конъюгированный-анти-кроличий IgG (1: 500 разбавление в 3% БСА) вторичные антитела на кусочек парафиновой пленки и место покровное на парафиновой пленки с нейросферах были направлены вниз в контакте с антителами. Оставьте в течение 1 ч при КТ.
    Примечание: Оба антитела могут быть получены в виде единого решения.
  6. Промыть покровное дважды с PBS, как описано на стадии 7.4.
  7. Развести 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) маточного раствора до 300 нМ в PBS. Пипетка 1 мл DAPI на кусочек парафиновой пленки и место покровное на парафиновой пленки с нейросферах были направлены вниз в контакте с DAPI в течение 2 мин при комнатной температуре для ядер окрашивания.
  8. Промывают один раз покровное ПБС, а затем дважды деионизованной водой, как описано на стадии 7.4. Установите покровное на предметном стекле с использованием подходящего монтажного среды и дайте высохнуть O / N при комнатной температуре.

10. ИмаГинг из дифференцированной нейросферах (13 день)

  1. нейросферы изображение под конфокальной микроскопии с использованием 40X. С помощью лазеров на длине волны 488 нм, 594 нм и 647 нм для обнаружения олигодендроциты, нейроны и астроциты, соответственно.
  2. Определить процент унипотентными, бипотентными и tripotent нейросферах.
    Примечание: Потенции определяется способностью нейросфера дифференцироваться в трех нервных родословных - олигодендроцитов, нейронов и астроцитов 5,14,15,26. Олигодендроциты идентифицируются положительное окрашивание для O4 (раздел 8). Нейроны обозначаются положительное окрашивание для Tuj1 (раздел 9). Астроциты идентифицируются положительное окрашивание для GFAP (раздел 9). Унипотентная нейросфера дифференцируется в только одном из линии и должно положительно окрашиваются либо для O4, GFAP или Tuj1. Бипотентными нейросфера дифференцируется в любых двух линий и должно положительно пятно для O4 и GFAP или O4 и Tuj1 или GFAP и Tuj1. Tripotent нейросфера разныеiates во всех трех родах и должно положительно пятно для O4, GFAP и Tuj1.
  3. Определить частоту НСК в интересующей популяции, используя следующую формулу:
    Частота NSC = (NFU х% от tripotent нейросферах) / 100%.

Representative Results

Мы использовали этот протокол для оценки способности Лекси, известной клеточной поверхности НСК маркер 7, обогащать для NSCs. Данные этого исследования будут использованы для иллюстрации того, как NSCs перечислены с использованием клоновых анализов в протоколе. E14.5 нейросфера мышиные клетки инкубировали с анти-LEX антителом. Затем клетки , которые экспрессируют ЛЕКС деятельности (LEX +) и клетки , которые не экспрессируют ЛЕКС (ЛЕКС -) высевают в количестве 50 клеток / мл с помощью флуоресцентной-сортировка клеток (FACS) , и влево , чтобы генерировать клональные нейросферы в течение 1 нед. Покадровый изображений показывает , что нейросферы генерируется на 50 клеток / мл клоновая (рисунок 2). NFU для LeX + и LeX - клеток определяли. Показано , что ЛЕКС + клетки имеют значительно более высокую способность образования нейросфера по сравнению с клетками - LeX (рис 3 г). В нейросферы генерируемые затем дифференцируютсяпри клоновых условиях, впоследствии иммуноокрашиванию и образ (рис 3а-е). ЛЕКС + клетки генерируют значительно больше , чем tripotent нейросферы - LeX клетки (рис 3F). Частота НСК Затем был рассчитан на основании NFU и% от tripotent нейросферах (рис 3 г). Выбор на основе LeX, обогащают частоту НСК более чем в 14 раз, проверка ЛЕКС в качестве маркера НСК. Мы также определили частоту НСК E14.5 нейросферах мыши , используя этот протокол 27 и NCFCA 28. Оба метода сообщают сопоставимую частоту НСК около 2% в E14.5 нейросферах мыши.

Рисунок 1
Рисунок 1. Протокол нейросфера дифференцировке при клоновых условиях. Примеры нейросферы выращенные в условиях клоновых индивидуально помещают в каждую ФАПЧ / ламинин-сoated лунку 50-луночного патроннике покровное, и позволило придерживаться O / N. В тот же день, сыпучие культивированный нейросферы высевают в среде для дифференцировки в среде ФАПЧ / ламининовым покрытием 10 см чашку, и дают возможность прилипать O / N. На следующий день, кондиционированной средой от объемных культивируемых нейросферах фильтруют и помещают обратно в 10 см чашку. Образцы нейросферы переворачивают на кондиционированной среды и позволило дифференцировать в течение 3-4 дней 28. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2. Рост клонального нейросфера. Клетки , полученные из E14.5 нейросферах диссоциируют и высевают в количестве 50 клеток / мл в 96-луночных блюдо. Отдельные клетки были прослежены в течение 6 дней с помощью покадровой обработки изображений. Изображения Oпе такая клетка растет в нейросфера показан. Обратите внимание, что нейросфера поддерживает клональности. (А) 0 дней; (Б) 1.19.45; (С) 2.95.37; (D) 3.32.76; (Е) 4.46.53; (Е) 5.61.44; где первое число относится ко дню, вторая цифра относится к доле дня, а третье число относится к доле ч. 10-кратным увеличением. Масштаб бар, 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Дифференциация клоновых нейросферах и подсчет НСК частоты. Одиночные нейросферы собирали и дифференцируются в 50-хорошо патроннике покровное в течение 3 дней. Представитель образ tripotent нейросфера ГНАIned с (а) DAPI и иммунологически окрашивали для (б) GFAP, (с) Tuj1 и (d) О4. (Е) показывает накладку (а) - (г). Шкала бар, 65 мкм. (Е)% унипотентных, бипотентными и tripotent нейросферах порожденных LeX + и - LeX клеток (среднее значение ± SEM, п = 3). (Г) НСК частоты в LeX + и - LeX. Клеток , рассчитанных как произведение NFU и% от tripotent нейросферах Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

Мы опишем хи перечисление NSCs под клоновых условиях. Критические шаги включают в себя использование свежего роста и дифференциации среды НБК, а также использование свежеприготовленного раствора ФАПЧ / Laminin для покрытия камерные покровные, а также блюда культуры. Это обеспечивает оптимальный рост и дифференциацию условий жизни нейросферах. Использование хороших антител качества для эффективного обнаружения нейронов и глии, а также выборочное комплектование клональных нейросферах, которые не находятся в контакте с другими нейросферах, имеют решающее значение. Кроме того, важно обеспечить отборные нейросферы не высыхают. Рекомендуется добавить 10 мкл среды дифференцировки в каждую лунку после получения каждые 10 нейросферы. Важно, чтобы использовать один камерные покровное в одном 10-см чашку на образец, чтобы избежать взаимных помех между нейросферах из разных образцов. Если два покровные (каждая из которых содержит нейросферах из разных образцов) помещают вТе же 10 см блюдо, нейросферы из одного покровное может выпустить факторы, которые могут изменить склонность нейросферах в другом покровного дифференцироваться в специфические клоны. Два покровные в том же 10-см чашку также может привести к смеси между образцами.

В случае NFU или частота НСК ниже, чем ожидалось, убедитесь, что используются с низким числом пассажей нейросферы. Кроме того, важно, что здоровые низкие нейросферы проход используются для генерации кондиционированную среду. Далее, если нейросферы культивируют в скважинах малого диаметра, например, в 96-луночного блюдо, то это будет трудно маневрировать и выбрать нейросферы с помощью микропипетки. В этом случае, передача нейросферы в большую чашку для культивирования, такие как блюдо 6-луночного, до сбора. Некоторые из отборных нейросферах может отрываться от камерно покровного во время культивирования и иммунное окрашивание. Сведение к минимуму движение камерно покровного во время культивирования, и менее интенсивное мытьеING во время иммуноокрашиванием, помогло бы избежать отряд нейросферах.

Первоначальные исследования количественно NSCs с использованием только НКА 7,11,13. Тем не менее, NFA завышает частоту НСК , как оба NSCs и ранние NPs генерировать нейросферы 5. Луи и др. Разработали другой метод количественной оценки NSCs известный как NCFCA 21,22. NCFCA включает культивирование отдельных клеток в матрице на основе коллагена для обеспечения клональности, и было показано, что нейросферы выше 2 мм в диаметре образованы только NSCs. Подобно NCFCA, клональности обеспечивается на протяжении всего этого протокола. Это достигается за счет генерации нейросферы на клональной плотности и дифференциации нейросферы в камерных покровные. Использование камерных покровные дает ряд преимуществ. Камерных покровного позволяет каждый образец нейросфера дифференцировать без физического контакта с другими нейросферах образца, обеспечивая тем самым клональности во время дифференцировки.Камерные покровное может быть помещен приостановлено на дифференциации среды, чтобы позволить образец нейросферы быть постоянно кондиционером и для обеспечения максимальной дифференциации. При отсутствии кондиционированной среды и сыворотки в процессе дифференцировки, выживаемости нейросферах уменьшается, а в основном нейросферы генерировать астроциты (Тэм M и Ahmed S, неопубликованные данные). Кроме того, иммунологически нейросферы можно удобно хранить в течение длительного периода времени и камерные покровные могут быть установлены непосредственно на микроскопе предметные стекла. Кроме того, визуализация из иммуноокрашиванию нейросферах производится легко, как можно быстро найти нейросфера в малом камерные хорошо, захватить изображение, и двигаться дальше к следующей скважине.

Мы определили частоту НСК в E14.5 мыши нейросфера культуры с использованием как протокол , описанный в этой рукописи 27 и NCFCA 28. Частота НСК в E14.5 нейросферах мыши определяется как мнеthods сопоставимы. NCFCA перебирает NSCs, которые мультипотентны и имеют долгосрочный потенциал самообновления. Поскольку частота NSC из нашего метода сопоставима с NCFCA, считывание из нашего протокола, кажется, не переоценивать частоту НСК. NCFCA требуется три недели, чтобы быть завершены и в основном включает в себя покрытие клеток и среднего пополнения. Протокол , описанный здесь , требуется 13 дней , чтобы выполнить и включает в себя различные серии шагов, например, нейросфера комплектование и иммунное окрашивание. Этот протокол может служить в качестве альтернативного метода для перечисления NSCs. Исследователи могут использовать как NCFCA и этот протокол для проверки частоты НСК в их образцах.

Одним из ограничений этого протокола заключается в том, что ряд важных шагов должны быть все выполнены на 8-й день Методику кондиционированной среды, определение NFU образцов нейросферах и передачи образцов нейросферах к 50-а камерно покровное должны быть выполнены на дау 8. Можно было бы занять некоторое время, чтобы завершить эти шаги. Кроме того, она требует практики для выполнения этих шагов в эффективным образом.

Нейросферах широко используется для изучения функции НСК и поведение. Тем не менее, нейросферы состоят из обоих NSCs и NPs. Следовательно, важно, чтобы обогатить NSCs от нейросферах для изучения NSC биологии. В настоящее время на поверхности клеток маркеры, краситель исключения собственности, а также размера клеток и зернистости, были использованы для обогащения NSCs 6,7,9-13,29,30. Этот протокол может быть использован для количественного обогащения NSCs потенциальных маркеров НСК, а также для облегчения поиска окончательного НСК маркера. Четыре недавние исследования использовали этот протокол для перечисления частоты НСК 5,14,15,26.

Acknowledgments

Мы благодарим Агентство по науке, технологиям и исследованиям (A * STAR), Сингапур за финансирование этого исследования.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL conical centrifuge tubes  BD 352096
50 mL conical centrifuge tubes  BD 352070
20 mL sterile syringe   BD 300141
50 mL sterile syringe  BD 300144
Fetal Bovine Serum (FBS)  Biowest S1810
Mouse anti-Tuj1 IgG2a antibody Covance MMS-435P-100
Rabbit anti-GFAP IgG antibody Dako Z033401
Hemocytometer  Hausser Scientific 3100
Microscope fitted to laminar flow hood  Leica MZ6
Glass slides Marienfeld-superior 1000200
Mouse anti-O4 IgM antibody  Merck Millipore MAB345
Hydromount National Diagnostics HS-106
Microscope Nikon Eclipse TS100-F
Laminar flow hood NuAire NU-543
96-well culture dishes NUNC 167008
10-cm culture dishes  NUNC 150350
Paraffin film Parafilm PM999
Human Epidermal Growth Factor (EGF)  Peprotech AF-100-15
Recombinant human basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)  Peprotech 100-18B
0.2 µm filter  Sartorius Stedim 16534-K
0.45 µm filter Sartorius Stedim 16555-K
1.0 N Sodium Hydroxide (NaOH)  Sigma-Aldrich S2770
1.0 N Hydrochloric acid (HCl)  Sigma-Aldrich H9892
Trypan Blue  Sigma-Aldrich T8154
Poly-L-Lysine (PLL)  Sigma-Aldrich P8920
Paraformaldehyde (PFA) powder  Sigma-Aldrich P6148 Toxic
Bovine Serum Albumin (BSA) powder  Sigma-Aldrich A7906
50-well chambered coverslips  Sigma-Aldrich C7735
Stir plate with heat function  Stuart UC152
DMEM/F12 medium Thermo Fisher Scientific 11320-033
B27 supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
Penicillin-Streptomycin  Thermo Fisher Scientific 15140-122
Laminin Thermo Fisher Scientific 23017-015
1x Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ (DPBS) Thermo Fisher Scientific 14190144
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody Thermo Fisher Scientific A21042
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG2a antibody Thermo Fisher Scientific A21135
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG antibody Thermo Fisher Scientific A31573
4’,6’-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)  Thermo Fisher Scientific D3571
Cell-culture centrifuge Thermo Fisher Scientific  RT1 75002383
Pasteur pipettes Thermo Fisher Scientific 10006021
CO2 incubator
Ventilated fume-hood
Aspirator
Confocal microscope
Micropipettes
Micropipette tips
Plastic pipettes
Multichannel pipettes
Glass beaker
Sterile forceps
pH meter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ahmed, S. The culture of neural stem cells. J. Cell. Biochem. 106, (1), 1-6 (2009).
  2. Reynolds, B. A., Tetzlaff, W., Weiss, S. A multipotent EGF-responsive striatal embryonic progenitor cell produces neurons and astrocytes. J. Neurosci. 12, (11), 4565-4574 (1992).
  3. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, (5052), 1707-1710 (1992).
  4. Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and Population Analyses Demonstrate That an EGF-Responsive Mammalian Embryonic CNS Precursor Is a Stem Cell. Dev. Biol. 175, (1), 1-13 (1996).
  5. Narayanan, G., et al. Single-Cell mRNA Profiling Identifies Progenitor Subclasses in Neurospheres. Stem Cells and Dev. 21, (18), 3351-3362 (2012).
  6. Uchida, N., et al. Direct isolation of human central nervous system stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 97, (26), 14720-14725 (2000).
  7. Capela, A., Temple, S. LeX/ssea-1 Is Expressed by Adult Mouse CNS Stem Cells, Identifying Them as Nonependymal. Neuron. 35, (5), 865-875 (2002).
  8. Capela, A., Temple, S. LeX is expressed by principle progenitor cells in the embryonic nervous system, is secreted into their environment and binds Wnt-1. Dev. Biol. 291, (2), 300-313 (2006).
  9. Corti, S., et al. Isolation and characterization of murine neural stem/progenitor cells based on Prominin-1 expression. Exp. Neurol. 205, (2), 547-562 (2007).
  10. Nagato, M., et al. Prospective characterization of neural stem cells by flow cytometry analysis using a combination of surface markers. J. Neurosci. Res. 80, (4), 456-466 (2005).
  11. Kim, M., Morshead, C. M. Distinct Populations of Forebrain Neural Stem and Progenitor Cells Can Be Isolated Using Side-Population Analysis. J. Neurosci. 23, (33), 10703-10709 (2003).
  12. Murayama, A., Matsuzaki, Y., Kawaguchi, A., Shimazaki, T., Okano, H. Flow cytometric analysis of neural stem cells in the developing and adult mouse brain. J. Neurosci. Res. 69, (6), 837-847 (2002).
  13. Rietze, R. L., Valcanis, H., Brooker, G. F., Thomas, T., Voss, A. K., Bartlett, P. F. Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain. Nature. 412, (6848), 736-739 (2001).
  14. Tham, M., et al. CSPG Is a Secreted Factor that Stimulates Neural Stem Cell Survival Possibly by Enhanced EGFR Signaling. PLoS ONE. 5, (12), e15341 (2010).
  15. Gan, H. T., Tham, M., Hariharan, S., Ramasamy, S., Yu, Y. H., Ahmed, S. Identification of ApoE as an autocrine/paracrine factor that stimulates neural stem cell survival via MAPK/ERK signaling pathway. J. Neurochem. 117, (3), 565-578 (2011).
  16. Ramasamy, S., Narayanan, G., Sankaran, S., Yu, Y. H., Ahmed, S. Neural stem cell survival factors. Arch. Biochem. Biophys. 534, (1-2), 71-87 (2013).
  17. Ahmed, S., et al. Transcription factors and neural stem cell self-renewal, growth and differentiation. Cell Adh. Migr. 3, (4), 1-12 (2009).
  18. Gritti, A., et al. Multipotent Neural Stem Cells Reside into the Rostral Extension and Olfactory Bulb of Adult Rodents. J. Neurosci. 22, (2), 437-445 (2002).
  19. Gritti, A., et al. Epidermal and Fibroblast Growth Factors Behave as Mitogenic Regulators for a Single Multipotent Stem Cell-Like Population from the Subventricular Region of the Adult Mouse Forebrain. J. Neurosci. 19, (9), 3287-3297 (1999).
  20. Vescovi, A. L., et al. Isolation and cloning of multipotential stem cells from the embryonic human CNS and establishment of transplantable human neural stem cell lines by epigenetic stimulation. Exp. Neurol. 156, (1), 71-83 (1999).
  21. Azari, H., Louis, S. A., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (49), e2639 (2011).
  22. Louis, S. A., et al. Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony-Forming Cell Assay. Stem Cells. 26, (4), 988-996 (2008).
  23. Coles-Takabe, B. L., et al. Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26, (11), 2938-2944 (2008).
  24. Mori, H., Fujitani, T., Kanemura, Y., Kino-Oka, M., Taya, M. Observational examination of aggregation and migration during early phase of neurosphere culture of mouse neural stem cells. J. Biosci. Bioeng. 104, (3), 231-234 (2007).
  25. Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat. Methods. 3, (10), 801-806 (2006).
  26. Yu, Y. H., et al. Purification, Visualization, and Molecular Signature of Neural Stem Cells. Stem Cells and Dev. 25, (2), 189-201 (2016).
  27. Yu, Y. H. C1qR1 is comparable with LeX and Prom1 as a neural stem cell marker. Identification of mouse embryonic neural stem cell surface markers. Chapter 3.5, Figure 3.17 (2012).
  28. Tham, M. Neural colony-forming cell assay. A role for chondroitin sulfate proteoglycan in regulating the survival and growth of neural stem cells. Chapter 3.6.3, Figure 3.22A (2009).
  29. Yuan, S. H., et al. Cell-Surface Marker Signatures for the Isolation of Neural Stem Cells, Glia and Neurons Derived from Human Pluripotent Stem Cells. PLoS ONE. 6, (3), e17540 (2011).
  30. Hall, P. E., Lathia, J. D., Miller, N. G. A., Caldwell, M. A., Ffrench-Constant, C. Integrins Are Markers of Human Neural Stem Cells. Stem Cells. 24, (9), 2078-2084 (2006).
Перечень нервных стволовых клеток, с помощью клоновых Assays
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Narayanan, G., Yu, Y. H., Tham, M., Gan, H. T., Ramasamy, S., Sankaran, S., Hariharan, S., Ahmed, S. Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays. J. Vis. Exp. (116), e54456, doi:10.3791/54456 (2016).More

Narayanan, G., Yu, Y. H., Tham, M., Gan, H. T., Ramasamy, S., Sankaran, S., Hariharan, S., Ahmed, S. Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays. J. Vis. Exp. (116), e54456, doi:10.3791/54456 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter