Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Nöral Kök Hücre Sayım klonal Tahliller Kullanma

doi: 10.3791/54456 Published: October 4, 2016

Summary

Nöral kök hücreler (NSC'lerde) kendini yenilemek ve üç sinir soy içine ayırt edebilirsiniz hücrelere bakın. Burada, klonal koşullarda neurosphere oluşumu ve farklılaşmayı kullanarak belirli bir hücre popülasyonu MGK sıklığını belirlemek için bir protokol açıklar.

Abstract

astrositler, nöron ve oligodendrositleri - nöral kök hücreler (NSC'lerde) kendini yenilemek ve üç büyük nöral soyları üretmek için yeteneği var. NSC'lerde ve nöral progenitörler (NPS) neurospheres in vitro genel olarak kültürlenir. Bu protokol klonal şartlar altında belirli bir hücre popülasyonunda MGK sıklığını belirlemek için nasıl ayrıntılı olarak anlatılmaktadır. Protokol klonal neurospheres üretilmesine olanak sağlayan bir yoğunlukta hücreler tohumlama ile başlar. Neurospheres sonra odacıklı lamelleri transfer ve neurospheres farklılaşma potansiyeli maksimize şartlandırılmış ortamda, içinde klonal şartlarda ayrılır. Son olarak, MGK frekans neurosphere oluşumu ve multipotency yeteneklerine göre hesaplanır. Bu protokolün Kamu aday MGK belirteçlerin değerlendirilmesi, NSC'lerde saflaştırılması ve NPS gelen NSCs ayırt yeteneği vardır. Bu yöntem çok s olan gerçekleştirmek için 13 gün sürerGeçerli yöntemlere göre daha Hörter MGK frekansını numaralandırmak için.

Introduction

Nöral kök hücreler (NSC'lerde) kendini yenilemek ve multipotent vardır, merkezi sinir sistemi (MSS) hücrelerdir. NSC'lerde ilk embriyonik ön beyin gelişimi sırasında belirlenen ve bu tür lateral ventriküllerin subventricular bölge (SVZ) ve hipokampus dentat girus (DG) gibi belirli bölgelerde yetişkin beyinde devam etmeye devam edilir. MGK hatlarının bir dizi böyle Batten hastalığı 1 olarak inme ve diğer nörolojik hastalıkların tedavisi için klinik çalışmalarda kullanılmaktadır.

NSC'lerde ve nöral atalarıdır (NPS) Neurospheres adlandırılan 3 boyutlu sfero yapılarını yüzen olarak kültüründe yayılır. Embriyonik ve yetişkin kortikal hücre, epidermal büyüme faktörü (EGF) ve temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) 2-4 mevcudiyetinde bölmek olabilir saptandığında neurosphere kültür sistemi, 1990'ların başında Reynolds ve Weiss tarafından geliştirilmiştir. Neurospheres C heterojen bir karışımı oluşurfarklı gelişim aşamalarında 5 de alt sınıflar oluşan arşın. Özellikle nedeniyle NPS varlığı neurospheres elde edilen verileri kullanarak NSCs çalışmaya zordur. Bu nedenle, neurospheres gelen NSCs ettirecek önemlidir. Bu, dört ana yöntem, in vitro olarak NSC'lerde zenginleştirilmesi için kullanılmıştır. Ana hücre yüzeyi markerlerinin kullanımı. Lewis-X (Lex) ve (aynı zamanda Prominin1 olarak da bilinir) CD133 MGK 6-9 işaretleme kalemler en önemli hücre yüzeyi vardır. Sindekan-1, Çentik 1 ve integrin beta1 NSC'lerde 10 ettirecek diğer yüzey proteinleridir. İkincisi boya dışlama olduğunu. Fluoresan DNA bağlanma boya Hoechst 33342 üzerinden pompa için eşsiz bir yeteneği vardır yan popülasyonu, hücrelerin, NSC'lerde 11 zenginleştirilmiş olduğu gösterilmiştir. Üçüncü morfolojik seçim kullanılmasıdır. Artan hücre boyutu ve ayrıntı hücreler muadillerinden 5,12,13 daha NSCs liman olduğu gösterilmiştir. Dördüncü MGK su eklenmesidirKültür ortamına rvival faktörler. Bu Kondroitin sülfat proteoglikan eklenmesinin gösterilmiş ve apolipoprotein E NSC hayatta kalmasına katkıda bulunur ve bu yüzden MGK frekansı 14,15 artar. Transkripsiyon faktörleri de dahil olmak üzere pek çok belirteçler NSC'lerde 16,17 ile ilişkili olsa da, bu markerlerin hiçbiri saflığına NSCs ettirecek edebiliyoruz. Kesin MGK belirteçlerin eksikliği nedeniyle, bu NSCs ölçmek ve in vitro NPS onları ayırmak için bir sorundur.

İlk çalışmalar NSCs 7,11,13 ölçmek için neurosphere formasyonu deneyi (NFA) kullanılır. Bu tahlilde, hücreler ayrışmış Neurospheres oluşturmak üzere kültürlenir ve neurospheres sayısı belirlenir kaplı her 100 hücre için oluşturulan. Bu değer Neurosphere Formasyonu Birimi (NFU) olarak adlandırılır. Tüm Neurospheres NSC'lerde kaynaklanan eğer NFU MGK frekansını eşittir. Bununla birlikte, her iki Neurospheres NS tarafından oluşturulan gibi NFU MGK frekansı tahminini fazla olduğu gösterilmiştirCs ve erken NPS 5. Böylece, sadece neurosphere oluşumuna dayanan NSCs numaralandırmak için yanlıştır. Bu onların yeteneklerine göre NSCs ölçmek mümkün olabilir, kendini yenilemek yoğun çoğalmaya ve multipotent neurospheres oluşturur.

Duyarlı EGF ve bFGF olan NSC'lerde, genellikle en az on pasajları hayatta ve böylece kültür 4,18-20 geniş kendini yenileme kapasitesini gösterir. hem duyarlı EGF ve bFGF olan NPS, aynı zamanda, uzun bir süre için bir kaç geçişleri ancak için Neurospheres oluşturabilir. Bu nedenle, yaygın iyi niyetli NSC'lerde en az on geçişleri için neurosphere oluşumuna dayanan adil bir doğrulukla numaralandırılan edilebileceği kabul edilmiştir. Çalışmaların çoğunda, ancak, kendini yenileme nedeniyle genellikle on geçişleri için gerekli olan uzun deneysel zaman ikincil veya üçüncül neurosphere oluşumu dayalı olarak ölçülür. Bu nedenle, ikincil NFA geniş kendini yenileme yeteneği bahsi karşılaştırma için kullanılabilirween popülasyonları, ama doğru MGK frekansını numaralandırmak için kullanılamaz.

NSC'lerde NP kıyasla daha büyük bir çoğalma yeteneğine sahiptir. NSC'lerde Bu özellik Louis ve arkadaşları tarafından kullanılmıştır. Nöral koloni oluşturan hücre deneyi (NCFCA) 21,22 - MGK sayımı için bir test geliştirmek için. Bu deneyde, tek hücreler kolajen ihtiva eden yarı katı matris içinde 3 hafta içinde kültürlenir. Bu kültür koşulları altında, çapı 2 mm üzerinde Neurospheres hücreler, tripotent ve uzun bir dönem için kendi kendine yenileyebilir gösterilmiştir. Bu hücreler NSC'lerde olarak tanımlanır. Bu nedenle, NSC'lerde etkin bir NPS ayırt edilir.

NSC'lerde astrositler, oligodendrositler ve nöronlar içinde farklılaşan yeteneğine sahiptir. neurospheres farklılaşması için, büyüme faktörleri kaldırılır ve serum, kültür ortamına ilave edilir. Her üç sinir soy o neurosphere başlatılan daha sonra hücre bir neurosphere gözlenen ise benBir MGK s. Ancak, farklılaşma denemesi bazı sınırlamalar vardır. İlk olarak, farklılaşması için kullanılan kültür koşulları üç nöral soylarının üretimi için uygun olmayabilir. Aslında, tek neurosphere farklılaşma sürecinde, çok hücre ölümü meydana gelir ve çok astrosit nesil (Tham M ve yayınlanmamış Ahmed S) meydana gelir. İkincisi, klonalitenin sorunu var. NSC'lerde, oluşumu ve neurospheres farklılaşma doğru sayım için, her neurosphere tek bir hücreden kaynaklanan klonal koşullar altında gerçekleştirilmesi gerekir. Toplu süspansiyon kültürlerinde, toplama hücresel ve neurosphere seviyelerinde 23-25 hem de oluşur. Her neurosphere neurosphere sayma ve multipotency değerlendirilmesini karmaşık hale birden fazla hücre veya neurospheres, ortaya için nedenle, mümkündür. Son kanıtlar hücrelerinin toplanması 0.5 hücre / aşağıda uL veya ve düşük kaplama yoğunluğunda meydana gelmez gösterir kültür plakaları neu sırasında taşınır zamanrosphere oluşumu 15. Böylece klonalite sağlayacak kadar düşük yoğunlukta hücrelerin kültürlenmesi.

Şu anda, NCFCA NPS gelen NSCs ayırt ve MGK frekansını numaralandırmak için en sık kullanılan yöntemdir. NCFCA Ancak üç hafta nispeten uzun bir zaman alır. Burada, multipotent Neurospheres oluşturulması için NSC'lerde yeteneklerine göre MGK frekans numaralandırmak için bir protokol açıklar. Bu protokol gerçekleştirmek için sadece 13 gün sürer. kollajen matris neurospheres hareketini önlediği NCFCA klonalite sağlamaktadır. Bu protokolde kullanılan kültür koşulları, aynı zamanda klonalite boyunca muhafaza edilmesini sağlar. Örneğin, 50-çukurlu odacıklı lamelleri kullanımı Neurospheres birbirlerine temas etmeden ayırt etmesini sağlar. Ayrıca, neurospheres (Şekil 1) farklılaşma potansiyelinin en üst düzeye çıkarmak farklılaşma sırasında nörotrofik faktörler malzemeleri orta klimalı kullanın.

Protocol

Hayvanların tedavisi hayvan departmanı tarafından ((http://www.brc.astar.edu.sg/index.php?sectionID-11) IACUC ve NACLAR kurallarına uygun olarak yapılan ve kabul edildi.
Not: Neurosphere kültürleri / 6 fareleri, daha önce 5 açıklandığı embriyonik (E14) C57BL ön beyin hazırlandı.

Kültür Klon Örnek Neurospheres 1. (Gün 1)

  1. EGF (nihai konsantrasyon: 20 ng / ml), bFGF (nihai konsantrasyon: 10 ng /: B27 eki ile Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı / Besin F-12 (DMEM / F12) orta birleştirerek (1x nihai konsantrasyon) MGK büyüme ortamı hazırlamak ml) ve penisilin / streptomisin (nihai konsantrasyon: 1 x).
  2. 1 ml MGK büyüme ortamı ve oda sıcaklığında, 7 dakika için 1 ml 0.05 N sodyum hidroksit içinde E14.5 fare Neurospheres ayrıştırmaları. Pipet hücreleri yukarı ve aşağı bazen süspansiyon hücreleri tutmak için. nötr 0.05 N hidroklorik asit, 1 ml ekleyinAlkali ize.
    Not: Neurosphere hücreleri 10 cm'lik kültür kabı başına 20.000 hücre / ml'de tohumlanmıştır ve 37 ° C'de,% 5 CO2 seviyesinde 5 gün boyunca kültürlenmektedir. beklenen verim sonra 10 cm çanak başına yaklaşık 10 milyon hücredir. Bu hücreler daha sonra ayrılmış ve adımlar sırasıyla 1.2 ve 1.3, tarif edildiği gibi klonal yoğunluğunda tohumlanır.
    1. Tripan Mavisi boyama ve hemasitometre kullanarak hücre sayımı gerçekleştirin.
  3. 96 oyuklu bir çanak / ml veya daha düşük 100 uL MGK büyüme ortamında 50 hücre yoğunluğunda Tohum tek E14.5 fare neurosphere hücreleri. Klonal Neurospheres üretmek için B 37 ° C'de 1 için,% 5 CO2 hücreleri inkübe edin.
    NOT: Hücreler birbirine temas etmeyecek şekilde Klonalite bu yoğunlukta Neurosphere oluşumu sırasında sağlanmaktadır.

Klimalı ortamda için Neurospheres 2. Kültür (Gün 3)

  1. Adım 1.2'de tarif edildiği gibi E14.5 fare Neurospheres ayrıştırmaları.
  2. E'den Tohum tek hücre10 cm'lik bir kültür kabı içinde 10 ml MGK büyüme ortamında 20,000 hücre / ml yoğunluğunda 14.5 fare Neurospheres. Toplu kültürlenmiş Neurospheres oluşturmak için 5 gün süreyle 37 ° C,% 5 CO2 hücreleri inkübe edin.

Orta Klima neurosphere 3. Hazırlama (Gün 8)

  1. 700 uL karıştırılarak kaplama çözeltisi hazırlayın% 0.01 Poli-L-lisin (PLL), 70 1 mg ul / ml laminin ve Fosfat Tamponlu Salin 6.230 uL (PBS).
  2. Ceket, 37 ° C 'de 2 saat süre ile PLL / laminin çözeltisi 7 mL, 10 cm'lik kültür çanağı.
  3. 10 ml serolojik pipet kullanarak 15 ml konik santrifüj tüpüne tüm dökme kültürlenmiş Neurospheres aktarın. Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 171 x g'de santrifüj Neurospheres tamamen supernatant çıkarın.
  4. ve fetal sığır serumu (FBS) (nihai konsantrasyon:% 0.5) Ad (1x nihai konsantrasyon) B27 DMEM / F12 ortamı birleştirerek MGK farklılaşma ortamı hazırlayınneurospheres MGK farklılaşma orta d 10 ml. yukarı pipet ve bir kaç kez aşağı neurospheres tekrar süspansiyon.
  5. Aspire PLL / 10 cm kültür çanak laminin ve 10 ml PBS ile bir kez yıkayın. PLL / Laminin kaplı 10 cm kültür çanak tüm neurospheres aktarın. 37 ° C sıcaklıkta O / N inkübe, neurospheres% 5 CO2 çanak uyması.

Örnek neurospheres NFU 4. Belirlenmesi (Gün 8)

  1. (; Bölüm 1 gün 1 numaralı seribaşı) iyi bir mikroskop altında her oluşturulan neurospheres sayısını.
    NOT: NFU verir kaplı 100 hücre başına oluşan neurospheres sayısını belirler.

50-de Chambered lamel örnek neurospheres 5. Transferi (Gün 8)

  1. Ceket, 37 ° C 'de 2 saat süre ile PLL / laminin kaplama solüsyonu 10 uL 50-kuyucuklu odacıklı lamel her bir.
    NOT: tarif edildiği gibi kaplama çözeltisi hazırlayın3.1 adım.
  2. PBS her biri 30 mL içeren 3 x 50 mL konik santrifüj tüpü hazırlayın. Steril forseps kullanarak, kaplamalı 50-iyi odacıklı lamel çıkarın. Kaplama çözüm yıkayın, ikinci ve daha sonra PBS üçüncü tüp ardından PBS ilk tüp içine odacıklı lamel batırın.
  3. odacıklı lamel kuyulardan kalan sıvıyı aspire.
  4. Yavaşça 96 oyuklu çanak her bir yanı, tüm orta ve Neurospheres pipet ve tek bir 10 cm'lik kültür tabağına aktarın.
  5. Mikroskop altında, 10 uL pipet ile donatılmış bir P10 mikropipet kullanarak bir örnek neurosphere seçin. sadece tek bir neurosphere 2 mcL pipet sütun ayarlayarak her zaman alınır emin olun. Her neurosphere için yeni bir pipet kullanın.
  6. kaplanmış 50-iyi odacıklı lamel bir kuyunun merkezi üzerine neurosphere aktarın.
  7. Tekrarlayın odacıklı lamel conta her bir kuyu kadar 5.5 ve 5.6 adımlarıBir neurosphere ins.
    Not: Neurospheres bir laminer akış başlığı içinde ya da sıra üzerine yerleştirilmişlerdir mikroskop altında aldı edilebilir.
  8. odacıklı lamel her bir kuyunun 10 uL MGK'nın farklılaşma orta ekleyin. MGK farklılaştırma ortamının kurumasını önlemek için çanak kenarları boyunca bir 10 cm'lik kültür kabı ve pipet PBS odacıklı lamel yerleştirin. bir 10 cm kültür çanak iki odacıklı lamelleri kadar yerleştirin. Gece boyunca 37 ° C'de,% 5 CO2 seviyesinde (10 cm kültür kabı içinde ihtiva) bölmeli lamel inkübe edin.

Örnek Neurospheres 6. Farklılaşma (Gün 9)

  1. 15 ml konik santrifüj tüpüne (bölüm 3 itibaren) toplu kültür neurospheres gelen farklılaşma ortamı aktarın. farklılaşma orta 2-3 mL koparmasını yapıştırılır hücreleri önlemek için kültür çanak kalmasını sağlamak. 20 ml steril şırınga kullanarak, bir 0.2 μ içinden farklılaşma orta geçmesim filtre herhangi bir hücre veya enkaz kaldırmak için.
  2. geri yapıştırılır hücreleri içeren 10 cm kültür çanak filtrelenmiş farklılaşma orta aktarın.
  3. Steril forseps kullanarak, yavaşça örnek Neurospheres aşağıya bakacak şekilde ters çevrilmiş bir şekilde farklılaşma ortamına odacıklı lamel yerleştirin. 37 ° C 'de 3 gün boyunca farklılaşma ortamı ile odacıklı lamel inkübe,% 5 CO2.
    Not: Örnek Neurospheres farklılaşma ortamı ile temas halindedir, ancak altında farklılaşan hücreler ile temas halinde.

Farklılaştırılmış Neurospheres 7. Tespit (Gün 12)

  1. Yavaşça steril forseps kullanarak 10 cm kültür çanak odacıklı lamel çıkarın. Yavaşça koşullu orta yıkayın PBS içine lamel batırın.
  2. lamel silikon conta soyulabilir. lamel bozulmaması için nazikçe ve yavaşça bu gerçekleştirin. nerede inci tarafında dikkat edinE farklılaşmış Neurospheres yapıştırılır.
  3. lamel ölçülerine parafın filmi kesmek bir parça üzerine,% 4 paraformaldehid (PFA) Pipet 1 mi. Yavaşça PFA ile temas aşağı bakacak neurospheres ile parafin film üzerinde lamel yerleştirin. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca Neurospheres saptamak.
    Dikkat: PFA toksik hem sıvı hem de buhar şeklinde ve yanabilir. buharı solumaktan kaçının ve Göz ve cilt ile temasa geçin. Her zaman bir havalandırmalı davlumbaz PFA anlaştım.
  4. parafın film parçası üzerine PBS pipetle 1 ml. hafifçe Neurospheres, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS ile temas içinde aşağı doğru bakacak şekilde lamel yerleştirerek Neurospheres yıkayın.
  5. Adımı yineleyin 7.4 iki kez daha.

Farklılaştırılmış Neurospheres 8. O4 Boyama (Gün 12)

  1. PBS içinde% 3 sığır serum albümini (BSA) hazırlayın. parafın film parçası üzerine% 3 BSA pipetle 1 ml. hafifçe placin tarafından neurospheres engelleg, oda sıcaklığında 30 dakika süreyle BSA ile temas içinde (Neurospheres aşağı bakacak şekilde) lamel.
  2. Pipet 1 fare anti-O4 IgM antikorunun ml: parafın film parçası üzerine (3: 1,% BSA içinde 300 seyreltme) ve antikor ile temas içinde aşağı gelecek şekilde neurospheres parafin film lamel. O4 boyama oda sıcaklığında 2 saat süre ile meydana izin verin.
  3. Aşama 7.4 de tarif edildiği gibi PBS ile iki kez lamel yıkayın.
  4. Yeşil fluoresan boya konjüge-anti-fare IgM ikincil antikor pipetle 1 ml (1: 500% 3 BSA içinde seyrelti) parafın film parçası üzerine ve antikor ile temas içinde aşağı gelecek şekilde neurospheres parafin film lamel . karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat bekletin.
    NOT: itibaren bu adımdan karanlık bir ortamda immün gerçekleştirin.
  5. Aşama 7.4 de tarif edildiği gibi PBS ile iki kez lamel yıkayın.

9. Tuj1 ve glial fibriller asidik protein (GFAP) boyamaFarklılaştırılmış neurospheres (Gün 12)

  1. % 3 BSA: Triton X-100 (% 0.5 son konsantrasyon) eklenerek çözelti Su-geçirimli hazırlayın. parafın film parçası üzerine çözelti Su-geçirimli Pipet 1 ml. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca su-geçirimli çözeltisi ile temas içinde aşağı gelecek şekilde neurospheres parafin film lamel yerleştirin.
  2. Aşama 7.4 de tarif edildiği gibi PBS ile iki kez lamel yıkayın.
  3. Fare pipetle 1 ml anti-Tuj1 IgG 2a antikoru (1: 500% 3 BSA içinde seyreltme) ve tavşan anti-GFAP IgG antikoru (1: 3% BSA içinde 1000 seyrelti) parafın film ve bir yer örtücü bir parça üzerine ilgili antikorlarla temas aşağı gelecek şekilde neurospheres parafin filmi. Tuj1 ve GFAP boyama oda sıcaklığında 2 saat süre ile meydana izin verin.
    NOT: Her iki antikor, tek bir çözelti halinde elde edilebilir.
  4. Aşama 7.4 de tarif edildiği gibi PBS ile iki kez lamel yıkayın.
  5. Kırmızı floresan boya Pipet 1 mLkonjüge-anti-fare IgG 2a (1: 3% BSA içinde 500 dilüsyon) ve uzak-kırmızı flüoresan boya konjüge-anti-tavşan IgG (1: 3% BSA içinde 500 dilüsyon) parafın film ve yerde bir parça üzerine ikincil antikorlar antikorlar ile temas aşağı bakacak neurospheres ile parafin film üzerine lamel. Oda sıcaklığında 1 saat bekletin.
    NOT: Her iki antikor, tek bir çözelti halinde elde edilebilir.
  6. Aşama 7.4 de tarif edildiği gibi PBS ile iki kez lamel yıkayın.
  7. PBS içinde 300 nM'ye 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) stok çözeltisi ile seyreltilir. çekirdek boyama için oda sıcaklığında 2 dakika için DAPI ile temas içinde aşağı gelecek şekilde neurospheres parafin film parafın film ve bir yer örtücü bir parça üzerine DAPI Pipet 1 ml.
  8. Aşama 7.4 de tarif edildiği gibi, iyonu giderilmiş su ile bir kez PBS ile ve iki kez de lamel yıkayın. Uygun bir montaj orta kullanarak bir cam slayt lamel monte edin ve oda sıcaklığında O / N kurumasını bekleyin.

10. ImaFarklılaştırılmış neurospheres ging (Gün 13)

  1. 40x kullanarak bir konfokal mikroskop altında görüntü Neurospheres. sırasıyla, oligodendrosit, nöronlar ve astrositler algılamak için 488 nm, 594 nm ve 647 nm lazerler kullanın.
  2. unipotent, bipotent ve tripotent neurospheres yüzdesini belirlemek.
    Not: - oligodendrosit nöron ve astrositler 5,14,15,26 Etkili üç nöral soy ayırt etmek neurosphere yeteneği belirlenir. Oligodendrosit O4 (bölüm 8) için pozitif boyama ile tanımlanır. Nöronlar Tuj1 (Bölüm 9) pozitif boyama ile tanımlanır. Astrositler GFAP (bölüm 9) için pozitif boyama ile tespit edilir. Bir unipotent neurosphere soy sadece birine ayırır ve pozitif O4, GFAP veya Tuj1 biri için leke gerekir. Bir bipotent neurosphere herhangi iki soy içine ayıran ve olumlu O4 ve GFAP veya O4 ve Tuj1 veya GFAP ve Tuj1 için leke gerekir. Farklı bir tripotent neurosphereÜç soy içine ara ürünlerinin pozitif O4, GFAP ve Tuj1 için leke gerekir.
  3. Aşağıdaki formülü kullanarak ilgi popülasyonda MGK sıklığının saptanması:
    MGK frekans = (tripotent neurospheres NFU x%) /% 100.

Representative Results

Biz NSC'lerde için zenginleştirmek için Lex, bilinen bir hücre yüzeyi MGK işaretleyici 7 yeteneğini değerlendirmek için bu protokolü kullanılır. Bu çalışmadan elde edilen veriler NSC'lerde protokolde klonal tahliller kullanılarak numaralandırılır nasıl göstermek için kullanılacaktır. E14.5 fare neurosphere hücreleri, anti-Lex antikoru ile inkübe edilmiştir. Daha sonra, Lex (Lex -) eksprese etmeyen Lex (Lex +) ve hücrelerinde bulunmuştur (FACS) flüoresanslı etkinleştirilmiş hücre 50 hücre / ml'de ekildi ve 1 wk klonal Neurospheres oluşturmak için bırakılmıştır. Time-lapse görüntüleme Neurospheres 50 hücreleri üretilen gösterir / ml klonal (Şekil 2). Lex + ve Lex için NFU - hücreler tespit edildi. Hücreleri (Şekil 3g) - Lex + hücre Lex ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha yüksek neurosphere oluşum yeteneğine sahip olduğu gösterilmiştir. Oluşturulan Neurospheres sonra ayırt edildiklonal koşullar altında, daha sonra boyanmış (Şekil 3a-e) 'de görüntülenmiştir. Hücreleri (Şekil 3F) - Lex + hücreleri önemli ölçüde daha fazla tripotent Lex daha Neurospheres oluşturur. MGK frekansı sonra NFU ve tripotent neurospheres (Şekil 3g)% 'si olarak hesaplanmıştır. Lex dayalı seçim, bir MGK işaretleyici olarak Lex doğrulayarak, 14'ten fazla kat MGK frekansını zenginleştirir. Biz de bu protokol 27 ve NCFCA 28 kullanılarak E14.5 fare neurospheres MGK frekansını tespit ettik. Her iki yöntem de E14.5 fare neurospheres yaklaşık% 2 karşılaştırılabilir MGK frekansını bildirmektedir.

Şekil 1
Klonal Koşullarında Neurosphere Farklılaşma için Şekil 1. Protokol. Klonal koşullarda yetiştirilen Numune neurospheres tek tek her PLL / Laminin-c yerleştiriliriyi bir 50-iyi odacıklı lamel oated ve / N O uymak için izin verdi. Aynı gün, dökme kültürlenmiş Neurospheres PLL / laminin ile kaplanmış 10 cm tabak farklılaşma ortama yerleştirilmiş ve / nO yapışmaya izin verilir. Toplu kültürlenmiş neurospheres ertesi gün, kıvamlandırılmış ortam filtre edildi ve tekrar 10 cm çanak içine yerleştirilmiştir. Örnek neurospheres sonra klimalı ortama ters ve 3-4 gün 28 için. Farklılaştırmak için izin verilen bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
E14.5 neurospheres türetilen Şekil klonal neurosphere 2. Büyüme. Hücreler ayrılmış ve 96-yuvalı tabak ml / 50 hücre tohumlandı. Bireysel hücreler zaman atlamalı görüntüleme ile 6 gün boyunca takip edildi. o görüntüleriBir neurosphere içine büyüyen ne tür hücre gösterilir. neurosphere klonalite tutar unutmayın. (A) 0 gün; (B) 1.19.45; (C) 2.95.37; (D) 3.32.76; (E) 4.46.53; (F) 5.61.44; İlk sayısı gün belirtir burada, ikinci sayı gün fraksiyonuna değinmektedir, ve üçüncü sayı h fraksiyonuna değinmektedir. 10X büyütme. Ölçek çubuğu, 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil Klon Neurospheres ve MGK Frekansı Numaralama 3. Farklılaşma. Tek neurospheres 3 gün 50-iyi odacıklı lamel toplanmış ve ayırt edildi. Bir tripotent neurosphere sta bir temsilcisi görüntü(a) DAPI ile daimi olarak tutturulabilir ve (b) GFAP için immuno, (c) Tuj1 ve (d) O4. (D) - (e) (a) kaplamayı gösterir. Ölçek çubuğu, 65 mikron. (F) unipotent, bipotent ve tripotent Lex + ve Lex tarafından üretilen neurospheres% - hücreleri (ortalama ± SEM, n = 3). Lex + ve Lex (g) MGK frekans -. NFU ürünü ve tripotent neurospheres% olarak hesaplanmıştır hücrelerin bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Biz hee klonal koşullarda NSC'lerde numaralandırma açıklar. Kritik adımlar, taze MGK büyüme ve farklılaşma ortam maddesinin kullanımını ve ayrıca kaplamak için taze hazırlanmış PLL / laminin çözeltisinin kullanımı odacıklı lamelleri, hem de kültür kaplarına içerir. Bu neurospheres optimal büyüme ve farklılaşma koşulları sağlar. kaliteli antikorların kullanımı etkili nöronlar ve glia, hem de diğer neurospheres ile temas halinde olmayan klonal neurospheres seçici toplama tespit etmek için, önemlidir. Ayrıca, o kadar kuru değil aldı neurospheres sağlamak için önemlidir. Her 10 neurospheres çekme sonra her oyuğa farklılaşma orta 10 uL eklemek için tavsiye edilir. Farklı örneklerden neurospheres arasında çapraz karışmayı önlemek için, numune başına bir adet 10 cm'lik bir tabakta bir odacıklı lamel kullanılması önemlidir. İki lamelleri (farklı numune, her ihtiva Neurospheres) yerleştirilir iseAynı 10 cm çanak, bir lamel Neurospheres belirli soy içine ayırt etmek için diğer lamel içinde neurospheres eğilimi değiştiren faktörleri serbest olabilir. Aynı 10 cm'lik bir tabakta iki lamelleri da örnekler arasında karıştırmak neden olabilir.

NFU veya MGK frekans beklenenden daha düşük olması durumunda, düşük geçit sayısı Neurospheres kullanıldığından emin olun. Sağlıklı düşük geçiş Neurospheres koşullandırılmış ortam üretilmesi için kullanılması da önemlidir. Neurospheres örneğin 96 gözlü tabak içinde küçük çaplı olan kuyularda kültürlenir Ardından, o zaman manevra ve bir mikropipet kullanılarak Neurospheres almak zor olacaktır. Bu durumda, önceki çekme için, bir 6-yuvalı tabak olarak, daha büyük bir kültürü çanak Neurospheres aktarın. aldı neurospheres Bazı kültür ve immün sırasında odacıklı lamel kapalı kaldırabilir. kültür sırasında odacıklı lamel hareketini ve daha az yoğun yıkama en aza indirmek,immün sırasında ing, neurospheres ayrılmasını önlemek için yardımcı olacaktır.

İlk çalışmalar sadece NFA 7,11,13 kullanarak NSCs sayısal. NSC'lerde ve erken NPS hem neurospheres 5 oluşturmak Ancak, NFA MGK frekansını overestimates. Louis et al. NCFCA 21,22 şekilde bilinmektedir NSCs ölçmek için bir yöntem geliştirdi. NCFCA klonalite sağlamak için kollajen bazlı bir matris içinde tek hücre kültür edilmesini içerir, ve çapı 2 mm üzerinde Neurospheres yalnızca NSC'lerde oluşturduğu gösterilmiştir. NCFCA benzer şekilde, klonalite bu protokol boyunca sağlanır. Bu klonal yoğunlukta Neurospheres oluşturma ve odacıklı lamelleri olarak Neurospheres farklılaştırarak elde edilir. odacıklı lamelleri kullanılması bir çok avantaj bahşeder. odacıklı lamel her bir örnek neurosphere böylece diğer örnek neurospheres ile fiziksel temas olan farklılaşma sırasında klonalite sağlanmadan ayırt etmek için izin verir.odacıklı lamel Örnek Neurospheres sürekli konması ve en farklılaşmasını sağlamak için izin vermek için farklılaşma ortamına süspansiyon yerleştirilebilir. farklılaşması sırasında koşullandırılmış ortam ve serum yokluğunda, neurospheres sağkalım düşürür ve Neurospheres çok astrositler (Tham M Ahmed S, yayınlanmamış) oluşturur. Buna ek olarak, immüno neurospheres uygun zaman uzun süre saklanabilir ve odacıklı lamelleri mikroskop cam slaytlar doğrudan monte edilebilir. bir hızla, iyi odacıklı küçük de neurosphere bulmak bir görüntü yakalamak ve bir sonraki kuyuya taşıyabilirsiniz Buna ek olarak, immüno neurospheres görüntüleme kolay yapılır.

Biz bu yazıda 27 ve NCFCA 28 anlatılan protokol ikisini de kullanarak E14.5 fare neurosphere kültüründe MGK frekansı belirledik. ikisi de benim tarafından belirlenen E14.5 fare neurospheres NSC frekansthods karşılaştırılabilir. NCFCA multipotent ve uzun vadeli kendini yenileme kapasitesine sahip NSCs sıralar. Bizim yönteminden MGK frekans NCFCA gelen karşılaştırılabilir olduğundan, bizim protokolden okuma MGK frekansını abartma görünmüyor. NCFCA tamamlanmak üzere üç hafta gerektirir ve özellikle hücre kaplama ve orta ikmal içerir. Burada açıklanan protokol gerçekleştirmek için 13 gün gerektirir ve farklı adımların serisi, örneğin, neurosphere toplama ve immün içerir. Bu protokol NSCs numaralandırmak için alternatif bir yöntem olarak hizmet verebilir. Araştırmacılar kendi örneklerinde MGK frekansını doğrulamak için NCFCA ve bu protokolü hem de kullanabilirsiniz.

Bu protokolün bir sınırlama önemli adımlar bir dizi olması tüm gün 8. 50-de odacıklı lamel klimalı ortamın hazırlanması, örnek neurospheres NFU belirlenmesi ve örnek neurospheres transferi üzerinde yapılacak olması dekar üzerinde yapılany 8. Tek bu adımları tamamlamak için zaman alabilir. Buna ek olarak, verimli bir şekilde bu adımları gerçekleştirmek için pratik gerektirir.

Neurospheres yaygın MGK fonksiyonu ve davranışlarını incelemek için kullanılır olmuştur. Ancak, Neurospheres NSC'lerde ve NP hem oluşmaktadır. Bu nedenle, MGK biyoloji çalışma neurospheres arasında NSCs ettirecek önemlidir. Şu anda, hücre yüzeyi markerleri, boya çıkarma özelliği ve hücre boyutu ve ayrıntı NSC'lerde 6,7,9-13,29,30 zenginleştirilmesi için kullanılmıştır. Bu protokol potansiyel MGK belirteçleri ile NSC'lerde zenginleştirme ölçmek için ve kesin MGK işaretleyici aramayı kolaylaştırmak için kullanılabilir. Dört yeni çalışmalar MGK frekansını 5,14,15,26 numaralandırmak için bu protokolü kullanılır.

Acknowledgments

Biz bu araştırmayı finanse etmek için Bilim, Teknoloji ve Araştırma (A * STAR), Singapur Ajansı teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL conical centrifuge tubes  BD 352096
50 mL conical centrifuge tubes  BD 352070
20 mL sterile syringe   BD 300141
50 mL sterile syringe  BD 300144
Fetal Bovine Serum (FBS)  Biowest S1810
Mouse anti-Tuj1 IgG2a antibody Covance MMS-435P-100
Rabbit anti-GFAP IgG antibody Dako Z033401
Hemocytometer  Hausser Scientific 3100
Microscope fitted to laminar flow hood  Leica MZ6
Glass slides Marienfeld-superior 1000200
Mouse anti-O4 IgM antibody  Merck Millipore MAB345
Hydromount National Diagnostics HS-106
Microscope Nikon Eclipse TS100-F
Laminar flow hood NuAire NU-543
96-well culture dishes NUNC 167008
10-cm culture dishes  NUNC 150350
Paraffin film Parafilm PM999
Human Epidermal Growth Factor (EGF)  Peprotech AF-100-15
Recombinant human basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)  Peprotech 100-18B
0.2 µm filter  Sartorius Stedim 16534-K
0.45 µm filter Sartorius Stedim 16555-K
1.0 N Sodium Hydroxide (NaOH)  Sigma-Aldrich S2770
1.0 N Hydrochloric acid (HCl)  Sigma-Aldrich H9892
Trypan Blue  Sigma-Aldrich T8154
Poly-L-Lysine (PLL)  Sigma-Aldrich P8920
Paraformaldehyde (PFA) powder  Sigma-Aldrich P6148 Toxic
Bovine Serum Albumin (BSA) powder  Sigma-Aldrich A7906
50-well chambered coverslips  Sigma-Aldrich C7735
Stir plate with heat function  Stuart UC152
DMEM/F12 medium Thermo Fisher Scientific 11320-033
B27 supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
Penicillin-Streptomycin  Thermo Fisher Scientific 15140-122
Laminin Thermo Fisher Scientific 23017-015
1x Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ (DPBS) Thermo Fisher Scientific 14190144
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody Thermo Fisher Scientific A21042
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG2a antibody Thermo Fisher Scientific A21135
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG antibody Thermo Fisher Scientific A31573
4’,6’-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)  Thermo Fisher Scientific D3571
Cell-culture centrifuge Thermo Fisher Scientific  RT1 75002383
Pasteur pipettes Thermo Fisher Scientific 10006021
CO2 incubator
Ventilated fume-hood
Aspirator
Confocal microscope
Micropipettes
Micropipette tips
Plastic pipettes
Multichannel pipettes
Glass beaker
Sterile forceps
pH meter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ahmed, S. The culture of neural stem cells. J. Cell. Biochem. 106, (1), 1-6 (2009).
  2. Reynolds, B. A., Tetzlaff, W., Weiss, S. A multipotent EGF-responsive striatal embryonic progenitor cell produces neurons and astrocytes. J. Neurosci. 12, (11), 4565-4574 (1992).
  3. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, (5052), 1707-1710 (1992).
  4. Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and Population Analyses Demonstrate That an EGF-Responsive Mammalian Embryonic CNS Precursor Is a Stem Cell. Dev. Biol. 175, (1), 1-13 (1996).
  5. Narayanan, G., et al. Single-Cell mRNA Profiling Identifies Progenitor Subclasses in Neurospheres. Stem Cells and Dev. 21, (18), 3351-3362 (2012).
  6. Uchida, N., et al. Direct isolation of human central nervous system stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 97, (26), 14720-14725 (2000).
  7. Capela, A., Temple, S. LeX/ssea-1 Is Expressed by Adult Mouse CNS Stem Cells, Identifying Them as Nonependymal. Neuron. 35, (5), 865-875 (2002).
  8. Capela, A., Temple, S. LeX is expressed by principle progenitor cells in the embryonic nervous system, is secreted into their environment and binds Wnt-1. Dev. Biol. 291, (2), 300-313 (2006).
  9. Corti, S., et al. Isolation and characterization of murine neural stem/progenitor cells based on Prominin-1 expression. Exp. Neurol. 205, (2), 547-562 (2007).
  10. Nagato, M., et al. Prospective characterization of neural stem cells by flow cytometry analysis using a combination of surface markers. J. Neurosci. Res. 80, (4), 456-466 (2005).
  11. Kim, M., Morshead, C. M. Distinct Populations of Forebrain Neural Stem and Progenitor Cells Can Be Isolated Using Side-Population Analysis. J. Neurosci. 23, (33), 10703-10709 (2003).
  12. Murayama, A., Matsuzaki, Y., Kawaguchi, A., Shimazaki, T., Okano, H. Flow cytometric analysis of neural stem cells in the developing and adult mouse brain. J. Neurosci. Res. 69, (6), 837-847 (2002).
  13. Rietze, R. L., Valcanis, H., Brooker, G. F., Thomas, T., Voss, A. K., Bartlett, P. F. Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain. Nature. 412, (6848), 736-739 (2001).
  14. Tham, M., et al. CSPG Is a Secreted Factor that Stimulates Neural Stem Cell Survival Possibly by Enhanced EGFR Signaling. PLoS ONE. 5, (12), e15341 (2010).
  15. Gan, H. T., Tham, M., Hariharan, S., Ramasamy, S., Yu, Y. H., Ahmed, S. Identification of ApoE as an autocrine/paracrine factor that stimulates neural stem cell survival via MAPK/ERK signaling pathway. J. Neurochem. 117, (3), 565-578 (2011).
  16. Ramasamy, S., Narayanan, G., Sankaran, S., Yu, Y. H., Ahmed, S. Neural stem cell survival factors. Arch. Biochem. Biophys. 534, (1-2), 71-87 (2013).
  17. Ahmed, S., et al. Transcription factors and neural stem cell self-renewal, growth and differentiation. Cell Adh. Migr. 3, (4), 1-12 (2009).
  18. Gritti, A., et al. Multipotent Neural Stem Cells Reside into the Rostral Extension and Olfactory Bulb of Adult Rodents. J. Neurosci. 22, (2), 437-445 (2002).
  19. Gritti, A., et al. Epidermal and Fibroblast Growth Factors Behave as Mitogenic Regulators for a Single Multipotent Stem Cell-Like Population from the Subventricular Region of the Adult Mouse Forebrain. J. Neurosci. 19, (9), 3287-3297 (1999).
  20. Vescovi, A. L., et al. Isolation and cloning of multipotential stem cells from the embryonic human CNS and establishment of transplantable human neural stem cell lines by epigenetic stimulation. Exp. Neurol. 156, (1), 71-83 (1999).
  21. Azari, H., Louis, S. A., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (49), e2639 (2011).
  22. Louis, S. A., et al. Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony-Forming Cell Assay. Stem Cells. 26, (4), 988-996 (2008).
  23. Coles-Takabe, B. L., et al. Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26, (11), 2938-2944 (2008).
  24. Mori, H., Fujitani, T., Kanemura, Y., Kino-Oka, M., Taya, M. Observational examination of aggregation and migration during early phase of neurosphere culture of mouse neural stem cells. J. Biosci. Bioeng. 104, (3), 231-234 (2007).
  25. Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat. Methods. 3, (10), 801-806 (2006).
  26. Yu, Y. H., et al. Purification, Visualization, and Molecular Signature of Neural Stem Cells. Stem Cells and Dev. 25, (2), 189-201 (2016).
  27. Yu, Y. H. C1qR1 is comparable with LeX and Prom1 as a neural stem cell marker. Identification of mouse embryonic neural stem cell surface markers. Chapter 3.5, Figure 3.17 (2012).
  28. Tham, M. Neural colony-forming cell assay. A role for chondroitin sulfate proteoglycan in regulating the survival and growth of neural stem cells. Chapter 3.6.3, Figure 3.22A (2009).
  29. Yuan, S. H., et al. Cell-Surface Marker Signatures for the Isolation of Neural Stem Cells, Glia and Neurons Derived from Human Pluripotent Stem Cells. PLoS ONE. 6, (3), e17540 (2011).
  30. Hall, P. E., Lathia, J. D., Miller, N. G. A., Caldwell, M. A., Ffrench-Constant, C. Integrins Are Markers of Human Neural Stem Cells. Stem Cells. 24, (9), 2078-2084 (2006).
Nöral Kök Hücre Sayım klonal Tahliller Kullanma
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Narayanan, G., Yu, Y. H., Tham, M., Gan, H. T., Ramasamy, S., Sankaran, S., Hariharan, S., Ahmed, S. Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays. J. Vis. Exp. (116), e54456, doi:10.3791/54456 (2016).More

Narayanan, G., Yu, Y. H., Tham, M., Gan, H. T., Ramasamy, S., Sankaran, S., Hariharan, S., Ahmed, S. Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays. J. Vis. Exp. (116), e54456, doi:10.3791/54456 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter