Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Micropatterning и сборка 3D микрососудов

Published: September 9, 2016 doi: 10.3791/54457
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1,2
1Department of Bioengineering, University of Washington, 2Center for Cardiovascular Biology, Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Washington
* These authors contributed equally

Summary

Эта рукопись представляет собой метод литья под давлением для инженера-микрососудов, что перепросматривать физиологические свойства эндотелия. Процесс Микрожидкостных на основе создает патент 3D сети сосудов с адаптивности условиями, такими, как поток, клеточный состав, геометрии и биохимических градиентов. Процесс изготовления и примеры возможных применений описаны.

Abstract

В пробирке платформ для изучения эндотелиальные клетки и сосудистой биологии в основном ограничиваются 2D - эндотелиальной клеточной культуре, проточных камер с полимером или на основе стеклянных подложек, а также анализов образования трубки гидрогеля на основе. Эти анализы, в то время как информативным, не резюмировать люменов геометрию, правильное внеклеточный матрикс и многоклеточные близость, которые играют ключевую роль в модуляции сосудистой функции. Эта рукопись описывает метод литья под давлением для создания Engineered сосуды диаметром порядка 100 мкм. Микрососуды изготовлены затравкой эндотелиальные клетки в микрожидкостных канал встроенного в родной типа I коллагена гидрогель. Объединив паренхиматозные клетки в коллагеновой матрице предварительного направлять образование, специфические микросреды ткани могут быть смоделированы и изучены. Дополнительные модуляциями гидродинамических свойств и состава средств массовой информации позволяют управлять сложной сосудистой функции в пределах желаемого микросреды.Данная платформа позволяет для изучения набора периваскулярного клеток, крови-эндотелий взаимодействий, ответ потока и тканевой микрососудистой взаимодействий. Engineered микрососудов дают возможность изолировать влияние от отдельных компонентов сосудистой ниши и точно контролировать свои химические, механические и биологические свойства для изучения сосудистой биологии как в здоровье и болезни.

Introduction

Микрососудов в каждом органе помогает определить микросреду ткани, поддержания гомеостаза тканей и регулируют воспаление, проницаемость, тромбоз и фибринолиза 1,2. Микрососудистой эндотелий, в частности, является интерфейсом между кровотоком и окружающей ткани и , следовательно , играет критическую роль в модуляции сосудистой и функции органов в ответ на стимулы , такие как гидродинамические силы и циркулирующих цитокинов и гормонов 3 - 5. Понимание подробные взаимодействия между эндотелий, кровь, и окружающая микросреда ткани имеет важное значение для изучения сосудистой биологии и прогрессирования заболевания. Однако прогресс в изучении этих взаимодействий тормозились ограничены в пробирке инструментов , которые не Резюмируя в естественных условиях структуры микрососудов и функционируют 6,7. В результате, поле и терапевтическое продвижение уже в значительной степени опирался на дорогостоящий и Time-потребляющих животных моделей , которые часто не в состоянии перевести к успеху у людей 8 - 10. В то время как модели в естественных условиях незаменимы при изучении механизмов болезни и сосудистых функций, они являются сложными и зачастую не имеют точный контроль индивидуального клеточного, биохимических и биофизических киев.

Сосудистую систему по всему телу обладает зрелой иерархическую структуру в сочетании с экспансивной капиллярных кровати, обеспечивая оптимизированную перфузию и переноса питательных веществ одновременно 11. Первоначально сосудистую формы как примитивный сплетении , который реорганизует к иерархически разветвленной сети во время раннего развития 12,13. Хотя многие из сигналов , участвующих в этих процессах хорошо изучены 14 - 16, он остается неуловимым , как такое сосудистая структурирование определяется 15. В свою очередь, обобщал этот процесс в пробирке инженер организованных сосудистых сетей пчелп трудно. Многие из существующих платформ в пробирке для моделирования сосудистой сети , такие как двухмерных культурах эндотелиальных клеток, отсутствие важных характеристик , таких как многоклеточной близость, трехмерной геометрии просвету, потока, и внеклеточного матрикса. Анализы труб формирования в 3D гидрогелей (коллаген или фибрина) 17 - 19 или инвазии анализы 20,21 были использованы для изучения эндотелиальной функции в 3D и их взаимодействия с другими сосудистыми 17,22 или клеток ткани типов 23. Тем не менее, собранные просветы в этих анализах не хватает взаимосвязанности, гемодинамического потока и соответствующую перфузию. Кроме того, склонность к сосудистой регрессии в этих анализах образования 24 трубки предотвращает долгосрочную культуру и созреванию , которая ограничивает степень функциональных исследований , которые могут быть выполнены. Таким образом, существует необходимость в расцветающий инженер платформ в пробирке микрососудистых сетей , которые могут надлежащим образом моделировать анdothelial характеристики и способны долгосрочной культуре.

Разнообразие сосудистых инженерии появились на протяжении многих лет для медицинских применений для замены или выносной пораженных сосудов у пациентов с сосудистыми заболеваниями. Сосуды большого диаметра , изготовленные из синтетических материалов , таких как полиэтилентерефталат (ПЭТ) и политетрафторэтилена (ПТФЭ) имели значительный терапевтический успех на долгий срок ( в среднем проходимости 95% проходимость более 5 лет) 25. Несмотря на небольшой диаметр синтетических трансплантатов (<6 мм) , как правило , сталкиваются с осложнениями , такие как гиперплазии интимы и тромбопоэза 26 - 28, тканевой инженерии трансплантатов малого диаметра , изготовленные с биологическим материалом достигли значительного прогресса 29,30. Несмотря на успехи такого рода, сконструированные сосуды на микроуровне остались вызов друг другу. Для того, чтобы адекватно смоделировать микрососудов, необходимо создавать сложные сетевые модели с Sufфициент механическую прочность для поддержания проходимость и с композицией матрицы, что позволяет как питательных веществ для проникновения паренхимных клеток и клеточного ремоделирования.

Этот протокол представляет собой новую искусственную perfusable сеть сосудов , которая имитирует уроженца в естественных условиях установки с настраиваемым и управляемым микросреды 31 - 34. Описанный метод генерирует Engineered микрососуды с диаметром порядка 100 мкм. Engineered микрососудов изготавливаются перфузируя эндотелиальные клетки через микрожидком канал, который встроен в мягкого типа I коллагена гидрогель. Эта система имеет способность генерировать узорных сетей с открытой структурой просвету, тиражировать многоклеточных взаимодействий, модулировать внеклеточного матрикса состава, и применять соответствующие физиологически гемодинамические силы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. микротехнологий узорчатых полидиметилсилоксана (PDMS) с Network Design

  1. Вафли Fabrication создать негативный шаблон сетевого дизайна
    1. Создание шаблона сети с помощью любого программного обеспечения проектирования систем автоматизированного (САПР). Убедитесь, что размер по диагонали между входом и выходом соответствует расстояние между входным и выходным резервуаров на кожухе устройства в будущих шагов (см 2.1.1).
      Примечание: Конструкция шаблона сам заказ в зависимости от конкретных исследовательских задач пользователя (см Рисунок 1 Примеры шаблонов).
    2. Создайте маску шаблона сети, используя высокое разрешение печати или заказать хром фотошаблона от коммерческого поставщика. Более подробный протокол процесса фотолитографии доступен в другом месте 35.
    3. Почистите пластины 8 "кремния в течение 5 мин при 100 Вт с плазменной обработкой кислородом.
    4. Налейте достаточно негативного фоторезиста (SU-82,100 хорошо работает) на пластину таким образом, что резист образует с диаметром ложку 2,5 см. Использование спина для нанесения покрытий, спина пластины при 500 оборотах в минуту с 100 оборотов в минуту / с рампой и поддерживать в течение 10 сек. Затем разгоняться до 1600 оборотов в минуту с 300 об / сек и поддерживать в течение 30 сек. Примечание: Скорость и рампы должны быть оптимизированы для каждого лабораторных условиях с получением резиста толщиной 150 мкм.
    5. Софт-испечь пластины при 65 ° С в течение 7 мин, нарастание до 95 ° C при 360 ° С / ч, и поддерживать в течение 45 мин. Медленно остыть до комнатной температуры на горячей плите. Впечатывать образец сосуда на пластину с покрытием под воздействием 365 нм УФ - светом под хромированной фотошаблона, с воздействием раза большую, чем рекомендациями производителя (350 мДж / см 2 для толщины SU-8 составляет около 150 мкм).
      Примечание: Так как SU-8 представляет собой негативный резист, экспонированные участки (все, кроме шаблона проектирования) станет нерастворимым разработчику на этапе 1.1.7.
    6. Hard-печет открытой пластины при температуре 65° С в течение 5 мин и сползать до 95 ° C при 360 ° С / ч и поддерживают в течение 25 мин, а затем позволить ему медленно остыть до комнатной температуры на горячей плите.
    7. Погрузить вафельные в СУ-8 разработчика для 10 - 15 минут, чтобы смыть неэкспонированные сопротивляться, а затем чистым изопропиловым спиртом и сушат при сжатом потоке азота. Проверьте образец под световым микроскопом, чтобы гарантировать, СУ-8 резист хорошо приклеена к пластине (см нежелательного шелушения и пузырьков).
    8. Измерьте толщину особенностей модели с использованием профилометра в соответствии с инструкциями изготовителя 36. Во время измерения приобретения, избегать областей структуры, которые необходимы для функционирования сети (т.е., входной и выходной каналы) в качестве контактного профилометра на основе может поставить под угрозу структурную целостность узорных особенностей на пластине. В качестве альтернативы, использовать бесконтактный метод (т.е. оптический профилометра) , чтобы избежать этой проблемы в целом.
  2. Geузорчатых вознаграждениям и Flat Пресс-формы для формования Коллаген
    Примечание: Ручка силанов в химическом вытяжном шкафу.
    1. Поместите пластину в эксикаторе с помощью 100 мкл трихлор (3,3,3-силана) в течение 2 ч, чтобы silanize поверхность.
    2. Передача силанизированы пластины в 120 х 120 мм квадратный чашку Петри. Налейте смешанный и дегазировали ПДМС эластомер и отвердитель (10: 1 вес / вес соотношение) над пластиной для достижения 4 - 6 мм толщины. Налейте дополнительные PDMS в отдельную 120 х 120 мм квадратный чашку Петри для создания плоских форм без узоров. Застывал при температуре 65 ° С в течение 2 часов.
    3. Удалите из духовки и дайте ПДМС остыть до комнатной температуры. Используя скальпель тщательно вырезать квадрат вокруг СУ-8 и медленно слезьте плесень PDMS от пластины. Обрезать края до 30 мм х 30 мм. Для плоских форм, вырезать вылечить PDMS без тисненой рисунка на квадратные куски около 40 мм х 40 мм.

2. Устройства для дома

  1. изгоион сверху и снизу Корпус шт
    1. Изготовить корпус судна с использованием поли (метилметакрилата) (ПММА). Для того, чтобы изготовить, заказать детали из стандартного механического цеха с компьютерным числовым программным управлением (ЧПУ) возможности фрезерования. На рисунке 1 представлена ​​схема верхней и нижней части.
    2. Конструкция верхнего корпуса часть (рис 1D) , чтобы включать в себя 20 мм х 20 мм и на нижней стороне устройства с глубиной 1 мм, два порта впрыска коллагена (4 мм) может быть на верхней части устройства расположены по углам квадрата хорошо, два впускных и выпускных резервуаров с диаметром 6 мм и четыре отверстия для винтов (диаметр 3 мм) на четырех углах устройства.
      Примечание: Дополнительные отверстия могут быть просверлены на периферии части для целей обработки.
    3. Конструкция нижнего корпуса часть (рис 1E) , чтобы включить квадратное отверстие в середине (размеры 15 мм х 15 мм) с окружающими размерами 25 мм х 25 ммполки с глубиной 0,25 мм. Просверлите 4 отверстия для винтов с резьбой 4-40. Убедитесь, что резьбовые отверстия в нижней и верхней части будут выровнены друг с другом в ходе будущих этапов сборки.

3. микрососудов Изготовление устройств

  1. Подготовка материалов
    1. Мытье и автоклав два комплекта пинцетом, шпателем из нержавеющей стали, небольшой плоской отвертки, винты из нержавеющей стали, а также несколько штифтов из нержавеющей стали. Для изготовления сосудов, также автоклав micropatterned PDMS формы, PDMS плоские квадраты, покровные стекла (22 х 22 мм) и ватные части.
    2. Стерилизовать ПММА жилищные части в хлорной извести в течение не менее 1 ч, а затем промыть водой автоклавного в капюшоне культуры ткани в два раза, и дайте высохнуть на воздухе в стерильной ткани чашки для культивирования (150 мм х 25 мм).
  2. Стерильный полиэтиленимин-глутаральдегида (PEI - GA) Покрытие
    1. Лечить внутренние колодцы стерилизованных сухих кусков ПММАс плазмой в течение примерно 1 мин. Добавьте 1% полиэтилениминовой (PEI) на внутренние скважины (20 мм квадрат а на верхней и квадратной полке на дне 25 мм) штук ПММА в течение 10 мин. Промыть стерильной H 2 O и дайте высохнуть в капюшоне культуры ткани.
      Примечание: Время, необходимое для плазменной обработки может изменяться в зависимости от используемого устройства, - ИОН должен распространяться легко указывает на гидрофильную поверхность. Если нет, то дополнительная плазменная обработка может быть необходимым.
    2. Применить 0,1% глутаральдегид (GA) на PEI обработанных поверхностей деталей из ПММА в течение 30 мин. Промыть два раза стерильной водой и дайте высохнуть.
      Примечание: В будущих шагов, коллаген будет прилипать к поверхности с покрытием через сшиванию коллагеном глутаровый альдегид. Это помогает обеспечить гель на месте внутри устройства во время будущих этапов сборки и на протяжении всего периода культивирования устройства.
  3. Коллаген гель Приготовление
    1. Изготовить судов, использующих 0,6% - 1% коллагенарешения. Для того, чтобы 0,75% коллагена для изготовления сосудов, смешать тип коллагена маточного раствора (1,5% - изолированные от крысы хвосты 37) с гидроксидом натрия (NaOH), 10x Медиа Дополнение (М199) и среды для культивирования клеток. Держите все решения на льду.
    2. Определить объем коллагена следующим уравнением, где V ƒinal является конечный объем геля требуемого ( как правило, 1 мл коллагена на устройство достаточно), V запас коллагена является объем акций коллагена , необходимого, запас углерода коллаген концентрация фондового коллагена, и с ƒinal коллаген требуемая концентрация коллагена в сосуде.
      Уравнение 1
    3. С помощью 1 мл шприц для передачи соответствующего объема акций коллагена в новый 30 мл коническую трубку. Определить объемы нейтрализующего NaOH (V NaOH), М199 10x средства массовой добавки(V 10 Х), и среды для культивирования клеток (V 1 Х) следующим образом и смешивать отдельно в 15 мл коническую пробирку:
      Уравнение 2
    4. Добавляют смесь нейтрализующих реагентов (V 10 X, V NaOH, V 1 Х) к коллагену на аликвоты, и использовать небольшой шпатель , чтобы аккуратно перемешать раствор до тех пор , пока не получат гомогенный гель. Избегайте введения пузырьков, медленно и осторожно перемешивая.
    5. Для того, чтобы включить клеток в матрицу в нужной концентрации (например, 0,5 - 20 миллионов клеток / мл), добавляют клетки раствора коллагена после того, как его смешивают с нейтрализующих реагентов, и продолжают перемешивать до тех пор , пока клетки не будут равномерно распределены.
    6. При добавлении клетки, регулировать громкость среды для культивирования клеток для размещения дополнительного объема, как определено следующим уравнением, где V ячеек </ суб> является требуемый объем суспензии клеток, плотность ƒinal клеток C является желаемой плотности клеток в сосуде, плотность C клеточной суспензии плотность клеток в маточном растворе.
      Уравнение 3
  4. Коллаген Инъекции - Верхняя часть
    1. Поместите micropatterned PDMS плесень в 100 мм х 20 мм блюдо. PLASMA очистить плесень PDMS в течение 1 мин.
    2. Совместите верхнюю ПММА часть на верхней части формы PDMS так , что квадратные резервуары на форме находятся непосредственно под входным и выходным водохранилищах (рис 1D - пунктирные линии). Поместите нержавеющей стали штифты во впускной и выпускной коллектора отверстия на верхней части ПММА для поддержания свободного доступа из резервуаров к образцу.
    3. С помощью 1 мл шприц для извлечения ~ 0,5 - 0,6 мл коллагена. Убедитесь в том, что никакие пузырьки не остаются в шприце.
    4. Нажмите на лightly с помощью пинцета на верхней части корпуса, чтобы обеспечить заподлицо контакт между верхней частью и пресс-формы PDMS. Вводят коллаген медленно через инжекционное отверстие в верхней части ПММА. Убедитесь, что коллаген заполняет в области 20 мм х 20 мм над рисунком и не просачивается.
    5. Закройте блюдо без толкаются центрирующие штифты и позволяют гель в 37 ° C инкубаторе в течение 30 мин.
  5. Коллаген Инъекции - нижняя часть
    1. Поместите 22 х 22 мм покровным стеклом в центре нижней части. С помощью 1 мл шприц, чтобы равномерно распределить ~ 0,25 мл коллагена на предметное стекло. Осторожно опустите PDMS плоский квадрат над коллагена, обеспечивая PDMS является плоской против ПММА и нет запертых пузыри. Разрешить гель при 37 ° С в течение 30 мин.
  6. Сборка устройства
    1. После желатинизации, добавьте достаточное количество PBS вокруг плоской PDMS части на нижней части, чтобы окружить PDMS (около 1 мл). Используйте пинцет для удаления любого еXcess коллагена вокруг краев, и медленно отделите кусок PDMS. Добавить еще PBS на верхней части коллагена для поддержания гидратации.
    2. Чтобы подготовить верхнюю часть, используйте пинцет, чтобы поднять верхнюю часть ПММА и переверните его таким образом, что плесень PDMS находится на вершине. Добавьте несколько капель PBS на интерфейс, а затем быстро и надежно удалить PDMS формы из верхней части ПММА.
    3. Аккуратно удалите из нержавеющей стали штифты с другой стороны корпуса PMMA, используя другую пару пинцета. Добавьте еще несколько капель PBS на micropatterned коллагена. Переверните верхнюю часть ПММА над тем, что коллаген обращена вниз и поместите 4 винта в угловые отверстия.
    4. Осторожно положите верхнюю часть на верхней части нижней части, совместив винты с угловыми отверстиями на нижней части. Не допускать две части, чтобы скользить по отношению друг к другу. С помощью отвертки затяните винты, используя нежное прикосновение. Не затягивайте.
    5. Аспирация PBS окружающий ПММА поверхности и поместите небольшой пиЕСЕ хлопка под одним краем устройства. С помощью пипетки, удалите PBS из резервуаров и заменить среды для культивирования клеток. Дайте устройство гель вместе в инкубаторе C 37 ° в течение не менее 1 часа.
  7. Cell Посев
    1. Культура Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVECs) в эндотелиальной ростовой среде при температуре 37 ° C (CO 2, O 2) до состояния сплошности 38. Всякий раз, когда это возможно, используйте между проходами 4 и 7.
    2. Trypsinize эндотелиальные клетки путем промывки колбы культуры с 6 мл PBS, а затем добавлением 2 мл 0,05% трипсина при 37 ° С для диссоциации клеток. Оставьте клетки в трипсин, пока большинство из фокальных спаек не обособленным и клетки окружены (обычно это занимает около 2 - 3 мин). Остановить реакцию трипсина путем добавления 4 мл эндотелиальной питательной среды, содержащей фетальной бычьей сыворотки (FBS). Промыть колбу несколько раз средств массовой информации, чтобы обеспечить клетки отделяются от колбы и собираютв конической трубе.
    3. Граф клеток с использованием гемоцитометра и ресуспендируют их при плотности 10 миллионов клеток на мл. Удалить все среды для культивирования клеток из впускных и выпускных коллекторов. С помощью 200 мкл гель-наливного наконечника, добавить 10 мкл суспензии клеток в центре впускного коллектора. Клетки должны начать поступать в сеть немедленно и пальто в сеть.
    4. Добавить 200 мкл среды в равной степени к обоим водохранилищах и пусть клетки прикрепиться и распространяться в сети, по крайней мере, 1 ч.
  8. Культура устройства
    1. Культура устройство с гравитационным приводом потока через сеть путем добавления 200 мкл среды для культивирования клеток к входному отверстию резервуара и 50 мкл к выходному отверстию резервуара. С помощью этого метода культуры, замены среды каждые 12 ч, чтобы поддерживать жизнеспособность эндотелиальную.
      Примечание: Если непрерывный поток условия культивирования желательны (для поддержания постоянного напряжения сдвига, собирать средства массовой информации на выходе и т.д.), SyrИнге насос может быть использован вместо гравитационной приводом культуры.
    2. Разрешить сеяные эндотелиальные клетки по меньшей мере, 24 часа в сутки, чтобы прикрепить и стабилизировать перед нанесением непрерывного потока. Перед установкой непрерывного потока, техническое обслуживание устройств с гравитацией приводом условий потока.
      Примечание: Условия для средств массовой информации прикладного потока отличаются от тяжести приводом культуры. Добавление плазмозаменителя, такие как декстран, в средствах массовой информации стабилизирует сконструированного микрососуды и предотвращает сосудистый коллапс в течение продолжительного перфузии 39.
    3. Для того, чтобы средства массовой информации для установки непрерывного потока, растворите 3,5% декстран (70 кДа) в эндотелиальной питательной среды для оптимальной культуры судна. Использование стерильной техники, заполняют 10 мл шприцы с ростовой средой эндотелиальной с 3,5% декстрана.
    4. Приготовьте стерильную культуры блюдо для потока расплавлением отверстий в боковой стенке чашки Петри с помощью паяльника.
    5. Прикрепите 12 "силиконовую трубку (1/32" ID) в замок сцепления Luer (женский, 1/16 "ID), и 1 /16 "прямой разъем трубки к трубке с 1" сегмент трубки на другом конце. Вставьте 1/4 "20G тупую иглу (отдельно от втулки иглы) к свободному концу 1" сегмента. Кроме того, подготовить "сегмент трубки, присоединенные к 90 ° разъем локтевого сустава трубки к трубке (для установки на входе корпуса). В последующих стадиях, тем длиннее трубка будет продет через подготовленное блюдо и крепится к 3 3 "сегмент через G иглы 20. Выход трубки должны отражать впускной трубопровод, со свободным концом вместо муфты замка Luer. Автоклав все сегменты до использования.
    6. Резьба автоклавного на входе и выходе трубки через отверстия в готовое блюдо. Присоединить 3 "сегменты к внутреннему 20 G иглы. Закрепите муфту блокировки Люэра к мультимедийному заполненный шприц и заливать носитель через трубку с помощью шприца насосного агрегата при высокой скорости потока. Убедитесь в том, что нет никаких пузырей в НКТ или разъемов, так как они будут мешать потоку в емкость.
    7. Вставьте грonnector сустава во входное отверстие корпуса. Установите шприцевой насос до желаемой скорости потока и начать перфузию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть скорректирована в зависимости от геометрии сосуда и экспериментальных условиях приложенных напряжений сдвига. Для канала диаметром 100 мкм, скорость потока 3 мкл / мин работает хорошо.
    8. При желании, собирать перфузат с подготовленной выпускной трубки, вставленной в стерильный 5 мл полистирола с круглым дном пробирку, содержащую 500 мкл среды.
      Примечание: Небольшое количество сред добавляется к коллекторной трубе, чтобы предотвратить образование пузырьков, которые могут блокировать поток.
    9. В зависимости от скорости потока, шприц, возможно, потребуется быть пополнен после того, как от 24 до 36 часов. Это делается путем удаления соединителя от входного отверстия в корпусе, заменив шприц, и медиаданных заливать при высокой скорости потока в течение нескольких минут. Эта последовательность гарантирует, что пузырьки не вводят в трубку. Сброс насоса до требуемой скорости потока для культуры, вставьте разъем в корпуса, ивернуться в инкубатор.

Анализ 4. Устройство

  1. Проницаемость Анализ
    1. Используйте 40 кДа FITC-декстрана , чтобы визуализировать проницаемость сосуда на месте. Поместите корпус судна на конфокальной микроскопии и сосредоточиться на плоскости судна. Добавить 5 мкМ 40 кДа FITC-декстрана на входе и изображения на 4-кратным увеличением, 25 мс времени экспозиции, и на 1 кадра в секунду в течение 10 мин.
    2. Анализ серии изображений с кодом анализа для оценки проницаемости декстрана через стенку сосуда в коллаген (мкм / сек) на основе модели , опубликованной Zheng ЕТ. и др. 31.
  2. Анализ Иммунологическое и конфокальной микроскопии
    1. Для фиксации сосудов, обрызгивать с 3,7% формальдегида через впускное отверстие в течение 20 мин и стирке путем перфузии PBS три раза (20 мин на промывку). Блок неспецифическое связывание антитела с 2% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 0,5% Тритон Х-100 реrfused через сеть в течение 1 часа. Заливать растворы первичных антител в течение ночи при температуре 4 ° С и мыть три раза PBS. Заливать решения вторичными антителами в течение 1 - 2 ч, и снова промывают PBS таким же образом.
    2. Возьмем иммунофлуоресцентных изображения микрососудов на месте с помощью конфокальной микроскопии с г-шагом 1 мкм. Изображение микрососудов при увеличении 4X, 10X или 20X.
      Примечание: Увеличение 4X обеспечит глобальную информационную сеть структуру, в то время как 10X и 20X увеличенные изображения обеспечит клеточные детали , такие как удлинение, образование соединения и др.
    3. Анализ стеки изображений с помощью ImageJ с Z проекций (Image / Стеки / Z-проекта), сечений (Image / Стеки / мультиплексирование с ортогональным взгляд), и 3D-реконструкций (Image / Стеки / 3D Project).
  3. Сканирующей электронной микроскопии изображений
    1. Для анализа электронной микроскопии, зафиксировать на месте путем перфузируя вполсилы золь Карновскому всоциологическое загрязнение (2% параформальдегид / 2,5% глутаральдегида в 0,2 М какодилатном буфере) в течение ночи. Разберите сосуд и осторожно отделить две части. Обрезка кромок и полностью погружать в Фиксирующий раствор в течение нескольких дней.
    2. Опустить толстую верхнюю часть сосуда в 25% глутаральдегида в течение 20 мин и полоскать три раза PBS (2 мин каждый). Высушить в серийных этанол промывками 50%, 70%, 85% (2 мин каждый) и две отмывки в 100% этаноле (5 мин каждый раз).
    3. Подготовьте образец для анализа с последующим обезвоживанием критической точки сушки в соответствии с протоколом производителя 40. Sputter пальто судно с золотом-палладием (7 нм) и анализируют под сканирующим электронным микроскопом с ускоряющим напряжением 5 кВ, размер пятна 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Инженерных платформа судно создает функциональный микроциркуляторного русла , внедренного в естественной коллагена типа I матрица и допускает жесткий контроль клеточного, биофизических и биохимических среды в пробирке. Для изготовления спроектированных микрососудов, Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVECs) перфузируют через коллагеном встроенный микрожидком сети, где они придают сформировать патентные люмена и сливающийся эндотелий. Как показано на фиг.1А-C, геометрии сосуда может быть специально разработан , чтобы отвечать на вопросы , касающиеся скорости потока, извитость, и углов ветвления, среди других. Модуляция скорости потока через микрососудов дает представление о сдвиге стресс-реакции эндотелиальных клеток. Раньше изготовление внимание было сосредоточено в основном на судах, в диапазоне от 100 мкм размер, тем не менее микрососудов до 500 мкм или, в некоторых случаях, как малые, как 50 мкм в диаметре, были Successfully сделал и культивируют. Примеры долгосрочной проходимость показаны, а также выживание микрососудов под действием силы тяжести , культивируемых приводом потока (фиг.2А) и непрерывного приложенного потока (Фигура 2В). В естественных условиях -как свойства спроектированных микрососудов можно продемонстрировать несколькими способами. Различные эндотелиальные функции могут быть измерены с помощью этой платформы, в том числе и барьерной функции (фиг.3А), межклеточных взаимодействий и сигнализации (рис 3б) и ангиогенных переделки (рис 3C). Важнейшей особенностью этих микрососудов является их способность реагировать на воспалительные стимулы в биологически соответствующим образом. Это лучше всего продемонстрировано через их взаимодействие с цельной крови на рисунке 4A-C , где неактивированной эндотелий в состоянии покоя (рис 4б) и активированный эндотелий индуцирует образование тромба (рис 4в). Культивированием в эндотелиальные клетки диffering происхождение в пределах этой платформы, можно понять функциональной гетерогенности между эндотелиальными клетками из различных источников. Рисунок 5A-C показан пример этой неоднородности с двух различных клеточных производных типов эндотелиальных клеток человека стволовых , что при культивировании на дисплее системы микрососудов резко различными фенотипами 41. Настраивая профили потока, клеточный состав и условия культивирования, сконструированные микрососуды обеспечивают мощный инструмент в пробирке для изучения эндотелиальной биологии и микроциркуляторного русла в обоих здоровья и болезни.

Рисунок 1
Рисунок 1. Схема построения сети и протокола Микроканальные Fabrication. Геометрия сосудистой сети может быть специально разработаны для создания различных режимов течения. А. Например, разветвленная конструкция будет уменьшились флOW ставки вблизи центра (уменьшение содержания в 8 раз в 3 × 3 сетке) , что приводит в регионах разнообразного напряжения сдвига на эндотелий в том же сосуде 31. B. Весьма разветвленная сетка следует тому же принципу, что и предыдущий дизайн, но с большим сплетение. С помощью этой конструкции, эффекты уменьшения в 50 кратном скорости потока, что приводит к снижению скорости сдвига от 10 до 500 сек -1 может наблюдаться при падении давления 1000 Па прикладывается через сеть 32. C. Более сложные конструкции такие как извилистую сеть с острыми углами 32 могут быть использованы , чтобы ответить на вопросы относительно эндотелиальной реакции на перебоев с ламинарным потоком, которые часто встречаются в патологических контекстах 42. Микрососуды , изготовленные из этих моделей будет иметь диаметр 100 -. 150 мкм D. Есть три основных этапа в процессе изготовления микроканалов. Во-первых, верхняя часть корпуса зажимного приспособления находится на верхней части ДПМS узорной сеть форму таким образом, что входное и выходное отверстия выровнены. Коллаген I затем вводят в замкнутое пространство через инжекционные отверстия (черная стрелка). Как правило, 0,75% коллагена I смесь используют для изготовления. Успешное изготовление микрососудов может быть достигнуто при цене 0,6% коллагена, тем не менее меньше , чем 0,6% , как правило , приводит к недостаточной механической прочности и разрушения канала. Е. Тонкий слой коллагена добавляется к нижней части на верхней части покровного стекла, и уплощенная с другой PDMS куском. F. После гелеобразования при 37 ° с, PDMS формы удаляются , а верхний и нижний кондукторы жилье привинчены вложить сеть. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
> Рисунок 2. Микрососуды культивированный с контролируемыми профилей потока. А. HUVECs высевают в микрососудах , культивируемых под действием силы тяжести ведомой потока и В. применяется непрерывный поток со скоростью 3 мкл / мин. Культура при приложенном потока лучше всего достигается с добавлением 3,5% декстрана в средствах массовой информации , который , как было показано , чтобы стабилизировать микрофлюидных основе коллагена микрососуды, оказывая физическое давление в просвете, усиливающие образование спая, хотя точный механизм движения этого эффекта неясна 39 , Микрососуды окрашивали для CD31 эндотелиальные перехода белка или кластера дифференциации 31 (красный) и фактор фон Виллебранда (VWF) гранулы (зеленый). A ', B'. В обоих условиях HUVECs выражены эндотелиальные маркеры межклеточных соединений и VWF гранулы. а "Б". Ортогональные виды показывают патент и скругленные просветы через 6 дней в культуре.arge.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Engineered Микрососуды для изучения эндотелиальной функции. A. Эндотелиальная барьерная функция может быть оценена после перфузии FITC (флуоресцеин изотиоцианатом) -conjugated декстрана через сети (вверху) и последующим измерением его диффузии в объемном коллагена (внизу). Использование пользовательского кода, видео перфузии могут быть проанализированы для построения интенсивности пикселей по интересующей области в кадре с течением времени для определения коэффициента проницаемости K (мкм / сек) в FITC-декстрана. Предыдущие публикации в лаборатории показали , что проницаемость этих сосудов сконструированных сравнима с экс виво млекопитающим сосудов 31,43. B. Эндотелиальные взаимодействия клеток с perivascular или поддерживающие клетки могут быть проанализированы в этой платформы путем модуляции клеточного состава коллагеновой матрицы. Здесь приведен пример этих межклеточных взаимодействий можно увидеть, когда клетки гладких мышц встроены в коллаген окружающих сосуды. Через 14 дней в культуре, клетки гладких мышц (окрашивают альфа актин гладких мышц (αSMA) в зеленом) ассоциированную с эндотелием и расширить процессы вдоль стенки сосуда и действуют как периваскулярные клетки , как показано на ортогональные проекции 31. Изображения , показанные на панели А и В являются репродукции с более ранней публикации 31. C. Ангиогенеза и ремоделирование может быть оценена в сконструированных микрососудов путем изменения среды для культивирования, чтобы включать в себя ангиогенные стимулы. Без ангиогенных стимулов, HUVECs показывают минимальную прорастание (слева); с ангиогенных стимулов (1 мкМ ингибитора малой молекулы GSK-3, 20 нг / мл фактора роста эндотелия сосудов, и 20 нг / мл основных GRO фибробластамиWTH фактор), HUVECs легко прорастают в матрицу, как видно в сверху вниз проекции и ортогональных видов (справа). Длина прорастают и номер легко поддаются количественной оценке с ImageJ программного обеспечения 41. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. кроваво-эндотелий взаимодействий. Engineered микрососудов находятся в состоянии покоя и адекватно реагировать на воспалительные стимулы. A. Немодифицированный, HUVEC культивируют судно сфотографировали вблизи входа показывает сильное CD31 Junctional окрашивание (красный) и круглый, открытый просвет. А '. Ортогональным вид на просвет показан. B. Когда цитратной цельной крови с CD41a меченые тромбоциты (зеленый) перфузию через аналогично покоящейся судна, минимальное объявлениеhesion тромбоцитов (зеленый) к эндотелию наблюдается. C. При воздействии на воспалительные стимулы, такие как форбол-12-миристат-13-ацетата (РМА, 50 нг / мл), в средствах массовой информации, перфузией целых крови приводит к образованию больших тромбов (CD41a-меченого, зеленый) в пределах канала и адгезия лейкоцитов (CD45 + маркированы, белый) к стенке 31 сосуда. Изображения видели здесь воспроизводятся с более ранней публикации 31. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5. Микрососуды сгенерированных с помощью человеческих стволовых клеток , полученных-КЭ. Дополнительные источники эндотелиальных клеток могут быть использованы для создания сконструированных микрососудов. Ранее в этом году, Palpant и др. и др. показали , что два различных подтипов оF клеток получают эндотелиальные клетки эмбриональных стволовых человека могут быть получены путем манипулирования Wnt / передачу сигналов β-катенина в процессе дифференцировки: гемогенного эндотелиальные клетки (характеризующихся экспрессией Hand1 и высокий кроветворный потенциал) и эндокарда, как эндотелиальные клетки (характеризуется частично выражением из NFATC1 и GATA4) 41. А. Когда высевают и культивируют в платформе 3D сосуда, гемогенного КЭ пройти некоторое ангиогенеза. В. Тем не менее, эндокарда, как КЭ гораздо более развитие кровеносных сосудов , и мигрирующие, предлагая функциональные различия, возможно , в ответ на потока, между двумя подтипами КЭ (эта работа представлена ​​более подробно в предыдущей публикации 41). Оба типа клеток выражают CD31 Junctional белки (красный) и некоторые VWF (зеленый). Ортогональные проекции как показывают патент люменов. С. помощью сканирующего электронного микроскопа изображение эндокардиальную типа КЭ внутри сосуда показывает ангиогенный росток , как видноот полостной стороны. Изображения , представленные в панели А и В являются репродукциями из Palpant и др. и др. 41. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Engineered микрососудов являются моделью в пробирке , где физиологические характеристики , такие как геометрия просвету, гидродинамические силы и многоклеточных взаимодействий присутствуют и перестраиваемой. Этот тип платформы является мощным в том , что она дает возможность моделировать и изучать эндотелиальной поведение в различных контекстах , где в пробирке условия культивирования могут быть сопоставлены , что микроокружения в вопросе. Например, механизмы , движущие эндотелиальные процессы, такие как ангиогенез, как известно, происходят по- разному в различных органах и в различных патологических состояниях, таких как здоровье и болезнь 44. По этой причине, плоская эндотелиальную клеточную культуру последовательно неадекватными 6 и, таким образом поле имеет полагались на дорогостоящим и трудоемким моделях на животных.

Модели на животных, в то время как информативным и важным для прогресса биологических исследований, не всегда хорошо переводятся в клинику.Это было во многом связано с различиями между мышиной и человеческой биологии, особенно в отношении их реакции на стимулы 9,45. Поэтому крайне важно , чтобы иметь возможность построить в моделях пробирке , которые могут предоставить дополнительные данные человека специфичные для дополнения информации , полученной от животных моделей. В пробирке платформы имеют потенциал , чтобы имитировать микроокружение интерес с дополнительной мощности для настройки этой среды. Основные характеристики такой системы должны включать в себя трехмерную структуру и геометрию, внеклеточного матрикса состава (ECM), близость паренхимы клеток и взаимодействие, кровоток и биохимические стимулы. Engineered микрососуды имеют потенциал для включения всех этих параметров. Это может быть сделано одновременно, чтобы создать всеобъемлющую модель, или добавлять на стадии мудрое выделить индивидуальные реакции и взаимодействия.

Мощный аспект сконструированных микрососудов является возможностьуправление потоком и манипулировать гидродинамические силы, воздействующие на эндотелий. В качестве примера, устройство можно культивировать под действием силы тяжести приводом условий потока или с непрерывной перфузии (рисунок 2). Величина напряжения сдвига на стенке сосуда, можно модулировать в обоих условиях за счет изменения скорости потока и геометрии сосуда. Основное различие между этими двумя условиями является временное распределение напряжения сдвига внутри сосуда. В гравитационных приводом условий потока, напряжение сдвига не является постоянным в течение долгого времени. Скорость потока и напряжения сдвига являются самыми высокими сразу после смены носителя, когда впускной резервуар заполнен. В стоках СМИ, напряжение сдвига будет уменьшаться. Это приводит к диапазону напряжения сдвига на протяжении 12 часов. Эксперименты, которые требуют точного контроля над гидродинамическими свойствами (например, для изучения влияния напряжения сдвига на эндотелий) следует использовать непрерывные условия культивирования потока.

Еngineered микрососудов может быть настроен, чтобы ответить на широкий круг вопросов с относительно простых модификаций. Различные типы клеток, как паренхиматозной и эндотелиальный, могут быть использованы для моделирования различных систем органов. В дополнение к фабрикации микрососуды с посевом клеток эндотелия, эпителиальные клетки , вместо того, чтобы можно было бы использовать на линию канала для исследований , относящихся к слизистой оболочки кишечника, альвеолы ​​легкого, почки канальцев и др. После того , как микросреда определяется составом клеток, питательного раствора (то есть, средства массовой информации, в крови, факторы роста или другие биологически соответствующие жидкости) , который используется для обрызгивать устройство может быть изменено , чтобы дать ответ на сложные вопросы клеточной сигнализации, неподвижности, напряжения сдвига , питательные вещества, реакция лекарственного средства, и многое другое. Кроме того, геометрия сосуда может быть специально разработан для исследования реакции эндотелия напряжение сдвига и извилистость. В качестве примера, в недавней публикации из Чжэн и др. и др. показали , что эндотелиальные клетки имеют повысекреция ред ФВ и монтаж волокон в микрососудов регионах с высоким уровнем напряжения сдвига и ускорения потока. В частности, ФВ пучки обычно не образуются в углах и крутых поворотов в пределах сети. Геометрия сети также может быть предназначена для изготовления многоклеточных канальцев. Например, конструкция , которая состоит из двух параллельных каналов , каждый со своим собственным входом и выходом может быть использован для создания градиента концентрации или моделировать смежную канальцев окружающей среды (например, лимфатический сосуд с прилегающей микрососудов). Сетка-подобные структуры текущих конструкций сети (показанные на фиг.1А-С) , являются предпочтительными для моделирования переноса текучей среды , и для структурной целостности в процессе изготовления, но не являются показателем сосудистой структуры в организме. В будущих исследованиях следует использовать более физиологические сетевые структуры, такие, как те, с иерархическим разветвленности и закругленными углами.

В то время как все шаги, описанные в этой процедуре имеют важное значение, естьнесколько важных шагов, которые необходимы для успешного изготовления спроектированного микрососудов. Коллагеновый гель необходимо тщательно перемешать до достижения гомогенного раствора, и важно, чтобы не вводить пузырьков во время этого этапа. Это имеет важное значение для жизнеспособности клеток и физиологической функции, в частности, для экспериментов, которые включают паренхимных клеток в коллагеновой матрице. Если однородную смесь коллагена, трудно получить, проверить рН раствора, чтобы убедиться, что он является нейтральным. Если проблема не устранена, возможно коллаген запас должен быть заменен. Другим важным шагом является сборка верхней и нижней частей на жилье - это очень важно, чтобы не использовать избыточную силу, так как это может привести каналы к коллапсу. Несколько раундов практике может быть необходимым, чтобы получить ощущение величины усилия, необходимого для применения при вращении винта. Если коллапс канала или ломка продолжает возникать даже после того, как на практике, возможно сеть PDMS стала деформированы из-за absorptион влаги. Начиная с свежеприготовленных форм PDMS поможет решить эту проблему. Неверная резьбовые отверстия в нижнем устройстве также может вызвать коллапс канала. Если винты не могут вращаться плавно во время сборки, дополнительное усилие должно что часто приводит к разрушению конструкции. Последний важный шаг, который следует подчеркнуть, является важность частого кормления, как правило, каждые 12 часов. Это очень важно для поддержания эндотелий и предотвращая устройство от высыхания. В том случае, посеянных эндотелиальные клетки появляются нездоровыми или отделяться от коллагена стенки, потенциальные пути улучшения эндотелиальной здоровья будут кормить сосуды чаще используют шприцевой насос для применения непрерывного потока, или проверить рН геля коллагена, чтобы обеспечить его находится на физиологическом уровне.

В настоящее время эта платформа ограничена фабрикации с внеклеточным матриксом соответствующей жесткости, чтобы сохранить структурную целостность канала во время сборки. Плотные сотрудничествоllagen на уровне или выше, чем 6 мг / мл является достаточным, но коллаген менее 6 мг / мл и другие матрицы, такие как decellularized матрицы из целых органов слишком слабы. Эту проблему можно решить, используя смесь коллагена с матрицей о котором идет речь. Engineered микрососудов также ограничены по своим масштабам размера. Сосуды могут быть изготовлены с нижним пределом примерно 100 мкм, но существенные изменения должны быть применены для достижения меньшего масштаба. Несмотря на то, сконструированные микрососудов создать трехмерный просвет, сама сеть является плоской. Для того, чтобы создать действительно трехмерный сплетение сосудов, дополнительные изменения должны быть применены, например, как создание многослойной сети путем укладки нескольких спроектированных судов.

Представительные результаты, представленные в этом методе демонстрируют, как Engineered микрососудов может быть использован для оценки барьерной функции, сигнализации межклеточную (набора перицитов и стабилизации сосудистой), ангиогенез и тромбоз. Highlights этих исследований представлены здесь более подробные презентации в предыдущих публикациях 31,32. Эти исследования показывают , как перицитов мигрировать и пальто эндотелий сконструированных микрососудов 31, тромбоциты придерживаться активированного эндотели 31, и напряжение сдвига жидкости модулирует эндотелиальную активацию и секрецию VWF и узел 32. Engineered микрососудов в дальнейшем может быть использован для создания васкуляризированных ткани и модели специфические для органа системы, такие как почки 33 или сердце 34. Способность повторить эти физиологические крови эндотелием взаимодействий и настроиться на микросреду относительно напряжения сдвига, геометрия, ECM, и клеточный состав позволит будущим исследования сосудистых заболеваний.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы хотели бы отметить Линн и Майк Гарви визуализации лаборатории в Институте стволовых клеток и регенеративной медицины, а также Вашингтон Nanofabrication фонда в Университете штата Вашингтон. Они также признают финансовую поддержку Национального института здравоохранения предоставляет DP2DK102258 (к YZ), а также обучение предоставляет T32EB001650 (к ССК и САХ) и T32HL007312 (к САХ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wafer Fabrication
AutoGlow Plasma System AutoGlow
Headway Spin Coater Headway Research, Inc  PWM32 Spin Coater 
ABM Contact Aligner AB-M
Alpha Step Profilometer Tencor Alpha Step 200
SU-8 Developer Microchem Y020100
SU-8 Resist Microchem SU-8 2000
8" silicon wafer Wafer World Inc.
Tabletop Micro Pattern Generator Heidelberg Instruments μPG 101 For generation of photomask
Hot plate VWR 97042-646
Ispropyl alcohol Avantor Performance Materials 9088
Petri dishes (120 x 120 mm, square) Sigma-Aldrich Z617679
Trichloro(3,3,3-trifluoropropyl)silane Sigma-Aldrich MKBG3805V
Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer base and curing agent Dow Corning Sylgard 184 Mixed at 10:1 (w/w)
Vacuum desiccator Sigma-Aldrich Z119024-1EA
Oven VWR 9120976
Device Fabrication and Culture
poly(methyl methacrylate) (PMMA) Plexiglas
Corona Treater Electro-Technic Products, Inc. BD-20 Handheld device for plasma treatment of PMMA devices and PDMS molds
Soldering Iron Weller  WTCPS
Stainless Steel Truss Head Slotted Machine Screw McMaster-Carr  91785A096
Stainless steel dowel pins McMaster-Carr  93600A060
Tweezers  Miltex 24-572 Any similar tweezers may be used
Spatula (Micro Spoon) Electron Microscopy Services 62410-01
Screw driver Any flat head screwdriver may be used, autoclaved
Glass coverslips (22 x 22 mm) Fisher Scientific 12-542B
Bleach Clorox 4460030966
Petri dishes (150 x 25 mm) Corning 430599
Petri dishes (100 x 20 mm) Corning 2909
Cotton, cut into 1 cm x 3 cm pieces Autoclaved
Polyethyleneimine (PEI) Sigma-Aldrich P3143 Dilute to 1% in cell culture grade water
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G6257 Dilute to 0.1% in cell culture grade water
Sterile H2O Autoclaved DI H2O
Type I collagen, dissolved in 0.1% acetic acid Isolated from rat tails as described in Rajan et. al. 2006 (ref #37)
1 ml syringe BD 309659
10 ml syringe BD 309604
15 ml conical tubes Corning 352097
30 ml conical tubes Corning 352098
M199 10x Media  Life Technologies 11825-015
1 N NaOH (sterile) Sigma-Aldrich 415413 Dilute to 1 N in cell culture grade water
HUVECs Lonza
Endothelial growth media Lonza CC-3124
Trypsin Corning 25-052-CI
Fetal bovine serum (FBS) Thermofisher Scientific 10082147
Dextran from Leuconostoc spp. (70 kDa) Sigma-Aldrich 31390
Phosphate Buffered Saline (PBS) Corning 21-031-CV
Hemocytometer Hausser Scientific Co. 3200
Gel loading tips VWR 37001-152
18 G Blunt Fill Needle BD  305180
20 G Stainless Steel Dispensing Needle McMaster-Carr 75165A123
Tygon 1/32” ID, 3/32" OD Silicon Tubing Cole-Parmer EW-95702-00
1/16" Tube-to-tube Coupling McMaster-Carr 5116K165
90° Elbow Connectors, Tube-to-Tube McMaster-Carr 5121K901
Luer Lock Coupling (Female, 1/16" ID) McMaster-Carr 51525K211
Plastic Forceps, with Jaw Grips Electron Microscopy Services 72971
Dual Syringe Pump Harvard Apparatus 70-4505
5 ml Polystyrene Round-bottom tube Fisher Scientific 14-959-2A
Device Analysis
Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A8806-5G
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-9284
Rabbit anti-hCD31 Abcam ab32457 1:25 working dilution
FITC conjugated anti-von Willebrand Factor antibody Abcam ab8822 1:100 working dilution
Goat anti-rabbit 568 secondary antibody Thermofisher Scientific A-11011 1:100 working dilution
Hoescht Thermofisher Scientific H1399 Resuspended in DMSO
Sodium cacodylate  Sigma-Aldrich C0250 To make 0.2 M cacodylate buffer
Ethanol VWR International BDH1164-4LP
40 kDa FITC-conjugated Dextran Sigma-Aldrich FD40S 
Additional Culture Reagents 
CHIR-99021 Selleck Chem S2924 Small molecule GSK-3 inhibitor
Human recombinant VEGF Peprotech 100-20
Human recombinant bFGF Peprotech AF-100-18B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rubanyi, G. M. The role of endothelium in cardiovascular homeostasis and diseases. J. Cardiovasc. Pharmacol. 22, Suppl 4 37-44 (1993).
  2. van Hinsbergh, V. W. The endothelium: vascular control of haemostasis. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 95 (2), 198-201 (2001).
  3. Chiu, J. -J., Chien, S. Effects of Disturbed Flow on Vascular Endothelium: Pathophysiological Basis and Clinical Perspectives. Physiol. Rev. 91, 327-387 (2011).
  4. Qi, Y., Jiang, J., et al. PDGF-BB and TGB-b1 on cross-talk between endothelial and smooth muscle cells in vascular remodeling induced by low shear stress. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 1908-1913 (2011).
  5. Sozzani, S., Del Prete, A., Bonecchi, R., Locati, M. Chemokines as effector and target molecules in vascular biology. Cardiovasc. Res. 107 (3), 364-372 (2015).
  6. Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. From 3D cell culture to organs-on-chips. Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).
  7. Staton, C. a, Reed, M. W. R., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int. J. Exp. Pathol. 90, 195-221 (2009).
  8. Greek, R., Menache, A. Systematic Reviews of Animal Models: Methodology versus Epistemology. Int. J. Med. Sci. 10, 206-221 (2013).
  9. Can Animal Models of Disease Reliably Inform Human Studies. PLoS Med. van der Worp, H. B., Howells, D. W., et al. 7 (3), e1000245 (2010).
  10. Leong, X. -F., Ng, C. -Y., Jaarin, K. Animal Models in Cardiovascular Research: Hypertension and Atherosclerosis. Biomed Res. Int. 2015, 528757 (2015).
  11. Pries, A. R., Secomb, T. W. Making Microvascular Networks Work: Angiogenesis, Remodeling, and Pruning. Physiology. 29, 446-455 (2014).
  12. D'Amore, P. Mechanisms Of Angiogenesis. Annu. Rev. Physiol. 49, 453-464 (1987).
  13. Geudens, I., Gerhardt, H. Coordinating cell behaviour during blood vessel formation. Development. 138, 4569-4583 (2011).
  14. Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. The development of the vascular system: a historical overview. Methods Mol. Biol. 1214, 1-14 (2015).
  15. Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. Morphological and molecular aspects of physiological vascular morphogenesis. Angiogenesis. 12 (2), 101-111 (2009).
  16. Bautch, V. L. VEGF-directed blood vessel patterning: From cells to organism. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2 (9), 1-12 (2012).
  17. Stratman, A. N., Schwindt, A. E., Malotte, K. M., Davis, G. E. Endothelial-derived PDGF-BB and HB-EGF coordinately regulate pericyte recruitment during vasculogenic tube assembly and stabilization. Blood. 116, 4720-4730 (2010).
  18. Bach, T. L., Barsigian, C., et al. VE-Cadherin mediates endothelial cell capillary tube formation in fibrin and collagen gels. Exp. Cell Res. 238 (238), 324-334 (1998).
  19. Kubow, K. E., Conrad, S. K., Horwitz, aR. Matrix microarchitecture and myosin II determine adhesion in 3D matrices. Curr. Biol. 23 (17), 1607-1619 (2013).
  20. Potapova, I. A., Gaudette, G. R., et al. Mesenchymal Stem Cells Support Migration, Extracellular Matrix Invasion, Proliferation, and Survival of Endothelial Cells In Vitro. Stem Cells. 25 (7), 1761-1768 (2007).
  21. Bayless, K. J., Davis, G. E. Sphingosine-1-phosphate markedly induces matrix metalloproteinase and integrin-dependent human endothelial cell invasion and lumen formation in three-dimensional collagen and fibrin matrices. Biochem. Biophys. Res. Commun. 312 (4), 903-913 (2003).
  22. Hellström, M., Gerhardt, H., et al. Lack of pericytes leads to endothelial hyperplasia and abnormal vascular morphogenesis. J. Cell Biol. 152 (3), 543-553 (2001).
  23. Tulloch, N. L., Muskheli, V., et al. Growth of Engineered Human Myocardium With Mechanical Loading and Vascular Coculture. Circ. Res. 109, 47-59 (2011).
  24. Davis, G. E., Saunders, W. B. Molecular balance of capillary tube formation versus regression in wound repair: role of matrix metalloproteinases and their inhibitors. J. Investig. dermatology Symp. 11 (1), 44-56 (2006).
  25. Kannan, R. Y., Salacinski, H. J., Butler, P. E., Hamilton, G., Seifalian, A. M. Current status of prosthetic bypass grafts: a review. J. Biomed. Mater. Res. B. Appl. Biomater. 74, 570-581 (2005).
  26. Nerem, R. M., Seliktar, D. Vascular Tissue Engineering. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3 (1), 225-243 (2001).
  27. Melchiorri, A. J., Hibino, N., Fisher, J. P. Strategies and techniques to enhance the in situ endothelialization of small-diameter biodegradable polymeric vascular grafts. Tissue Eng. Part B. Rev. 19 (4), 292-307 (2013).
  28. Abbott, W. M., Callow, A., Moore, W., Rutherford, R., Veith, F., Weinberg, S. Evaluation and performance standards for arterial prostheses. J. Vasc. Surg. 17 (4), 746-756 (1993).
  29. Niklason, L. E. Functional Arteries Grown in Vitro. Science. 284 (5413), 489-493 (1999).
  30. Niklason, L., Counter, C. Blood vessels engineered from human cells - Authors' reply. Lancet. 366 (9489), 892-893 (2005).
  31. Zheng, Y., Chen, J., et al. In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 9342-9347 (2012).
  32. Zheng, Y., Chen, J., Lòpez, J. A. Flow-driven assembly of VWF fibres and webs in in vitro microvessels. Nat. Commun. 6, 7858 (2015).
  33. Ligresti, G., Nagao, R. J., et al. A Novel Three-Dimensional Human Peritubular Microvascular System. J. Am. Soc. Nephrol. 27, (2015).
  34. Roberts, M. A., Tran, D., et al. Stromal cells in dense collagen promote cardiomyocyte and microvascular patterning in engineered human heart tissue. Tissue Eng. Part A. , (2016).
  35. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protoc. 5 (3), 491-502 (2010).
  36. Alpha-Step 200 Manual. Tencor Instruments. , (1989).
  37. Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).
  38. Baudin, B., Bruneel, A., Bosselut, N., Vaubourdolle, M. A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells. Nat. Protoc. 2 (3), 481-485 (2007).
  39. Leung, A. D., Wong, K. H. K., Tien, J. Plasma expanders stabilize human microvessels in microfluidic scaffolds. J. Biomed. Mater. Res. - Part A. 100 (7), 1815-1822 (2012).
  40. Tousimis SAMDRI-780 Critical Point Drying Apparatus. Tousimis Research Corporation. , (1987).
  41. Palpant, N. J., Pabon, L., et al. Inhibition of β-catenin signaling respecifies anterior-like endothelium into beating human cardiomyocytes. Development. 142 (18), 3198-3209 (2015).
  42. Gimbrone, M. a, Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial Dysfunction, Hemodynamic Forces, and Atherogenesis. Thromb. Haemost. 82, 722-726 (1999).
  43. Wu, M. H., Ustinova, E., Granger, H. J. Integrin binding to fibronectin and vitronectin maintains the barrier function of isolated porcine coronary venules. J. Physiol. 532 (3), 785-791 (2001).
  44. Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Roncali, L., Dammacco, F. Endothelial cell heterogeneity and organ specificity. J. Hematother. Stem Cell Res. 11, 81-90 (2002).
  45. Shanks, N., Greek, R., Greek, J. Are animal models predictive for humans. Philos. Ethics. Humanit. Med. 4, 2 (2009).

Tags

Биоинженерия выпуск 115 тканевой инженерии микрососудов эндотелиальные клетки сосудистой инженерии 3D культуры клеток micropatterning
Micropatterning и сборка 3D микрососудов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Roberts, M. A., Kotha, S. S., Phong, … More

Roberts, M. A., Kotha, S. S., Phong, K. T., Zheng, Y. Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels . J. Vis. Exp. (115), e54457, doi:10.3791/54457 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter