Summary
该原稿提出了一种注射模制方法来设计该概括内皮生理特性微血管。基于微流体过程创建具有可调整的条件，如流量，细胞组成，几何形状和生化梯度专利3D血管网络。制造过程和潜在的应用例子中描述。
Abstract
体外平台研究血管内皮细胞和血管生物学很大程度上限于2D内皮细胞培养物，与聚合物或基于玻璃基板，和基于水凝胶的管形成测定流动腔室。这些测定，而信息量大，不概括腔的几何形状，正确的细胞外基质，和多细胞的接近，这在调节血管功能中发挥关键作用。该原稿描述了一种注射成型方法，以产生直径为100μm量级的工程化血管。微血管被嵌入的本地I型胶原凝胶内的微流体通道播种内皮细胞制造。通过通道形成之前胶原基质内掺入实质细胞，组织特异性微环境进行建模和分析。流体力学性质和介质组合物的附加的调制允许对所需的微环境内复杂的血管功能的控制。这个平台允许血管周围细胞募集，血内皮细胞相互作用，流动响应，并组织微血管相互作用的研究。工程改造微血管提供来隔离从血管利基的单个组件的影响的能力，并精确地控制其化学，机械和生物性质，研究血管生物学两个健康和疾病。
Introduction
各器官微血管帮助定义组织微环境，保持组织的平衡和调节炎症反应，透气性，血栓形成，纤溶1,2。的微血管内皮，尤其是血流和周围组织并因此之间的界面起着响应于刺激如流体动力和循环细胞因子和激素3调制血管和器官功能起关键作用- 5。理解内皮，血液之间的详细的相互作用，与周围组织的微环境是血管生物学和疾病进展的研究很重要。然而，在研究这些相互作用的进展已经阻碍通过体外工具不体内微血管结构概括和功能6,7-限制。其结果是，外地和治疗的进步主要依赖昂贵和耗时消费的动物模型，往往不能转化为人类的8成功- 10。而在体内模型中的疾病机制和血管功能的研究非常宝贵的，它们是复杂的，且往往缺乏个体细胞，生化的精确控制，和生物物理提示。
血管遍布全身拥有与扩张毛细血管床结合了成熟的分层结构，提供优化的灌注和养分运输同时11。最初，血管的形式作为早期发育过程中12,13整理到一个层次支网络原始丛。尽管许多参与这些过程的信号的充分理解14 - 16日 ，它的血管形成图案是如何这样确定的15仍然难以捉摸。反过来， 在体外扼要这个过程中为工程师举办的血管网络具有蜂Ñ 困难的。许多现有体外平台建模脉管，如二维内皮细胞培养物，缺乏如多细胞接近度，三维管腔几何形状，流量，和细胞外基质的重要特征。在三维水凝胶管形成测定（胶原或纤维蛋白）17 - 19或入侵检测20,21已被用于研究在3D和它们之间的相互作用内皮功能与其他血管17,22或组织的细胞类型23。然而，组装在这些测定流明缺乏互连性，血流动力学流动，以及适当的灌注。此外，对于在这些管形成测定24血管退化的倾向防止长期培养和成熟这限制了可以进行功能性研究的程度。因此，存在一个新兴需要工程师体外微血管网络，可以适当地进行建模连接的平台内皮特性，并能够长期培养的。
各种血管的工程技术已经出现多年来为医疗应用，以取代或患有血管疾病旁路血管的影响。如聚乙烯对苯二甲酸酯（PET），和聚四氟乙烯（ePTFE）由合成材料制成的大直径容器已经与长期通畅（平均95％的通畅超过5年）25相当的治疗成功。虽然小直径合成移植物（<6毫米）通常面临的并发症，如内膜增生和血栓形成26 - 28日 ，组织工程与生物材料制成的小直径移植取得了显著的进展29,30。尽管有这样的进步，在微尺度工程船仍然是一个挑战。到微血管充分模拟，有必要产生具有萨夫复杂网络模式够的机械强度，以保持通畅，并用基质组合物，其允许为实质细胞和细胞重塑既养分渗透。
该协议提出了一种新的人工血管perfusable网络模拟体内的天然具有可调可控的微环境设置31 - 34。所描述的方法生成的直径为100微米量级上的工程微血管。工程微血管由通过嵌入软I型胶原蛋白凝胶中的微流体通道灌流内皮细胞制造。该系统具有生成具有开放的管腔结构图案网络，复制的多细胞相互作用，调节细胞外基质成分，并应用生理学相关的血流动力学部队的能力。
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Protocol
1.图案聚二甲基硅氧烷（PDMS）与网络设计的微细
- 晶圆制造到创造的网络设计的负模板
- 创建使用任何计算机辅助设计（CAD）软件的网络格局。确保入口和出口之间的对角线尺寸匹配在未来的步骤（见2.1.1）的壳体装置的入口和出口储槽之间的距离。
注意：本身是定义这取决于用户的具体的研究目标的图案的设计（ 见图1，例如图案）。 - 生成使用高分辨率打印的网络图案的面罩或从商业供应商订购了镀铬光罩。光刻工艺的更详细的协议，可在其他地方35。
- 清洁的8“硅晶片在100瓦用氧等离子体处理5分钟。
- 倒入足够的负性光刻胶（SU-82100效果很好）到晶片，使抵抗形式的2.5厘米直径的一团。使用旋涂器，旋晶片在500rpm以100rpm /秒斜坡并保持10秒。然后上升到1600 rpm的转速300转/秒，保持30秒。注：速度和斜坡需要为每个实验室条件进行优化，以得到150μm的抗蚀剂厚度。
- 软烘烤在65℃下7分钟的晶片，斜坡上升至95℃以360℃/小时，保持45分钟。慢慢冷却到室温在热板上。由铬光掩模下曝光于365nm UV光压印容器图案上涂覆的晶片，用曝光三倍制造商的建议（350毫焦/厘米2的大约150微米的厚度的SU-8）的。
注意：由于SU-8是一种负性抗蚀剂中，曝光区域（除了图案设计的所有内容）将变得不溶于在步骤1.1.7显影剂。 - 硬烘烤65露出的晶片℃进行5分钟，并上升到95℃与360℃/小时，保持25分钟，然后允许其缓慢冷却到室温在热板上。
- 浸入SU-8开发晶圆10 - 15分钟洗去未曝光的抵抗，然后用异丙醇清洁和干燥压缩氮气流中。检查在光学显微镜下的图案，以确保对SU-8抗蚀剂被很好地结合到晶片（寻找不必要剥离和气泡）。
- 测量使用根据制造商的说明36轮廓曲线的图案特征的厚度。在测量过程中获取，避免对于网络功能（ 即，入口和出口导管），为基于接触轮廓可能损害在晶片上的图形化功能部件的结构完整性所必需的结构的区域。另外，使用非接触方式（ 即光学轮廓仪）完全避免这个问题。
- 创建使用任何计算机辅助设计（CAD）软件的网络格局。确保入口和出口之间的对角线尺寸匹配在未来的步骤（见2.1.1）的壳体装置的入口和出口储槽之间的距离。
- 通用电器图案和平板模具neration胶原成型
注：化学通风柜内拉手硅烷。- 放置晶片用100μl三氯（3,3,3-三氟丙基）硅烷的干燥器2小时到silanize表面。
- 硅烷化转移晶片制成120×120平方毫米的培养皿。倒混合并脱气的PDMS弹性体和固化剂（10:1重量/重量比）在晶片上，以实现4 - 第6毫米的厚度。另外倒入PDMS到一个单独的120×120平方毫米的培养皿中生成平模具无模式。固化在65℃下2小时。
- 从烤箱中取出，并允许PDMS冷却到室温。使用手术刀小心切开围绕的SU-8的正方形和慢慢剥离从晶片的PDMS模具。修剪边缘至30mm×30毫米。适用于平面模具，剪治愈PDMS没有压印花纹小方块约为40mm×40毫米。
2.房屋设备
- Fabricat顶离子和底部外壳件
- 制造使用的聚（甲基丙烯酸甲酯）（PMMA）的容器壳体。为了制作，从一个标准的机加工车间与计算机数控（CNC）铣削功能订购的部分。参见图 1的顶部和底部件的示意图。
- 设计顶壳件（ 图1D），以包括20毫米×20mm的孔上的设备的为1毫米的深度在位于四角的装置的顶部下侧，二胶原喷射口（直径4 mm直径）方形的孔，两个出入口油藏6毫米直径，并且在该装置的四角四个螺孔（直径为3毫米）。
注意：附加孔可以对片进行处理的目的的周边钻孔。 - 设计底部外壳件（ 图1E），包括在中间的方孔（尺寸15毫米×15毫米）与周围25毫米×25mm的架具有0.25毫米的深度。钻4个螺丝孔与4-40线程。确保在底部的螺丝孔和顶部的作品将在今后的组装步骤一起对齐。
3.微血管器件制造
- 材料的制备
- 洗和高压灭菌两套镊子，不锈钢刮刀，一个小的扁平螺丝刀，不锈钢螺丝和几个不锈钢定位销。为容器的制造中，也进行高压灭菌微图案的PDMS模具，PDMS平坦正方形，玻璃盖玻片（22×22 MM）和棉片。
- 消毒在漂白剂的PMMA壳件，至少1小时，然后在组织培养橱蒸压水冲洗两次，并允许在无菌组织培养皿空气干燥（150毫米×25毫米）。
- 无菌聚乙烯亚胺-戊二醛（PEI - GA）涂层
- 对待消毒干PMMA片的外侧井与等离子体约1分钟。添加1％聚乙烯亚胺（PEI）到内孔中（20毫米见方以及在顶部和底部25mm的正方形货架）聚甲基丙烯酸甲酯片10分钟的。用无菌H 2Ø冲洗并在组织培养罩干燥。
注意：需要的等离子体处理的时间是可变的取决于所使用的设备上 - PEI的应该容易传播表示的亲水性表面。如果不是这样，附加的等离子体处理可能是必要的。 - 应用0.1％戊二醛（GA）到PEI处理的聚甲基丙烯酸甲酯片的表面30分钟。用无菌水冲洗两次，晾干。
注：在未来的步骤，胶原蛋白会通过胶原交联戊二醛附着在涂层表面。这有助于在未来的组装步骤和整个装置文化时期固定在设备内发生凝胶。
- 对待消毒干PMMA片的外侧井与等离子体约1分钟。添加1％聚乙烯亚胺（PEI）到内孔中（20毫米见方以及在顶部和底部25mm的正方形货架）聚甲基丙烯酸甲酯片10分钟的。用无菌H 2Ø冲洗并在组织培养罩干燥。
- 胶原凝胶制备
- 制造使用0.6％的船只 - 1％的胶原蛋白解决方案。为了使对容器制造0.75％的胶原蛋白，拌I型胶原蛋白原液（1.5％ -从大鼠分离尾部37）用氢氧化钠（NaOH），10倍的媒体补充（M199），和细胞培养介质。置于冰上所有的解决方案。
- 通过下面的等式，其中Vƒinal是需要凝胶的最终体积确定胶原蛋白的量（通常为1毫升每个设备胶原的就足够了），V 股 票胶原是所需库存胶原蛋白的量， 碳库胶原是浓度股票的胶原蛋白，和Cƒinal胶原是在容器中的胶原蛋白的所需的浓度。
- 用1ml注射器向库存胶原的适当体积转移至新的30毫升锥形管中。确定中和氢氧化钠（V 氢氧化钠 ）的体积，M199 10X媒体的补充（V 10 X）和细胞培养基（Ⅴ1Ⅹ）如下和在15ml锥形管中分别混合：
- 添加中和试剂（V 10 X，V 氢氧化钠 ，V 1 x）的等分胶原蛋白的混合物中，并用小刮铲，直至获得均质凝胶轻轻混合溶液。避免搅拌下慢慢，轻轻地引入气泡。
- 为了将细胞进入基质在所希望的浓度（ 例如，0.5年- 2000万元细胞/ ml），将细胞加入到胶原溶液其与中和试剂混合后，并继续搅拌直至细胞均匀分布。
- 当加入细胞，调整细胞培养基的体积，以容纳附加的体积，如通过下面的等式，其中V 细胞来确定</子>是细胞悬浮液所要求的体积，Cƒinal细胞密度是在容器的细胞的期望的密度，C 悬浮细胞密度是细胞在原液的密度。
- 胶原蛋白注射-顶件
- 放在100毫米×20毫米的菜的微图案PDMS模。等离子体清洁的PDMS模具1分钟。
- 对齐的PDMS模具的顶部的顶部的PMMA片，使得模具上的正方形储层直属入口和出口储（ 见图1D -虚线）。将不锈钢定位销到入口和出口的顶部PMMA片水库孔，以保持与水库花纹清晰访问。
- 用1ml注射器抽取〜0.5 - 0.6毫升胶原。确保没有气泡残留在注射器中。
- 按下倒升ightly与顶部壳体上镊子以确保顶部件和PDMS模具之间齐平的接触。通过在顶部的PMMA片的注射口注射胶原慢。检查胶原20mm的×20mm的领域上面的图案填充，不会泄漏出来。
- 关闭盘不拥挤的定位销，并允许在37℃培养箱胶凝30分钟。
- 胶原蛋白注射-底件
- 放置一个22×22毫米的玻璃盖玻片在底部件的中心。用1ml注射器均匀分配〜0.25毫升胶原到玻璃载玻片。轻轻降低PDMS平面方形过的胶原蛋白，以确保与PDMS是针对PMMA平面和没有捕获的气泡。允许在37℃胶凝30分钟。
- 设备装配
- 凝胶化后，在底部件补充足够的PBS周围的平坦PDMS片包围的PDMS（约1ml）。使用镊子取出任何电子邮件xcess胶原周围的边缘，并慢慢剥去PDMS片。添加更多的PBS的胶原蛋白来维持水化顶部。
- 为了准备顶部件，用镊子拿起顶部PMMA一块，将其翻转过来，以使PDMS模具之上。添加PBS几滴到界面，然后迅速和坚定地取下顶部PMMA片PDMS模。
- 轻轻地取出由PMMA壳的另一侧用另一个镊子不锈钢定位销。添加PBS的几个滴在微图案的胶原蛋白。翻转PMMA顶件以上，使胶原朝下，并把4个螺钉成角孔。
- 轻轻躺在底部件的顶部的顶板，对准在底部件的拐角处的孔的螺钉。不要让两件相互滑动。用螺丝刀拧紧用温柔的触摸螺丝。不要拧得过紧。
- 吸出PBS周边PMMA表面并放置一个小圆周率根据该装置的一个边缘棉花ECE。使用移液管，从容器除去任何的PBS并用细胞培养基代替。允许设备在37℃培养箱在一起凝胶至少1小时。
- 细胞种植
- 培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的内皮生长培养基在37℃（CO 2，O 2）至汇合38。只要有可能，通道4和7之间使用。
- 通过用6ml PBS中洗涤培养烧瓶中，然后在37℃加入0.05％胰蛋白酶2毫升以解离细胞Trypsinize内皮细胞。离开细胞胰蛋白酶直到大部分粘着斑具有离并将细胞四舍五入（这通常需要约2 - 3分钟）。停止加入4毫升含有牛胎儿血清（FBS）的内皮生长培养基的胰蛋白酶反应。洗与媒体几次烧瓶中以确保将细胞从烧瓶中分离，并收集在锥形管中。
- 算使用血球细胞中并在每毫升1000万个单元的密度重悬。从入口和出口储除去所有的细胞培养基。用200μl凝胶加载提示，加10微升细胞悬浮液到入口储的中心。细胞应该开始流入紧接网络和外套网络。
- 同样加入200μl媒体两者水库和让细胞附着和网络内至少1小时传播。
- 设备文化
- 培养通过添加200微升的细胞培养基向入口储和50μl到出口储槽与通过网络重力驱动流的装置。随着文化的这种方法，更换介质每12小时，以保持血管内皮的可行性。
注意：如果连续流动的培养条件是所希望的（保持恒定的剪切应力，在出口处， 等等收集介质）一SYR英格泵可以用来代替重力驱动的文化。 - 允许种子内皮细胞至少24小时的连续申请前流附加和稳定。此前连续流设置，保持与重力驱动流动条件的设备。
注：应用流媒体条件与重力驱动的文化差异。增加了一个等离子体膨胀，如葡聚糖，向媒体稳定工程改造微血管和持续灌注39期间防止血管塌陷。 - 为了让媒体连续流设置，在内皮细胞生长介质溶解3.5％葡聚糖（70 kDa的）最佳船文化。使用无菌技术，填补10毫升注射器与内皮细胞生长介质3.5％右旋糖酐。
- 通过使用烙铁熔化在培养皿的侧壁孔制备用于流的无菌培养皿中。
- 附加12“硅管（1/32”ID），以鲁尔锁连接（女，1/16“ID）和一个1 /16“直管与管连接器与一个1”在另一端管段。插入一个1/4“20G钝针（从针毂分离的）至1的自由端”段。还准备附连到管与管90°弯头连接器接头（将被装配到壳体入口），在随后的步骤中，较长的管将通过准备菜螺纹并安装于3管道的3“段通过20G的针“段。出口管路应反映入口管，具有一个自由端，而不是一个路厄锁定连接。高压灭菌，使用前所有段。
- 通过准备好的菜孔螺纹高压入口和出口管路。连接3“的段到内20G针。附加在Luer锁耦合到填充介质注射器，并通过使用注射器泵设定在一个较高的流速管灌注介质。确保有在管道或接头无气泡，因为这些将阻碍流动到容器中。
- 插入的Connector关节入壳体入口。设定注射器泵以所需的流速和开始灌注。
注意：此可根据容器的几何形状和所施加的剪切应力的实验条件进行调整。对于100微米直径的通道，3微升的流速/分钟效果很好。 - 如果需要，收集灌流液与插入含有500微升媒体无菌5毫升聚苯乙烯圆底管准备出口管道。
注意：介质少量加入到收集管，以防止气泡的形成，可以阻止流动。 - 取决于流速，注射器可能需要后24至36小时，再填充。这是通过从壳体入口移除连接器，取代了注射器，并且允许媒体以高流速几分钟灌注完成。这个序列可确保气泡不会被引入到管道。重置泵到所需的流速为培养，插入连接器插入壳体入口，并返回到培养箱中。
- 培养通过添加200微升的细胞培养基向入口储和50μl到出口储槽与通过网络重力驱动流的装置。随着文化的这种方法，更换介质每12小时，以保持血管内皮的可行性。
4.设备分析
- 渗透性分析
- 使用40 kDa的FITC-葡聚糖形象化原位血管的渗透性。广场上共聚焦显微镜血管住房和集中在容器面。添加5μM的40 kDa的FITC-葡聚糖在4X放大，25毫秒的曝光时间在入口和图像，并以每秒1帧为10分钟。
- 分析与分析代码图像系列基于由Zheng 等发表的模型来估计葡聚糖的渗透性穿过血管壁进入胶原（微米/秒）。人 31。
- 免疫组化和共焦成像分析
- 要修复的船只，由灌注PBS冲洗三次（每次洗涤20分钟）灌注用3.7％的甲醛通过20分钟，并洗涤所述入口。块的非特异性抗体具有2％牛血清白蛋白（BSA）和0.5％的Triton X-100 PE结合通过网络1小时rfused。在4℃下过夜灌注初级抗体溶液并用PBS洗涤三次。灌注次级抗体溶液为1 - 2小时，并以相同的方式，用PBS再次洗涤。
- 使用共聚焦显微镜的1微米的z步骤采取原位微血管免疫荧光图像。图像在4X，10X，或20X的放大倍数的微血管。
注意：4X的倍率将提供全球网络结构的信息，而10X和20X的放大图像将提供蜂窝的细节，如伸长率，结形成， 等等 。 - 分析使用ImageJ以Z预测（图片/栈/ Z-项目），横截面（图片/栈/正交视图）和三维重建（图片/栈/ 3D项目）图像堆栈。
- 扫描电子显微影像
- 对于电子显微镜分析， 修复原位灌注半强度Karnovsky的溶胶ution（在0.2M的二甲胂缓冲液2％多聚甲醛/ 2.5％戊二醛）过夜。拆卸船只，小心地将两件分开。修剪边，并在几天固定液充分浸泡。
- 沉浸在25％的戊二醛在容器的厚顶部部分20分钟，并用PBS冲洗三次（每次2分钟）。脱水在50％，70％，85％（每次2分钟），并在100％乙醇（每次5分钟）洗涤两次串行乙醇洗涤。
- 准备用于与按照制造商的协议40进一步脱水临界点干燥分析样品。溅射涂覆容器用金 - 钯（7纳米）和扫描电子显微镜下分析用5千伏，光斑尺寸3的加速电压。
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Representative Results
该工程船平台创建嵌入式天然I型胶原基质内的微血管功能，并允许进行体外细胞，生物物理和生物化学环境的严格控制。为了制造工程改造的微血管，人脐静脉内皮细胞（HUVECs）通过胶原包埋微流体网络，其中它们连接，以形成一个专利腔和汇合内皮灌注。如在图1A-C中所示，容器的几何形状可以被专门设计用于回答有关的流速，扭曲的问题，和分支角度，等等。调制通过微血管的流速提供深入的内皮细胞的剪切应力响应。先前，制造重点一直主要是在100微米的尺寸范围容器，然而微血管高达500微米或在一些情况下，小至50微米的直径已经SUCCessfully制成并培养。长期通畅的例子示以及在重力作用下驱动流动（ 图2A）和连续施加流动（ 图2B）培养微血管的存活。工程微血管的体内样特性可以通过多种方式来证明。各种内皮功能都可以使用该平台，包括屏障功能（ 图3A），细胞-细胞相互作用和信号（ 图3B），和血管生成重塑（ 图3C）来测量。这些微血管的一个重要特征是其在生物学相关的方式响应炎性刺激的能力。这最好是通过它们与在图4A-C的全血，其中非激活的内皮是静态（ 图4B）相互作用证实和激活的内皮诱导血栓形成（ 图4C）。通过培养迪内皮细胞这个平台内ffering起源，所以可以理解的内皮细胞之间的功能的异质来自不同来源。 图5A-C示出了具有两种不同的人类干细胞衍生的内皮细胞类型这种异质性的一个例子是，当培养在微血管系统的显示截然不同的表型41。通过调节流动剖面，细胞成分和培养条件，工程微血管提供体外工具，一个强大的研究，既卫生和疾病内皮细胞生物学和微血管。
图1的网络的原理图的设计和微通道制造协议。血管网络几何可以专门设计成产生不同的流动图案。A.例如，一个支化设计将已经FL减少中心附近最大流率（一个3×3格的8倍减少）导致不同的剪切应力区同船31 B中的内皮细胞。高度支化的格遵循相同的原理与前面的设计，但具有较大的丛。利用这一设计，在流率的50倍的降低，导致在从10的剪切速率减少到500秒的效果-1可以当通过网络被施加1000 Pa的压力降观察32。℃。更复杂的设计如用锐利的角部的曲折网络32可以被用来回答关于向中断层流，这往往发生在病理学上下文42内皮反应的问题。从这些模式做微血管将有一个直径为100 - 150微米D.有微制造过程中三个主要步骤。首先，壳体夹具的顶部放置在PDM的顶小号图案化网络模具中，使得入口和出口对准。然后胶原I被注入到通过喷射口的封闭空间（黑箭头）。典型地，0.75％的胶原蛋白I混合物用于制造。成功的微血管制造可以用低至0.6％的胶原蛋白来实现，但是小于0.6％通常会导致机械强度不足和信道塌陷。 大肠杆菌的薄胶原的层被添加到底部件上盖玻片顶部和扁平的在37℃的另一块PDMS。F.凝胶后，模具取出PDMS和顶部和底部的住房夹具拧在一起，封闭的网络。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.工程微血管内皮功能的研究。一个 。内皮屏障功能可以FITC（异硫氰酸荧光素）的灌注后进行评估通过网络（顶部）和其扩散的后续测量到大量胶原（底部）结合的葡聚糖。使用自定义码，灌注的视频可以分析在感兴趣的区域中的帧内随时间来确定FITC-葡聚糖的渗透系数K（微米/秒），以绘制像素强度。通过实验室以前的出版物已经表明，这些工程化血管的渗透性是比得上体外哺乳动物血管31,43。B辑。与periv内皮细胞的相互作用ascular或支持细胞可以在这个平台上通过调制胶原基质的细胞组成进行分析。这里，当平滑肌细胞嵌入血管周围的胶原内的这些细胞 - 细胞相互作用的一个例子中可以看出。后在培养14天，平滑肌细胞（染色绿色α平滑肌肌动蛋白（αSMA）），与内皮准并沿血管壁延伸过程和如在正交突起31所示充当血管周围细胞。在面板A和B中显示的图像从早期出版物31Ç复制品。血管生成萌芽和重塑在改造微血管通过修改培养基包括血管的刺激进行评估。如果没有血管的刺激，血管内皮细胞表现出最小的出芽（左）;与血管发生刺激（GSK-3，20纳克/毫升血管内皮生长因子的1μM的小分子抑制剂，和20纳克/毫升碱性成纤维细胞格罗WTH因子），内皮细胞容易发芽到矩阵，如自上而下的预测和正交视图（右）看到。芽长度和数量是ImageJ的软件41容易量化。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4.血内皮细胞相互作用。其设计微血管是静态和适当的炎症刺激反应。A.未修改，入口附近拍照HUVEC培养容器显示出强大的CD31交界染色（红色）和一个回合，开光衰。A'。正交视图管腔被示出。B.当柠檬酸盐化的全血与CD41a-标记的血小板（绿）通过类似的静态容器灌注，最小的广告血小板（绿色）的内皮HESION观察。℃。在暴露于炎症刺激如佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA，50纳克/毫升）的媒体，全血的结果在大血栓的形成灌注（CD41a标记，绿色）通道内并白细胞（标记为CD45 +，白色）到容器壁31的粘附。在这里看到的图像从早期出版物31再现。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5.人干细胞衍生-内皮。附加内皮细胞来源生成的微血管可用于产生工程化微血管。今年早些时候，Palpant 等。人证明了两个不同的亚型Ø˚F人胚胎干细胞衍生的内皮细胞可以通过分化过程中操纵的Wnt /β-catenin信号来获得：hemogenic内皮细胞（其特征在于HAND1和高hemogenic潜在的表达）和心内膜样内皮细胞（通过表达特征部分NFATC1和GATA4）41。A.。当种子培养在3D容器平台，hemogenic内皮细胞经过一些血管生成萌芽。B.然而，心内膜样内皮细胞更为血管生成和迁移，暗示功能上的差异，可能是响应流动，内皮细胞的两种亚型之间（这一工作提出更详细的先前出版物41）。两种细胞类型表达CD31连接蛋白（红色）和一些VWF（绿色）。二者的正交视图显示专利流明。C.通过容器内的心内膜状内皮细胞的扫描电子显微镜图像示出了血管生成萌芽所见从腔侧。在板A和B呈现的图像从Palpant 等复制品。人 41， 请点击这里查看该图的放大版本。
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Discussion
改造的微血管是一个体外模型，其中诸如鲁米几何形状，流体动力，和多细胞相互作用生理特性是存在和可调。这种类型的平台的是，它提供模拟和在各种情况下，其中在体外培养条件可以匹配，有关的微环境的研究内皮行为的能力强大。例如，驾驶内皮过程，如血管生成的机制，已知在不同器官和在不同的病理状态，例如健康和疾病44不同发生。出于这个原因，平面内皮细胞培养物是一致的不足6和作为这样的领域主要依赖昂贵和费时的动物模型。
动物模型，而信息和生物研究的进展必不可少的，并不总是很好的转化到临床。这已经很大程度上归因于小鼠和人类生物学之间的差异，特别是关于他们对刺激的反应9,45。因此，必须要能够建立体外模型，可以提供额外的人类特有的数据，以补充从动物模型中收集信息， 在体外平台有模仿所关注的微环境与额外的容量来调节该环境的潜力。这种系统的主要特征应该包括三维结构和几何形状，细胞外基质组合物（ECM），实质细胞接近和相互作用，血流量，以及生化刺激。工程微血管必须将所有这些参数的能力。这可以同时完成创建一个包罗万象的模式，或分步明智的方式来分离单个反应和相互作用增加。
工程微血管的一个强大的方面是能够控制流和操纵流体动力施加在内皮。作为一个例子，该装置可以重力驱动流动的条件下，或在连续灌注（ 图2）中培养。剪切应力对血管壁的幅度可在两个条件通过在流率和容器的几何形状的变化进行调制。这两个条件之间的主要区别是剪切应力的容器内的时间分布。在重力驱动流动的条件下，剪切应力不超过时间常数。的流速和剪切应力最高立即是一个媒体变化后当入口储满。作为媒体排水管，剪切应力将减小。这导致在12小时的过程中的一系列剪切应力。这需要在流体力学性质精确地控制（例如，以研究剪切应力对内皮的影响）的实验应该使用连续流动的培养条件。
Ëngineered微血管能够被调谐来回答各种各样的具有相对容易变形的问题。不同的细胞类型，这两个实质和内皮细胞，可用于不同器官系统建模。除了 制造具有内皮细胞接种微血管，上皮细胞可以替代地使用到线用于与肠壁，肺泡，肾小管等研究的通道。一旦微环境是由细胞组合物，该营养液所定义（ 即，媒体，血液，生长因子或其他生物相关的流体），其用于灌注设备可以改变为回答关于细胞信号传导，静止，剪切应力复杂的问题，营养物，药物的反应，以及更多。此外，容器的几何形状可以被专门设计用于研究内皮响应于剪切应力和扭曲。作为一个例子，从郑等人最近的出版物。人表明，内皮细胞具有的人口增加编VWF分泌和纤维集合体中的高剪切应力和流动加速微血管区域。具体来说，VWF捆包通常形成在网络内的弯道和急转弯。网络几何还可设计来制造多细胞小管。例如，它包含每两个平行的通道与自己的入口和出口的设计可以用于产生浓度梯度或与相邻的小管的环境（ 例如，淋巴管与相邻的微血管）建模。当前网络设计的格子状结构（ 图1A-C中所示）是用于计算流体建模和制造过程中的结构完整性是有利的，但并不代表在体内血管结构的。在今后的研究，应当使用多个生理网络模式，如那些与分层分支和圆角。
而在此过程中所概述的所有步骤是重要的，有是所需要的成功改造的微血管制造几个关键步骤。胶原蛋白凝胶必须彻底混合以达到均匀的溶液，而不是在此步骤中引入的气泡它是必不可少的。这是细胞存活力和生理功能，特别是用于实验，其中包括在胶原基质实质细胞是必不可少的。如果胶原的均匀混合物难以获得，检查溶液的pH以确保它是中性的。如果问题仍然存在，这是可能的胶原股票应及时更换。另一个关键步骤是在顶部和底部壳体件的组装 - 不使用不适当的力，因为这会导致信道将其折叠是必不可少的。几个练习轮可能是必要的，以获得同时旋转螺钉以应用所需要的力的量感。如果通道塌陷或粉碎甚至继续训练结束后发生，则可能是PDMS网络已经成为翘由于absorpt水分离子。用新鲜的PDMS模具起将有助于解决这一问题。在底部设备不正确的螺纹孔也可以引起信道塌陷。如果螺丝无法装配过程中平稳地旋转，额外力，必须施往往造成结构失效。应当强调，最后关键步骤是频繁馈送，典型地，每12小时的重要性。这是用于维持内皮和防止设备干燥是必不可少的。在该接种内皮细胞出现不健康或从胶原壁分离，以改善内皮健康被更频繁地喂容器，使用注射泵以应用连续流，或检查胶原凝胶的pH值，以确保它的潜力的方法的情况下处于生理水平。
目前，该平台被限制为制造具有适当刚度的细胞外基质在组装过程中，以保持信道的结构完整性。密集合作在llagen或大于6毫克/毫升是足够的，但胶原小于6毫克/毫升和其他基质如从整个器官脱细胞基质太弱。这可以通过使用与所讨论的基质胶原的混合物来克服。改造的微血管也通过它们的大小规模的限制。容器可以制造成约100微米的下限，但实质性的修改将需要被应用到实现规模较小。尽管工程微血管创建一个三维管腔，网络本身是平面的。要创建一个真正的三维血管丛，补充修改需要，创建通过堆叠多个工程船的多层网络应用等。
在该方法中呈现的代表性结果证明微血管如何工程改造可被用来评估屏障功能，细胞 - 细胞信号传导（周细胞招募和血管稳定化），血管发生，和血栓形成。 Highli这些研究的亮灯都与以前的出版物31,32更详细的介绍这里介绍。这些研究显示了如何迁移周细胞和外套设计的微血管31的内皮细胞，血小板粘附于血管内皮细胞激活31，和流体剪切力调节内皮细胞的活化和VWF分泌和组件32。改造的微血管可以进一步用于构建血管化组织和模型特定器官的系统中，如肾33或心脏34。复制这些生理血液内皮细胞的相互作用和调整相对于微环境的能力，剪切应力，几何，ECM和细胞成分可使血管疾病的未来研究。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
笔者想承认Lynn和迈克·加维成像实验室的研究所干细胞与再生医学，以及在华盛顿大学华盛顿纳米加工设施。他们也承认美国国立卫生研究院的资助授予DP2DK102258（YZ到），以及培训补助T32EB001650（SSK来和MAR）和T32HL007312（以MAR）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wafer Fabrication | |||
| AutoGlow Plasma System | AutoGlow | ||
| Headway Spin Coater | Headway Research, Inc | PWM32 Spin Coater | |
| ABM Contact Aligner | AB-M | ||
| Alpha Step Profilometer | Tencor | Alpha Step 200 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y020100 | |
| SU-8 Resist | Microchem | SU-8 2000 | |
| 8" silicon wafer | Wafer World Inc. | ||
| Tabletop Micro Pattern Generator | Heidelberg Instruments | μPG 101 | For generation of photomask |
| Hot plate | VWR | 97042-646 | |
| Ispropyl alcohol | Avantor Performance Materials | 9088 | |
| Petri dishes (120 x 120 mm, square) | Sigma-Aldrich | Z617679 | |
| Trichloro(3,3,3-trifluoropropyl)silane | Sigma-Aldrich | MKBG3805V | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer base and curing agent | Dow Corning | Sylgard 184 | Mixed at 10:1 (w/w) |
| Vacuum desiccator | Sigma-Aldrich | Z119024-1EA | |
| Oven | VWR | 9120976 | |
| Device Fabrication and Culture | |||
| poly(methyl methacrylate) (PMMA) | Plexiglas | ||
| Corona Treater | Electro-Technic Products, Inc. | BD-20 | Handheld device for plasma treatment of PMMA devices and PDMS molds |
| Soldering Iron | Weller | WTCPS | |
| Stainless Steel Truss Head Slotted Machine Screw | McMaster-Carr | 91785A096 | |
| Stainless steel dowel pins | McMaster-Carr | 93600A060 | |
| Tweezers | Miltex | 24-572 | Any similar tweezers may be used |
| Spatula (Micro Spoon) | Electron Microscopy Services | 62410-01 | |
| Screw driver | Any flat head screwdriver may be used, autoclaved | ||
| Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Bleach | Clorox | 4460030966 | |
| Petri dishes (150 x 25 mm) | Corning | 430599 | |
| Petri dishes (100 x 20 mm) | Corning | 2909 | |
| Cotton, cut into 1 cm x 3 cm pieces | Autoclaved | ||
| Polyethyleneimine (PEI) | Sigma-Aldrich | P3143 | Dilute to 1% in cell culture grade water |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G6257 | Dilute to 0.1% in cell culture grade water |
| Sterile H2O | Autoclaved DI H2O | ||
| Type I collagen, dissolved in 0.1% acetic acid | Isolated from rat tails as described in Rajan et. al. 2006 (ref #37) | ||
| 1 ml syringe | BD | 309659 | |
| 10 ml syringe | BD | 309604 | |
| 15 ml conical tubes | Corning | 352097 | |
| 30 ml conical tubes | Corning | 352098 | |
| M199 10x Media | Life Technologies | 11825-015 | |
| 1 N NaOH (sterile) | Sigma-Aldrich | 415413 | Dilute to 1 N in cell culture grade water |
| HUVECs | Lonza | ||
| Endothelial growth media | Lonza | CC-3124 | |
| Trypsin | Corning | 25-052-CI | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermofisher Scientific | 10082147 | |
| Dextran from Leuconostoc spp. (70 kDa) | Sigma-Aldrich | 31390 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific Co. | 3200 | |
| Gel loading tips | VWR | 37001-152 | |
| 18 G Blunt Fill Needle | BD | 305180 | |
| 20 G Stainless Steel Dispensing Needle | McMaster-Carr | 75165A123 | |
| Tygon 1/32” ID, 3/32" OD Silicon Tubing | Cole-Parmer | EW-95702-00 | |
| 1/16" Tube-to-tube Coupling | McMaster-Carr | 5116K165 | |
| 90° Elbow Connectors, Tube-to-Tube | McMaster-Carr | 5121K901 | |
| Luer Lock Coupling (Female, 1/16" ID) | McMaster-Carr | 51525K211 | |
| Plastic Forceps, with Jaw Grips | Electron Microscopy Services | 72971 | |
| Dual Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-4505 | |
| 5 ml Polystyrene Round-bottom tube | Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| Device Analysis | |||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8806-5G | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
| Rabbit anti-hCD31 | Abcam | ab32457 | 1:25 working dilution |
| FITC conjugated anti-von Willebrand Factor antibody | Abcam | ab8822 | 1:100 working dilution |
| Goat anti-rabbit 568 secondary antibody | Thermofisher Scientific | A-11011 | 1:100 working dilution |
| Hoescht | Thermofisher Scientific | H1399 | Resuspended in DMSO |
| Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | To make 0.2 M cacodylate buffer |
| Ethanol | VWR International | BDH1164-4LP | |
| 40 kDa FITC-conjugated Dextran | Sigma-Aldrich | FD40S | |
| Additional Culture Reagents | |||
| CHIR-99021 | Selleck Chem | S2924 | Small molecule GSK-3 inhibitor |
| Human recombinant VEGF | Peprotech | 100-20 | |
| Human recombinant bFGF | Peprotech | AF-100-18B |
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